Summary
Este manuscrito descreve vários protocolos para a administração de agentes farmacológicos para as abelhas, incluindo métodos não invasivos simples para abelhas de vôo livre, bem como variantes mais invasivos que permitem que o tratamento localizado precisa de abelhas dispositivos de retenção.
Abstract
As abelhas do mel demonstrar capacidades de aprendizagem surpreendentes e comportamento social avançada e comunicação. Além disso, o seu cérebro é pequeno, fácil de visualizar e estudar. Portanto, as abelhas têm sido um modelo preferido entre os neurobiólogos e neuroethologists para estudar as bases neurais do comportamento social e natural. É importante, no entanto, que as técnicas experimentais usadas para estudar abelhas não interferir com o comportamento a ser estudada. Devido a isto, tem sido necessário o desenvolvimento de uma variedade de técnicas para a manipulação farmacológica de abelhas de mel. Neste artigo é demonstrar os métodos para o tratamento de abelhas produtoras de mel contido ou livre de voar com uma vasta gama de agentes farmacológicos. Estes incluem ambos os métodos não invasivos, tais como tratamentos orais e tópicos, assim como métodos mais invasivos que permitem a entrega da droga precisa em qualquer forma sistémica ou localizada. Finalmente, discutimos as vantagens e desvantagens de cada método e descreverobstáculos comuns e como melhor superá-los. Concluímos com uma discussão sobre a importância de adaptar o método experimental para as questões biológicas, em vez do contrário.
Introduction
Desde Karl von Frisch elucidado sua linguagem de dança 1, as abelhas têm permanecido uma espécie de estudo populares para pesquisadores em comportamento animal e neurobiologia. Nos últimos anos uma miríade de novas disciplinas surgiram na interseção desses dois campos, e várias outras disciplinas (por exemplo, biologia molecular, genômica e ciência da computação) surgiram ao lado deles. Isto levou a um rápido desenvolvimento de novas teorias e modelos para a compreensão de como o comportamento resulta de atividade dentro do sistema nervoso. Por causa do estilo de vida único, rico repertório comportamental, e facilidade de manipulação experimental e farmacológico, as abelhas têm-se mantido na vanguarda dessa revolução.
As abelhas do mel estão sendo usados para estudar questões neurobiológicas básicos tais como os de aprendizagem subjacentes e memória 2,3, tomada de decisão 4, olfativas 5 ou 6 processamento visual. Nos últimos anos, o honey abelha sequer foi usado como um modelo para o estudo de temas geralmente reservados para a investigação médica, tais como os efeitos das drogas viciantes 7 - 11, o sono 12, o envelhecimento 13, ou os mecanismos subjacentes a anestesia 14.
Ao contrário dos clássicos organismos modelo genético (por exemplo, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), há muito poucas ferramentas genéticas disponíveis para manipular as funções neurais em abelhas produtoras de mel, embora isso está mudando 15. Em vez disso, estudos de abelhas têm se baseou principalmente em manipulações farmacológicas. Isso tem sido muito bem sucedida; no entanto, a diversidade de pesquisa abelha é tal que uma série de métodos para a administração farmacológica são necessários. A pesquisa com abelhas aborda mais diversas questões, é estudado por pesquisadores de diferentes disciplinas e experiências, e usa uma variedade de abordagens experimentais. muitos reseperguntas arco exigem abelhas para quer ser livre de vôo, interagindo livremente na sua colónia, ou ambos. Isso pode tornar difícil manter o controle de animais experimentais individuais, e faz a restrições ou a punção inviável.
Para acomodar a diversidade de pesquisa da abelha do mel, são necessários uma variedade de métodos de administração de fármacos, permitindo a administração robusto e flexível, assegurando ao mesmo tempo que a perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos, invasividade do método, e a sua fiabilidade, adequar o paradigma em questão. Devido a estas necessidades diversas, a maioria dos grupos de pesquisa têm desenvolvido os seus próprios métodos de administração de medicamentos originais. Até agora, esta tem sido uma força da comunidade de pesquisa de abelhas; que tem levado ao desenvolvimento de matrizes de métodos que permitam a administração do mesmo medicamento em diferentes circunstâncias. Nosso objetivo aqui não é desenvolver um método padronizado único para manipulações farmacológicas de abelhas, mas sim para destacar os métodos queprovaram ser particularmente bem sucedidas, e os investigadores ajuda adoptar estes. Discutimos os princípios básicos de como eles funcionam, bem como suas vantagens e desvantagens.
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Protocol
1. Drug Administration para as abelhas aproveitou
- O tratamento oral
- Preparar uma solução 1,5 M de sacarose através da mistura de 257 g de sacarose com 500 ml de água (que é mais fácil de dissolver esta quantidade de sacarose em água a ferver). Armazenamento da solução de sacarose a 4 ° C até à sua utilização.
NOTA: Solução de sacarose fornece um ambiente muito hospitaleiro para certos microorganismos e, portanto, facilmente torna-se contaminado e intragável para as abelhas. solução de sacarose em massa pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. - Decidir sobre uma dose droga apropriada (como alcançá-lo, é abordado na seção de discussão abaixo), e preparar uma solução tal que a dose droga preferida é dissolvido em 20 mL da solução de sacarose (por exemplo, para fornecer 20 mg, diluir droga a uma proporção de 1 mg / ml). abelhas arnês de acordo com Felsenberg et al. (2011) 16. Faça este passo, pelo menos, 12 horas antes do tratamento de drogas para garantir que as abelhas não são mais estressado out de aproveitamento quando a solução de fármaco é apresentada.
NOTA: Para obter resultados mais consistentes, o melhor é matar de fome as abelhas (colocando as abelhas aproveitado em uma incubadora a 34 ° C e 70% de umidade) O / N. - Usando uma micropipeta, toque em uma gota de água de sacarose 1,5 M à antena de uma abelha aproveitada. Quando a tromba é estendido, toque em uma gota de 20 mL de 1,5 M de sacarose contendo a droga diretamente para a tromba da abelha. Certifique-se a abelha consome tudo. Como o controle do veículo usar a solução 1,5 M de sacarose sem drogas adicionado.
NOTA: A quantidade de solução de sacarose pode ter de ser ajustada com base nos planos experimentais. Se appetitive condicionado destina-se, alimentando as abelhas apenas antes do treino irá interferir com a capacidade de resposta das abelhas. - Descarte ou anular as abelhas que não consomem toda a sacarose.
NOTA: Se um grande número de abelhas deixar de beber a solução de sacarose, o horário de alimentação pode ter de ser ajustada.
- Preparar uma solução 1,5 M de sacarose através da mistura de 257 g de sacarose com 500 ml de água (que é mais fácil de dissolver esta quantidade de sacarose em água a ferver). Armazenamento da solução de sacarose a 4 ° C até à sua utilização.
- Injecção no tórax
- Prepare droga em mel de abelha Ringer 17 da seguinte forma:
- Misture e autoclave 7,45 g de NaCl, 0,448 g de KCl, 0,812 g de MgCl 2, 0,735 g de CaCl 2, 54,72 g de sacarose, 4,95 g de D-glucose, e 2,48 g de HEPES em 1.000 ml de água. Tenha cuidado ao armazenar Ringer, pois é facilmente contaminado. Alíquotas e armazenamento de Ringer a -20 ° C até à sua utilização.
- Dissolve-se o fármaco em solução de Ringer e depois dilui-se de modo a que a quantidade desejada está presente em 5 ul. Como um exemplo, se as abelhas são para ser tratados com 5 ug de um fármaco, um g pode ser inicialmente dissolvido em 1 ml de Ringer, antes de ser diluída a 1: 1000 em solução de Ringer para um final de 1 ug / uL.
NOTA: Como alternativa, disponível comercialmente de PBS (fosfato tamponado Salin) pode ser usado em vez de solução de Ringer.
- Fazer uma microscalpel por romper o canto de uma lâmina de dois gumes com lâminaum suporte de lâmina. Fixe o fragmento de lâmina para um suporte de lâmina para que ele faz um bom lâmina com um ponto de extremidade afiada.
- Sob um microscópio estereoscópico, use cuidadosamente o microscalpel para cortar um buraco 2 milímetros pouco acima do escutelo, ao lado do processo de asa posterior do tórax de uma abelha. Evitar o corte muito profundo, pois isso poderia prejudicar músculos de vôo, e ter cuidado para evitar as dobradiças laterais. Idealmente, só reduzir três lados, de modo que a aba de cutícula pode depois ser dobrada para trás para fechar o local da lesão.
- Usando uma micropipeta, depósito 5 ml·l Ringer (ou PBS) que contém o fármaco no topo do orifício no tórax. monitorizar cuidadosamente sob microscópio para assegurar que toda a gota é absorvida pela hemolinfa. Use campainha (ou PBS) como um controlo do veículo.
- Se possível, coloque a aba cutícula para trás por cima do buraco. Após 5-10 horas, ele vai recolocar e selar.
NOTA: Como uma alternativa a esta técnica, injectam-se 1 ul directamente no tórax usando uma seringa de vidro, depois de abrir uma SMALL buraco no meio do freio (linha transversal na região posterior do escutelo) com uma agulha de seringa (diâmetro: 0.6 mm L: 23). Isto evita a necessidade de cortar primeiro o tórax com um bisturi e o local da injecção é menor, mas este método vai deixar o local de injecção exposta.
- Prepare droga em mel de abelha Ringer 17 da seguinte forma:
- injeção ocellus
NOTA: Este é um método adequado para a entrega de moléculas em toda a cápsula cabeça, na hemolinfa.- Prepare drogas como em 1.2.1, mas ajustar as concentrações de fármaco de tal modo que a dose desejada irá ser contida em 1 mL de Ringer ou PBS (menos de volume pode ser absorvida através do orifício ocelo do que através do tórax).
- Prepara-se uma microscalpel como em 1.2.2. Sob um microscópio estereoscópico, bloquear a cabeça de uma abelha aproveitado no lugar preenchendo a fenda no pescoço com cera. Use cera de fusão a baixa temperatura (por exemplo, cera, cirurgia dentária) de modo a evitar os receptores olfactivos antenal nocivos ou outras células que podem ser important para avaliar o comportamento (por exemplo, a aprendizagem olfactiva). Em seguida, remover cuidadosamente a lente do ocelo mediana através da inserção da ponta do microscalpel sob a lente e a lente suavemente quebrar livre a partir da cápsula cabeça.
NOTA: É também possível colocar cera cuidadosamente através da antena para evitar o movimento. - Cuidadosamente pipeta de drogas para o buraco ocellus. Espere até que tudo seja levado para dentro da cápsula cabeça. Remova a cera dental da antenas e permitir que a abelha para descansar um pouco antes de continuar o procedimento experimental. Use campainha (ou PBS) como um controlo do veículo.
- Injecção no trato ocelar
NOTA: O trato ocelar contém fibras grandes, conectando a maioria das regiões do cérebro central 18. Este método de tratamento permite a aplicação de compostos com apenas o cérebro, mas não segmentação sub-regiões específicas do cérebro.- Prepare abelha como em 1.3.2. e remover a lente do ocelo mediana, com o tIP de um microscalpel como em 1.3.3.
NOTA: Este pode ser feito até 2 horas antes da injecção. Com base em nossa experiência, as abelhas alimentadas são mais capazes de lidar com esta cirurgia que não as abelhas famintos - Encher uma seringa de vidro de 10 mL equipado com um calibre pequeno (por exemplo, 33, diâmetro: 210 mm) da agulha com solução de fármaco preparado como no 1.3.1.
- Utilizando um micromanipulador Manual, insira a ponta da seringa através da retina ocelar na cápsula cabeça até uma profundidade de 50 mm e injectar 250 nl de solução.
- Após o uso, lavar a seringa de 3 vezes com água destilada, em seguida, 3 vezes com etanol a 75%.
- Prepare abelha como em 1.3.2. e remover a lente do ocelo mediana, com o tIP de um microscalpel como em 1.3.3.
- Microinjecção em particular as estruturas cerebrais
NOTA: Para além dos tratamentos sistemáticos mencionados acima, é possível realizar microinjections em particular as estruturas cerebrais. Isto permite a manipulação farmacológica de uma ou mais regiões do cérebro, deixando outras afectada. Isso funcionamelhor com as regiões do cérebro que são fáceis de reconhecer a partir da superfície do cérebro anterior (por exemplo, lobos antenais, cálices cogumelo corpo ou lóbulos verticais, ou os lobos ópticos), mas outras regiões têm sido alvo. Por favor note que a orientação (anterior / posterior, dorsal / ventral) refere-se ao eixo do corpo, em vez, do que para o neuroeixo 19.- Prepara-se o fármaco em PBS ou da campainha da mesma maneira como em 1.2.1, adicionando um fluorescente (por exemplo, 0,5 mg / ml de dextrano, Alexa Fluor 546 ou 568) ou de um corante não fluorescente (por exemplo, 1 mM de metileno azul).
NOTA: A adição de um corante fluorescente vai permitir a verificação do local de injecção após o experimento é longo (usando microscopia confocal, após dissecção do cérebro), enquanto que corantes não fluorescentes permitem o monitoramento direto durante o experimento. - Para tornar pipetas de vidro para injeção, insira capilares de vidro do diâmetro correto em grampos titular de um puxador de eletrodo (1,0 mm para o porão padrãoer incluído para o microinjetor mencionado na lista de materiais). Ajustar as configurações de tração e de calor para produzir uma ponta de cerca de 0,5 cm de comprimento (definições serão diferentes para cada extrator, mesmo se o mesmo modelo é utilizado).
NOTA: Idealmente, as duas pipetas puxado a partir de um vidro devem ter o mesmo comprimento e forma, de modo que tanto pode ser utilizado. - Sob um microscópio estereoscópico, quebrar as pontas para obter um diâmetro exterior de cerca de 10-15 uM, com base na estimativa visual utilizando uma escala de uma retícula inserido na ocular. Os passos na escala são definidas pelo fabricante e podem ser corrigidos para a ampliação usada.
- Em seguida, preencha as pipetas de vidro com a solução para injetar. Se são utilizados capilares de vidro com filamentos, encher a pipeta, colocando o lado de trás para dentro da solução de droga, de outro modo preencher ponta utilizando pontas microloader.
- Inserir a pipeta de vidro cheio no suporte do capilar de um microinjector, a qual é controlada por um mi manual ou electrónicocromanipulator.
- Calibrar o microinjector para injectar o volume desejado (0,5-2 nl, dependendo do tamanho da estrutura do cérebro alvo). Para isso, injectar directamente para uma pequena placa de Petri contendo óleo mineral e medir o diâmetro da gotícula com a retícula. Alterar as configurações até que o volume desejado seja alcançado.
- Fixar a cabeça de uma abelha aproveitada usando cera dental macia como em 1.3.2, antes de cortar uma abertura na parte anterior da cápsula cabeça, usando um microscalpel, com três cortes: um pouco abaixo do ocellus mediana (ventral), um de a fronteira da direita ou olho esquerdo e um acima da antena hastes (dorsal). Use um pedaço de cera dental para segurar a aba aberta no lugar.
- empurre cuidadosamente glândulas e traqueia deitado em cima do cérebro de lado usando uma pinça fina, em seguida, fazer uma pequena ruptura no Neurilema (membrana muito fina em torno do cérebro) acima da estrutura do cérebro alvo.
NOTA: Se muitas abelhas estão a ser tratados ao mesmo tempo, este procedimentopode ser realizada mais cedo; no entanto, ter cuidado para não deixar abelhas neste estado por muito tempo (não mais de 30 min), como seus cérebros pode desidratar. - Inserir a ponta na região do cérebro desejado, e ajustar a profundidade perpendicular à superfície do cérebro (por exemplo, 60 uM para cálices corpo de cogumelo). Injectar o volume pré-definido. Para as regiões cerebrais laterais, injetam bilateralmente (ou seja, fazer uma injecção para cada hemisfério). Se um corante não fluorescente é usado, garantir a injeção ocorreu na região direita sobre a observação enquanto está a injectar. Se um corante fluorescente é usado fazer o mesmo sob luz fluorescente usando um estereomicroscópio com um sistema de visualização de fluorescência.
- Em seguida, coloque a tampa traseira aberta sobre a cabeça da abelha. Derreter um cristal de eicosano, que é de aproximadamente 1 mm de diâmetro, usando um fio fino enrolado em torno da ponta do ferro de soldar micro (temperatura de fusão é 35-37 ° C) e selar os cortes. Isto irá reduzir significativamente a mortalidade.
- Liberte oabelha do arnês para a análise comportamental (mas ver discussão), ou manter o arnês para experimentos com abelhas contido - por exemplo, a extensão probóscide reflex (PER) testando 20.
- Se foi utilizado um corante fluorescente, assegurar que a injecção de atingir a área de interesse, após a experiência acabou usando um microscópio de varrimento laser confocal (Figura. 1).
NOTA: Isto é particularmente útil quando o direcionamento áreas cerebrais mais profundas (onde seria difícil ver corante não fluorescente durante a fase de injecção).
- Prepara-se o fármaco em PBS ou da campainha da mesma maneira como em 1.2.1, adicionando um fluorescente (por exemplo, 0,5 mg / ml de dextrano, Alexa Fluor 546 ou 568) ou de um corante não fluorescente (por exemplo, 1 mM de metileno azul).
2. Métodos de administração de medicamentos para as abelhas vôo livre
- O tratamento oral
- Prepare droga, da mesma forma como nos passos 1.1.1-1.1.2. Adicionar solução de um fármaco a um alimentador e coloque na geladeira para o armazenamento.
Nota: Qualquer alimentador vai fazer, como uma tampa de garrafa de cabeça para baixo ou um frasco invertido sobre papel absorvente. - Treinar abelhas para um alimentador de gravidade contendo 1 M ou 0,5solução de sacarose M, colocando um alimentador perto da colmeia. Uma vez que as abelhas começar forrageamento no alimentador, movê-lo gradualmente mais longe até que ele esteja a uma distância confortável para evitar ser picado (mínimo 5 m).
- abelhas tinta de marca, a fim de manter o controle das abelhas individuais. Faça uma lista de todas as combinações de cores que serão utilizados. Quando uma abelha terras no alimentador, marque cuidadosamente seu abdômen com duas cores, e fazer uma nota na lista que a combinação é tomada.
- Trocar o alimentador de gravidade para um alimentador que contém a solução de fármaco / sacarose. Tome nota das abelhas marcadas que visitam o alimentador. Pegar qualquer abelha sem marcação visitar o alimentador como as abelhas são recrutadores prolíficos, e os números de abelhas que visitam o alimentador drogado pode rapidamente sair do controle. Isto é especialmente problemático se a mesma experiência é para ser realizado em dias sucessivos, como abelhas simples pode não ser ingénuos.
NOTA: Como uma alternativa para treinar abelhas individuais para um alimentador, autor anteriors ter alimentado com sucesso água sacarose-atada drogas a todo um ramo de 21-23.
- Prepare droga, da mesma forma como nos passos 1.1.1-1.1.2. Adicionar solução de um fármaco a um alimentador e coloque na geladeira para o armazenamento.
- O tratamento tópico
NOTA: O objectivo é dissolver o composto de interesse no seio de um solvente que pode penetrar a cutícula cerosa inseto. Diferentes solventes podem ser utilizados para este fim. O mais vulgarmente utilizado incluem acetona, dimetilformamida (DMF) e dimetilsulf óxido (DMSO).- Avaliar quais solvente funciona melhor para o composto em questão. Se um fenótipo forte é esperado a partir de uma sobredosagem (por exemplo, paralisia ou morte), abelhas tratar (passo 2.2.2), com uma dose elevada (por exemplo, 20 ug a cocaína 7) Dissolveu-se em cada um dos diferentes solventes e cuidadosamente monitorar o tempo até paralisia ou morte.
- Usando um microcapilar 1 uL (ou uma micro-seringa, que pode ser instalado em um dispensador de repetição apropriado) e titular microcapilar, compre 1 ul da solução do fármaco (por exemplo, 381; g / L de cocaína) para o capilar. Expelir a gota, e pintá-lo com cuidado sobre o tórax de uma abelha marcada. Cubra tão grande de uma área de uma possível com a solução, em vez de deixar uma gota sólida, como a abelha é provável, portanto, para noivo-lo. Tenha cuidado para não permitir que o composto em contato com a asa dobradiças, ou isso pode desenhá-lo fora do tórax e ao longo das asas, onde ele irá evaporar, sem ser absorvido na hemolinfa.
NOTA: Dependendo do objectivo de investigação, este método também pode ser utilizado para administrar drogas para o abdómen da abelha. No entanto, drogas atingir o SNC e mais rápido em maiores quantidades quando aplicado ao tórax método .Este 24 funciona igualmente bem com aproveitada como com as abelhas de vôo livre.
- tratamento volatilizado
- Dissolve-se a droga (anteriormente este método foi usado para entregar cocaína para abelhas 10) em 100% de etanol. Para garantir a solubilidade, não use um cloridrato ou outras formas de sal dodroga se possível. Ao fazer uma diluição prepará-lo de modo a que a quantidade a ser entregue a um abelha está presente em 100 ul. O uso do etanol puro como um controlo do veículo.
- Para criar um filamento, utilizar o mesmo procedimento como McClung e Hirsh 25.
- Resumidamente explicou: acabar fio de nicromo firmemente em torno de um prego e anexar a dois fios elétricos (um em cada extremidade do filamento). Remover o prego. A bobina de nicrómio restante é referido como o filamento.
- Passe os dois fios através de orifícios perfurados no cuidadosamente a tampa de um tubo de centrífuga de 50 ml, o que deve ser resistente à temperatura escolhida. Cole os fios no lugar com silicone líquido.
NOTA: Isto fará o hermético tubo. Isto é essencial para evitar a exposição secundária ao experimentador e assegurar que as abelhas são tratados com a dose apropriada.
- Anexar os fios que conduzem ao filamento a uma fonte de energia. Usando um termopar para medir a temperatura deo filamento, experiência com diferentes combinações de tensão / corrente até que aquela que resulta em um perfil de temperatura adequado para a droga em questão, de preferência, uma que permite a 10 s de aquecimento ou menos. Isto é muito importante, referem-se a literatura relevante (por exemplo, a fim de cocaína para volatilizar precisa de ser aquecida a pelo menos 200 ° C, mas a temperaturas superiores a 350 ° C, ele é dividido em compostos secundários 26).
- Cuidadosamente Pipetar 100 ul de droga que contém uma solução de etanol para o filamento. Espalhe o líquido sobre a superfície do filamento, tanto quanto possível, pois isso irá aumentar a eficiência da evaporação. Deixar o filamento exposto à temperatura ambiente até todo o etanol se ter evaporado.
NOTA: Se o etanol não é suficientemente evaporada, abelhas vai ser tratada tanto com a droga de escolha e etanol. As abelhas são extremamente sensíveis ao etanol, e alguns fármacos têm interacções sinérgicas com etanol, o que vai viés exresultados rimentais. - Uma vez que o etanol foi completamente evaporado (geralmente precipitado droga pode ser visto sobre o filamento seco sob um microscópio), apanhar um abelha de vôo livre em um tubo de 50 ml. Cuidadosamente fechar a tampa contendo o filamento.
- Ligue a alimentação durante 10 segundos, desligar o gravador, e esperar mais 50 segundos (para permitir que o composto volatilizado para esfriar e, assim, condensar ou depósito). Solte a abelha.
NOTA: Embora este método de tratamento funciona de forma excelente para as abelhas de vôo livre, ele pode ser usado apenas como eficazmente com as abelhas aproveitado. Basta conectar a abelha aproveitada dentro de um tubo de 50 ml. Recarregar o filamento tal como descrito no 2.3.4 entre abelhas. Para um maior rendimento, vários filamentos podem ser usados em paralelo.
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Representative Results
Uma selecção de resultados representativos para os métodos acima descritos são representados, principalmente para demonstrar que os métodos de permitir que os agentes farmacológicos para chegar ao cérebro e afectar o comportamento das abelhas de mel.
efeitos específicos sobre processos cerebrais podem ser facilmente obtidos após a injecção tórax.
Como os agentes farmacológicos injectados através do tórax pode actuar em vários alvos no corpo, e ser diluída para o corpo antes de chegar ao cérebro, esta técnica pode aumentar possíveis preocupações especificidade. No entanto, tem sido amplamente utilizada na literatura para interferir com os processos cognitivos, sem a necessidade de utilizar doses muito elevadas que podem produzir efeitos secundários principais. Por exemplo, bloqueadores de transcrição foram administrados utilizando esta técnica, a fim de identificar fases de memória que requerem geneexpressão. Thorax injecção de tais moléculas é compatível com uma sobrevivência para vários dias 27, o que significa que o seu potencial de acção tóxica sobre outros alvos pode ser limitada, desde que a concentração é bem escolhidos. Em tais condições, podem ser obtidos efeitos selectivos e dependentes do tempo na memória, mostrando assim direccionamento eficaz do cérebro (Figura. 2).
Difusão de moléculas na hemolinfa cabeça conduz a efeitos rápidos e dependentes da dose.
injeção ocellus é uma maneira de permitir uma difusão rápida de moléculas de interesse em toda a cabeça através da hemolinfa, especialmente se eles podem ter muitas metas generalizadas no cérebro. Este método foi utilizado para administrar allatostatins, neuropéptidos que pode também actuar como neuro-28). Como consequência, uma redução do desempenho foi observado num ensaio de aprendizagem olfactiva, consistente coma presença sugerido de allatostatin receptores em diferentes regiões do cérebro envolvidas no processamento olfativo e aprendizagem 28. Uma curva dose-dependente para este efeito pode ser estabelecido, por injecção de diferentes concentrações de grupos independentes são executados em paralelo (Fig. 3).
Diferentes vias de administração pode produzir efeitos semelhantes sobre a função cerebral.
Emetina, um bloqueador da síntese de proteínas, é usado para prejudicar a formação da memória olfactiva memória precoce de longo prazo, que é normalmente expressa 1-2 dias após o condicionamento. Na maioria dos estudos publicados que tenha sido injectada no tórax 29. Mostrámos que efeitos semelhantes podem ser obtidos por administrando-o directamente para o cérebro através do tracto ocelar (Figura 4.): Proporcionar um ajustamento de parâmetros de injecção (menor volume, concentração mais elevada e mais curtoatraso antes do acondicionamento), obteve-se uma diminuição (~ 20%) semelhante ao encontrado na literatura utilizando a mesma quantidade de droga (10 nM) - comparar com a figura 4 em Stollhoff et ai, 2005 29..
Os efeitos de injecções localizadas estão confinados no tempo e no espaço
Para testar as propriedades espaciais e temporais da droga micro-injectadas em regiões específicas do cérebro, abelhas atrelados foram treinados num olfactiva PER paradigma de condicionamento e, em seguida injectados bilateralmente com 0,5 nl de procaína 740 mM (um anestésico) em cálices corpo de cogumelo ou de lobos verticais ( solução salina foi usada como um controlo). Quando as abelhas foram sucessivamente testado para recolha 1, 2, e 3 horas após a injecção, o desempenho foi prejudicada apenas em abelhas com injecções bilaterais no lóbulos (Figura. 5). saída intacta neural dos lobos, mas não a partir dos cálices, é conhecida aser necessária para a recuperação da memória olfactiva, então isto sugere que a procaína permaneceram localizados ao lobo no qual tinham sido injectados durante pelo menos 3 h. Ele também mostra que, quando injetado nos cálices, difusão para os lobos nas proximidades foi limitado durante o mesmo período, uma vez que uma injeção calycal de procaína não levou ao bloqueio dos lobos.
Fenótipos comportamentais após a administração de drogas são muitas vezes dependente do contexto
Experiências anteriores mostraram que após o tratamento com as abelhas cocaína sobre-estimar a qualidade de uma solução de sacarose a 10,30. Para ver se este efeito foi dependente de contexto (aqui, a qualidade de sacarose linha de base), que voam livres abelhas foram tratados com cocaína volatilizado. Individualmente abelhas voando livres marcadas foram autorizados a forragem em um alimentador contendo solução de sacarose 1 M. No alimentador, as abelhas foram capturadas no suavementeum tubo de centrífuga de 50 ml como eles estavam prestes a sair do alimentador. As abelhas foram tratados quer com 100 ug de base livre de cocaína ou de controlo de veículo (etanol evaporou). Após o tratamento, o alimentador de sacarose ou foi substituído por uma solução a 0,5 M ou um alimentador de 2,0 M de sacarose, e as taxas de forrageiras devolvido para o alimentador foi gravado. Utilizando este paradigma, as abelhas tratadas com cocaína aumentar o esforço de A alimentar no alimentador de 0,5 M, mas não no alimentador 2.0 M (Figura 6). A diferença no efeito observado com as duas concentrações de sacarose demonstra muito bem a importância de tomar estímulos ambientais em conta quando se estuda o comportamento das abelhas.
Figura 1: confocal de varredura a laser Imagem do local da injeção. dextrano Alexa 546-marcado é injectado em conjunto com a solução de fármaco (vermelho). Para identificar o neurópilosa contra-coloração com DAPI é adicionado (verde). No hemisfério direito do local da injecção foi localizado no lóbulo vertical (LV), mostrada como um exemplo de uma injecção com sucesso. No hemisfério esquerdo do local da injecção foi localizado dorsal do lóbulo vertical na neurópilo anel, mostrado como um exemplo para uma injecção mal sucedida. Barra de escala = 100 mm, MB: Corpos de cogumelos, AL: antenais Lobes, d: dorsal, v: ventral, L: esquerda, R: Sim. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito dependente do tempo de actinomicina D (Transcrição Blocker) na memória de longo prazo, quando injetados na Thorax Em diferentes atrasos seguinte condi olfativa appetitive. mento (6, 9 ou 12 h), 1 mL de actinomicina D (1,5 mM em PBS) foi injectado no tórax. Memória (LTM) de recuperação de longo prazo foi avaliada 3 d após condicionamento (n = 25-65). O desempenho da memória foi reduzida de uma forma dependente do tempo, quando comparada com a dos controlos tratados com PBS: o efeito foi significativo quando injecção também colocar 6 h após condicionamento (χ 2 = 18,04, p <0,005), mas não em atrasos mais longos ( 9 h: × 2 = 0,95; 12 h: χ 2 = 0,47), sugerindo que a formação LTM exige uma onda de transcrição que ocorre durante um intervalo de tempo definido após o condicionamento. As barras de erro representam erros padrão. Dados foi publicado anteriormente 27 e é recriado aqui com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3:. A inibição dependente da dose da aprendizagem Desempenho a seguir à injecção de um neuropeptídeo ocelar O neuropeptídeo allatostatin C foi injectada na hemolinfa cabeça (200 nl em PBS), através do ocelo mediana, 1 h antes do condicionamento olfactiva. grupos independentes de animais injectados com diferentes concentrações (ou PBS para controles) foram treinados. tratamento Allatostatin C levou a uma diminuição no desempenho da aprendizagem, tal como avaliada pela percentagem de respostas condicionadas na última condicionado, de um modo dependente da dose a seguir uma curva em forma de U (n = 70-78). Esta diminuição foi significativa em 10 -6 M, mas não em outras concentrações. As barras de erro representam erros padrão. Dados foi publicado anteriormente em 28, e está adaptada aqui com permissão. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.
Figura 4:. O bloqueio de uma D Memória ay a seguir à injecção de emetina (Tradução inibidor) por meio do ocelar Trato A emetina inibidor de síntese de proteínas (50 mM em PBS, 200 nl) foi injectada no cérebro, através do tracto ocelar, 20 min antes de condicionado olfativo. Memória foi então testado 24 h mais tarde. O tratamento de retenção diminuída de modo significativo de memória (χ 2 = 7,03, p <0,01) em comparação com os controlos tratados com PBS (n = 57-70). As barras de erro representam erros padrão. JM Devaud, dados não publicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Anatômica e temporal Especificidade da Microinjeções Seguindo condicionado olfativa appetitive, procaína foi injetado bilateralmente em ambos os cálices do corpo de cogumelo ou lóbulos verticais. Recuperação da memória foi avaliado 1 hora após a injecção e só foi afectada por injecções procaína nos lóbulos (1 h após o tratamento: vs solução salina: χ 2 = 10,00, p <0,005; vs procaína a cálices: χ 2 = 32,92, p < 0,005). O efeito pode ainda ser visto 2 h (χ 2 = 6,65, p <0,01) e 3 (χ 2 = 27,22, p <0,005) após a injecção, e ainda era específica do local (2 h: χ 2 = 8,60, p < 0,05; 3 h: χ 2 = 17,15, p <0,0001), o que sugere que apenas a área afectada foi injectado por procaína. As proporções são em relação ao nível de condicionamento dutocar a última prova condicionado. As barras de erro representam erros padrão (n = 23-28). Dados foi publicado anteriormente em 31, e é recriado aqui com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:. Efeitos da cocaína nas abelhas vôo livre taxa de visitação (número de visitas por uma abelha dadas / visitas médios para todas as abelhas durante o período de teste) foi aumentada após o tratamento cocaína volatilizado em uma fonte de baixa qualidade (0,5 M: t 70 = 5,0710, p = 0,00003), mas não a uma fonte de alta qualidade (2M: T 70 = -0,2087, p = 0,8353). As caixas representam 1º e 3º quartis com a linha média que mostra a mediana. Os bigodes estender a 1,5x do intervalo interquartil. Outliers não estão representados como todos os pontos de dados individuais são sobrepostas. Dados foi publicado anteriormente em 10, e é recriado aqui com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tratamento | Pode ser feito com abelhas voando LIVRE? | Pros | Cons |
| O tratamento oral | Sim. | Fácil, minimamente invasiva. | Bee digestão não é simples |
| O tratamento tópico | Sim. | Fácil, minimamente invasivo, rápido. | Os tratamentos repetidos podem ser problemático. |
| Injecção no tórax | Complicado,afeta as abelhas habilidades de vôo | Consistente e robusto. | Um pouco invasiva. Potencial de prejudicar / abelha stress. |
| Injecção no ocellus médio | Não recomendado. | Consistente e robusta, tanto localizadas. | Um pouco invasiva. Potencial de prejudicar / abelha stress. |
| Injecção no trato ocelar | Não recomendado. | muito localizada | Muito invasivo. Potencial de prejudicar / abelha stress. |
| Micro-injecção em regiões do cérebro | Não recomendado. | muito localizada | Muito invasiva, difícil de realizar. Potencial de prejudicar / abelha stress. |
| entrega da droga volatilizado | Sim. | Fácil, minimamente invasivo, rápido. | não funciona para todas as drogas. |
Tabela 1: Comparifilho dos métodos de tratamento diferentes e suas propriedades.
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Discussion
Os métodos descritos acima permitir um tratamento simples, eficaz e robusto de qualquer vôo livre ou abelhas aproveitado. Estes métodos são compatíveis com diversos paradigmas experimentais e questões biológicas (Tabela 1). Todos os métodos livre de vôo pode ser facilmente aplicado para as abelhas aproveitado. O inverso é menos bem sucedido, no entanto, uma vez restrição temporária e métodos invasivos de tratamento muitas vezes pode comprometer a capacidade de vôo das abelhas.
Os métodos têm sido apresentados a partir de uma perspectiva cérebro-centric. Isto não é devido a limitações inerentes às técnicas, mas sim por causa de interesses pessoais dos autores. Não há razão para que estes métodos não podem ser utilizados para o estudo de outros órgãos. No entanto, pequenas modificações podem ser necessários para tornar o método mais adequado para outros sistemas de órgãos. Por exemplo, enquanto o tratamento tópico destina-se a chegar ao cérebro é tipicamente aplicada ao tórax, pode ser preferível aplicar this para o abdômen, se o alvo pretendido é ovários. Da mesma forma, as injeções podem ser facilmente aplicada a outras áreas do que o tórax ou na cabeça (por exemplo, órgãos abdominais pode ser alvo de injetar entre as sclerites abdominais).
Em termos dos quais compostos podem ser administrados para as abelhas, realmente não há limites. Normalmente, as pessoas têm administrados compostos farmacológicos tais como moléculas de sinal 21 ou seus antagonistas 32, e peptídeos feitos sob medida 28. No entanto, tem havido um aumento recente na administração de compostos abelhas com perguntas aplicadas em mente, como pesticidas 33 e contaminantes antropogénicos 34. Recentemente, compostos administrados começaram a incluir moléculas de RNA que interferem com a expressão do gene diretamente, como dsRNA ativando a interferência via RNA 35 ou mesmo microRNAs 36 e antagomirs 37. Nem todos os métodos funcionam igualmente bem para todos os compostos.Este é talvez melhor ilustrado por compostos amargos ou azedos que fazem água com açúcar intragável para abelhas, impedindo-os de consumi-la. moléculas frágeis, tais como ARN ou certos polipéptidos, são quebradas, quando aquecido durante um procedimento de volatilização ou colocado em um solvente como DMF dura. Por conseguinte, é importante compreender a química do que está sendo administrado para assegurar que sobrevive ao processo de tratamento.
Conseguir um agente farmacológico em uma abelha é a parte fácil, mas há três grandes preocupações que nunca deve ser tomada de ânimo leve ao realizar experimentos farmacológicos. A primeira é descobrir uma boa dose para o experimento em questão. Dependendo do fármaco, não pode já ser publicada literatura disponível, mas para a maior parte, isto terá de ser resolvido por uma mistura de buscas na literatura, conjecturas informado, e as curvas de dose-resposta. Dependendo de como é complicado o protocolo experimental é, pode ser útilprimeiro gerar uma curva dose-resposta em ensaios biológicos mais simples (por exemplo, quantificando movimento geral ou a sobrevivência) para ter uma idéia melhor de uma dose-range vale a pena tentar em um bioensaio mais elaborado. No nosso laboratório, uma dose de partida ou é encontrada na literatura abelha ou fazendo um mg / kg de conversão com base nos dados da literatura roedor. A partir deste ponto de partida, as abelhas são tratados com a dose inicial, mais 2 ou 3 doses de 10 vezes maiores e menores do que a dose inicial (por exemplo, se a dose inicial é de 1 mg, 0,01, 0,1, 10, e 100 mg também seria utilizado), e, claro, um controlo de veículo apropriado.
O segundo problema é um pouco mais mimado: especificidade de drogas. A maioria dos medicamentos não foram desenvolvidos com as abelhas, ou qualquer outro inseto, em mente. Devido a isso, os efeitos fora do alvo são comuns (por exemplo, mianserina, um antagonista do receptor de serotonina vertebrado 38, foi pensado para ser um insecto octopaminergic antagonista do receptor, mas recente Fidescobertas mostram que em abelhas também é um antagonista do receptor de dopamina 39). Uma solução comum para este problema é, em vez de depender de apenas um medicamento, para repetir o mesmo experimento com um conjunto de fármacos que têm o alvo de interesse em comum. Basicamente, se vários fármacos são conhecidos por bloquear um determinado alvo, observando-se resultados semelhantes em diferentes drogas devem dar maior confiança de que a droga tem o efeito esperado, uma vez que diferentes drogas têm muitas vezes perfis fora do alvo original.
A última questão consiste em assegurar que a droga está agindo onde é suposto estar a agir. A este respeito, haverá sempre um trade-off entre especificidade e capacidade de invasão. métodos de tratamento sistemático são geralmente a menos invasiva, mas não existe nenhum controlo de onde no corpo abelha a droga está a ter o seu efeito. Mesmo para microinjecção de tecidos alvo drogas podem viajar com a hemolinfa para outras partes do corpo de abelha. Como esta questão é abordada needs ser informado pelas questões colocadas. Para certos experimentos localização anatômica é irrelevante, enquanto que para outros, esta é a única questão de importância. A melhor maneira de lidar com isso é começar com tratamentos sistêmicos e gradualmente diminuir a uma localização anatômica usando métodos cada vez mais específicas. Se o comportamento a ser estudada é particularmente incompatível com métodos invasivos de tratamento, pode valer a pena tentar desconstruí-lo em componentes mais simples antes de fazer uma série de experimentos com tratamentos farmacológicos muito específicas.
Este problema de fuga de droga é ainda mais exagerada com o tratamento oral de abelhas de vôo livre, em que as drogas podem afectar abelhas não-alvo. abelhas forrageiras recolhem o néctar no campo para trazer de volta à sua colônia. Eles vão descarregar a maioria de sua solução de sacarose na colmeia ao retornar ao invés de absorvê-lo. Na colméia é lançado em células, desidratados e armazenados como mel. Por causa deeste, os fármacos podem afectar potencialmente abelhas não-alvo. Com os métodos mais específicos (tais como micro-injecções), este problema é minimizado.
Com essas ressalvas em mente, e tratada adequadamente, manipulação neurofarmacologia de abelhas pode ser uma ferramenta muito poderosa. Enquanto as ferramentas de transgênicos estão sendo desenvolvidos para as abelhas 15, por causa de seu estilo de vida social, é pouco provável que os transgênicos nunca vai ser uma maneira fácil e confiável para realizar estes tipos de experimentos. Portanto, é provável que a farmacologia continuará a ser um elemento importante da pesquisa de abelhas no futuro. Enquanto alguns pesquisadores de abelhas fizeram chamadas para métodos experimentais padronizados 40, neste caso, isso seria um erro. Parte do poder do sistema de abelha tem sido sempre a diversidade de abordagens experimentais, e como técnicas foram desenvolvidas com questões biológicas reais em mente, em vez de o contrário. No entanto, é importante garantirmoso uso do método mais adequado para a questão em apreço. Se as comparações com estudos anteriores são fundamentais, protocolos padronizados devem ser seguidas à risca. No entanto, utilizando o protocolo estabelecido por causa da utilização de métodos padronizados não deve ser deixada em repouso no caminho do desenvolvimento de novos métodos que podem abrir novas possibilidades experimentais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
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