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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54603
Automatic Translation
1, 5, 1,2, 1,2,5, 3,4, 3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Abstract

Metastasi a siti secondari come il polmone, fegato e osso è un evento traumatico con un tasso di mortalità di circa il 90% 1. Di questi siti, il polmone è il più difficile da valutare utilizzando imaging ottico intravitale grazie alla sua posizione chiusa all'interno del corpo, delicatezza e ruolo essenziale nel sostenere corretta fisiologia. Mentre le modalità cliniche (tomografia ad emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (CT)), sono in grado di fornire immagini non invasive di questo tessuto, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i primi eventi di semina, con un singolo pixel composto da quasi un migliaio di cellule. I modelli attuali di metastasi polmonari semina postulato che gli eventi subito dopo l'arrivo di una cellula tumorale sono deterministico per la sopravvivenza e la successiva crescita. Ciò significa che in tempo reale strumenti di imaging intravitale con risoluzione singola cella 2 sono necessari per definire i fenotipi della cel seminaLS e testare questi modelli. Mentre l'imaging ottico ad alta risoluzione del polmone è stato eseguito utilizzando vari ex vivo i preparativi, questi esperimenti sono in genere saggi di tempo a punto singolo e sono suscettibili di manufatti e le possibili conclusioni errate a causa dell'ambiente drammaticamente alterato (temperatura, profusione, citochine, etc. ) risultante dalla rimozione dalla cavità toracica e sistema circolatorio 3. Studi recenti hanno dimostrato che il time-lapse imaging ottico intravitale del polmone intatto è possibile utilizzando un vuoto stabilizzato finestra di imaging 2,4,5 Tuttavia, i tempi tipici di imaging si sono limitati a circa 6 ore. Qui si descrive un protocollo per eseguire l'imaging intravitale time-lapse a lungo termine del polmone utilizzando tale finestra su un periodo di 12 ore. Le sequenze di immagini time-lapse ottenuti con questo metodo consentono la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni cellula-cellula, la dinamica della membrana e perfusione vascolare nel polmone. Abbiamo inoltre dEscribe una tecnica di elaborazione di immagini che offre una visione senza precedenti chiara del microcircolo polmonare.

Introduction

Imaging ad alta risoluzione ottica intravitale ha dimostrato di essere fondamentale per comprendere molti processi biologici, permettendo a cella singola e parametri sub-cellulari da misurare e quantificare. Nella ricerca cancro, l'imaging intravitale delle cellule tumorali e stromali ha portato alla scoperta di molte interazioni microambientali 6-11 che sono presenti solo in animali intatti.

Scoperte circa microambienti associati intravasation e la diffusione delle cellule tumorali nel cancro al seno con l'imaging ottico risoluzione di singola cellula in vivo ha anche portato a nuovi marcatori per la prognosi e la risposta al trattamento in pazienti con cancro mammario 12-16. Le migliori tecnologie di imaging disponibili per la visualizzazione in profondità all'interno intatti gli organi vitali interni sono le modalità clinici (risonanza magnetica, PET, CT), che offrono una vista eccellente di tutta organo e possono rivelare patologie ancor prima che essi producono sintomi clinici. Non sono in grado, however, per rivelare le prime fasi di metastasi e dei meccanismi cellulari di guida progressione del tumore a causa della loro mancanza di risoluzione di singola cellula. Per il momento in metastasi polmonari sono visibili in queste modalità, sono ben stabiliti e proliferare. Data la stima che il 90% delle cellule disseminate tumorali che arrivano al polmone o non sopravvivono 17 o inizialmente rimangono dormienti 18, e l'osservazione che arrivano molto prima di quanto precedentemente previsto 19, l'imaging le prime fasi di arrivo e la sopravvivenza diventa cruciale per la comprensione del processo di semina metastatico e la ricorrenza della crescita tumorale in siti distanti.

L'esecuzione di queste osservazioni nel polmone si è dimostrato estremamente difficile tuttavia; la stragrande maggioranza degli studi di imaging hanno utilizzato ex vivo o espianto preparati 20-23, che solo danno una visione nei polmoni in momenti singoli. Mentre questi preparativi forniscono informazioni utilirmazioni, non danno una comprensione completa delle interazioni, rapporti di causa ed effetto, e dinamiche che si verificano tra i vari componenti del microambiente. La mancanza di un adeguato sistema circolatorio (e squilibrio concomitante di omeostasi) e la disconnessione dal resto del sistema immunitario del corpo rende desideravano convalidare le conclusioni che queste preparazioni generano nel tessuto intatto in vivo.

Molti gruppi hanno eseguito l'imaging intravitale del polmone intatto 2,4,5,24-33 con Wearn e tedesco essere il primo a chirurgicamente esporre lo strato pleurico 24 e Terry il primo a utilizzare una finestra di imaging impiantabile 25.

immagini ad alta risoluzione nel polmone è fortemente ostacolata dal movimento costante del polmone e diverse tecniche sono state sviluppate per superare questa limitazione. Wagner e Filley 27 hanno studiato il movimento naturale del polmone caninoe progettato loro protocollo chirurgico per localizzare loro finestra impiantato su una regione relativamente fisso mentre Wagner utilizzata vuoto nella sua finestra preparazione chirurgica per immobilizzare il tessuto 28. Da quel momento, una varietà di tecniche sono state utilizzate per l'immagine polmone tra cui: bloccaggio bronchi, apnea sequenziale e di imaging gated, acquisizione sovracampionato, incollaggio del lobo polmonare e aspirazione 34. Ognuno di questi ha i suoi vantaggi e svantaggi e nessuno tecnica è emerso come superiore ad un altro 34. Ad esempio, bronchi bloccaggio e apnea sequenziale alterano il normale scambio di gas nei polmoni e possono causare atelettasia. l'imaging Gated e l'acquisizione sovracampionato non soffrono di questi svantaggi, ma richiedono ad alta velocità o di apparecchiature di imaging specializzata non ampiamente accessibile. Infine sia incollaggio del polmone e la tecnica del vuoto evitare entrambi gli inconvenienti sopra citati, ma che possono mostrare lesioni forza indotta taglio se cura non è takit. Negli ultimi anni, la finestra di vuoto è stato miniaturizzato e adattato per l'uso nei topi utilizzando confocale e microscopia multifotonica 4,5,33 e eccellente imaging ad alta risoluzione è stato raggiunto 2. La tabella 1 riassume questa ricca storia ed esalta quelle carte che descrivono romanzo avanzamenti nella l'uso di finestre di imaging polmonare intravitale.

Questo protocollo descrive l'uso di prolungato time-lapse multiphoton intravitale microscopia a immagine di metastasi nel vivo, polmone intatto con la massima risoluzione possibile subcellulare. Le immagini sono acquisite fino a 12 ore utilizzando un microscopio multifotone dotato di elevata apertura numerica della lente obiettivo e rivelatori tubo fotomoltiplicatore multipla (PMT). modelli di topi transgenici sono utilizzati per etichetta fluorescente macrofagi native con fluorescente ad alta destrano peso molecolare e proteine ​​transfettate cellule tumorali fluorescenti (per etichettare le cellule tumorali e sistema vascolare respectively). Anche se questa scelta di cellule fluorescente consente la visualizzazione delle interazioni cellula-macrofagi cellule endoteliali tumorali e le dinamiche, questo protocollo funziona per qualsiasi ceppo di topo fluorescenti o non fluorescente. Dopo l'acquisizione, il movimento residuo di deriva (se presente) viene eliminata con un plug-in Fiji 35,36 e personalizzati macro tempo medio del canale vascolare per eliminare lampeggiante causata da cellule del sangue circolanti senza etichetta.

Mentre questo protocollo concentra sull'imaging metastasi, le tecniche sono applicabili a molti altri processi biologici osservabili con l'imaging cella singola ad alta risoluzione nel polmone.

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Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui la preventiva approvazione da parte del Albert Einstein College of Medicine Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.

1. Modello mouse e cellule tumorali Generazione fluorescente

  1. Preparare 100 ml di 0,1% (w / v) di siero albumina bovina / tampone fosfato (BSA / PBS) mescolando 0,1 g di BSA con 100 ml di PBS.
  2. Preparare le cellule tumorali fluorescente mediante trasfezione stabile.
    NOTA: Qui usiamo cellule E0771-LG, un derivato altamente metastatico E0771 topo cellule di adenocarcinoma mammario 37 che sono stati isolati da tumori metastatici sviluppate nel polmone di C57BL / 6 del mouse iniettata per via endovenosa con le cellule E0771 parentali 38.
    1. 24 ore prima della trasfezione, Piastra 1 x 10 5 cellule EO771-LG su un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri su 2 ml di antibiofree 10% FBS (siero fetale bovino) DMEM tic (Dulbecco Modified Eagle Medium) e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2.
    2. Al momento della transfezione, incubare 2 ug del vettore proteina fluorescente con 10 ml di reagente di trasfezione per 30 minuti prima di aggiungere 190 ml di mezzi di siero ridotte.
    3. Lavare EO771-LG cellule con tampone fosfato Dulbecco (D-PBS) una volta e aggiungere al mix trasfezione delicatamente.
    4. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 6 ore.
    5. Lavare le cellule e la cultura trasfettate in 2 ml di DMEM completo (10% FBS, piruvato 1 mM, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml di streptomicina) per 2 giorni.
    6. Lavare le cellule con 2 ml di PBS sterile, aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubare per 2 minuti a 37 ° C.
    7. Raccogliere sospensione cellulare e mescolare con almeno 1 volume di DMEM completo e spin down a 280 x g.
    8. Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM completo ed espandere la coltura cellulare in10 cm coltura di tessuti piatto.
    9. Avviare selezione di cellule trasfettate con l'aggiunta di 700 ug / ml di G418 antibiotico selettivo 8 ml di DMEM completo e cultura per una settimana, cambiando media ogni tre giorni.
  3. Arricchisci la popolazione fluorescente da cellule transfettate che sono stati sotto selezione in G418 per l'ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) 39,40.
    1. Lavare le cellule con 5 ml di PBS e aggiungere 1,5 ml di 0,25% tripsina.
    2. Incubare per 2 minuti a 37 ° C e miscelare con almeno un volume di DMEM completo.
    3. Raccogliere sospensione cellulare e centrifugare a 280 xg e risospendere le cellule in 1 ml di soluzione sterile 0,1% (w / v) di tampone BSA / PBS.
    4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una maglia 40 micron e regolare il volume di 1 ml con 0,1% BSA / PBS per l'ordinamento.
    5. FACS-ordinare la popolazione più luminoso del 10% sulla base di spettro di fluorescenza utilizzando il sorter FACS 41.
    6. Coltivare le cellule ordinati per un'altra settimana uselezione nder (700 ug / ml di G418 in DMEM completo).
    7. Selezionare di nuovo le cellule fluorescente di citometria a flusso ripetendo i punti da 1.3.1 a 1.3.6, ancora una volta.
    8. Dopo un secondo turno di selezione, trypsinize, filtro e ri-sospendere le cellule in 0,1% BSA / PBS come descritto (gradini 1.3.1-1.3.4). Regolare la concentrazione a 2 x 10 6 cellule / ml per singola cella di smistamento in 96 pozzetti usando Ordine FACS.
    9. Preparare 3-5 96 pozzetti con 100 ml di DMEM completo per la raccolta. Per migliorare la sopravvivenza dopo la cernita, aggiungere 100 ml di terreno di coltura filtrati dai piatti in cui le cellule EO771-LG sono stati coltivati 42.
    10. Dopo l'ordinamento delle cellule nelle piastre a 96 pozzetti, tornare alle cellule di coltura per 2 giorni (37 ° C, 5% di CO 2).
    11. Identificare pozzi con vitali singoli cloni con l'esame sotto un microscopio invertito a 5x ingrandimento.
    12. Trypsinize ed espandere cloni vitali e congelare le cellule per il backup.
      1. Lavare pozzi con gra causa cloni con 100 ml di PBS sterile. Aggiungere 50 ml di 0,25% w / v tripsina e incubare 2 min a 37 ° C. Aggiungere 50 ml di DMEM completo e trasferimento sterile fondo piastra a 96 pozzetti V-parte inferiore o rotonda a girare verso il basso a 280 xg per 5 min.
      2. Risospendere le cellule in 100 ml di 700 mg / ml G418 DMEM completo e piastra ogni clone in piastre da 12 pozzetti. Aggiungere 400 ml di DMEM completo con G418 e la cultura fino confluenti.
      3. Lavare i pozzetti con 500 ml di PBS, aggiungere 100 ml di 0,25% tripsina e incubare 2 minuti a 37 ° C. Aggiungere 100 ml di DMEM completo e spin down per 5 min a 280 x g. Risospendere le cellule in 100 ul di DMEM completo con le cellule G418 e lamiere in 6 piastre bene fino confluenti.
      4. Una volta confluenti, trypsinize cellule, centrifugare e risospendere in 10% DMSO in FBS di congelare le scorte di cellule.
      5. Mantenere 1/10 delle sospensioni cellulari in coltura da loro placcatura in 100 mm piastre di coltura dei tessuti per la valutazione del loro potenziale metastatico.
  4. Prova potenziale metastatico dei cloni selezionati.
    1. Trypsinize e risospendere le cellule in soluzione salina ad una concentrazione di 2,5 x 10 6 cellule / ml e iniettare 200 microlitri in C57BL / 6 topi per via endovenosa attraverso la vena della coda.
    2. Dopo 2 settimane, raccogliere tessuto polmonare come descritto in precedenza 23 e quantificare il carico tumorale dal conte di superficie o di un metodo stereologica 43. Selezionare cloni ad alto potenziale metastatico per l'imaging intravitale.
  5. Sollevare MacBlue (un promotore specifico mieloide guida proteina fluorescente (PCP) espressione ciano (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) 44 topi reporter.
    NOTA: in genere, vengono utilizzati topi tra 8 e 12 settimane, ma i topi già nel 7 e più tardi a 20 settimane sono stati testati per funzionare pure.

2. Multiphoton Microscopio Set up and Imaging Preparazione

NOTA: Anche se questo protocollo può essere eseguita su qualsiasi multiphoton microscopio, il sistema utilizzato per acquisire i dati riportati in questo protocollo è stato descritto in precedenza in dettaglio 45.

  1. Accendere tutti i componenti del microscopio e laser, tra cui laser a due fotoni e rivelatori almeno un'ora prima del tempo di imaging desiderato.
  2. Appena prima dell'intervento chirurgico, misurare la potenza dell'ingresso luce microscopio posizionando la testa del misuratore di potenza ottica nel percorso ottico poco prima del microscopio e regolare le manopole specchio fine cavità laser fino alla massima intensità luminosa a 880 nm è leggere il misuratore di potenza ottica.

3. Vacuum System Impostare

  1. Incollare il vetrino nella finestra di imaging (Supplemental Figura 1) con cianoacrilato. Lasciare almeno 4 ore per la colla si asciughi completamente.
    NOTA: Questo passaggio può essere fatto anche prima del tempo.
  2. Tagliare la punta della pipetta 100 microlitri alla prima linea dalla piccola apertura e collegare l'estremità non tagliata per il sottile vTubo uoto.
  3. Collegare il sistema di aspirazione secondo la figura 1 e la figura 2 supplementare.
  4. Con il vuoto su e l'estremità aperta bloccato, regolare il regolatore di vuoto per <3 Hg.
    NOTA: La regolazione finale del livello di vuoto viene eseguita mediante osservazione del sistema vascolare in vivo.
  5. Applicare un sottile strato di grasso minerale al lato inferiore della piastra di imaging per evitare il mezzo di immersione lente dell'obiettivo venga trasferita all'esterno dalla piastra di imaging.
  6. Posizionare la piastra di imaging sul palco microscopio.
    NOTA: La piastra di imaging personalizzato (Supplemental Figura 3) è un foglio di 1/8 "in alluminio di spessore lavorato sia per adattarsi allo spazio inserto palco e con un foro passante nel centro per lo svolgimento della finestra di imaging.
  7. Inserire la finestra di vuoto nella piastra di imaging con il vetrino verso il basso.
  8. Sterilizzare tutte le superfici e gli strumenti tra cui piastra fase di imaging, e vincere l'imagingDow con il 70% di etanolo.
  9. Collegare l'estremità del taglio della punta della pipetta alla finestra del vuoto e il nastro il tubo verso il basso alla piastra di imaging.
  10. Portare l'obiettivo vicino alla finestra di imaging e posto una grossa goccia d'acqua tra l'obiettivo e il vetrino.
  11. Assicurarsi che non vi siano perdite dal vetrino, bloccando l'apertura centrale della finestra vuoto e verificare che la goccia d'acqua tra l'obiettivo e il vetrino non viene aspirato.
    NOTA: Una sfera del mouse del computer vecchio stile posto sopra la finestra è utile per bloccare l'apertura centrale.

4. Chirurgia

  1. Preparare l'area chirurgica sterile.
    1. Mettere tutti gli strumenti a portata di mano. Sterilizzare tutte le superfici e gli strumenti tra cui area chirurgica, e strumenti chirurgici con il 70% di etanolo.
  2. Tie una lunghezza di 3 pollici di 2-0 sutura al catetere, ¼ di pollice sopra la bussola con un doppio nodo.
  3. Preparare coda fol vena del cateterelowing il protocollo pubblicato da Harney et al. 46.
  4. Utilizzando una lampada di calore a raggi infrarossi (IR), riscaldare l'animale nella sua gabbia per ~ 5 minuti per aumentare il flusso di sangue nella vena della coda e per aiutare a catetere. Si raccomanda di mantenere l'animale riscaldato a temperature fisiologiche durante tutta la procedura chirurgica utilizzando una lampada di calore o un pad riscaldamento.
  5. Anestetizzare l'animale con 5% isoflurano e verificare che non vi è alcuna risposta ad una presa punta.
  6. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi dell'animale.
  7. Applicare la lozione depilatorio per 10-30 secondi per rimuovere i capelli dal lato sinistro dell'animale; dalla linea mediana del torace per ¼ della schiena e dal cavo ascellare per appena sotto la gabbia toracica.
  8. Pulire qualsiasi lozione in eccesso e sterilizzare la pelle esposta con il 70% di alcol.
  9. Attaccare una siringa sterile riempita con PBS alla coda della vena del catetere e inserire e nastro in posizione seguendo il protocollo pubblicato da Harney et al. 46. Assicurarsi che il nastro è rispettato in modo sicuro l'ago stesso e non è libero nello spazio tra la coda e il nastro.
  10. Intubare il mouse, o dopo il protocollo pubblicato da Das et al. 47 o da DuPage et al. 48
  11. Accendere il ventilatore e impostarlo per la fornitura di 135 respiri al minuto e 200 ml di miscela isoflurano-ossigeno.
  12. Collegare il catetere tracheale al ventilatore.
  13. Muovi il mouse per l'area chirurgica. Fate estrema attenzione a non rimuovere il catetere.
  14. Legare il 2-0 sutura intorno al muso del mouse sotto i denti davanti.
  15. Nastro il catetere per il muso.
  16. Nastro dell'arto anteriore sinistra al catetere di tenerlo fuori del campo chirurgico.
  17. Abbassare le anestesia isoflurano ad un livello di 2,5% manutenzione e verificare l'assenza di risposta ad una presa punta.
  18. Utilizzando le forbici affilate, rimuovere 1 cm 2 di pelle al di sopra della parete toracica sinistra.
  19. ascensore tegli mammaria cuscinetto adiposo e cauterizzare eventuali vasi sanguigni vista con la penna cauterizzazione.
  20. Resecare il cuscinetto adiposo tagliando con le forbici affilate.
  21. Rimuovere lo strato muscolare fino alla gabbia toracica tagliando con le forbici affilate. Fare attenzione a non tagliare la vena ascellare esecuzione alla base della zampa anteriore.
  22. Utilizzare pinze per afferrare e sollevare il 6 ° costola. Utilizzando le forbici affilate tenuti ad un angolo poco profondo (~ 5 °) tagliare la nervatura in prossimità del bordo dell'apertura in pelle. Prestare la massima attenzione a non toccare il tessuto polmonare esposto.
  23. Allargare l'apertura nella parete toracica per esporre l'intero lobo polmonare rimuovendo quattro costole consecutivi.
    Nota: Mantenere l'apertura di almeno 5 mm di distanza dallo sterno per evitare il cuore.
  24. Sollevare con cautela il mouse afferrando la coda e tracheale catetere e spostare il mouse alla fase di imaging microscopio.
  25. Con l'off vuoto, riempire la camera della finestra sottovuoto con PBS.
  26. Capovolgere il mouse e posizionare l'espostopolmone sopra la finestra di imaging vuoto.
  27. Lentamente attivare il vuoto per circa 3-5 pollici di mercurio utilizzando la valvola a sfera.
  28. Inserire una cintura di trattenimento di carta tissue piegato a metà per due volte sul petto del mouse e nastro al piattello come mostrato in Figura 2 supplementare.
  29. Agganciare il sensore coscia del pulsossimetro per coscia dell'animale e avviare il software.
  30. Posizionare la camera ambientale sulla fase e accendere il calore per mantenere il mouse a temperatura fisiologica.
  31. Ridurre il livello di isoflurano al 1-1,5% per mantenere l'anestesia e mantenere il flusso di sangue.

5. Imaging intravitale

  1. Portare la lente obiettivo 25 x 0,95 apertura numerica (NA), vicino al vetrino e aggiungere una grande goccia d'acqua tra di loro.
  2. Utilizzando la modalità epifluorescenza, visualizzare il canale FITC e portare il tessuto polmonare a fuoco.
  3. Se non fatto prima dell'intervento chirurgico, icellule tumorali nject attraverso il catetere vena della coda.
    1. Staccare la siringa PBS dal catetere coda vena.
    2. Caricare una siringa sterile con 100 ml di sospensione cellulare tumorale (2 x 10 7 cellule / ml in PBS massimo).
      NOTA: Questo passaggio può essere fatto in anticipo per studiare arrivo cellule di cancro al polmone in diversi punti temporali.
    3. Collegare la siringa con le cellule tumorali sul catetere vena della coda.
    4. Iniettare lentamente le cellule tumorali nella vena della coda.
    5. Staccare la siringa con le cellule tumorali dal catetere vena della coda.
    6. Collegare nuovamente la siringa PBS al catetere vena della coda.
      NOTA: identificare le posizioni di tutte le cellule tumorali prima di iniettare il destrano come diventa difficile distinguere le cellule tumorali dal segnale destrano via oculare dopo l'iniezione.
  4. Individuare le cellule tumorali a immagine
    1. Per l'imaging cellule tumorali singole, individuare tutte le cellule tumorali e registrare le loro posizioni con °Pannello multipunto e del software.
      1. Individuare tutti i campi di vista di immagine osservando le cellule tumorali nel oculari microscopio.
      2. Nel software, passare al pannello multipunto facendo clic sul pulsante Multi-Point e memorizzare la posizione della cella facendo clic sul pulsante Aggiungi posizione.
    2. Per l'imaging mosaico, localizzare l'origine del mosaico e impostare le coordinate di imaging
      1. Individuare una posizione in alto a sinistra della struttura per essere catturato.
      2. Zero le coordinate x, yez del palcoscenico premendo il tasto "Zero" sul controller palco.
      3. Caricare l'elenco appropriato di coordinate mosaico facendo clic sul pulsante "Carica" ​​e selezionando la lista.
        NOTA: Un elenco esempio per un mosaico 2 x 2 con una sovrapposizione di 20% di un campo di 500 micron di vista sarebbe: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0,400), Pos. 4 = (400,400).
  5. Rimuovere la siringa with PBS nella vena della coda catetere e sostituirlo con la siringa contenente il destrano.
  6. Iniettare lentamente fino a 100 ml di 20 mg / ml 155 kDa rodamina-destrano sciolto in PBS nel mouse tramite il catetere vena della coda seguiti iniettando 50 ml di PBS sterile per lavare la linea. Non introdurre eventuali bolle nella linea. Quando necessario, iniettare destrano almeno un'ora dopo l'iniezione delle cellule del cancro in modo che il volume totale somministrata al topo non superi le 4 ml / Kg / hr.
  7. Impostare i parametri di imaging.
    1. Passare il microscopio alla modalità multiphoton.
    2. Impostare lo zoom ad un fattore di 2X facendo clic sul pulsante di segnali di temporizzazione e l'aggiornamento del campo Fattore di zoom.
    3. Regolare la potenza del laser al ~ 10% (~ 10-15 mW a campione) facendo clic sul pulsante Rilevatori e laser e poi regolando il cursore Tsunami alimentazione a 10.
  8. Immagine ciascuna posizione per verificare la presenza di cellule tumorali e visualizzare il flusso e l'integrità del vascunitario.
    NOTA: Le navi dovrebbero apparire pienamente perfuso con eritrociti fluenti e destrano fluorescente devono essere contenute all'interno dei vasi senza perdite agli spazi extravascolare. Circa 10 - 20 cellule tumorali dovrebbero essere all'interno della apertura libera della finestra di vuoto.
  9. Regolare la profondità di partenza di ciascuna posizione per essere ripreso.
    1. Per ciascuna posizione, regolare la posizione z ruotando la manopola del fuoco sul controller palco all'immagine la fetta superiore della cellula tumorale.
    2. Posizionare la cella al centro del campo visivo.
    3. Fare clic sul pulsante Multipoint, fare clic sulla posizione del campo visivo per evidenziarlo e fare clic su Add seguito dal pulsante Elimina per sostituire posizione memorizzata della cella nella lista multipunto.
    4. Visivamente osservare la luminosità relativa della cellula tumorale in ogni posizione.
  10. Salvare le nuove posizioni di ciascuna delle cellule facendo clic sul pulsante Salva nel pannello un multipuntod specificare un nome di file.
  11. Per l'imaging di cellule tumorali singole, raccogliere tre celle di luminosità approssimativamente equivalente ed eliminare tutte le altre località dalla lista multipunto cliccando sulla loro posizione nella lista e facendo clic sul pulsante Elimina.
  12. Fare clic sul pulsante Rilevatori e laser e regolare i cursori per il guadagno PMT dei canali verde e rosso 45 in modo che i segnali sono al di sotto della saturazione.
  13. Regolare il cursore per il canale blu 45 in modo che i macrofagi appaiono ciano.
    NOTA: apparirà Qualsiasi segnale di seconda armonica solo nel canale blu e può essere separato dal macrofagi ciano seguendo la procedura di canale di sottrazione descritto in precedenza 45.
  14. Impostare la profondità di inizio z-stack a 0 micron e la profondità finale di 24 micron spostando la fase Z per la posizione e facendo clic sul pulsante Start e pulsanti Fine rispettivamente.
    NOTA: Le cellule all'interno di questa profondità verrà visualizzato con il miglior segnale dirumore e risoluzione.
  15. Impostare la dimensione z passo per 3 micron.
  16. Impostare i parametri di imaging seguenti parametri precedentemente descritti 45,49.
    1. Per l'imaging di cellule tumorali singole, fare clic sul pulsante segnali di temporizzazione e quindi immettere 4 V nel campo fattore di zoom (equivalente ad un fattore di zoom 1.5X), inserire 3 nel campo medie telaio e fare clic sul pulsante di Time-Lapse e immettere 10 nel campo Time-lapse.
      NOTA: Queste impostazioni acquisiranno 1 frame ogni 3 secondi.
    2. Per l'imaging mosaico, fare clic sul pulsante segnali di temporizzazione e immettere un fattore di ingrandimento di 1,5 V (equivalente ad un fattore di zoom 4X), digitare 3 nel numero di medie telaio e fare clic sul pulsante Time-Lapse e immettere 10 nel tempo- lapse campo ritardo.
      NOTA: Queste impostazioni acquisiranno 1 frame ogni 3 secondi.
  17. Abilitare il multipunto, z-stack e modalità di imaging t-lapse cliccando sui relativi pulsanti.
  18. Premere il pulsante Record per acquisire immagini.
    NONE: il tessuto polmonare è molto delicata e suscettibile a foto-danni. Se dopo il tempo del flusso sanguigno lapse imaging ferma nel campo immaginata, il laser potrebbe essere troppo elevata e successiva imaging altri campi deve essere fatto a potenza inferiore.
  19. Ogni 30-45 min, iniettare lentamente 50 ml di PBS o soluzione salina per mantenere l'idratazione dell'animale.

6. L'eutanasia

  1. Aumentare la isoflurano al 5%.
  2. Mantenere l'animale sotto il 5% isoflurano fino al 30 sec dopo che cessa di respirare e rimuovere l'animale dal palco.
  3. Eseguire dislocazione cervicale per garantire la completa eutanasia.

Analisi 7. Immagine

  1. Per gli esperimenti singoli imaging cellulare:
    1. Caricare le immagini in Fiji e formato come una HyperStack.
    2. Per ogni z-slice nel HyperStack, riprodurre il filmato lasso di tempo e guardare per il movimento xy residua. Se viene rilevato il movimento xy residuo, applicare il plugin chiamato StackReg 36 alla pila aeliminare il movimento.
  2. Per gli esperimenti di imaging a mosaico:
  3. Caricare le immagini in Fiji ed unirle aprendo il Mosaico Stitching macro (file supplementare codice Mosaico in brossura) e le informazioni di entrare sulle immagini, come la directory, il nome di base del file, il numero di X e Y campi nel mosaico e il numero di fette e punti di tempo.
    NOTA: a causa di come Java interpreta le directory, i nomi delle cartelle deve avere due barre rovesciate come separatori sottocartella. A causa delle limitazioni del built-in plug-in a coppie in brossura, i nomi dei file di base non devono contenere trattini.
  4. Per ottenere una visione chiara dei confini del sistema vascolare, media insieme tutti i punti di tempo per il canale di sangue in una singola immagine e quindi replicare questa immagine come sfondo per ogni fotogramma del film degli altri canali.
    NOTA: Questo viene fatto semplicemente eseguendo la macro Eseguire della media Sangue (file di codice Supplemental Perform della media Sangue).

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Representative Results

Per dimostrare il tipo di risultati che si possono ottenere con questo metodo, abbiamo iniettato cellule tumorali E0771-LG etichettati con il trifoglio proteina fluorescente nella vena della coda di topi MacBlue 44 a varie punti di tempo prima dell'intervento chirurgico. Dopo l'intervento chirurgico, 155 kD rodamina destrano marcato è stato iniettato IV per segnare è stata eseguita imaging vascolare e time-lapse.

Quando l'imaging topi dopo l'iniezione 24 ore, le singole cellule sono visibili all'interno del sistema vascolare, l'interazione con i macrofagi e monociti. Un esempio di questo è mostrato in Figura 2A (Supplemento Film 1). Qui una singola sezione ottica di una cellula tumorale solitaria (verde) 12 micron profondo depositato nel sistema vascolare polmonare è ripreso più di 5 ore e 20 minuti, come interagisce transitoriamente con un macrofago residente (ciano). Vascolare è etichettato da un elevato peso molecolare destrano. La stabilità delimaging è tale che l'imaging sequenziale z-stack del campo può essere acquisito e una ricostruzione tridimensionale 3 può essere effettuato (Figura 2B, Supplemento Film 2).

Uso delle impostazioni microscopio descritte nel protocollo per l'imaging mosaico permette l'imaging di strutture più grandi di un singolo campo di vista. Ad esempio, la Figura 3 illustra l'acquisizione di una singola lesione metastatica, 12 giorni dopo l'iniezione. Questo mosaico 5 x 5 mostra un 890 micron campo visivo oltre 205 min a 15 (Figura 3A, a sinistra del pannello; Supplemento film 3) e 25 micron (Figura 3A, pannello di destra) sotto la superficie del polmone. Nonostante il grande campo visivo, l'alta risoluzione dei fotogrammi che compongono l'mosaico permette la cattura di eventi subcellulari come mitosi di una singola cella come evidenziato da separazione cromosomica (Figura 3B, SupplementoFilm 4).

iniezione intravascolare di un elevato peso molecolare fluorescente risultati destrano in etichettatura del lume vascolare, tuttavia senza etichetta circolanti eritrociti e leucociti occludere il destrano. Nei piccoli capillari del polmone, l'occlusione è completa conseguente lampeggio del segnale destrano e una perdita di definizione dei limiti vascolare (figura 4, sinistra; Supplemento film 5). L'elevata stabilità spaziale fornita da questo protocollo permette tempo medio del canale di sangue, senza sbavature, ripristinando così le occlusioni temporanee. Gli altri canali di segnali possono essere sovrapposti sul sistema vascolare per fornire una visione chiara dei confini dei vasi (Figura 4, a destra; Supplemental film 6).

Figura 1
Figura 1:. Disposizione del sistema di vuoto Casa vuoto viene utilizzato e impostato sul livello definito con un regolatore di vuoto. Un pallone bloccaggio impedisce la contaminazione del sistema regolatore e del vuoto da fluidi corporei. Un tubo sottile e flessibile convoglia il vuoto di un taglio punta della pipetta per adattarsi alla porta del vuoto della finestra di imaging. La finestra di imaging è in forma in una scanalatura incassata nella piastra di imaging mantenere la sua stabilità di posizione rispetto alla lente obiettivo microscopio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Imaging singola cellula del polmone (A) Sempre da un lasso di tempo di film di una singola cellula tumorale nel letto capillare del polmone 24 ore dopo la vena della coda.iniezione. (Vasi Rosso = del sangue, cellule Verde = tumore, Ciano = macrofagi) (B) di imaging stabile consente tre ricostruzione dimensione dei dati di imaging nel corso del tempo. I vasi sanguigni sono stati il ​​tempo in media per chiarezza. (Vasi sanguigni = Rosso, Verde = cellule tumorali, blu = macrofagi). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: La stabilità del polmone Consente ad alta risoluzione, di grande campo di vista Imaging nel polmone dal sequenziale Acquisizione e cucire insieme di più basso ingrandimento Fields (A) 5 x 5 mosaico che mostra un 890 micron campo di vista di. una lesione metastatica nel polmone 12 giorni dopo vena della coda iniezione di cellule tumorali prese a 15 micron sotto la superficie del polmone(Pannello di sinistra). pannello di destra mostra la stessa lesione metastatica a 25 micron sotto la superficie del polmone. (B) I singoli campi ad alta risoluzione rivelano processi subcellulari come l'allineamento dei cromosomi (frecce gialle) e la separazione (frecce rosse) durante la divisione cellulare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: iniezione intravascolare di fluorescente ad alto peso molecolare Destrano Marks la Lumen del sistema vascolare Tranne quando Senza etichetta eritrociti e altre cellule circolanti occludere il (A) risultati occlusione fluorescenza del segnale in una etichettatura incompleta che si muove nel tempo con conseguente effetto oscuramento lampeggiante. i confini nave. (B) L'altostabilità spaziale della finestra di vuoto permette il canale sangue per essere tempo di media, colmando le occlusioni temporanee e delimitare chiaramente i limiti dei vasi. Gli altri canali vengono poi sovrapposte senza media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Anno Primo Autore / ultimo autore Animale Chirurgia Tipo di Imaging Note
1926 Wearn e Tedesco I gatti parete toracica ridotto a livello pleurico. In secondo luogo l'apertura fatta attraverso il diaframma verso il basso per pleura per l'illuminazione. Bright-microscopia in campo. In primo luogo "finestra" attraverso la parete pleurica.
1939 Terry I gatti Le costole sono separati, 1 a. Finestra impiantato, l'aria rimosso dal torace con il vuoto. Binoculare e la pelle microscopio utilizzando l'illuminazione polarizzata. Prima impiantato finestra ottica. vuoto usato per disegnare il tessuto a finestra.
1963 de Alva & Rainer Conigli & Dogs Uno o due costole viene eseguita la resezione e 1 in. Finestra inserite e suturate alla parete toracica. Pelle è stato chiuso sopra la finestra e animale ha permesso di guarire. Prima di imaging, la pelle è stato sezionato per mostrare la finestra. Usato ad alta velocità fotografia stroboscopica attraverso un obiettivo a basso mag (11X). Finestra First sopravvivenza.
1965 Wagner & Filley Cani zampa anteriore destra rimosso, un taglio costola e finestra inserito e suturato. microscopia riflessione con l'obiettivo 22X. Prima finestra relativamente movimento libero senza vuoto.
Wagner Cani Una nervatura viene asportato, 3 a. Finestra impiantato. viti flangia filettata sulla finestra per formare tenuta a parete toracica. microscopia in campo chiaro con elevato ingrandimento obiettivo 100X olio da immersione. Prima finestra da utilizzare a vuoto per stabilizzare il movimento dei tessuti.
1992 Groh & Goetz conigli Una costola resezione, 1.2 in. Finestra impiantato. viti flangia filettata sulla finestra per formare tenuta a parete toracica. Vuoto applicato. microscopia epifluorescente con l'obiettivo 25X. Primo utilizzo di una finestra sottovuoto con epifluorescenza.
1994 Fingar & Wieman ratti 2 costole sono asportato, 1 a. Finestra impiantati e suturato alla parete toracica e la pelle. microscopia epifluorescente con obiettivo 40X. la finestra di sopravvivenza Prima nei ratti.
2000 FuňákOshi & Mitsui Topi Tutta la parete toracica rimosso. anello di aspirazione a vuoto attaccato al polmone destro. La microscopia confocale con un obiettivo 20X. Primo utilizzo della finestra di vuoto nei topi.
2005 Lamm & Glenny ratti Tutta la parete toracica rimosso, 1 a. finestra attaccato al polmone. Riflessione e microscopia epifluorescente con un obiettivo 20X. Primo utilizzo della finestra vuoto in ratti.
2008 Tabuchi & Keubler Topi 3 costole sono resecati, film plastico applicato all'apertura per sigillare il foro nella parete toracica. Aria rimosso tramite catetere intrapleurica. microscopia epifluorescente con l'obiettivo 20X. Prima di usare pellicola di plastica per sigillare l'apertura in parete toracica.

Tabella 1: Un'indagine storica del Develluppo di intravitale Lung Imaging di Windows. Molti nuovi finestre di imaging intravitale polmonari sono stati sviluppati negli anni con il più recente essere miniaturizzato per uso nei topi, impiegando vuoto per la stabilizzazione dei tessuti e raggiungere una risoluzione sufficiente per essere in grado di rivelare dettagli subcellulare.

Supplementare Figura 1: disegno della finestra di imaging vuoto Clicca qui per scaricare questa cifra.

Supplementare Figura 2: Fotografie di Setup vuoto Cliccate qui per scaricare questa cifra.

Supplementare Figura 3: Progettazione drawing della Fase Piastra Inserire Clicca qui per scaricare questa cifra.

Supplementare Figura 1
Supplementare Film 1:. Film di alambicchi in Figura 2A (Tasto destro del mouse per scaricare).

Supplemental Figura 2
Supplementare Movimento. 2: film di ricostruzione 3D mostrato in Figura 2B mostrano differenti angoli di visualizzazione e la progressione nel tempo (Tasto destro del mouse per scaricare).


Film supplementare. 3: film del mosaico 5x5 mostrato in Figura 3A a 15 micron sotto la superficie del polmone (Tasto destro del mouse per scaricare).

Supplemental Figura 4
Supplemental Movie 4:. Film di una singola cella illustrato nella figura 3B mitosi nel polmone (Tasto destro del mouse per scaricare).

Supplemental Figura 5
Film supplementare 5: film di figura 4, pannello di sinistra che mostra occlusione e fsferzante. (Tasto destro del mouse per scaricare).

Supplemental Figura 6
Film supplementare. 6: film di figura 4, pannello di destra che mostra il recupero della definizione vascolare dopo una media di sangue (Tasto destro del mouse per scaricare).

Supplemental file di codice:. Mosaico Stitching Cliccate qui per scaricare questo file.

File di codice supplementare:. Eseguire della media sangue Cliccate qui per scaricare questo file.

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Discussion

Ad alta risoluzione in vivo imaging ottico in combinazione con le etichette funzionali fluorescente come proteine e anticorpi ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della cascata metastatica. Ha permesso la visualizzazione diretta e la quantificazione di cella singola e parametri sub-cellulare nelle cellule tumorali, cellule ospiti e la loro microambiente. Questo l'imaging all'interno del tumore primario ha portato, ad esempio, alla scoperta di microambienti discreti, a sostegno di una invasione crescita o diffusione 6,7. Nel caso di invasione, imaging in vivo ha rivelato il ruolo preferenziale del flusso co-migrational di macrofagi e cellule tumorali intravasation 7,50.

Nei siti secondari come il polmone, comprendere le dinamiche del comportamento delle cellule tumorali nelle prime fasi di metastasi, compresa la fase di pre-semina micrometastasi quando i gruppi singoli e piccole delle cellule tumorali arrivano einteragire con l'endotelio dei vasi sanguigni, sarà realizzata solo con imaging ottico alta risoluzione. modalità di imaging cliniche standard non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare sia la struttura fine del letto capillare o la morfologia e interazione delle cellule con risoluzione di singola cellula. Le tecniche di imaging presentati in questo protocollo svolgere questo compito impegnativo.

Windows Imaging intravitale come quelli elencati nella tabella 1 offerta un vantaggio significativo rispetto preparati polmonari ex vivo, mantenendo una corretta fisiologia del polmone tra cui la perfusione, la connessione al sistema immunitario e che offre più di una semplice visione statica delle dinamiche cellulari. Il vuoto stabilizzato finestre in particolare offrono un livello di stabilità tessuto che permette l'acquisizione di immagini altamente registrati, consentendo tre ricostruzioni tridimensionali (Figura 2B) e la capacità di grande campo dell'imaging vista mosaico (Figure 3A). Insieme, questi forniscono una gamma di punti di vista del polmone, da un tipo istologico vista basso ingrandimento che dà la morfologia dei tessuti, per un sub vista cellulare che può anche rivelare la separazione cromosomica e discriminare le cellule tumorali dormienti e divisori (figura 3b). Canali di acquisizione multipli consentono diversi tipi di cellule e le loro interazioni per essere visualizzate contemporaneamente (Figura 2A).

Mentre il protocollo ci vuole una certa abilità tecnica, la pratica e l'attenzione ad alcuni passaggi critici e punti saranno migliorare il tasso di successo della procedura di imaging e tempi fino a 12 ore ci si può aspettare. E 'fondamentale per assicurarsi che il tessuto polmonare sia ben centrato sopra la finestra (passo 4.25). Questo assicura che il vuoto viene applicato uniformemente e completamente attraverso il tessuto polmonare (passo 4.27). La mancata centrare il tessuto si tradurrà nel movimento del tessuto. L'imbracatura di trattenimento (supplementare Figura 2) viene utilizzato to ridurre il movimento indotto dalla costrizione dei muscoli intercostali durante i respiri naturali l'animale prende. Si deve essere aderente sul mouse, ma non comprimere il torace. Troppa compressione esercita una pressione su tutti i lobi dei polmoni e cuore e risultati in una ridotta vitalità del mouse. Se destrano non si osserva che scorre nel sistema vascolare polmonare dopo l'iniezione (passo 5.8), il tessuto polmonare è o danneggiato da uso improprio durante l'intervento chirurgico o il livello di vuoto è troppo alto. Abbassando il vuoto 0,5-1 pollici Hg può essere tentato di vedere se il flusso viene ripristinato. Se il flusso non viene ripristinato, o se c'è flusso, ma destrano si osserva extravascularly, il tessuto polmonare è stato danneggiato in quella regione e sarà necessario immagine un campo di vista diverso. Manutenzione di flusso di sangue nella regione di imaging è importante garantire che la corretta fisiologia viene misurata. Poiché l'ossigeno è fornito al tessuto dall'interno degli alveoli e non attraverso i vasCulature, ipossia ischemica è improbabile. Eppure, vascolarizzazione unperfused può potenzialmente portare ad alterata ossigeno / CO 2 livelli e eviterà anche leucociti circolanti di raggiungere il tessuto di interesse. Visualizzazione di eritrociti scorre può essere utilizzato come indicatore della funzione polmonare corretta. tessuto polmonare è molto delicata e anche suscettibili di foto-danni. Se dopo il tempo del flusso sanguigno lapse imaging ferma nel campo immaginata, il laser potrebbe essere troppo elevata e successiva imaging altri campi deve essere fatto a potenza inferiore. Abbiamo trovato ~ 10-15 mW a campione per produrre immagini sufficientemente luminose senza fotodanneggiamento quando si utilizza GFP o Clover (che ha quattro volte la luminosità media), le cellule trasfettate. livelli minimi di luminosità per le proteine ​​fluorescenti sono altamente dipendenti parametri del microscopio e livelli di espressione nelle cellule e devono essere testati empiricamente.

In questo protocollo, le cellule tumorali sono etichettati con un brillante cytoplasproteina fluorescente microfono che offre una visione chiara del corpo cellulare e spazi intracellulari che escludono la proteina (cioè nucleo). I macrofagi sono etichettati utilizzando un modello di topo transgenico singenici alle cellule tumorali. Etichettare entrambi i tipi cellulari permette la visualizzazione della loro interazione diretta in tempo reale. La durata prolungata dell'imaging permette quantificazione della frequenza, la durata e l'entità con cui le cellule tumorali interagiscono con macrofagi in un contesto fisiologicamente rilevanti.

Quando eseguito correttamente, questa procedura consente gratuito, multicanale, ad alta risoluzione, l'imaging singola cella movimento nel polmone intatto per periodi fino a 12 ore. L'uso di un obiettivo ad alta numerica apertura obiettiva come il 25X 0.95NA e le capacità del multiphoton per zoom elettronico consente la massima risoluzione di imaging ottico nel polmone visto fino ad oggi.

Intravascolare iniettato fluorescenti, ad alto peso molecolare PE destranorforms il duplice ruolo di etichettatura spazio vascolare e verificarne l'integrità. 155 kDa destrano è utilizzato per prevenire la diffusione attraverso gli spazi interendothelial. Qualsiasi segno di una mancanza di flusso vascolare o di perdite vascolare nello spazio extravascolare indica un danno al tessuto a causa di uso improprio o il vuoto eccessiva.

Infine, le tecniche di elaborazione delle immagini uniche possono essere impiegati che sfruttano l'elevata stabilità spaziale di questo protocollo. Poiché gli eritrociti non marcati e altri leucociti escludono il destrano fluorescente quando passano attraverso i capillari, questo segnale può essere mediati nel tempo per rimuovere il lampeggiante che creano. Questo offre una vista ben definito della vascolarizzazione non possibile altrimenti.

Limitazioni di questa tecnica comprendono sia la natura invasiva della chirurgia, che complica potenzialmente il suo utilizzo per lo studio di malattie che indeboliscono l'animale (ad esempio cancro metastatico fase avanzata,anemia acuta falciforme), e il fatto che l'intervento chirurgico è terminale che limita si usa per un singolo, seppur lunga (fino a 12 ore), sessione di imaging. Inoltre, data la lunga durata della sessione di imaging e il basso di riserva di glicogeno epatico di topi 51, la supplementazione di glucosio può essere dato per evitare potenziali fonti di distorsione negli esperimenti.

Questo protocollo potrebbe potenzialmente essere modificato con iniettabili fluorescente anticorpi sia in sostituzione o in aggiunta al destrano per etichettare altre strutture o tipi cellulari in tempo reale. Ciò contribuirà ad accrescere le capacità di analisi e di sezionare il microambiente tumorale visualizzando direttamente le interazioni delle cellule cellula-ospite tumorali e le dinamiche in tempo reale.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

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Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

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