Summary
이 원고는 자유 비행 꿀벌에 대한 간단한 비 침습적 방법뿐만 아니라 억제 꿀벌의 정확한 지역화 된 처리 수 있도록 더 많은 침략 변종을 포함, 꿀벌에 약리 에이전트를 관리하기위한 여러 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
꿀벌은 놀라운 학습 능력 및 고급 사회적 행동과 의사 소통을 보여줍니다. 또한, 뇌는 작은 시각화하고 연구하기 쉽다. 따라서, 꿀벌은 오랫동안 사회와 자연 행동의 신경 기초를 공부 신경 생물 학자와 neuroethologists 사이에 선호하는 모델이었다. 이는 동작을 방해하지 꿀벌을 연구하기위한 실험 방법이 검토되고 있다는 것이 중요하다. 이 때문에 꿀벌의 약리학 적 조작을위한 기술의 범위를 개발할 필요가 있었다. 이 논문에서 우리는 약리 에이전트의 광범위한 절제 또는 자유 비행 꿀벌을 치료하는 방법을 보여줍니다. 이 중 하나를 전신 또는 국소 방식으로 정확한 약물 전달을 허용 모두 경구 및 국소 치료와 같은 비 침습적 방법뿐만 아니라 더 침습적 인 방법을 포함한다. 마지막으로, 우리는 각 방법의 장점과 단점을 토론하고 설명일반적인 장애물과 최선의 방법을 극복하는 방법. 우리는 생물학적 질문이 아닌 다른 방법으로 주위에 실험 방법을 적응의 중요성에 대한 논의와 결론 지었다.
Introduction
카를 폰 프리 슈는 자신의 춤 언어 (1)를 밝혀 때문에, 꿀벌은 동물의 행동 및 신경 생물학 연구자를위한 인기있는 연구 종을 남아있다. 최근 새로운 분야의 수많은 이러한 두 필드 및 그들과 함께 제기 한 여러 가지 다른 분야 (예를 들면, 분자 생물학, 유전학, 컴퓨터 과학)의 교차점에 나왔다. 이것은 문제가 신경계 내에서 활동의 결과 방법을 이해하기위한 새로운 이론과 모델의 신속한 개발을 주도하고있다. 때문에 독특한 라이프 스타일, 풍부한 행동 레퍼토리, 실험 및 약리 조작의 용이성, 꿀벌이 혁명의 최전선에 남아있다.
꿀벌은 같은 그 기본 학습과 기억 2, 3, 결정 (4)을, 후각 5, 시각 처리 (6)과 같은 기본적인 신경 생물학적 문제를 연구하는 데 사용하고있다. 최근 몇 년 동안, 혼11, 잠 12 13 노화, 또는 메커니즘 마취 (14)의 기초 - EY 꿀벌도 같은 중독성 약물 (7)의 영향으로 일반적으로 의학 연구를 위해 예약 주제를 연구하기위한 모델로 사용되어왔다.
고전적인 유전자 모델 생물에 대한 달리 (예를 들어, D. melanogaster의, 선충, M.의의 musculus)이 현재 15을 변경하더라도 꿀벌의 신경 기능을 조작 할 수 거의 유전 적 도구가 있습니다. 대신, 꿀벌 연구는 주로 약리 조작에 의존하고있다. 이것은 매우 성공적이었다; 그러나, 꿀벌의 연구는 다양한 약물 투여 방법의 범위가 필요되도록한다. 꿀 꿀벌 연구는 다른 분야와 배경을 가진 연구자들에 의해 연구되고, 매우 다양한 문제를 해결하고, 실험 방법의 다양한 사용합니다. 많은 rese아치 질문에 자유롭게 그들의 식민지, 또는 두 가지 모두에 상호 작용이 될 자유 비행에 꿀벌을 필요로한다. 이것은 어려운 개별 실험 동물을 추적 할 수 있도록하고, 억제 또는 삽관 실현성하게 할 수있다.
꿀벌 연구의 다양성을 수용하기 위해, 약물 전달 방법의 다양한 약물 동력 학적 및 약력 학적 프로필에있어서의 침입, 및 신뢰성 문제의 패러다임에 맞는 것을 보장하면서 강력하고 유연한 관리를 허용 필요하다. 때문에 이러한 다양한 요구, 대부분의 연구 그룹은 그들 만의 독특한 약물 투여 방법을 개발했습니다. 지금까지이 꿀벌 연구 커뮤니티의 힘이었다; 이는 다른 환경에서 동일한 약제의 투여 방법을 가능 어레이의 개발을 유도 하였다. 여기에 우리의 목표는 꿀벌의 약리 조작에 대해 하나의 표준화 된 방법을 개발하는 것이 아니라 방법을 강조하지 않습니다 그특히 성공적인 것으로 입증, 도움 연구자들은이를 채택했다. 우리는 기본 작동 방식의 원칙뿐만 아니라, 자신의 장점과 단점에 대해 설명합니다.
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Protocol
마구 꿀벌 1. 약국 (FDA)
- 구강 치료
- 물 500 ㎖로 크로즈 257g을 혼합하여 1.5 M 수크로오스 용액을 제조 하였다 (이것은 끓는 물에 자당이 양을 용해 쉽다). 사용할 때까지 4 ℃에서 자당 솔루션을 저장합니다.
참고 : 자당 솔루션은 특정 미생물에 대한 매우 친절 환경을 제공하고, 따라서 쉽게 오염 및 꿀벌에 싫은된다. 벌크 수크로오스 용액을 분취하고 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. - 적절한 약물 투여 량을 결정합니다 (아래의 토론 섹션에서 해결 그것을 달성하는 방법), 및 예를 들어, 20 μg의를 제공하기 위해 (선호하는 약물 투여 량은 20 μL에 용해되도록 자당 용액을 용액을 제조하는에서 약을 희석 1 ㎎ / ㎖의 비). 하네스 꿀벌 Felsenberg 등에 따라. (2011) 16. 오 꿀벌이 더 이상 강조되지 않도록하기 위해 적어도 12 시간 약물 치료 전에이 단계를 수행약액이 제공 될 때 활용에서 유타.
주 : 자세한 일관된 결과를 들어,이 O / N (34 ° C 및 70 % 습도 인큐베이터에서 무력화 꿀벌을 배치하여) 꿀벌을 굶어하는 것이 가장 좋습니다. - 마이크로 피펫을 사용하여 밝혀 꿀벌의 안테나에 1.5 M 수크로오스 물방울을 터치. 프로보 시스가 확장되면, 꿀벌의 코에 직접 약물을 함유하는 1.5 M 슈크로 오스 20 ㎕의 액 적을 터치. 꿀벌이 모든 것을 소비해야합니다. 차량 제어로 추가 약물없이 1.5 M 자당 솔루션을 사용합니다.
참고 : 자당 용액의 양은 실험 계획에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. appetitive 조절이 의도하는 경우, 훈련 직전에 꿀벌을 공급하는 꿀벌 '응답을 방해합니다. - 폐기 또는 자당을 모두 소비하지 않는 꿀벌을 따로 설정합니다.
주 : 꿀벌 다수 자당 용액 마시 실패하면 반송 스케줄을 조정해야 할 수도있다.
- 물 500 ㎖로 크로즈 257g을 혼합하여 1.5 M 수크로오스 용액을 제조 하였다 (이것은 끓는 물에 자당이 양을 용해 쉽다). 사용할 때까지 4 ℃에서 자당 솔루션을 저장합니다.
- 흉부에 주입
- 다음과 같이 꿀벌에 벨소리 17 약을 준비합니다 :
- 혼합 및 오토 클레이브 7.45 g의 NaCl, 0.448 g의 KCl, 0.812 g의의 MgCl 2, 0.735 g의 CaCl2를, 54.72 g 자당, 4.95 g의 D-포도당, 물 1,000 ml의에서 2.48 g의 HEPES. 그것은 쉽게 오염으로 벨소리를 저장할 때주의해야합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장 벨소리.
- 링거 용액에 약물을 녹인 다음, 원하는 양의 5 μL 존재가되도록 희석한다. 1 μg의 / μL의 최종 솔루션 링거 1000 : 꿀벌 약물 5㎍을 처리 할 경우에는 예를 들어, 1 g의 초기 한 희석 전에 링거액, 1 ㎖에 용해시킬 수있다.
주 : 대안 적으로, 시판은 PBS (살랑를 인산 완충) 대신 링거 용액을 사용할 수있다.
- 양날 면도날의 모서리를 파괴하여 microscalpel합니다블레이드 홀더. 그것은 날카로운 끝 지점과 함께 좋은 날을 수 있도록 블레이드 홀더에 칼날 조각을 연결합니다.
- 실체 현미경에서 조심스럽게 옆에 꿀벌의 흉부의 후방 날개 프로세스에 바로 배반 위에 2mm 구멍을 잘라 microscalpel를 사용합니다. 이 비행 근육을 다칠 수 있습니다으로 너무 깊이 절단하지 말고, 날개 경첩을 피하기 위해주의해야합니다. 표피의 플랩 나중에 부상의 사이트를 닫고 다시 접을 수 있도록 이상적으로, 만, 세 가지 측면을 잘라.
- 흉부에있는 구멍의 상단에있는 약물을 포함하는 마이크로 피펫, 보증금 5 μlL 벨소리 (또는 PBS)를 사용. 조심스럽게 전체 강하가 체액에 흡수되어 있는지 확인하기 위해 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다. 차량 제어로 벨소리 (또는 PBS)를 사용합니다.
- 가능하면, 다시 구멍을 통해 표피 플랩 이동합니다. 5 ~ 10 시간 후에는 다시 연결하고 밀봉한다.
주 :이 방법의 대안으로서, SMA 개봉 후, 유리 주사기를 사용 흉부에 직접 1 μL를 주입주사기 바늘로 frenum합니다 (배반의 후방 지역의 가로 라인)의 중간에 LL 구멍 (직경 : 0.6 mm, G : 23). 이것은 제 메스 및 주사 부위 작다와 흉부를 절단 할 필요를 회피하지만,이 방법은, 노광 주사 부위를 떠날 것이다.
- 다음과 같이 꿀벌에 벨소리 17 약을 준비합니다 :
- Ocellus 주입
주 :이 체액으로, 헤드 캡슐에 걸쳐 분자를 전달하기위한 적합한 방법이다.- 1.2.1와 같이 약물을 제조하지만, 원하는 투여 량 링거액 또는 PBS 중 1 ㎕를 함유 이도록 약물 농도를 조절 (더 적은 부피 흉부 통해보다 ocellus 홀을 통해 흡수 될 수있다).
- 1.2.2에서와 같이 microscalpel를 준비합니다. 실체 현미경에서 왁스와 목의 틈새를 작성하여 장소에 무력화 꿀벌의 머리를 잠급니다. 손상 더듬이 후각 또는 I를 할 수있는 다른 셀을 방지하기 위해 저온 용융 왁스 (예를 들면, 치과 용 왁스)를 사용하여행동 (예를 들어, 후각 학습)을 평가하기위한 mportant. 조심스럽게 렌즈 아래 microscalpel의 선단부를 삽입하여 중간 ocellus 렌즈를 제거하고 부드럽게 머리 캡슐이없는 렌즈를 휴식.
주 : 이동을 방지하기 위해, 안테나를 통해주의 깊게 왁스를 배치하는 것도 가능하다. - 조심스럽게 ocellus 구멍에 약을 피펫. 모두가 머리를 캡슐에 촬영 될 때까지 기다립니다. 안테나에서 치과 왁스를 제거하고 꿀벌 실험 절차를 계속하기 전에 잠시 동안 휴식 할 수 있습니다. 차량 제어로 벨소리 (또는 PBS)를 사용합니다.
- ocellar 기관에 주입
주 : ocellar 기관이 큰 섬유를 포함, 중앙 뇌 (18)의 대부분의 지역에 연결. 이 처리 방법만을 뇌로 화합물을 적용하지만, 뇌의 특정 하위 영역 타겟팅되지 있습니다.- 1.3.2에서와 같이 벌을 준비합니다. 그리고 t와 중간 ocellus의 렌즈를 제거1.3.3에서와 같이 microscalpel의 IP.
참고 :이 주입하기 전에 2 시간까지 수행 할 수 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로, 공급 꿀벌 굶주린 꿀벌보다이 수술에 대처 더 잘 할 수있다 - 작은 게이지가 장착 된 10 μL 유리 주사기를 작성 (예를 들어, 33, 직경 210 μm의) 약물 용액 바늘 1.3.1에서와 같이 제조 함.
- 수동 미세 조작기를 사용하여, 50 ㎛의 깊이까지 헤드 캡슐로 ocellar 망막을 통해 주사기의 끝 부분을 삽입하여 용액 250 NL 주입.
- 사용 후에는, 그 후, 증류수로 주사기를 75 % 에탄올로 3 회 3 회 헹군다.
- 1.3.2에서와 같이 벌을 준비합니다. 그리고 t와 중간 ocellus의 렌즈를 제거1.3.3에서와 같이 microscalpel의 IP.
- 특정 뇌 구조에 미세 주입
주의 : 전술 한 체계적인 치료 이외에, 그것은 특히 뇌 구조로 microinjections을 수행 할 수있다. 영향을받지 않는 다른 남기고 이것은 하나 이상의 뇌 영역의 약리학 적 조작을 허용한다. 이 작품뇌의 앞쪽 뇌 표면 (예를 들어, 더듬이 로브, 버섯 몸 꽃받침 또는 수직 로브, 또는 광학 로브)에서 인식하기 쉬운 지역이지만, 다른 지역과 가장을 대상으로하고있다. 방향 (전방 / 후방, 지느러미 / 복부)가 neuraxis 19보다, 오히려 몸 축에 의미 있습니다.- 형광을 추가 1.2.1에서와 동일한 방식으로 벨소리 또는 PBS에 약물을 준비한다 (예, 0.5 ㎎ / ㎖ 덱스 트란 알렉사 546 또는 568 불소) 또는 비 형광 색소 (예를 들면, 1 mM의 메틸렌 블루).
참고 실험 (뇌 절개 다음, 공 초점 현미경을 사용하여)를 통해 후 비 형광 염료가 실험 기간 동안 직접 모니터링을 허용하는 반면 형광 염료의 첨가는 주입 위치의 인증을 허용 할 것이다. - 표준 개최 (전극 풀러의 홀더 클램프에 1.0 mm를 올바른 직경의 유리 모세관을 삽입, 주입 용 유리 피펫을 만들려면어 물질 목록에 언급 된 마이크로 인젝터)을 위해 포함되어 있습니다. 약 0.5 cm 길이 팁을 제조 당겨 열 설정을 조정 (설정은 동일한 모델이 사용 되더라도, 각 풀러에 대해 상이 할 것이다).
주의 : 이상적으로, 두 피펫 모두 사용할 수 있도록 동일한 길이와 형상을 가져야 하나의 유리로부터 뽑아. - 실체 현미경 아래에서 눈에 삽입 된 계수의 크기를 이용하여 비주얼 추정에 기초하여, 약 10 ~ 15 ㎛의 외경을 구하는 팁 휴식. 눈금 단계는 제조자에 의해 정의되고 사용 된 배율 보정 될 수있다.
- 그런 다음 주입하는 용액을 유리 피펫을 입력합니다. 필라멘트 유리 모세관을 사용하는 경우, 그렇지 않으면 microloader 팁을 사용 팁을 작성하여 약물 용액에 뒷면을 배치하여 피펫을 입력합니다.
- 수동 또는 전자식 MI에 의해 제어되는 마이크로 인젝터의 모세관 홀더로 채워진 유리 피펫을 삽입cromanipulator.
- (타겟 뇌 구조의 크기에 따라 0.5 NL) 원하는 볼륨을 주사하도록 마이크로 인젝터 보정. 이를 위해 미네랄 오일을 함유하는 작은 페트리 접시에 직접 주사하여 계수와 액체 방울의 직경을 측정한다. 원하는 볼륨에 도달 할 때까지 설정을 변경합니다.
- 세 인하와 더불어, microscalpel를 사용하여 헤드 캡슐의 앞쪽 부분에 개구부를 절단하기 전에, 1.3.2에서와 같이 부드러운 치과 용 왁스를 사용하여 무력화 꿀벌의 머리를 수정 : 그냥 중간 ocellus 아래 하나 (복부), 하나에서 안테나 위의 오른쪽 또는 왼쪽 눈과 하나의 테두리 (지느러미) 유래한다. 장소에서 열린 플랩을 개최 치과 왁스의 조각을 사용합니다.
- 조심스럽게 분비 따로 미세 집게를 사용하여 뇌의 상단에 거짓말 기관이 다음 대상 뇌 구조 이상 (뇌 주위에 매우 얇은 막)을 neurilemma에 작은 파열을 누릅니다.
참고 : 많은 꿀벌이 한 번에 처리 할 경우,이 절차를이전에 수행 될 수있다; 뇌가 건조하는 수도로, (더 이상 30 분 이상) 너무 오래이 상태에서 꿀벌을 떠나지에 그러나주의해야합니다. - 원하는 뇌 영역에 팁을 삽입하고 뇌 표면에 수직 깊이를 조정 (예를 들어, 버섯 몸 꽃받침 60 μm의). 사전 설정 볼륨을 주입한다. 측면 뇌 영역의 경우 (즉, 각 반구 하나의 주입을) 양자 주입. 비 형광 염료를 사용하는 경우, 주입하는 동안 관찰에 적합한 영역에서 발생한 주사를 보장한다. 형광 염료를 사용하는 경우, 형광 관찰 시스템 실체 현미경을 이용하여 형광등 아래에서 동일한 작업을 수행.
- 그 후, 다시 꿀벌의 머리 위에 열려있는 플랩을 배치합니다. 마이크로 납땜 인두의 끝을 감싸 얇은 와이어를 사용하여, 직경 약 1mm 인 에이코의 결정을 용융 (용융 온도 것은 35-37 °의 C이다)과 상처를 봉인. 이것은 크게 사망률을 줄일 수 있습니다.
- 릴리스예를 들어, 코 확장 반사 (PER) 20 테스트 - 행동 분석을위한 하네스에서 꿀벌 (그러나 설명을 참조), 또는 구속 꿀벌 실험을위한 하네스에 보관하십시오.
- 형광 염료를 사용한 경우의 실험 공 초점 레이저 주사 현미경 (도. 1)를 사용하는 동안 후 분사가 관심 영역에 충돌 확인.
주 : (가 주입 단계 동안 비 형광 염료를 참조 어려운 것) 깊은 뇌 영역을 목표로 할 때 특히 유용하다.
- 형광을 추가 1.2.1에서와 동일한 방식으로 벨소리 또는 PBS에 약물을 준비한다 (예, 0.5 ㎎ / ㎖ 덱스 트란 알렉사 546 또는 568 불소) 또는 비 형광 색소 (예를 들면, 1 mM의 메틸렌 블루).
무료 비행 꿀벌 2. 의약품 안전청 방법
- 구강 치료
- 단계에서와 동일한 방법으로 약물을 준비 1.1.1-1.1.2. 급 지대에 약액을 추가하고 저장 냉장고에 넣습니다.
주 : 모든 장치는 거꾸로 병 뚜껑이나 티슈 페이퍼에 반전 항아리로 할 것입니다. - 1 M 또는 0.5를 포함하는 중력 공급에 꿀벌 기차하이브에 가까운 공급 장치를 배치하여 M 자당 솔루션입니다. 꿀벌 피더에서 꼴을 시작하면 그것은 (최소 5m) 찌르 게되는 것을 방지하기 위해 편안한 거리가 될 때까지 점진적으로 더 멀리 이동합니다.
- 순서 페인트 마크 꿀벌 개별 꿀벌을 추적합니다. 사용되는 모든 색상 조합의 목록을 확인합니다. 피더에서 꿀벌 땅은 조심스럽게 두 가지 색상과의 복부를 표시하고, 조합이 촬영 목록에 메모를 할 때.
- 약물 / 자당 솔루션을 포함하는 장치에 대한 중력 공급 장치를 교체합니다. 피더를 방문 표시된 꿀벌 기록해 둡니다. 꿀벌 다작의 채용만큼 공급기를 방문하는 표시되지 않은 벌, 신속하게 통제 얻을 수있는 마약을 상용 공급을 방문하는 꿀벌의 숫자를 잡아라. 동일한 실험이 연속 일에 수행 될 경우, 나이브 꿀벌이 더 이상 없을 나이브 하듯이 특히 문제가된다.
참고 : 급 지대에 개별 꿀벌을 훈련, 이전의 저자에 대한 대안으로23 -의 성공적 전체 하이브 (21)에 약물 레이스 크로스 물을 공급하고있다.
- 단계에서와 동일한 방법으로 약물을 준비 1.1.1-1.1.2. 급 지대에 약액을 추가하고 저장 냉장고에 넣습니다.
- 국소 치료
주 : 목적은 왁스 곤충 표피를 관통 할 수있는 용매에 관심있는 화합물을 용해하는 것이다. 용제는이 목적을 위해 사용될 수있다. 가장 일반적으로 사용되는 아세톤, 디메틸 포름 아미드 (DMF) 및 디메틸 술폭 시드 (DMSO)를 포함한다.- 용매가 손 화합물에 대한 가장 적합한 평가합니다. 강력한 표현형이 조심스럽게 다른 용매의 각각에 용해 과다 복용 (예를 들어, 마비 또는 사망), 고용량으로 치료 꿀벌 (단계 2.2.2) (예를 들어, 20 μg의 코카인 7)에서 예상되는 경우 마비까지 시간을 모니터링 또는 사망.
- 1 μL의 마이크로 캐 필러 (또는 마이크로 실린 적절한 반복 디스펜서에 부착 될 수 있음) 및 마이크로 캐 필러 홀더를 사용하여 약액의 1 μL (예를 들어, 3 무승부(81), 모세관에 코카인 g / μL). 드롭을 추방 조심스럽게 표시된 꿀벌의 가슴에 그것을 페인트. 꿀벌은 다음을 신랑 가능성 등의 영역이 아니라 고체 드롭을 떠나보다, 솔루션과 가능성의 큰 커버. 화합물이 날개 경첩, 또는이 흉부 떨어져 그것을 끌어와는 체액에 흡수되지 않고 증발 측면을 따라 할 수 닿지 않도록주의하십시오.
참고 : 연구 목표에 따라이 방법은 꿀벌의 복부에 약물을 관리하는 데 사용할 수 있습니다. 흉부 (24) .This 방법을 작품에 적용 동일하게 무료로 비행 꿀벌로 밝혀 그러나 약물은 더 빠르고 더 많은 양의 CNS에 도달합니다.
- 휘발 처리
- 약물을 용해 100 % 에탄올 (이전에이 방법은 꿀벌 (10)에 코카인을 전달하는 데 사용되었다). 가용성을 보장하기 위해, 염산염 또는 다른 염 형태를 사용하지 않는약물 가능한 경우. 양 꿀벌에 전달할되도록 희석하여 제조 할 때는 100 μL로 존재한다. 차량 제어로 순수 에탄올을 사용합니다.
- 필라멘트를 만들려면 McClung와 Hirsh (25)와 동일한 절차를 사용합니다.
- 간단히 설명 : 손톱 주위에 단단히 니크롬 선을 바람과 두 개의 전선 (필라멘트의 각 끝에 하나)에 연결합니다. 못을 제거합니다. 나머지 니크롬 코일 필라멘트로서 지칭된다.
- 선택된 온도에 저항력이 있어야 50 mL의 원심 분리 튜브의 뚜껑으로주의 깊게 천공 홀을 통해 배선을 두 스레드. 액체 실리콘과 장소에 와이어를 접착제.
참고 :이 튜브 밀폐 할 것입니다. 이 실험에 이차 노출을 방지하고 꿀벌이 적절한 투여 량으로 처리되어 있는지 확인하는 것이 필수적이다.
- 전원에 필라멘트로 이어지는 선을 연결. 열전쌍을 사용하여 온도를 측정필라멘트, 이상적으로, 문제의 약물에 대한 적절한 온도 프로파일을 초래 하나, 난방 이하의 10 초를 허용 하나까지 서로 다른 전압 / 전류 조합으로 실험. 이것은 매우 중요하다, (적어도 200 ° C까지 가열 할 필요가 휘발 코카인 위해서는 예를 들어,하지만, 350 °의 C 이상 온도가 보조 화합물 (26)로 분해된다) 관련 문헌을 참조하십시오.
- 조심스럽게 필라멘트 상 에탄올 용액을 포함하는 약 100 μl를 피펫. 이러한 증착 효율을 증가하므로 가급적 필라멘트 표면에 액체를 확산. 모든 에탄올이 증발 될 때까지 상온에서 노출 된 필라멘트를 남겨주세요.
주 : 에탄올이 충분히 증발되지 않으면 꿀벌 선택과 에탄올의 약물 모두로 처리한다. 꿀벌은 에탄올에 매우 민감한, 일부 약은 어떤 것 바이어스 전을 에탄올로 시너지 상호 작용이perimental 결과. - 에탄올을 완전히 (약물의 침전이 보통 현미경 건조 필라멘트에서 알 수있는)이 증발되면, 50 ㎖ 튜브에서 자유 비행 꿀벌 타기. 조심스럽게 필라멘트를 포함하는 덮개를 닫습니다.
- 10 초 동안 전원을 켜고 전원을 끄고 다른 50 초를 기다립니다 (휘발 된 화합물을 냉각하여 응축 또는 예금 할 수 있도록하기 위해). 꿀벌을 놓습니다.
참고 :이 치료 방법은 자유 비행 꿀벌에 대한 뛰어난 작동하지만, 그냥 효과적으로 무력화 꿀벌 사용할 수 있습니다. 단순히 50 ML 튜브 내부의 무력화 꿀벌을 연결합니다. 꿀벌 사이에 2.3.4에 설명 된대로 필라멘트를 다시로드하십시오. 높은 처리량, 여러 섬유는 병렬로 사용될 수있다.
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Representative Results
상기의 방법에 대한 대표적인 결과의 선택은 주로 방법은 약리 에이전트가 뇌에 도달 할 수 있도록, 꿀 꿀벌의 행동에 영향을 미치는 것을 입증하기 위해 표시됩니다.
뇌의 특정 처리의 효과를 용이 흉부 주입 다음을 얻을 수있다.
약리 에이전트가 몸에 여러 대상에 따라 행동 할 수 있고, 뇌에 도달하기 전에 몸에 희석 얻을 흉부 통해 주입하기 때문에,이 기술은 가능한 특이성 문제를 제기 할 수있다. 그럼에도 불구하고,이 주요 차 효과를 얻을 수있는 매우 높은 투여 량을 사용할 필요없이,인지 과정을 방해하기 문헌에서 널리 사용되어왔다. 예를 들어, 전사 차단제 유전자를 필요로 메모리의 위상을 확인하기 위해이 기술을 사용하여 투여되었다표현. 이러한 분자의 흉부 주입 다른 대상에 잠재적 독성 작용이 제한 잘 선택된 농도를 제공 할 수 있다는 것을 의미 수일 27 생존율과 호환된다. 이러한 상황에서, 메모리에 선택적 및 시간 - 종속 효과에 따라서 뇌 (도. 2)의 효율적인 타겟팅을 도시 얻을 수있다.
헤드 체액에 분자 확산이 빠르고, 투여 량 - 의존적 효과를 이끈다.
Ocellus 주사는 뇌의 많은 광범위한 목표를 가질 수있다, 특히 체액 통해 머리 전체에 관심 분자의 빠른 확산을 가능하게하는 방법이다. 이 방법은 또한 신경 호르몬 allatostatins 28 작용할 수있는, 신경 펩티드)를 관리하다 하였다. 그 결과, 감소 된 성능과 일치, 후각 학습 분석에서 관찰후각 처리에 관련된 다른 뇌 영역에서 수용체를 allatostatin 28 학습의 제안 존재. 이 효과에 대한 용량 의존적 곡선 (그림. 3) 병렬로 실행 독립적 인 그룹에 서로 다른 농도를 주입하여 설립 할 수있다.
관리의 다른 방법은 뇌 기능에 유사한 효과를 얻을 수 있습니다.
Emetine, 단백질 합성의 차단은 일반적으로 1-2일 조절 한 후 표현이다 초기 후각 기억 장기 기억의 형성을 저해하는 데 사용됩니다. 대부분의 발표 된 연구에서이 흉부 (29)에 주입하고있다. 우리는 유사한 효과가 ocellar 관을 통해 뇌에 직접 투여함으로써 수득 할 수 있었다 (도 4). : 사출 파라미터 (작은 부피의 조절, 높은 농도를 제공하고 짧아컨디셔닝 전에 지연), 우리는 같은 약제 량 (10 나노 미터)를 사용하여 문헌에서 발견되는 것과 유사한 감소 (~ 20 %)을 수득 -. 등, 2005 년 29 Stollhoff도 4와 비교한다.
국소 주사의 효과는 시간과 공간에 갇혀
특정 뇌 영역에 미세 주입 약물의 공간 및 시간 특성을 테스트하려면 무력화 꿀벌은 (에어컨 패러다임 당 후각 훈련하고 버섯 몸 꽃받침 또는 수직 로브에서 740 밀리미터 프로 카인 (마취제)의 0.5 NL과 양자 주사 하였다 식염수)는 대조군으로 사용 하였다. 꿀벌이 연속적으로 회수 1, 2, 주입 후 3 시간 동안 테스트 한 경우, 성능은 로브 양측에 주사 (도. 5) 꿀벌에 장애가되었다. 꽃받침에서 그대로 신경 로브로부터 출력 아니라이 알려져있다후각 메모리 검색을 위해 필요하다, 그래서 이것은 프로 카인이 적어도 3 시간 동안 주입했다있는 로브에 지역화 된 남아 있음을 시사한다. 또한 꽃받침에 주입 할 때 프로 카인의 calycal 주입이 로브의 봉쇄로 이어질하지 않았기 때문에, 근처의 로브로 확산, 같은 기간 동안 제한하고 있음을 보여줍니다.
약물 투여에 따라 행동 표현형은 종종 상황에 따라 달라집니다
이전 실험 코카인 꿀벌 치료 후 자당 용액 10, 30의 품질을 과도하게 평가하는 것으로 나타났습니다. 이 효과는 컨텍스트 (여기서,베이스 라인 크로스 품질)에 의존했다 있는지 확인하려면, 자유 비행 꿀벌은 휘발 코카인 처리 하였다. 개별적으로 표시된 자유 비행 꿀벌은 1 M 자당 용액을 포함하는 공급 장치에 꼴시켰다. 피더에서 꿀벌은 부드럽게 캡처 한50 ML의 원심 분리기 튜브 그들은 공급 장치에서 하차에 있었던있다. 꿀벌은 유리 염기 코카인 또는 차량 제어 (증발 에탄올)의 100 μg의 하나로 처리 하였다. 치료 후, 자당 공급이 중 0.5 M 또는 2.0 M 자당 공급 장치로 대체하고, 속도 초지는 공급이 기록에 돌려 보냈다. 이 패러다임을 사용하여, 코카인 처리 꿀벌 아니라 2.0 M 공급 장치 (그림 6)에서, 0.5 M 공급 장치에서 자신의 꼴 노력을 증가했다. 두 자당 농도 볼 효과의 차이는 잘 꿀벌의 행동을 연구 할 때 계정에 환경 단서를 복용의 중요성을 보여줍니다.
그림 1 : 주사 부위의 공 초점 레이저 주사 이미지. 알렉사 546 표지 덱스 트란은 약액 (적색)과 함께 주입된다. neuropil를 확인하려면DAPI와 사 반 염색 (녹색)에 추가됩니다. 오른쪽 반구 주사 부위가 성공적으로 주입하기위한 예시로서 도시 수직 로브 (VL)에 위치하고있다. 좌반구에서 주사 부위는 실패한 주입 일례로 나타낸 고리 neuropil에서의 수직 돌출부의 등쪽에 위치시켰다. 스케일 바 = 100 μm의, MB : 버섯 기관, AL : 더듬이 로브, D : 지느러미, V : 복부, 난 : R 왼쪽 :. 바로 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 흉부에 주입 장기 메모리에 티노 마이신 D (전사 차단기)의 시간에 따른 효과 서로 다른 지연에서 appetitive 후각 CONDI 다음과 같습니다. 컨디셔닝 (6, 9 또는 12 시간), 액 티노 마이신 D 1 μL (PBS 1.5 mM)을 흉부에 주입 하였다. 장기 기억 (LTM) 검색이 조절 후 (- 65 N = 25) 3 일을 평가 하였다. PBS 처리 제어에 비하여 메모리 성능은 시간 - 의존적 방식으로 감소 하였다 사출도 (긴 지연에 조화 (χ (2) = 18.04, p <0.005) 후 6 시간을 배치 할 수 있지만 경우에 효과가 유의 한 9 시간 : χ 2 = 0.95; 12 시간 : χ 2 = 0.47), LTM 형성이 조절 후 정의 된 시간 기간 동안 발생 전사의 물결 필요하다는 것을 시사한다. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 데이터는 이전에 27을 발표하고, 허가 여기에 다시 만들어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
도 3 :. 신경 펩티드의 Ocellar 주입 후 학습 성과 용량 의존적 억제 C allatostatin 신경 펩타이드 1 시간 후각 조절 전에 중간 ocellus 통해 헤드 체액 (PBS 200 NL)에 주입 하였다. (컨트롤 또는 PBS) 다른 농도로 주입 동물의 독립적 인 그룹을 훈련했다. U 자형 곡선 (N = 70-78) 아래의 투여 량에 의존적으로, 마지막 컨디셔닝 조건 반응의 비율이 정한 Allatostatin C 처리, 학습 성능이 저하되었다. 이 감소는 다른 농도에서 10-6 M에서 중요하지만하지 않았다. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 데이터는 이전에 (28)을 발표하고, 허가 여기에 적합하다. 버전 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 시온.
도 4. 1 D의 바깥 메모리 봉쇄 Ocellar 요로 통해 Emetine (번역 억제제)의 주입 이후 단백질 합성 억제제 emetine (PBS 중 50 mM의 200 NL)는 20 분 전에 ocellar 관을 통해 뇌에 주입 후각 조절. 메모리는 다음 24 시간 후에 시험 하였다. PBS 처리 제어 (N = 57-70)과 비교하여 치료를 현저히 저해 기억력 (χ (2) = 7.03, p <0.01). 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. JM Devaud, 게시되지 않은 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 해부학 및 Microinjections의 시간적 특이성 appetitive 후각 컨디셔닝 후, 프로 카인는 버섯 몸 꽃받침 또는 수직 로브 하나에 좌우 주입 하였다. 메모리 검색은 주사 후 1 시간을 평가했다 단지 (1 시간 처리 후 로브에 프로 카인 주사에 의해 영향을받은 : 식염수 대 : χ 2 = 10.00, P <0.005, 프로 카인 대 꽃받침에 : 2 = 32.92, P χ < 0.005). 효과는 여전히 주사 후 2 시간 (χ 2 = 6.65, P <0.01), 3 (χ 2 = 27.22, P <0.005)을 볼 수, 여전히 특정 지역 (2 시간이었다 수 : χ 2 = 8.60, p < 0.05, 3 시간 : 2 = 17.15 χ, p <0.0001) 만 주입 영역은 프로 카인에 의해 영향을받는 것을 시사한다. 비율은 에어컨 수준 뒤를 기준으로합니다마지막 컨디셔닝 재판 반지. 오류 바 (N = 23-28)를 표준 오차를 나타냅니다. 데이터는 이전에 (31)을 발표하고, 허가 여기에 다시 만들어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :. 무료 비행 꿀벌에 코카인의 효과 방문 비율 (테스트 기간 동안 모든 꿀벌의 지정된 꿀벌 / 평균 방문의 방문 수) 낮은 품질의 소스에서 휘발 코카인 처리 다음 증가 하였다 (0.5M : 70t = 5.0710, P = 0.00003) 아니라 고품질의 소스 (2M : t (70) = -0.2087, p = 0.8353). 상자는 1 일을 대표하고 3 번째는 중간을 보여주는 중간 선으로 분위수. 수염은 1.5 확장사 분위 범위를 X. 모든 개별 데이터 포인트가 중첩 될 때 특이점은 플롯되지 않습니다. 데이터는 이전에 10을 발표하고, 허가 여기에 다시 만들어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 치료 | 자유 비행 꿀벌 함께 할 수 있습니까? | 프로 | 단점 |
| 구강 치료 | 예. | 쉬운, 최소 침습. | 꿀벌의 소화는 간단하지 않습니다 |
| 국소 치료 | 예. | 빠른, 최소 침습, 쉬운. | 반복 처리는 문제가 될 수 있습니다. |
| 흉부에 주입 | 복잡한,능력을 비행 꿀벌에 영향을 미치는 | 일관되고 강력한. | 다소 침습적. 잠재적는 / 스트레스 꿀벌을 해칠 수 있습니다. |
| 중간 ocellus에 주입 | 추천하지 않습니다. | 일관되고 강력한 다소 지역화. | 다소 침습적. 잠재적는 / 스트레스 꿀벌을 해칠 수 있습니다. |
| ocellar 기관에 주입 | 추천하지 않습니다. | 매우 지역화 | 매우 침습적. 잠재적는 / 스트레스 꿀벌을 해칠 수 있습니다. |
| 뇌 영역에 마이크로 인젝션 | 추천하지 않습니다. | 매우 지역화 | 매우 침습적 수행하기 어렵다. 잠재적는 / 스트레스 꿀벌을 해칠 수 있습니다. |
| 휘발 된 약물 전달 | 예. | 빠른, 최소 침습, 쉬운. | 모든 약물이 작동하지 않습니다. |
표 1 : Compari다른 치료 방법과 그들의 속성의 아들.
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Discussion
위에서 설명한 방법은 자유 비행 또는 무력화 꿀벌 중 하나의 간단하고 효과적이고 강력한 치료를 할 수 있습니다. 이러한 방법은 많은 실험 패러다임 생물 질문 (표 1)와 호환됩니다. 자유 비행하는 모든 방법을 쉽게 밝혀 꿀벌에 적용될 수있다. 임시 구속 침습성 치료 방법은 종종 꿀벌 '비행하는 능력을 손상시킬 수 있기 때문에 역방향 그러나 덜 성공적이다.
방법은 뇌 중심의 관점에서 제시되었다. 이것은 오히려 때문에 저자의 개인적 관심, 기술의 본질적인 한계로 인해 없습니다. 이 방법은 다른 기관을 연구에 사용할 수없는 이유가 없다. 그러나, 작은 수정은 다른 기관 시스템에 방법이 더 적합 할 필요할 수 있습니다. 국소 치료가 뇌에 도달하기위한 예를 들어, 일반적으로 흉부에 적용되고 생 적용하는 것이 좋을 수도복부에들 의도 된 대상은 난소 경우. 마찬가지로, 주사가 용이 흉부 또는 헤드 이외의 부분에 적용될 수있다 (예를 들면, 복부 장기는 복부 sclerites 사이에 주입하여 타겟팅 될 수있다).
화합물은 꿀벌에게 투여 될 수있는 측면에서, 정말 제한이 없습니다. 일반적으로 사람들은 신호 분자 (21) 또는 길항제 (32), 및 주문 제작 펩티드 (28)로 약리 화합물을 투여했다. 그러나, 농약 (33)와 인위적 오염 물질 (34) 등을 염두에 적용 질문과 꿀벌의 화합물을 투여에서 최근 증가하고있다. 최근 투여 화합물 등의 dsRNA가 RNA 간섭 통로 (35) 또는 (36) 및 마이크로 RNA antagomiRs 37 활성화 직접적 유전자 발현을 방해 RNA 분자를 포함하기 시작 하였다. 모든 방법은 모든 화합물에 대해 동일하게 작동합니다.이것은 아마도 가장 따라서 소비 것을 방지, 꿀벌에게 설탕 물이 싫은하게 쓴맛이나 신맛 화합물에 의해 설명된다. 휘발 과정에서 가열 또는 DMF와 같은 가혹한 용매에 배치 할 때 같은 RNA를하거나 특정 폴리 펩타이드와 같은 깨지기 쉬운 분자, 세분화된다. 치료 절차 남아 있도록 관리되는 내용의 화학적 성질을 이해하는 것이 중요하다.
꿀벌에 약리 에이전트를 얻는 것은 쉬운 부분이지만, 약리 실험을 수행 할 때 가볍게해서는 안됩니다 세 가지 큰 문제가있다. 첫 번째 문제의 실험을위한 좋은 용량을 파악한다. 약물에 따라 이미 문헌 가능한 문서가 될 수 있지만, 대부분의 경우, 이것은 문헌 검색하고, 정보를 추측하고, 용량 반응 곡선의 혼합물에 의해 해결되어야 할 것이다. 실험 프로토콜이 얼마나 복잡한에 따라서는 유용 할 수도먼저 더 정교한 생물 검정에 노력하고 가치 용량 범위의 더 나은 아이디어를 얻을 수 (전체 이동이나 생존을 정량화, 예를 들어) 간단한 생물학적 정량의 용량 - 반응 곡선을 생성합니다. 실험실에서, 출발 투여 량은 두 벌 문헌 또는 설치류 문헌 데이터에 기초 밀리그램 / kg 변환을 수행하여 발견된다. 출발 투여 량은 1 ㎎, 0.01, 0.1, 10 및 경우,이 시점에서, 꿀벌이 시작 용량 플러스 2 또는 3 투여 개시 량 (보다 10 배 더 작은로 처리 예를 들어 100 mg의도 것 )를 사용하고, 물론 적절한 차량 제어.
두 번째 문제는 조금 더 까다로운 것입니다 : 약물 특이성. 대부분의 약물은 마음에, 꿀벌, 또는 다른 곤충으로 개발되지 않았다. 이 때문에, 오프 - 타겟 효과는 공통 (예를 들어, 미안 세린은 척추 세로토닌 수용체 길항제 (38)가 긴 곤충 옥토 파민 수용체 길항제하지만 최근 인터넷 것으로 생각되었다있다ndings 꿀벌에)도 도파민 수용체 길항제 (39)임을 나타낸다. 이 문제에 대한 일반적인 해결책은 다소 일반적인 관심의 대상이있는 것으로 알려진 약물의 모음과 같은 실험을 반복하여, 하나의 약물에 의존하지 않고있다. 기본적으로, 몇몇 약물이 다른 약물은 종종 독특한 오프 - 타겟 정보를 갖고 있기 때문에, 약물은 예상 된 효과를 가지고 더 큰 신뢰를 제공한다 다른 약물에 걸쳐 유사한 결과를 관찰하고, 특정 대상을 차단하는 것으로 알려진 경우.
마지막 문제는이 역할을 할 것으로 예상되는 경우 약물이 작용하는 것을 보장하는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 항상 특이 침입 사이의 트레이드 오프있을 것입니다. 체계적인 치료 방법은 일반적으로 최소 침습 있지만 꿀벌 체내 약물이 그 효과를 가지는 곳의 통제가 없다. 심지어 대상 조직의 미세 주입을위한 약물 꿀벌 신체의 다른 부위에 체액으로 여행 할 수 있습니다. 이 문제는 태어나 셨를 해결하는 방법DS는 묻는 질문으로 통보한다. 다른 사람이 중요성의 유일한 문제는 반면, 특정 실험에 대한 해부학 적 위치는 무관하다. 이 문제를 해결하는 가장 좋은 방법은 전신 치료를 시작하여 점진적으로 점점 더 구체적인 방법을 이용하여 해부학 적 위치로 좁힐 수있다. 연구되고 행동이 침습적 치료 방법에 특히 호환되지 않는 경우는 매우 구체적인 약물 치료와 실험의 전체 시리즈를하기 전에 간단한 구성 요소로 그것을 해체하려고 가치가있을 수도 있습니다.
약물 누출이 문제는 심지어 약물 비 표적 꿀벌에 영향을 미칠 수있는 자유 비행 꿀벌의 경구 치료에 더 과장입니다. 사일리지 콤바인의 꿀벌은 그들의 식민지로 다시 가져 분야에서 꿀을 수집합니다. 이들은 복귀보다는 흡수시 하이브 그들의 자당 용액의 대부분을 오프로드 할 것이다. 하이브에서 그것은 세포에 포장 탈수, 꿀로 저장됩니다. 때문에이 약물은 잠재적으로 비 표적 꿀벌에 영향을 줄 수 있습니다. (예 : microinjections 등)보다 구체적인 방법으로이 문제가 최소화된다.
이러한주의 사항을 염두에두고, 제대로 해결과 함께, 꿀벌의 neuropharmacological 조작은 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다. 형질 전환 도구 때문에 사회 생활에, 꿀벌 (15)을 위해 개발되는 동안은 형질 전환 적 실험 이러한 종류의를 수행 할 수있는 쉽고 안정적인 방법이 될 것 같지는 않다. 약학 앞으로 꿀벌 연구의 중요한 요소가 될 것으로 계속 따라서 쉽다. 일부 꿀벌 연구자들은 표준화 된 실험 방법 (40)에 대한 호출을 한 반면,이 경우이 실수가 될 것입니다. 꿀벌 시스템의 전력의 일부는 항상 실험 방법의 다양성왔다 방법 및 기술들은 실제 생체 염두 질문이 아닌 다른 방법으로 주위로 개발되어왔다. 우리가 확인하는 것이 그럼에도 불구하고 중요하다손의 질문에 대한 가장 적절한 방법의 사용. 이전의 연구에 비교가 중요한 경우, 표준화 된 프로토콜을 엄격하게 준수해야합니다. 그러나, 표준화 된 방법을 이용을 위해서 확립 프로토콜을 사용하는 새로운 실험 가능성을 열 수있는 새로운 방법을 개발하는 방식 방치해서는 안된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
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