Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Langsigtet High-Resolution Intravital Mikroskopi i Lung med en Vacuum Stabiliseret Imaging Window

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54603
Automatic Translation
1, 5, 1,2, 1,2,5, 3,4, 3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Abstract

Metastase til sekundære steder såsom lunge, lever og knogler er en traumatisk begivenhed med en dødelighed på ca. 90% 1. Af disse sites, lungerne er den mest vanskelige at vurdere bruge intravital optisk billeddannelse på grund af sin lukkede position i kroppen, delikat natur og afgørende rolle i at opretholde ordentlig fysiologi. Mens kliniske retningslinjer (positron emission tomografi (PET), magnetisk resonans imaging (MRI) og computertomografi (CT)) er i stand til at levere invasive billeder af dette væv, de mangler beslutningen nødvendig for at visualisere de tidligste seeding begivenheder, med en enkelt pixel bestående af næsten tusind celler. Aktuelle modeller af metastatisk lunge seeding postulat, at begivenheder lige efter en tumor celle ankomst er deterministisk for overlevelse og efterfølgende vækst. Det betyder, at i realtid intravital billedbehandling med enkelt celle opløsning 2 er påkrævet for at definere de fænotyper af seeding cells og teste disse modeller. Mens høj opløsning optisk billeddannelse af lungen er blevet udført under anvendelse af forskellige ex vivo præparater, disse eksperimenter er typisk eneste gang-point assays og er modtagelige for artefakter og eventuelle fejlagtige konklusioner på grund af dramatisk ændret miljø (temperatur, overflod, cytokiner osv ) som følge af fjernelse fra brysthulen og kredsløbssygdomme 3. Nyligt arbejde har vist, at time-lapse intravital optisk afbildning af den intakte lunge er muligt ved hjælp af et vakuum stabiliseret scanningsvindue 2,4,5 dog har typiske billedoptagning været begrænset til ca. 6 timer. Her beskriver vi en protokol til udførelse af langsigtet intravital tid-lapse billeddannelse af lungen udnytte sådant vindue over en periode på 12 timer. Time-lapse billedsekvenser opnået ved hjælp af denne metode muliggøre visualisering og kvantificering af celle-celle-interaktioner, membran dynamik og vaskulær perfusion i lungen. Vi yderligere describe et billede behandlingsteknik, som giver et hidtil uset klart billede af lungerne mikrovaskulaturen.

Introduction

Høj opløsning intravital optisk billeddannelse har vist sig at være afgørende for at forstå mange biologiske processer, der giver mulighed encellede og sub-cellulære parametre, der skal måles og kvantificeres. I kræftforskning, har intravital billeddannelse af tumor og stromale celler førte til opdagelsen af mange microenvironmental interaktioner 6-11, der kun er til stede i den intakte dyr.

Opdagelser om mikromiljøer forbundet med intravasation og formidling af tumorceller i brystkræft ved hjælp af enkelt celle opløsning optisk billeddannelse in vivo har endda ført til nye markører for prognose og respons på behandling i brystkræftpatienter 12-16. De bedste imaging teknologier til visning dybt i intakte indre vitale organer er de kliniske retningslinjer (MRI, PET, CT), som tilbyder fremragende udsigt over hele organet og kan afsløre patologier, selv før de producerer kliniske symptomer. De er ikke i stand, however, at afsløre de tidligste stadier af metastaser og cellulære mekanismer kørsel tumor progression på grund af deres mangel på enkelt celle opløsning. Ved den tid lungemetastaser er synlige i disse modaliteter, de er godt etableret og prolifererende. I betragtning af den skøn, at 90% af udbredt tumorceller, der ankommer til lungerne enten ikke overlever 17 eller oprindelig forbliver sovende 18, og den iagttagelse, at de ankommer meget tidligere end tidligere forventet 19, billeddannelse de tidligste trin i ankomst og overlevelse bliver afgørende for forstå processen af ​​metastatisk podning og fornyet tumorvækst på fjerne steder.

Udførelse af disse observationer i lungerne har vist sig imidlertid yderst vanskeligt; det store flertal af billeddannende undersøgelser har udnyttet ex vivo eller eksplantatpartikler præparater 20-23, der kun giver en visning i lungen ved enkeltdoser tidspunkter. Mens disse præparater gør giver nyttig information, de ikke giver en fuldstændig forståelse af interaktionerne, årsag og virkning relationer og dynamik, der opstår mellem de forskellige komponenter i mikromiljø. Manglen på en ordentlig kredsløbssygdomme (og samtidig ubalance af homeostase) og frakobling fra resten af kroppens immunsystem gør det ønsker at validere de konklusioner, disse forberedelser genererer i intakt væv in vivo.

Mange grupper har udført intravital billeddannelse af den intakte lunge 2,4,5,24-33 med wearn og tysk være den første til at kirurgisk udsætte pleural lag 24 og Terry den første til at udnytte en implanterbar imaging vindue 25.

Høj opløsning billeddannelse i lungen er stærkt hæmmet af lungens konstant bevægelse og flere teknikker er blevet udviklet for at overvinde denne begrænsning. Wagner og Filley 27 undersøgte den naturlige bevægelse af hunde lungeog designet deres kirurgiske protokol til at finde deres implanterede vindue over en relativt stationær region, mens Wagner udnyttet vakuum i hans vindue kirurgisk forberedelse til at immobilisere vævet 28. Siden da har en række forskellige teknikker blevet anvendt til at afbilde lungen herunder: bronkier fastspænding, sekventiel apnø og gated billeddannelse, oversamplet erhvervelse, limning af lungen lap og vakuum 34. Hver af disse har sine fordele og ulemper, og ingen teknik har vist sig som overlegen i forhold til en anden 34. F.eks bronchus fastspænding og sekventiel apnø ændrer den normale udveksling af gasser i lungen og kan forårsage atelektase. Gated billedbehandling og oversamplede erhvervelse ikke lider af disse ulemper, men kræver høj hastighed eller specialiseret imaging udstyr ikke bredt tilgængelige. Endelig både limning af lungen og vakuumteknik undgå begge de ovenfor nævnte ulemper, men kan udvise forskydningskraft induceret skade, hvis pleje er ikke taken. I de senere år har vakuum vinduet blevet miniaturiseret og indrettet til brug i mus ved anvendelse af konfokal og multifoton mikroskopi 4,5,33 og fremragende høj opløsning billeddannelse er opnået 2. Tabel 1 opsummerer denne rige historie og fremhæver de papirer, der beskriver hidtil ukendte fremskridt i anvendelsen af ​​intravital lunge imaging vinduer.

Denne protokol beskriver brugen af ​​længere tid-lapse multifoton intravital mikroskopi til billedet metastaser i live, intakt lunge med den højest mulige subcellulære opløsning. Billeder er erhvervet i op til 12 timer ved hjælp af en multifoton mikroskop udstyret med en høj numerisk apertur objektiv og flere fotomultiplikatorrør (PMT) detektorer. Transgene musemodeller udnyttes til fluorescens label native makrofager sammen med fluorescerende høj molekylvægt dextran og fluorescerende protein transficerede tumorceller (at mærke vaskulaturen og tumorceller respectively). Mens dette valg af fluorescensmærkede celler muliggør visualisering af tumorcelle-endotelcelle-makrofag interaktioner og dynamik, vil denne protokol arbejde for enhver stamme af fluorescerende eller ikke-fluorescerende mus. Efter overtagelsen resterende afdrift bevægelse (hvis nogen) elimineres ved hjælp af en Fiji plugin 35,36 og brugerdefinerede makroer tid gennemsnit det vaskulære kanal til at fjerne blinkende forårsaget af umærkede cirkulerende blodceller.

Mens denne protokol fokuserer på billeddannelse metastase, teknikkerne er anvendelige til mange andre biologiske processer observerbare med høj opløsning single-cell imaging i lungen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjer og regler for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Generering fluorescensmærkede musemodel og tumorceller

  1. Fremstilling af 100 ml 0,1% (w / v) bovint serumalbumin / phosphatpufret saltvand (BSA / PBS) buffer ved at blande 0,1 g BSA med 100 ml PBS.
  2. Forbered fluorescensmærkede tumorceller ved stabil transfektion.
    BEMÆRK: Her bruger vi E0771-LG celler, en meget metastatisk derivat af E0771 mus brystadenocarcinom celler 37, der blev isoleret fra metastatiske tumorer udviklet i lungen af C57BL / 6 mus injiceret intravenøst med forældrenes E0771 celler 38.
    1. 24 timer før transfektion, plade 1 x 10 5 EO771-LG celler på en 60 mm vævskulturskål på 2 ml Antibiotic gratis 10% FBS (føtalt bovint serum) DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. På tidspunktet for transfektion, inkuberes 2 ug af det fluorescerende protein vektor med 10 pi transfektionsreagens i 30 minutter før tilsætning 190 pi nedsatte serum medier.
    3. Wash EO771-LG celler med Dulbeccos phosphatbufferet saltvand (D-PBS) én gang, og tilsæt transfektion mix forsigtigt.
    4. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 6 timer.
    5. Vask de transficerede celler og kultur i 2 ml komplet DMEM (10% FBS, 1 mM pyruvat, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) i 2 dage.
    6. Vask cellerne med 2 ml sterilt PBS, tilsættes 500 pi 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C.
    7. Indsamle cellesuspension og bland med mindst 1 volumen komplet DMEM og spin ned ved 280 x g.
    8. Resuspender cellerne i 1 ml komplet DMEM og udvide cellekulturen inden 10 cm vævskulturskål.
    9. Start selektion af transficerede celler ved at tilsætte 700 ug / ml G418 selektive antibiotikum til 8 ml komplet DMEM og kultur i en uge, skiftende medium hver tredje dag.
  3. Berige fluorescerende population fra transficerede celler, der har været under selektion i G418 ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) 39,40.
    1. Vask cellerne med 5 ml PBS, og der tilsættes 1,5 ml 0,25% trypsin.
    2. Inkuber i 2 minutter ved 37 ° C og blandes med mindst et volumen af ​​komplet DMEM.
    3. Indsamle cellesuspension og spin ned ved 280 x g og resuspender cellerne i 1 ml steril 0,1% (vægt / volumen) BSA / PBS-buffer.
    4. Filtrer cellesuspensionen gennem en 40 um mesh og justere volumen til 1 ml med 0,1% BSA / PBS-buffer til sortering.
    5. FACS-sortere de 10% klogeste befolkning baseret på fluorescensspektret ved hjælp af FACS sorteringsanlæg 41.
    6. Kultur de sorterede celler til en anden uge under selektion (700 ug / ml G418 i komplet DMEM).
    7. Genvælge fluorescensmærkede celler ved flowcytometri ved at gentage trin 1.3.1 til 1.3.6 igen.
    8. Efter en anden runde af udvælgelse, Trypsinisér, filter og re-suspendere celler i 0,1% BSA / PBS som beskrevet (trin 1.3.1-1.3.4). Juster koncentrationen til 2 x 10 6 celler / ml til enkelt-celle sortering i plader med 96 brønde under anvendelse af FACS sorteringsanlæg.
    9. Forbered 3-5 96 brøndsplader med 100 ul fuld DMEM til indsamling. For at forbedre overlevelsen efter sortering, tilsættes 100 ul filtreret dyrkningsmedium fra skåle, hvor EO771-LG celler blev dyrket 42.
    10. Efter sortering af cellerne i de plader med 96 brønde, returnere celler til dyrkning i 2 dage (37 ° C, 5% CO2).
    11. Identificer brønde med levedygtige enkelte kloner ved undersøgelse under et omvendt mikroskop ved 5x forstørrelse.
    12. Trypsinisér og udvide levedygtige kloner og fryse cellerne til backup.
      1. Vask brønde med grgrund kloner med 100 pi sterilt PBS. Tilsæt 50 pi 0,25% vægt / volumen trypsin og inkuberes 2 minutter ved 37 ° C. Der tilsættes 50 pi komplet DMEM og overførsel til steril V-bund eller rundbundet 96-brønds plade til spin ned ved 280 x g i 5 min.
      2. Resuspender celler i 100 pi 700 pg / ml G418 komplet DMEM og pladen hver klon i 12-brønds plader. Tilføj 400 pi komplet DMEM med G418 og kultur indtil sammenflydende.
      3. Vask brøndene med 500 pi PBS, tilsættes 100 pi 0,25% trypsin og inkuberes 2 minutter ved 37 ° C. Tilsæt 100 ul komplet DMEM og spin ned i 5 min ved 280 x g. Resuspender celler i 100 ul komplet DMEM med G418 og pladernes celler i 6 brønd plader indtil sammenflydende.
      4. Når sammenflydende, Trypsinisér celler, spin ned og resuspender i 10% DMSO i FBS at fryse celle bestande.
      5. Hold 1/10 af cellesuspensionerne i kultur ved at udplade dem i 100 mm vævskulturskåle til evaluering af deres metastatiske potentiale.
  4. Test metastatiske potentiale af udvalgte kloner.
    1. Trypsinisér og resuspender celler i saltvand til en koncentration på 2,5 x 10 6 celler / ml og injicere 200 pi i C57BL / 6-mus intravenøst gennem halevenen.
    2. Efter 2 uger, indsamle lungevæv som tidligere beskrevet 23 og kvantificere tumorbelastning ved overfladen tælle eller stereologiske metode 43. Vælg kloner med høj metastatisk potentiale for intravital billeddannelse.
  5. Hæv MacBlue (en myeloid specifik promoter kørsel cyan fluorescerende protein (CFP) udtryk (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) reporter mus 44.
    BEMÆRK: Typisk er musene mellem 8 og 12 uger brugt, men mus så tidligt som 7 og så sent som 20 uger er blevet testet til at fungere så godt.

2. multifotonexcitation Microscope Set op og Imaging Forberedelse

BEMÆRK: Selvom denne protokol kan udføres på en hvilken som helst multiphoton mikroskop, det system, der anvendes til at erhverve de data vist i denne protokol er tidligere blevet beskrevet i detaljer 45.

  1. Tænd for alle mikroskop og laser komponenter, herunder to-foton lasere og detektorerne mindst en time før den ønskede billeddannelse tid.
  2. Lige før operation, måle kraften i lyset input til mikroskopet ved at placere lederen af ​​den optiske power meter i strålegangen lige før mikroskopet og justere laser ende hulrum spejl drejeknapper indtil den maksimale lysintensitet ved 880 nm aflæses på den optiske effekt meter.

3. Vacuum System Opsætning

  1. Lim dækglasset i det billeddannende vindue (Supplemental Figur 1) med cyanoacrylat. Tillade mindst 4 timer for limen helt tør.
    BEMÆRK: Dette trin kan også udføres forud for tid.
  2. Skær 100 pi pipette spids på den første linje fra den lille åbning og tilslut ubeskåret ende til den tynde vhedsstøvsugere slange.
  3. Tilslut vakuum ifølge figur 1 og supplerende figur 2.
  4. Med vakuum på og den åbne ende blokeres, justere vakuum regulator til <3 inHg.
    BEMÆRK: Endelig justering af vakuumniveauet vil blive udført af observation af vaskulaturen in vivo.
  5. Påfør en tynd film af olie fedt til undersiden af ​​den billeddannende plade for at forhindre objektivlinsen immersionsmediet i at blive wicked væk af den billeddannende plade.
  6. Placer imaging plade på objektbordet.
    BEMÆRK: Den brugerdefinerede imaging plate (Supplemental figur 3) er en plade af 1/8 "tykke aluminium bearbejdes både til at passe i den fase insert plads og med et gennemgående hul i midten til at holde det billeddannende vindue.
  7. Sæt vakuum vindue i den billeddannende plade med dækglasset ned.
  8. Sterilisere alle overflader og instrumenter, herunder imaging etape tallerken og billedbehandling window med 70% ethanol.
  9. Forbind den afskårne ende af pipettespidsen til vakuum vinduet og tape slangen ned til billeddannelse plade.
  10. Bring det mål tæt på den billeddannende vinduet og placere en stor dråbe vand mellem objektiv og dækglasset.
  11. Sørg for, at der ikke er utætheder fra dækglasset ved at blokere den centrale åbning i vakuum vinduet og kontrollere, at vanddråben mellem målet og dækglas ikke bliver suget.
    BEMÆRK: En gammel stil computermus bolden placeres over vinduet er nyttig til blokering den centrale åbning.

4. Kirurgi

  1. Forbered sterile kirurgiske område.
    1. Læg alle instrumenter inden for rækkevidde. Sterilisere alle overflader og instrumenter, herunder kirurgiske område, og kirurgiske værktøjer med 70% ethanol.
  2. Bind en 3 inch længde på 2-0 sutur til kateteret, ¼ tomme over bøsningen med en dobbelt knude.
  3. Forbered hale vene kateter folgende den offentliggjorte protokol ved Harney et al. 46.
  4. Via en infrarød (IR) varmelampe, opvarme dyret i sit bur for ~ 5 min at øge blodgennemstrømningen i halevenen og til støtte i kateteret. Det anbefales at holde dyret opvarmes til fysiologiske temperaturer i hele den kirurgiske procedure ved hjælp af enten en varmelampe eller en opvarmning pad.
  5. Bedøver dyret med 5% isofluran og kontrollere, at der ikke er nogen reaktion på en tå knivspids.
  6. Påfør oftalmisk salve til øjnene af dyret.
  7. Ansøg rigtige spørgsmål lotion til 10-30 sek at fjerne hår fra den venstre side af dyret; fra midterlinjen af ​​brystet til ¼ af ryggen og fra armhulen til lige under brystkassen.
  8. Rens eventuelt overskydende lotion og sterilisere udsat hud med 70% alkohol.
  9. Vedhæft en steril sprøjte fyldt med PBS til halevenen kateteret og indsætte og bånd på plads efter den offentliggjorte protokol ved Harney et al. 46. Sørg for, at båndet er sikkert levet op til selve nål og er ikke fri i mellemrummet mellem halen og båndet.
  10. Intubere musen efter enten den offentliggjorte protokol af Das et al. 47 eller ved DuPage et al. 48
  11. Tænd for ventilatoren og sæt den til at levere 135 vejrtrækninger per minut og 200 pi isofluran-ilt-blanding.
  12. Slut tracheale kateter til ventilatoren.
  13. Flyt musen til det kirurgiske område. Vær meget forsigtig ikke at fordrive kateteret.
  14. Bind 2-0 suturen omkring snuden af ​​musen under den forreste tænder.
  15. Tape kateteret til snuden.
  16. Tape venstre forben til kateteret for at holde det ud af det kirurgiske område.
  17. Sænk isofluran anæstesi til en vedligeholdelse niveau på 2,5% og kontrollere, at der ikke er nogen reaktion på en tå knivspids.
  18. Brug af skarp saks, fjerne 1 cm2 af huden over venstre bryst væg.
  19. Lift than brystfedtpude og ætse eventuelle udsatte blodkar med kautering pen.
  20. Resektion fedt pad ved at skære med en skarp saks.
  21. Fjern muskellag ned til brystkassen ved at skære med en skarp saks. Pas på ikke at skære armhulen vene kører i bunden af ​​musens forben.
  22. Brug pincet til at gribe og løfte det 6. ribben. Brug af en skarp saks holdes i en flad vinkel (~ 5 °) afskårne ribben nær kanten af ​​åbningen i huden. Vær meget forsigtig med ikke at røre den udsatte lungevæv.
  23. Widen åbningen i brystvæggen for at blotlægge hele lungelap ved at fjerne fire på hinanden følgende ribber.
    Bemærk: Hold åbningen mindst 5 mm væk fra brystbenet for at undgå hjerte.
  24. Løft forsigtigt musen ved at tage fat i halen og tracheal kateter og flyt musen til mikroskopet imaging scenen.
  25. Med vakuum slukket, fylde kammeret af vakuum vindue med PBS.
  26. Vend musen og placere den udsattelunge over vakuumkilden imaging vinduet.
  27. Drej langsomt på vakuum til ca. 3-5 inches kviksølv ved anvendelse kugleventilen.
  28. Placer en fastholdende sele fremstillet af tissuepapir foldet på midten to gange over brystet af musen og tape til bordpladen som vist i Supplemental figur 2.
  29. Clip låret sensor pulsoximeter til dyrets øvre lår og start softwaren.
  30. Placer miljømæssige kammer på scenen og tænd for varme for at opretholde musen ved en fysiologisk temperatur.
  31. Reducer niveauet for isofluran til 1-1,5% for at opretholde anæstesi og vedligeholde blodgennemstrømningen.

5. Intravital Imaging

  1. Bring 25 x 0,95 numerisk åbning (NA) objektivlinse nær til dækglasset og tilføje en stor dråbe vand mellem dem.
  2. Ved hjælp af epifluorescens tilstand, se FITC kanal og bringe lungevævet i fokus.
  3. Hvis det ikke gøres før operationen, inject tumorceller gennem halevenen kateteret.
    1. Afbryd PBS sprøjten fra halevenen kateteret.
    2. Indlæse en steril sprøjte med 100 pi tumor cellesuspension (2 x 10 7 celler / ml i PBS maksimum).
      BEMÆRK: Dette trin kan udføres på forhånd at studere kræftcelle ankomst til lungen på forskellige tidspunkter.
    3. Forbind sprøjten med tumorceller på halevenen kateteret.
    4. Injicer langsomt tumorcellerne i halevenen.
    5. Afbryd sprøjte med tumorcellerne fra halevenen kateteret.
    6. Tilslut PBS sprøjten til halevenen kateteret.
      BEMÆRK: Identificer placeringen af ​​alle tumorcellerne før indsprøjtning af dextran som det bliver svært at skelne tumorcellerne fra dextran signal via øjet efter injektion.
  4. Find tumorceller til billedet
    1. Til billeddannelse individuelle tumorceller, finde alle tumorceller og registrere deres placeringer med the multipunkt panel af softwaren.
      1. Find alle områder af at billedet ved at observere tumorcellerne i mikroskopet okular.
      2. I softwaren, skifte til multipunkt panelet ved at klikke på knappen Multi-Point og gemme placeringen af ​​cellen ved at klikke på knappen Tilføj holdning.
    2. For mosaik billedbehandling, lokalisere oprindelsen af ​​mosaik og indstille billeddiagnostiske koordinater
      1. Find en position i øverste venstre hjørne af struktur, der skal indfanges.
      2. Nul x-, y- og z-koordinaterne for trin ved at trykke på knappen "Zero" på scenen controller.
      3. Læg op den relevante liste over mosaik koordinater ved at klikke på "Load" -knappen og vælge listen.
        BEMÆRK: Et eksempel liste for en 2 x 2 mosaik med en 20% overlapning af en 500 um synsfelt ville være: pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0400), Pos. 4 = (400.400).
  5. Fjern sprøjten wi'te PBS i halevenen kateteret og erstatte med sprøjten med dextran.
  6. Langsomt injicere op til 100 pi 20 mg / ml 155 kDa rhodamin-dextran opløstes i PBS i musen via halevenen kateteret efterfulgt af injektion af 50 pi sterilt PBS for at skylle den linje. Må ikke indføre nogen bobler i linjen. Når det er nødvendigt, injiceres dextran mindst en time efter cancercelle injektion, således at det samlede volumen administreret til musen ikke overstige 4 ml / kg / time.
  7. Opsæt imaging parametre.
    1. Skift mikroskop til multifoton tilstand.
    2. Indstil zoom til en faktor 2X ved at klikke på knappen tidsbestemmelsessignaler og opdatering af Zoom Factor feltet.
    3. Juster laser magt til ~ 10% (~ 10-15 mW ved prøven) ved at klikke på knappen Detektorer og Laser og derefter justere skyderen Tsunami Power til 10.
  8. Billede hvert sted at kontrollere tilstedeværelsen af ​​tumorceller og visualisere strømmen og integritet vasculature.
    BEMÆRK: Fartøjer skal vises fuldt perfunderet med flydende erythrocytter og fluorescerende dextran bør være indeholdt i skibene uden lækage til de ekstravaskulære rum. Ca. 10 - Der forventes 20 tumorceller at være inden for klare åbning i vakuum vinduet.
  9. Juster start dybden af ​​hvert sted, der skal afbildes.
    1. For hvert sted, justere Z position ved at dreje fokus knop på scenen controller at afbilde øverste skive af tumorcellen.
    2. Placer cellen i midten af ​​synsfeltet.
    3. Klik på knappen Multipoint, klik på positionen for synsfeltet for at fremhæve det, og klik på Tilføj efterfulgt af knappen Slet for at erstatte cellens lagrede position i multipoint listen.
    4. observere visuelt den relative lysstyrke tumorcellen i hver position.
  10. Gem de nye placeringer af hver af cellerne ved at klikke på knappen Gem i Multipoint panelet end angive et filnavn.
  11. For billeddannelse af individuelle tumorceller, vælge tre celler på ca. tilsvarende lysstyrke og slette alle andre steder fra multipoint listen ved at klikke på deres placering på listen og derefter klikke på knappen Slet.
  12. Klik på knappen Detektorer og Laser og justere skyderne for PMT gevinst på de grønne og røde kanaler 45, således at signalerne er under mætning.
  13. Juster skyderen for den blå kanal 45, således at makrofager synes cyan.
    BEMÆRK: Enhver anden harmoniske signal vises kun i den blå kanal og kan adskilles fra de cyan makrofager ved at følge kanal subtraktion procedure det tidligere beskrevne 45.
  14. Indstil z-stak starte dybde til 0 um og enden dybde til 24 um ved at flytte z fase til den placering og klikke på Start og End knapperne hhv.
    BEMÆRK: Celler i denne dybde vil blive visualiseret med det bedste signal tilstøj og opløsning.
  15. Indstil z trinstørrelse til 3 um.
  16. Indstil de billeddannende parametre følgende parametre tidligere beskrevet 45,49.
    1. For billeddannelse af individuelle tumorceller, skal du klikke på knappen tidsbestemmelsessignaler og derefter indtaste 4 V ind zoomfaktoren feltet (svarende til en zoom faktor 1,5 x), indtast 3 i feltet frame gennemsnit og klik på Time-Lapse knap og indtast 10 ind i Time-lapse felt.
      BEMÆRK: Disse indstillinger erhverve en ramme hver 3 sek.
    2. For mosaik billedbehandling, skal du klikke på knappen tidsbestemmelsessignaler og indtaste en zoom faktor på 1,5 V (svarende til en zoom faktor 4X), indtast 3 i antallet af frame gennemsnit, og klik på knappen Time-Lapse og indtast 10 i tids- bortfalder tidsforsinkelse felt.
      BEMÆRK: Disse indstillinger erhverve en ramme hver 3 sek.
  17. Aktiver multipoint, z-stack og t-lapse imaging tilstande ved at klikke på deres knapper.
  18. Tryk på knappen Optag for at hente billeder.
    IKKEE: Lunge væv er meget sart og modtagelig for foto-skader. Hvis der efter tidsforskydningen billeddannelse blodgennemstrømningen stopper i det afbildede område, laseren er mest sandsynligt for høj og efterfølgende billeddannelse af andre felter skal ske på lavere effekt.
  19. Hver 30-45 min, langsomt injicere 50 pi PBS eller saltvand for at opretholde hydrering af dyret.

6. Eutanasi

  1. Øg isofluran til 5%.
  2. Hold dyret under 5% isofluran indtil 30 sek efter at den ophører med at trække vejret og fjerne dyret fra scenen.
  3. Udfør cervikal dislokation at sikre fuldstændig eutanasi.

7. Image Analysis

  1. For enlige celle billeddannelse eksperimenter:
    1. Indlæs billeder i Fiji og formatere dem som en Hyperstack.
    2. For hver z-skive i Hyperstack, spille tid bortfalder film og se efter resterende xy bevægelse. Hvis der findes residual xy bevægelse, anvende plugin kaldet StackReg 36 til stakken tileliminere bevægelsen.
  2. For mosaik billedbehandling eksperimenter:
  3. Indlæs billeder i Fiji og sy dem sammen ved at åbne Mosaic Stitching makro (Supplerende kode fil Mosaic Stitching) og indtaste oplysninger om billederne som den mappe, filen basisnavn det, at antallet af x og y felter i mosaikken, og antallet af skiver og tidspunkter.
    BEMÆRK: På grund af hvordan Java fortolker mapper, skal mappenavne have to omvendte skråstreger som undermappe separatorer. På grund af begrænsninger i den indbyggede plugin Parvis Stitching, skal basen filnavne ikke indeholde bindestreger.
  4. For at få et klart overblik over grænserne for karrene, gennemsnit sammen alle tidspunkter til blod kanal til et enkelt billede, og derefter kopiere billedet som baggrund for hver ramme af filmen af ​​de andre kanaler.
    BEMÆRK: Dette gøres ved blot at køre Udfør Blood Gennemsnitsperiode makro (Supplerende kode fil Udfør Blood Gennemsnitsberegnings).

    5. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at demonstrere den type resultater, der kan opnås med denne fremgangsmåde, vi injicerede E0771-LG tumorceller mærket med det fluorescerende protein Clover i halevenen af MacBlue mus 44 ved varierende tidspunkter før operation. Efter operationen blev 155 kD rhodaminmærket dextran injiceret IV for at markere vaskulaturen og time-lapse billeddannelse blev udført.

Når billeddannelse mus 24 timer efter injektion, enkelte celler er synlige inde i vaskulaturen, interagere med makrofager og monocytter. Et eksempel på dette er vist i figur 2A (Supplemental Movie 1). Her et enkelt optisk sektion af en ensom tumor celle (grøn) 12 um dyb indgivet i lungen kar afbildes over 5 timer og 20 min, da det forbigående interagerer med en resident makrofag (cyan). Vaskulaturen er mærket af høj molekylvægt dextran. Stabiliteten afbilleddannelse er således, at sekventiel z-stak billeddannelse af marken kan erhverves og en 3 dimensional rekonstruktion kan foretages (figur 2B, Supplemental Movie 2).

Anvendelse af mikroskop indstillinger, der er beskrevet i protokollen for mosaik billeddannelse tillader billeddannelse af strukturer større end en enkelt synsfelt. For eksempel, figur 3 viser erhvervelse af en enkelt metastatisk læsion, 12 dage efter injektion. Dette 5 x 5 mosaik viser en 890 um synsfelt end 205 minutter ved 15 (figur 3A, venstre panel; Supplemental Movie 3) og 25 um (figur 3A, højre panel) under overfladen af lungen. Trods det store synsfelt, den høje opløsning af de underliggende rammer komponere mosaikken muliggør opsamling af subcellulære begivenheder såsom mitose af en enkelt celle som det fremgår af kromosomal separation (figur 3B, supplerendeMovie 4).

Intravaskulær injektion af en høj molekylvægt fluorescensmærket dextran resulterer i mærkning af de vaskulære lumen, men umærket cirkulerende erythrocytter og leukocytter okkludere dextran. I de små kapillærer i lungen, okklusionen er komplet resulterer i en inddækning af dextranen signal og et tab af definition af vaskulaturen grænser (figur 4, til venstre; Supplemental Movie 5). Den høje rumlige stabilitet, som denne protokol giver tid midling af blodet kanal, uden sløring, dermed genoprette de midlertidige tilstopninger. De andre signal-kanaler kan derefter oven på vaskulaturen at give et klart billede af fartøjet grænser (Figur 4, højre, Supplerende Movie 6).

figur 1
Figur 1:. Layout af Vacuum System House vakuum udnyttes, og indstillet til defineret niveau med et vakuum regulator. En fange kolbe forhindrer forurening af regulatoren og vakuum system ved kropsvæsker. Et tyndt fleksibelt rør transporterer vakuum til en pipettespids skåret til at passe ind i vakuum porten på scanningsvindue. Den billeddannende Vinduet er egnet til en forsænket rille i imaging plate bevare sin positionelle stabilitet med hensyn til mikroskopet objektivlinsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Single Cell Imaging i Lung (A) Still fra en tid bortfalder film af en enkelt tumor celle i kapillære sengen af lungen 24 timer efter hale vene.indsprøjtning. (Rød = Blodkar, Grøn = tumorceller, Cyan = makrofager) (B) Stabil billedbehandling giver tre dimension rekonstruktion af billeddata over tid. Blodkar har været tid midlet for klarhed. (Rød = Blodkar, Grøn = tumorceller, Blue = makrofager). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Stabilitets- af Lung Giver høj opløsning, stor-området View Imaging i Lung af Sequential Køb og Stitching Sammen af multipel lav forstørrelse Fields (A) 5 x 5 mosaik viser en 890 um synsfelt. en metastatisk læsion i lungen 12 dage efter haleveneinjektion af tumorceller taget ved 15 um under lungeoverfladen(Venstre panel). Højre panel viser det samme metastatisk læsion på 25 um under lungeoverfladen. (B) De enkelte felter i høj opløsning afslører subcellulære processer såsom kromosomal alignment (gule pile) og separation (røde pile) under celledeling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: intravaskulær injektion af fluorescensmærkede højmolekylær Dextran Marks lumen vaskulaturen Undtagen når Umærket erythrocytter og andre cirkulerende celler okkluderer fluorescenssignalet (A) okklusionsenheder resulterer i en ufuldstændig mærkning, der bevæger sig i tiden, hvilket resulterer i en blinkende effekt tilsløring. fartøjet grænser. (B) Den højerumlige stabilitet af vakuum vinduet kan blodet kanal til at være tid gennemsnit, udfylde de midlertidige tilstopninger og klart definere fartøjet grænser. De andre kanaler derefter overlejret uden gennemsnit. Klik her for at se en større version af dette tal.

År Første Forfatter / Sidste Forfatter Dyr Kirurgi Type af Imaging Noter
1926 Wearn & German Katte Brystvæggen skåret ned til pleural lag. Anden åbning foretaget gennem mellemgulvet ned til lungehinden til belysning. Lysfeltsbillede mikroskopi. Først "vindue" gennem pleural væg.
1939 Terry Katte Ribben er adskilt, 1 i. Vindue implanteret, luft fjernes fra brystkassen med vakuum. Kikkert og hud mikroskopet med polariseret lys. Først implanteret optiske vindue. Brugte vakuum til at trække væv til vinduet.
1963 de Alva & Rainer Kaniner & Dogs En eller to ribber er resekteret og 1 i. Vindue indsat og sutureres til brystvæggen. Hud blev lukket over vinduet og dyr tilladt at helbrede. Før billeddannelse, blev huden dissekeret for at blotlægge vinduet. Brugte højhastigheds stroboskopisk cinematografi gennem en lav mag (11X) mål. Første overlevelse vindue.
1965 Wagner & Filley Hunde Højre forben fjernet, en ribbe snit og vindue indsat og sutureres. Refleksion mikroskopi med 22X mål. Først relativt bevægelse fri vindue uden vakuum.
Wagner Hunde Én ribbe afskæres, 3 i. Vindue implanteret. Gevind flange skruer på vinduet for at danne tætning til brystvæggen. Brightfield mikroskopi med høj forstørrelse 100X fordybelse olie mål. Første vindue til at bruge vakuum for at stabilisere væv bevægelse.
1992 Groh & Goetz Kaniner En ribbe resektion, 1.2 i. Vindue implanteret. Gevind flange skruer på vinduet for at danne tætning til brystvæggen. Vakuum påført. Epifluorescens mikroskopi med 25X objektiv. Første anvendelse af et vakuum vindue med epifluorescens.
1994 Fingar & Wieman Rotter 2 ribber er resektion, 1 i. Vindue implanteret og sutureres til brystvæggen og hud. Epifluorescens mikroskopi med 40X objektiv. Første overlevelse vindue i rotter.
2000 FunakOshi & Mitsui Mus Hele brystvæggen fjernet. Vakuumsug ring fastgjort til højre lunge. Konfokal mikroskopi med en 20X objektiv. Første brug af vakuum vindue i mus.
2005 Lamm & Glenny Rotter Hele brystvæggen fjernet, 1 i. Vindue fæstnet til lungen. Refleksion og epifluorescens mikroskopi med en 20X mål. Første brug af vakuum vindue i rotter.
2008 Tabuchi & Keubler Mus 3 ribber er resektion, plastfilm påført på åbningen for at forsegle hullet i brystvæggen. Air fjernet via intrapleural kateter. Epifluorescens mikroskopi med 20 x objektiv. Første til at bruge plastfolie for at forsegle åbningen i brystvæggen.

Tabel 1: Historisk Undersøgelse af Devellingen af Intravital Lung Imaging Windows. Mange nye intravital lunge imaging vinduer er blevet udviklet i årenes løb med den seneste bliver miniaturiseret til brug i mus, beskæftiger vakuum til stabilisering væv og opnå høj nok opløsning til at være i stand til at afsløre subcellulær detaljer.

Supplerende Figur 1: Design Tegning af Vacuum Imaging Window Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende Figur 2: Fotografier af Vacuum Setup Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende Figur 3: Design Drawing Stage Plate Indsæt Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende Figur 1
Supplerende Movie 1:. Film af stillbilleder i figur 2A (Højreklik for at downloade).

Supplerende Figur 2
Supplerende Move 2:. Film af 3D-rekonstruktion vist i figur 2B viser forskellige synsvinkler og progression over tid (Højreklik for at downloade).


Supplerende Movie 3:. Film af 5x5 mosaik vist i figur 3A ved 15 pm under lunge overflade (Højreklik for at downloade).

Supplerende Figur 4
Supplerende Movie 4:. Film af en enkelt celle er afbildet i figur 3B undergår mitose i lungen (Højreklik for at downloade).

Supplerende Figur 5
Supplerende Movie 5: Film i figur 4, venstre panel viser okklusion og fsurring. (Højreklik for at downloade).

Supplerende Figur 6
Supplerende Movie 6:. Film i figur 4, højre panel viser genopretning af vaskulær definition efter blod gennemsnit (Højreklik for at downloade).

Supplerende kode fil:. Mosaic Stitching Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kode fil:. Udfør Blood Midlings- Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Høj opløsning in vivo optisk billeddannelse kombineret med fluorescensmærkede funktionelle tags såsom proteiner og antistoffer har dramatisk øget vores forståelse af den metastatiske kaskade. Det har gjort det muligt direkte visualisering og kvantificering af enkelt-celle og sub-cellulære parametre i tumorceller, værtsceller og deres mikromiljø. Denne billeddannelse inden for den primære tumor har ført, eksempelvis til opdagelsen af diskrete mikromiljøer, som understøtter enten vækst invasion eller spredning 6,7. I tilfælde af invasion, har in vivo-billeddannelse afslørede præferentiel rolle co-migrational streaming af makrofager og tumorceller i intravasation 7,50.

I sekundære sites som lungerne, forståelse dynamikken i tumor celle adfærd på de tidligste stadier af metastase, herunder pre-mikrometastase såning fase, hvor enkelt og små grupper af tumorceller ankommer oginteragere med blodkarret endotel, vil kun opnås under anvendelse af høj opløsning optisk billeddannelse. Standard kliniske afbildningsmodaliteter har ikke beslutning er nødvendig for at visualisere enten den fine struktur af den kapillære seng eller morfologi og interaktionen af ​​celler ved enkelt celle opløsning. De billeddiagnostiske teknikker præsenteres i denne protokol udføre denne udfordrende opgave.

Intravital billeddiagnostiske vinduer som de i tabel 1 tilbud en betydelig fordel i forhold ex vivo lunge præparater ved at opretholde en ordentlig lunge fysiologi herunder perfusion, tilslutning til immunsystemet og tilbyde mere end blot en statisk visning af cellulære dynamik. Vakuummet stabiliserede vinduer navnlig tilbyde et niveau af væv stabilitet, som tillader erhvervelse af stærkt registrerede billeder, så tredimensionelle rekonstruktioner (figur 2B) og evnen til stort synsfelt mosaik billeddannelse (figure 3A). Tilsammen disse giver en række synspunkter i lungerne, fra en histologisk type, lav forstørrelse, som giver vævet morfologi, til en sub cellulær at selv kan afsløre kromosomal separation og diskriminere hvilende og deler sig tumorceller (figur 3B). Flere erhvervelseskanaler tillade flere celletyper og deres samspil skal visualiseres samtidigt (figur 2A).

Mens protokollen tager nogle tekniske færdigheder, praksis og opmærksomhed på nogle kritiske trin og punkter vil forbedre succesraten for proceduren og billedbehandling på op til 12 timer kan forventes. Det er afgørende at sikre, at lungevævet er godt centreret over vinduet (trin 4.25). Dette sikrer, at vakuummet påføres jævnt og fuldstændigt tværs lungevævet (trin 4.27). Manglende centrere væv vil resultere i bevægelse af vævet. Den fastholdende sele (Supplemental Figur 2) anvendes to reducere bevægelse fremkaldt af konstriktion af mellemsiddende muskler i løbet af de naturlige vejrtrækninger dyret tager. Den skal sidde over mus, men ikke komprimere brystet. For meget kompression lægger pres på alle de kamre af lungerne samt hjertet og resulterer i en reduceret levedygtighed af musen. Hvis ikke overholdes dextran flyder i lungerne kar efter injektion (trin 5.8), er lungevævet enten beskadiget af forkert håndtering under kirurgi eller vakuum er for højt. Sænkning af vakuum ved .5-1 tommer Hg kan forsøges at se om strømning er genoprettet. Hvis flowet ikke genoprettes, eller hvis der er flow, men dextran observeres ekstravaskulært, lungevæv er blevet beskadiget i dette område, og det vil være nødvendigt at billedet et andet synsfelt. Opretholdelse af passende blodgennemstrømning i imaging region er vigtig for at sikre passende fysiologi der måles. Da oxygen tilføres til vævet fra indersiden af ​​alveolerne og ikke gennem vasculature, iskæmisk hypoxi er usandsynlig. Alligevel kan unperfused vaskulatur potentielt føre til ændret oxygen / CO 2 plan og vil også forhindre cirkulerende leukocytter i at nå vævet af interesse. Visualisering af strømmende erythrocytter kan anvendes som en indikator for korrekt lungefunktion. Lungevæv er meget sart og også modtagelige for foto-skader. Hvis der efter tidsforskydningen billeddannelse blodgennemstrømningen stopper i det afbildede område, laseren er mest sandsynligt for høj og efterfølgende billeddannelse af andre felter skal ske på lavere effekt. Vi har fundet ~ 10-15 mW ved prøven for at frembringe tilstrækkeligt lyse billeder uden lysskader ved brug af enten GFP eller Clover (som har fire gange middel lysstyrke) transficerede celler. Minimum lysstyrke niveauer for de fluorescerende proteiner er meget afhængig af mikroskop parametre og udtrykket niveauer i cellerne og skal testes empirisk.

I denne protokol, er tumorceller mærket med en lys cytoplasmic fluorescerende protein, der giver et klart overblik over cellelegemet og intracellulære rum, der udelukker proteinet (dvs. kerne). Makrofager er mærket ved anvendelse af en transgen musemodel syngen til tumorcellerne. Mærkning begge celletyper muliggør visualisering af deres direkte interaktion i realtid. Den udvidede varighed imaging tillader kvantificering af frekvens, varighed og omfang, som kræftceller interagerer med makrofager i en fysiologisk relevant kontekst.

Når udført korrekt, denne procedure giver bevægelse gratis, flere kanaler, høj opløsning, single-cell imaging i ubeskadiget lunge i perioder på op til 12 timer. Anvendelsen af ​​en høj numerisk apertur objektivlinse såsom 25X 0.95NA og multifoton evner til elektronisk zoom giver den højeste opløsning optisk afbildning i lungen set til dato.

Intravaskulært indsprøjtet fluorescerende, høj molekylvægt dextran performs den dobbelte rolle mærkning af vaskulære rum og kontrollere dens integritet. 155 kDa dextran anvendes til at forhindre diffusion gennem interendothelial rum. Ethvert tegn på manglende vaskulær flow eller af vaskulær lækage i det ekstravaskulære rum indikerer skade på vævet som følge af forkert håndtering eller overdreven vakuum.

Endelig kan unikke billedbehandlingsteknikker anvendes, som udnytter den høje rumlige stabilitet af denne protokol. Da de ikke-mærkede erythrocytter og andre leukocytter udelukker fluorescerende dextran, når de passerer gennem kapillærerne, kan dette signal gennemsnit over tid til at fjerne den blinkende, at de skaber. Dette giver en veldefineret billede af vaskulaturen ikke muligt andet.

Begrænsninger af denne teknik indbefatter både invasive karakter af kirurgi, som potentielt komplicerer dets anvendelse til undersøgelse af sygdomme, der svækker dyret (f.eks sent stadium metastatisk cancer,akut seglcelleanæmi), og det forhold, at kirurgi er terminal, som begrænser den bruge til en enkelt, omend lang (op til 12 timer), imaging session. Endvidere på grund af den lange varighed af imaging session og den lave hepatisk glykogen reserve af mus 51, kan gives glukose tilskud for at undgå potentielle kilder til skævhed i eksperimenter.

Denne protokol kan potentielt være modificeret med injicerbare fluorescensmærkede antistoffer enten i stedet for eller ud over dextranen for at mærke andre strukturer eller celletyper i realtid. Dette vil udvide funktionaliteten til at analysere og dissekere tumor mikromiljø ved direkte at visualisere tumor celle-vært celle-interaktioner og dynamik i realtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Tags

Cancer Research Intravital billedbehandling vakuum vindue multifoton mikroskopi lunge tidsforskudt kræft biologi
Langsigtet High-Resolution Intravital Mikroskopi i Lung med en Vacuum Stabiliseret Imaging Window
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T.,… More

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter