Summary
Detta manuskript beskriver flera protokoll för administrering av farmakologiska medel till honungsbin, inklusive enkla icke-invasiva metoder för fritt flygande bin, samt mer invasiva varianter som gör exakt lokaliserad behandling av återhållen bin.
Abstract
Honungsbin visar häpnadsväckande inlärningsförmåga och avancerad socialt beteende och kommunikation. Dessutom är deras hjärna liten, lätt att visualisera och att studera. Därför har bin länge varit en gynnad modell bland neurobiologists och neuroethologists för att studera neurala grunden för social och naturliga beteende. Det är dock viktigt att de experimentella tekniker som används för att studera bin inte stör de beteenden som studeras. På grund av detta har det varit nödvändigt att utveckla en rad tekniker för farmakologisk manipulation av honungsbin. I denna uppsats visar vi metoder för behandling av återhållen eller fritt flygande honungsbin med ett brett spektrum av farmakologiska medel. Dessa inkluderar både icke-invasiva metoder såsom orala och utvärtes behandlingar, liksom mer invasiva metoder som möjliggör exakt drug delivery antingen systemisk eller lokal mode. Slutligen, vi diskutera fördelar och nackdelar med varje metod och beskrivagemensamma hinder och hur man bäst övervinna dem. Vi avslutar med en diskussion om vikten av att anpassa den experimentella metoden till de biologiska frågor snarare än tvärtom.
Introduction
Eftersom Karl von Frisch klar sin dans språk 1, har honungsbin förblivit en populär studie art för forskare i djurens beteende och neurobiologi. Under de senaste åren en myriad av nya discipliner har dykt upp i skärningspunkten mellan dessa två områden, och flera andra discipliner (t.ex., molekylärbiologi, genomik och datavetenskap) har uppstått vid sidan av dem. Detta har lett till en snabb utveckling av nya teorier och modeller för att förstå hur beteende är resultatet av aktivitet i nervsystemet. På grund av den unika livsstil, rika beteenderepertoar och enkel experimentell och farmakologisk manipulation, har bin kvar i spetsen för denna revolution.
Honungsbin används för att studera grundläggande neurobiologiska frågor som de underliggande inlärning och minne 2,3, beslutsfattande 4, lukt 5, eller visuell bearbetning sex. Under de senaste åren, HONey bee har även använts som en modell för att studera ämnen i allmänhet reserverade för medicinsk forskning, såsom effekterna av beroendeframkallande droger 7 - 11, sova 12, åldrande 13 eller de mekanismer som ligger till grund för anestesi 14.
Till skillnad från de klassiska genetiska modellorganismer (t.ex. D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), det finns mycket få genetiska verktyg för att manipulera neurala funktioner i honungsbin, även om detta är närvarande förändras 15. I stället har honungsbiet studier främst förlitat sig på farmakologiska manipulationer. Detta har varit mycket framgångsrik; dock, är den mångfald av bee forskning så att en rad metoder för farmakologisk administration behövs. Forskning med honungsbin behandlar vitt skilda frågor, studeras av forskare från olika discipliner och bakgrunder, och använder en mängd olika experimentella metoder. många research frågor kräver bin till antingen fritt flygande, fritt interagera i sin koloni, eller båda. Detta kan göra det svårt att hålla reda på enskilda försöksdjur, och gör återhållsamhet eller kanyle omöjligt.
För att tillgodose de olika honungsbiet forskning behövs ett flertal drug delivery-metoder, vilket möjliggör robust och flexibel administration samtidigt som den farmakokinetiska och farmakodynamiska profilerna, invasivitet av metoden och dess tillförlitlighet, passa paradigm i fråga. På grund av dessa olika behov, har de flesta forskargrupper utvecklat sina egna unika läkemedelsadministreringsmetoder. Hittills har detta varit en styrka av biet forskarsamhället; Det har lett till utvecklingen av uppsättningar av metoder som gör det möjligt för administration av samma läkemedel i olika situationer. Vårt mål är inte att utveckla en enda standardiserad metod för farmakologiska manipulationer av bin, utan snarare att belysa metoder somhar visat sig vara särskilt framgångsrik, och hjälpa forskare antar dessa. Vi diskuterar de grundläggande principerna för hur de fungerar, samt deras fördelar och nackdelar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drug Administration för utnyttjas bin
- oral behandling
- Förbereda 1,5 M sackaroslösning genom blandning av 257 g sackaros med 500 ml vatten (det är lättare att lösa upp denna mängd sackaros i kokande vatten). Lagra sackaroslösning vid 4 ° C fram till användning.
OBS: Sucrose lösning ger en mycket gästfri miljö för vissa mikroorganismer, och därmed lätt blir förorenat och obehagliga för bin. Bulk sackaroslösning kan alikvoter och lagrades vid -20 ° C fram till användning. - Besluta om en lämplig läkemedelsdos (hur man ska uppnå det, behandlas i diskussionen nedan), och förbereda en lösning så att den föredragna läkemedelsdos löses i 20 mikroliter sackaroslösning (t.ex. för att leverera 20 mikrogram, späd läkemedel vid en förhållande av 1 mg / ml). Sele bin enligt Felsenberg et al. (2011) 16. Gör detta steg åtminstone 12 timmar före läkemedelsbehandling för att säkerställa att bina inte längre stressad out från utnyttja när läkemedelslösningen presenteras.
OBS: För mer konsekventa resultat, är det bäst att svälta bin (genom att placera selade bin i en inkubator vid 34 ° C och 70% luftfuktighet) O / N. - Med hjälp av en mikropipett trycker en droppe 1,5 M sackaros vatten till antennen av en utnyttjas bi. När snabel förlängs trycker en 20 pl droppe av 1,5 M sackaros innehållande läkemedlet direkt till snabel i bee. Se till att biet förbrukar allt. Som vehikelkontroll använda 1,5 M sackaroslösning utan tillsatta läkemedel.
OBS: Mängden sackaroslösning kan behöva justeras baserat på experimentella planer. Om appetitive Konditioneringen är avsedd att mata bina strax före träning stör binas känslighet. - Kasta eller avsätta bin som inte förbrukar all sackaros.
OBS: Om ett stort antal bin misslyckas med att dricka sackaroslösning, kanske utfodring schema behöva justeras.
- Förbereda 1,5 M sackaroslösning genom blandning av 257 g sackaros med 500 ml vatten (det är lättare att lösa upp denna mängd sackaros i kokande vatten). Lagra sackaroslösning vid 4 ° C fram till användning.
- Injektion i bröstkorgen
- Förbered läkemedel i honungsbiet Ringer 17 enligt följande:
- Blanda och autoklav 7,45 g NaCl, 0,448 g KCl, 0,812 g MgCl2, 0,735 g CaCl2, 54,72 g sackaros, 4,95 g D-glukos, och 2,48 g HEPES i 1000 ml vatten. Var försiktig vid förvaring Ringer eftersom det är lätt förorenas. Alikvot och Ringer förvara vid -20 ° C fram till användning.
- Lösa upp läkemedlet i Ringer-lösning och därefter utspädd så att den önskade mängden är närvarande i 5 fil. Som ett exempel, om bin ska behandlas med 5 | j, g av ett läkemedel, en g kan initialt lösas i 1 ml i Ringer, innan den späddes 1: 1000 i Ringer för en slutlig lösning av 1 mikrogram / l.
OBS: Alternativt kan kommersiellt tillgängliga PBS (Fosfatbuffrad Salin) kan användas i stället för Ringers lösning.
- Gör en microscalpel genom att bryta av hörnet av ett dubbeleggat rakblad meden bladhållare. Fäst bladet fragmentet till en bladhållare, så att det blir en fin blad med en vass slutpunkt.
- Under ett stereomikroskop, noggrant använda microscalpel att skära ett 2 mm hål precis ovanför scutellum, intill den bakre vingen processen av ett bi bröstkorg. Undvika att skära för djupt eftersom det kan skada flygmuskler, och vara noga med att undvika ving gångjärn. Helst skär bara tre sidor, så att fliken på nagelbanden senare kan vikas tillbaka för att stänga platsen för skadan.
- Med användning av en mikropipett för att anbringa 5 μlL Ringer (eller PBS) innehållande läkemedlet på toppen av hålet i bröstkorgen. Noggrant följa under mikroskop för att se till att hela droppen absorberas i hemolymfa. Använd Ringer (eller PBS) som en vehikelkontroll.
- Om möjligt, flytta nagelbanden flik tillbaka över hålet. Efter 5-10 timmar, kommer det att sätta tillbaka och täta.
OBS: Som ett alternativ till denna teknik, injicera en il direkt in i bröstkorgen med hjälp av en glasspruta, efter att ha öppnat ett small hål i mitten av frenum (tvärgående linje i den bakre regionen av scutellum) med en sprutnål (diameter: 0,6 mm, G: 23). Detta kringgår behovet av att först skära bröstkorgen med en skalpell och injektionsstället är mindre, men denna metod kommer att lämna injektionsstället exponeras.
- Förbered läkemedel i honungsbiet Ringer 17 enligt följande:
- ocellus injektion
OBS: Detta är en metod som är lämplig för att leverera molekyler hela huvudet kapsel, i hemolymfa.- Förbered droger som i 1.2.1, men justera läkemedelskoncentrationer så att den önskade dosen kommer att finnas i 1 pl Ringer eller PBS (kan mindre volym absorberas genom ocellus hålet än genom bröstkorgen).
- Förbered en microscalpel som i 1.2.2. Under en stereomikroskop, låsa huvudet på en utnyttjas bi på plats genom att fylla i nacken spricka med vax. Använd låg temperatur smältande vax (t.ex. tand vax) för att undvika skador på antenn luktreceptorer eller andra celler som kan vara important för bedömning av beteende (t.ex. lukt lärande). Sedan försiktigt bort objektivet av median ocellus genom att sticka in spetsen på microscalpel under linsen och försiktigt bryta linsen fri från huvudet kapsel.
OBS: Det är också möjligt att placera vax noggrant över antenner för att förhindra rörelse. - Noggrant pipettera drogen på ocellus hålet. Vänta tills allt tas in i huvudet kapsel. Att ta bort tand vax från antennerna och låt bi för att vila en stund innan det fortsätter den experimentella proceduren. Använd Ringer (eller PBS) som en vehikelkontroll.
- Injektion i ocellar vägarna
OBS! Ocellar kanalen innehåller stora fibrer, ansluta till de flesta regioner i centrala hjärnan 18. Denna behandlingsmetod möjliggör att applicera föreningar endast hjärnan, men inte riktade mot särskilda regioner i hjärnan.- Förbered bee som i 1.3.2. och ta bort lins av median ocellus med tip av en microscalpel som i 1.3.3.
OBS: Detta kan göras upp till 2 h före injektionen. Baserat på vår erfarenhet, matade bin är bättre på att hantera denna operation än svalt bin - Fyll en glasspruta 10 pl utrustad med en liten mätare (t.ex. 33, diameter: 210 nm) nål med läkemedelslösning framställd som i 1.3.1.
- Med hjälp av en manuell mikromanipulator, för in sprutspetsen genom ocellar näthinnan in i huvudet kapseln till ett djup av 50 | j, m och injicera 250 nl av lösning.
- Efter användning, skölj sprutan 3 gånger med destillerat vatten, därefter 3 gånger med 75% etanol.
- Förbered bee som i 1.3.2. och ta bort lins av median ocellus med tip av en microscalpel som i 1.3.3.
- Mikroinjektion i synnerhet hjärnstrukturer
OBS: Utöver de systematiska behandlingar som nämns ovan, är det möjligt att utföra microinjections i vissa hjärnstrukturer. Detta gör det möjligt för farmakologisk manipulation av ett eller flera områden i hjärnan, medan andra påverkas inte. detta fungerarbäst med hjärnregioner som är lätta att känna igen från den främre hjärnans yta (t.ex. antenn lober, svampkropps calyces eller vertikala lober, eller de optiska loberna), men andra regioner har riktats. Observera att orienteringen (främre / bakre, dorsala / ventrala) hänvisar till kroppens axel, snarare än till neuraxis 19.- Förbereda läkemedlet i Ringer eller PBS på samma sätt som i 1.2.1, tillsätta ett fluorescerande (t.ex., 0,5 mg / ml Dextran, Alexa 546 eller 568 fluor) eller icke-fluorescerande färgämne (t.ex., 1 mM metylenblått).
OBS: Tillägget av ett fluorescerande färgämne kommer att tillåta kontroll av injektions plats efter experimentet är över (med hjälp av konfokalmikroskopi, efter hjärn dissektion), medan icke-fluorescerande färgämnen tillåter direkt övervakning under experimentet. - För att göra glaspipetter för injektion, sätt glas kapillärerna i rätt diameter i hållaren klämmor hos en elektrod avdragare (1,0 mm för standard holder ingår för microinjector nämns i förteckningen material). Justera pull och värmeinställningar för att producera en ca 0,5 cm lång spets (inställningar kommer att vara annorlunda för varje avdragare, även om samma modell används).
OBS: Helst de två pipetter drogs från ett glas bör ha samma längd och form, så att båda kan användas. - Under ett stereomikroskop, bryta de tips för att erhålla en ytterdiameter av ca 10-15 | im, baserat på visuell bedömning med hjälp av en skala på en gradnät införd i den okulära. Stegen på skalan definieras av tillverkaren och kan korrigeras för förstoring används.
- Fyll sedan glaspipetter med lösningen att injicera. Om glas kapillärer med trådar används, fylla pipetten genom att placera baksidan i läkemedelslösningen, annars fylla spetsen med hjälp av micro tips.
- Sätt den fyllda glaspipett i kapillär innehavaren av en microinjector, som styrs av en manuell eller elektronisk micromanipulator.
- Kalibrera microinjector att injicera önskad volym (0,5-2 nl, beroende på storleken på hjärnstruktur riktade). För detta, injicera direkt i en liten petriskål innehållande mineralolja och mäta diametern på droppen med streckplattan. Ändra inställningarna tills önskad volym uppnåtts.
- Fäst huvudet på en utnyttjas bi använder mjuk dentalvax som i 1.3.2, innan du skär en öppning i den främre delen av huvudet kapsel, med hjälp av en microscalpel, med tre skär: ett strax under median ocellus (ventrala), en vid gränsen till höger eller vänster öga och en ovanför antennen stjälkar (rygg). Använd en bit dentalvax att hålla öppnade klaffen på plats.
- Tryck försiktigt körtlar och luftstrupen som ligger ovanpå hjärnan åt sidan med fin pincett, sedan göra en liten ruptur i neurilemma (mycket tunt membran runt hjärnan) ovanför målinriktade hjärnstrukturen.
OBS: Om många bin skall behandlas på en gång, denna procedurkan utföras tidigare; dock vara noga med att inte lämna bin i detta tillstånd för lång (högst 30 min), eftersom deras hjärnor kan torka ut. - In spetsen i den önskade hjärnregion och justera djup vinkelrätt mot hjärnans yta (t.ex. 60 um för svampkropps calyces). Injicera den förinställda volymen. För sidoområdena hjärnan, injicera bilateralt (dvs göra en injektion till varje halvklotet). Om en icke-fluorescerande färgämne används, se till att injektionen skedde i rätt region vid observation under injicering. Om ett fluorescerande färgämne används göra samma sak under fluorescerande ljus med hjälp av ett stereomikroskop med en fluorescensbildsystem.
- Efteråt, placera den öppna fliken tillbaka över bee huvud. Smälta en kristall av eikosan, vilket är cirka 1 mm i diameter, med hjälp av en tunn tråd virad runt spetsen av en mikro lödkolv (smälttemperatur är 35-37 ° C) och försegla snitten. Detta kommer att avsevärt minska dödligheten.
- släppbee från selen för beteendeanalys (men se diskussion), eller hålla i selen för experiment på återhållsamma bin - t.ex. snabel förlängning reflex (PER) testa 20.
- Om en fluorescerande färg användes, se till att injektionen drabbade området av intresse efter experimentet är över med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop (Figur. 1).
OBS: Detta är särskilt användbart när du riktar djupare hjärnområden (där det skulle vara svårt att se icke-fluorescerande färgämne under injektionsfasen).
- Förbereda läkemedlet i Ringer eller PBS på samma sätt som i 1.2.1, tillsätta ett fluorescerande (t.ex., 0,5 mg / ml Dextran, Alexa 546 eller 568 fluor) eller icke-fluorescerande färgämne (t.ex., 1 mM metylenblått).
2. Drug Administration Metoder för friflygande Bin
- oral behandling
- Förbereda läkemedlet på samma sätt som i stegen 1.1.1-1.1.2. Lägg läkemedelslösning till en matare och placera i kylskåp för förvaring.
OBS: Varje matare kommer att göra, såsom en upp- och nedvänd kapsyl eller en burk inverterat på mjukpapper. - Träna bin till en allvar matare innehållande 1 M eller 0,5M sackaroslösning genom att placera en matare nära kupan. När bin börja föda på mataren, gradvis flytta den längre bort tills den är på ett bekvämt avstånd för att undvika att bli stucken (minst 5 m).
- Paint-mark bin för att hålla koll på enskilda honungsbin. Gör en lista över alla färgkombinationer som kommer att användas. När ett bi landar på mataren, markera noggrant sin buk med två färger, och gör en anteckning på listan att kombinationen tas.
- Byta allvar matare för en matare innehållande läkemedlet / sackaroslösning. Ta del av de markerade bin som besöker mataren. Fånga någon omärkt bi besöker mataren som bin är produktiva rekryterare, och antalet bin besöker drogad mataren kan snabbt komma ur kontroll. Detta är särskilt problematiskt om samma experiment är som skall utföras på varandra följande dagar, som naiva bin kanske inte längre att vara naiva.
OBS: Som ett alternativ till att utbilda enskilda bin till en matare, tidigare författares har framgångsrikt matas läkemedels spetsad sackaros vatten till en hel kupan 21-23.
- Förbereda läkemedlet på samma sätt som i stegen 1.1.1-1.1.2. Lägg läkemedelslösning till en matare och placera i kylskåp för förvaring.
- topisk behandling
OBS: Målet är att lösa upp föreningen av intresse i ett lösningsmedel som kan tränga in i vaxartad insekt nagelbanden. Olika lösningsmedel kan användas för detta ändamål. Det mest använda inkluderar aceton, dimetylformamid (DMF) och dimetylsulfoxid (DMSO).- Utvärdera vilka lösningsmedel som fungerar bäst för föreningen till hands. Om en stark fenotyp förväntas av en överdos (t.ex. förlamning eller död), behandla bin (steg 2.2.2) med en hög dos (t.ex. 20 mikrogram kokain 7) upplöst i vart och ett av de olika lösningsmedel och noggrant övervaka tid tills förlamning eller död.
- Med hjälp av en 1 mikroliter microcapillary (eller en mikro som kan monteras på en lämplig upprepande dispenser) och microcapillary hållare, dra 1 pl av läkemedelslösningen (t.ex. 381; g / l av kokain) in i kapillären. Utvisa droppe, och försiktigt måla det på bröstkorgen av en markant bi. Täcka så stor av ett område en möjlig med lösningen, snarare än att lämna ett fast droppe, som biet är då sannolikt att exploatera av den. Var noga med att inte låta föreningen att kontakta vingen gångjärn, eller det kan dra den från bröstkorgen och längs kanterna där det avdunstar utan att absorberas i hemolymfa.
OBS: Beroende på forskningsmålet, kan denna metod även användas för att administrera läkemedel till biets mage. Emellertid läkemedel når CNS snabbare och i större mängder när de appliceras på bröstkorgen 24 .Detta metod fungerar lika bra med utnyttjas såsom med fritt flygande bin.
- förflyktigade behandling
- Lös droger (tidigare denna metod har använts för att leverera kokain till honungsbin 10) i 100% etanol. För att säkerställa löslighet, inte använda en hydroklorid eller andra saltformer av dendrogen om möjligt. När man gör en utspädning förbereda den så att den mängd som skall avges till ett bi är närvarande i 100 pl. Använd ren etanol som en vehikelkontroll.
- För att skapa en glödtråd, använd samma procedur som McClung och Hirsh 25.
- Förklaras kortfattat: avveckla Nichromtråd tätt runt en spik och fäster två elektriska ledningar (en i varje ände av glödtråden). Ta bort spiken. Den återstående nikrom spole refereras till som glödtråden.
- Trä de två ledningarna genom noggrant borrade hål i locket på en 50 ml centrifugrör, som bör vara resistent mot temperaturen som väljs. Limma trådarna på plats med flytande silikon.
OBS: Detta kommer att göra röret lufttät. Detta är nödvändigt för att undvika sekundär exponering till försöksledaren och se till att bina behandlas med lämplig dos.
- Fästa kablarna som leder till glödtråden till en strömkälla. Med användning av ett termoelement för att mäta temperaturen hostråden, experimentera med olika spänning / ström kombinationer tills en som resulterar i en lämplig temperaturprofil för läkemedlet i fråga, helst en som gör det möjligt för 10 sekunder av värme eller mindre. Detta är mycket viktigt, se relevant litteratur (t.ex. för att kokain att förånga det behöver värmas till åtminstone 200 ° C, men vid temperaturer över 350 ° C är det uppdelat i sekundära föreningar 26).
- Försiktigt pipett 100 pl läkemedelsinnehållande etanollösning på tråden. Sprida vätskan över så mycket filamentytan som möjligt eftersom detta kommer att öka avdunstningseffektivitet. Lämna filamentet exponeras vid rumstemperatur tills all etanol har avdunstat.
OBS: Om etanolen inte är tillräckligt förångas, kommer bina behandlas med både droger och etanol. Bin är extremt känsliga för etanol, och vissa läkemedel har synergistiska interaktioner med etanol, vilket kommer att partiskhet experimental resultat. - När etanolen har avdunstat helt (läkemedel fällning kan oftast ses på den torra filament under ett mikroskop), fånga en fritt flygande bee i en 50 ml tub. Stäng försiktigt locket innehållande tråden.
- Slå på strömmen under 10 sekunder, slå av strömmen och vänta ytterligare 50 sekunder (för att göra det möjligt för förflyktigas föreningen svalna och därigenom kondensera eller deposition). Släpp biet.
OBS: Även om denna behandlingsmetod fungerar utmärkt för fritt flygande bin, kan den användas lika effektivt med bör tas i bruk bin. Anslut bara utnyttjas bee i en 50 ml tub. Ladda glödtråden som beskrivs i 2.3.4 mellan bin. För högre genomströmning kan flera filament användas parallellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett urval av representativa resultat för de metoder som beskrivits ovan visas, i första hand för att visa att metoderna tillåter farmakologiska medel för att nå hjärnan och påverka honungsbiet beteende.
Specifika effekter på hjärnprocesser kan lätt erhållas efter bröstkorgen injektion.
Eftersom farmakologiska medel injiceras genom bröstkorgen kan verka på flera mål i kroppen, och få späds in i kroppen innan de når hjärnan, kan denna teknik öka möjliga specificitet oro. Ändå har det använts i stor utsträckning i litteraturen att störa kognitiva processer, utan att det är nödvändigt att använda mycket höga doser som kan ger stora sekundära effekter. Till exempel har blockerare av transkription administrerats med hjälp av denna teknik för att identifiera faser av minne som kräver genenuttryck. Thorax injektion av sådana molekyler är kompatibel med överlevnad i flera dagar 27, vilket innebär att deras potential toxisk verkan på andra mål kan begränsas, förutsatt att koncentrationen är väl vald. Under sådana förhållanden kan selektiva och tidsberoende effekter på minne uppnås, vilket visar effektiv inriktning av hjärnan (figur. 2).
Diffusion av molekyler i huvudet hemolymph leder till snabba, dosberoende effekter.
Ocellus injektion är ett sätt att göra det möjligt för en snabb diffusion av molekyler av intresse in i hela huvudet genom hemolymfa, särskilt om de kan ha många utbredda mål i hjärnan. Denna metod användes för att administrera allatostatins, neuropeptider som också kan verka som neurohormoner 28). Som en konsekvens ades en minskad prestanda observerades i ett doft inlärning assay, i överensstämmelse medden föreslagna närvaro av allatostatin receptorer i olika områden i hjärnan som är inblandade i lukt bearbetning och lärande 28. En dosberoende kurva för denna effekt skulle kunna inrättas, genom att injicera olika koncentrationer till oberoende grupper löper parallellt (figur. 3).
Olika administreringssätt kan ge liknande effekter på hjärnans funktion.
Emetin, en blockerare av proteinsyntes, används för att försämra bildningen av tidiga doftminne långtidsminne, vilket är typiskt uttryckt 1-2 dagar efter konditionering. I de flesta publicerade studier att det har injicerats i bröstkorgen 29. Vi visade att liknande effekter kan erhållas genom att administrera den direkt till hjärnan genom ocellar vägarna (figur 4.): Tillhandahålla en justering av insprutningsparametrar (mindre volym, högre koncentration och kortarefördröjning innan konditionering), erhöll vi en minskning (~ 20%) liknande den som finns i litteraturen med användning av samma läkemedelsmängden (10 nM) - jfr fig 4 i Stollhoff et al, 2005 29..
Effekterna av lokaliserade injektioner är begränsade i tid och rum
För att testa den rumsliga och tidsmässiga egenskaper av läkemedel mikroinjicerade i specifika delar av hjärnan, spändes bin utbildats i en lukt PER konditione paradigm, och sedan injiceras bilateralt med 0,5 nl 740 mM prokain (ett bedövningsmedel) i svampkropps calyces eller vertikala lober ( saltlösning användes som en kontroll). När bina successivt testats för återkallande 1, 2, och 3 timmar efter injektion, var prestanda endast nedsatt hos bin med bilaterala injektioner i lober (Figur. 5). Intakt neural ut från lober, men inte från calyces, är känd för attvara nödvändigt för luktminneshämtning, så detta tyder på att prokain förblev lokaliserade till loben i vilken den hade injicerats i minst 3 timmar. Det visar också att, när det injiceras i calyces var diffusion i de närliggande lober begränsad under samma period, eftersom en calycal injektion av prokain inte ledde till blockad av lober.
Behavioral fenotyper efter läkemedelsadministrering är ofta kontextberoende
Tidigare experiment har visat att efter behandling med kokain bin överskatta kvaliteten på en sackaroslösning 10,30. För att se om denna effekt var beroende av sammanhang (här baslinjen sackaros kvalitet), var friflygande honungsbin behandlas med förångad kokain. Individuellt märkta fritt flygande honungsbin fick forage på en matare innehållande 1 M sackaroslösning. Vid mataren var bin försiktigt fångas ien 50 ml centrifugrör som de var på väg att stiga från mataren. Bin behandlades med antingen 100 | ig av Freebase kokain eller vehikelkontroll (avdunstades etanol). Efter behandlingen bedömdes sacka mataren antingen ersätts av en 0,5 M eller en 2,0 M sackaros feeder och avgiften hackar returneras till mataren registrerades. Med hjälp av denna paradigm, kokain-behandlade bina ökat sin föda ansträngning vid 0,5 M mataren, men inte vid 2,0 M mataren (Figur 6). Skillnaden i effekt sågs med de båda sackaroskoncentrationer visar fint vikten av att miljö signaler beaktas när man studerar bee beteende.
Figur 1: Confocal Laser scanning Bild av injektionsstället. Alexa 546-märkt dextran injiceras tillsammans med läkemedelslösningen (röd). För att identifiera neurosa counter-färgning med DAPI tillsätts (grön). I den högra hjärnhalvan injektionsstället var beläget i den vertikala lob (VL), som visas som ett exempel för en lyckad injektion. I den vänstra hjärnhalvan injektionsstället var beläget rygg av den vertikala lob i ringen neuropil, visas som ett exempel för ett misslyckat injektion. Skalstreck = 100 pm, MB: Mushroom organ, AL: Antenn Lobes, d: rygg, v: ventral, L: vänster, R:. Höger Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tidsberoende Effekt av actinomycin D (Transcription Blocker) på långtidsminnet, när det injiceras i Thorax Vid olika fördröjningar efter appetitive lukt Condi. sätt (6, 9 eller 12 h), 1 | il aktinomycin D (1,5 mM i PBS) injicerades i bröstkorgen. Långtidsminnet (LTM) hämtning bedömdes 3 d efter konditionering (n = 25-65). Minnesprestanda reducerades på ett tidsberoende sätt, jämfört med den PBS-behandlade kontroller: effekten var betydande när injektion också placera 6 timmar efter konditionering (χ 2 = 18,04, p <0,005), men inte vid längre förseningar ( 9 h: × 2 = 0,95; 12 h: χ 2 = 0,47), vilket tyder på att LTM bildning kräver en våg av transkription som sker under en viss tid efter konditionering. Felstaplar representerar standardfelen. Data har tidigare publicerats 27 och återskapas här med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
Figur 3:. Dosberoende hämning av Learning Performance Efter Ocellar Injektion av en neuropeptid Den neuropeptid allatostatin C injicerades i huvudet hemolymfa (200 nl i PBS), genom median ocellus, 1 h före olfaktorisk konditionering. Oberoende grupper av djur som injicerats med olika koncentrationer (eller PBS för kontroller) utbildades. Allatostatin C-behandling ledde till en minskning av inlärningsförmåga, enligt bedömning av andelen betingade svar i sista luftkonditionering, i ett dosberoende sätt efter en U-form kurva (n = 70-78). Denna minskning var signifikant vid 10 -6 M men inte vid andra koncentrationer. Felstaplar representerar standardfelen. Data har tidigare publicerats 28, och är anpassad här med tillstånd. Klicka här för att se en större versionsionen av denna siffra.
Figur 4:. Blockad av en D ay Minne Efter Injektion av Emetin (Översättning Inhibitor) genom Ocellar Tract emetin Den proteinsyntesinhibitor (50 mM i PBS, 200 nl) injicerades in i hjärnan, genom ocellar-tarmkanalen, 20 min före luktkonditionering. Minne testades sedan 24 timmar senare. Behandlingen signifikant försämrad minne lagring (χ 2 = 7,03, p <0,01) jämfört med PBS-behandlade kontroller (n = 57-70). Felstaplar representerar standardfelen. JM DEVAUD, opublicerade data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Anatomiska och Temporal specificitet microinjections Efter appetitive luktkonditionering, var prokain injicerades bilateralt in antingen svamp kropps calyces eller vertikala lober. Minne hämtning bedömdes en timme efter injektion och endast påverkats av prokain injektioner i flikarna (1 timme efter behandling: vs. saltlösning: χ 2 = 10,00, p <0,005; vs. prokain till calyces: χ 2 = 32,92, p < 0,005). Effekten kunde fortfarande ses 2 h (χ 2 = 6,65, p <0,01) och 3 (χ 2 = 27,22, p <0,005) efter injektion, och var fortfarande platsspecifik (2 hr: χ 2 = 8,60, p < 0,05; 3 h: χ 2 = 17,15, p <0,0001), vilket tyder på att endast det injicerade området påverkades av prokain. Proportionerna är i förhållande till konditionering nivå during sista konditione rättegång. Felstaplar representerar standardfel (n = 23-28). Data har tidigare publicerats 31, och återskapas här med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Effekterna av kokain på friflygande bin Visitation hastighet (antalet besök av en given bi / genomsnittligt besök för alla bin under testperioden) ökades efter förångas kokain behandling vid en låg kvalitet källa (0,5M: t 70 = 5,0710, p = 0,00003), men inte vid en hög kvalitet källa (2M: t 70 = -0,2087, p = 0,8353). Rutorna representerar 1: a och 3: e kvartiler med mittlinjen visar medianen. De whiskers sträcker sig till 1,5x den kvartilavståndet. Extremvärden inte ritas som alla enskilda datapunkter är överlagrade. Data har tidigare publicerats 10, och återskapas här med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Behandling | Kan göras med fri- flygande bin? | Fördelar | Nackdelar |
| oral behandling | Ja. | Lätt, minimalt invasiva. | Bee matsmältning är inte okomplicerat |
| topisk behandling | Ja. | Lätt, minimalt invasiva, snabbt. | Upprepade behandlingar kan vara problematisk. |
| Injektion i bröstkorgen | Komplicerad,påverkar bin flyger förmågor | Konsekvent och robust. | Något invasiva. Potential att skada / spännings bi. |
| Injektion i median ocellus | Rekommenderas inte. | Konsekvent och robust, något lokaliserad. | Något invasiva. Potential att skada / spännings bi. |
| Injektion i ocellar vägarna | Rekommenderas inte. | mycket lokaliserad | Mycket invasiva. Potential att skada / spännings bi. |
| Mikroinjektion i hjärnregioner | Rekommenderas inte. | mycket lokaliserad | Mycket invasiva, svårt att utföra. Potential att skada / spännings bi. |
| Förflyktigade läkemedelstillförsel | Ja. | Lätt, minimalt invasiva, snabbt. | Fungerar inte för alla läkemedel. |
Tabell 1: Comparison av olika behandlingsmetoder och deras egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs ovan tillåter enkelt, effektivt och robust behandling av antingen fritt flygande eller bör tas i bruk honungsbin. Dessa metoder är kompatibla med många experimentella paradigm och biologiska frågor (tabell 1). Alla de fritt flygande metoder kan lätt appliceras på bör tas i bruk bin. Det omvända är mindre framgångsrik, men eftersom tillfälliga återhållsamhet och invasiva behandlingsmetoder ofta kan äventyra binas flygande förmåga.
Metoderna har presenterats från en hjärna centrerade perspektiv. Detta är inte på grund av inneboende begränsningar av de tekniker, utan snarare på grund av författarnas personliga intressen. Finns det ingen anledning till varför dessa metoder inte kan användas för att studera andra organ. Dock kan små modifieringar behövas för att göra metoden mer lämpad för andra organsystem. Till exempel, medan topikal behandling syftar till att nå hjärnan typiskt appliceras på bröstkorgen, kan det vara bättre att tillämpa this till buken om det avsedda målet är äggstockarna. På liknande sätt kan injektioner lätt tillämpas på andra områden än bröstkorgen eller huvudet (t.ex. bukorganen kan riktas genom att injicera mellan de abdominala sclerites).
När det gäller vilka föreningar kan administreras för bin, egentligen finns det inga gränser. Vanligtvis har människor administrerade farmakologiska föreningar såsom signalmolekyler 21 eller deras antagonister 32, och skräddarsydda peptider 28. Däremot har det skett en senaste tidens ökning av administrering till bin föreningar med tillämpade frågor i åtanke, såsom bekämpningsmedel 33 och antropogena föroreningar 34. Nyligen har föreningar som administreras börjat inkludera RNA-molekyler som stör genuttryck direkt, såsom dsRNA aktiverar RNA-interferens vägen 35 eller till och med mikroRNA 36 och antagomiRs 37. Inte alla metoder fungerar lika bra för alla föreningar.Detta är kanske bäst illustreras av bitter eller sur föreningar som gör socker vatten obehagliga för bin, vilket hindrar dem från att konsumera den. Ömtåliga molekyler, såsom RNA eller vissa polypeptider bryts ned vid upphettning under en förångning förfarande eller placeras i en hård lösningsmedel som DMF. Det är därför viktigt att förstå kemin av det som administreras för att säkerställa att det överlever behandlingsproceduren.
Att få ett farmakologiskt medel till ett bi är den enkla biten, men det finns tre stora problem som aldrig bör tas lätt när de utför farmakologiska experiment. Den första är att räkna ut en bra dos för experimentet ifråga. Beroende på läkemedlet, kan det redan publicerad litteratur tillgänglig, men för det mesta, måste detta lösas genom en blandning av litteratursökning, informerade gissningar och dos-responskurvor. Beroende på hur komplicerad den experimentella protokollet är, kan det vara användbart attförst generera en dos-responskurva i en enklare bioanalys (t.ex. kvantifiering totala rörelse eller överlevnad) för att få en bättre uppfattning om en dosintervallet värt att försöka på ett mer genomarbetade bioanalys. I vårt laboratorium, är en startdos antingen finns i biet litteraturen eller genom att göra en mg / kg konvertering baserad på data från gnagare litteratur. Från denna utgångspunkt är bina behandlas med startdosen, plus 2 eller 3 doser 10 gånger större och mindre än startdos (t.ex. om startdosen är 1 mg, 0,01, 0,1, 10, och 100 mg skulle också vara används), och naturligtvis en lämplig kontrollvehikel.
Det andra problemet är något mer petiga: läkemedelsspecificitet. De flesta läkemedel utvecklades inte med honungsbin, eller någon annan insekt, i åtanke. På grund av detta, off-target effekter är vanliga (t.ex. mianserin, ett ryggradsdjur serotoninreceptorantagonist 38, var länge tänkt att vara en insekt octopaminergic receptorantagonist, men den senaste tidens findings visar att i bin det är också en dopaminergisk receptorantagonist 39). En vanlig lösning på detta problem är, i stället för att förlita sig på endast ett läkemedel, för att upprepa samma experiment med en svit av läkemedel som är kända för att ha målet av intresse gemensamt. I grund och botten, om flera läkemedel är kända för att blockera ett visst mål, observera liknande resultat mellan olika läkemedel bör ge större förtroende för att läkemedlet har den förväntade effekten, eftersom olika läkemedel ofta har unika off-målprofiler.
Den sista frågan handlar om att se till att läkemedlet agerar där det är tänkt att agera. I detta avseende kommer det alltid att finnas en avvägning mellan specificitet och invasiv. Systematiska behandlingsmetoder är vanligtvis den minst invasiva, men det finns ingen kontroll av var i bee kroppen läkemedlet är att ha sin effekt. Även för mikroinjektion i specifika vävnader läkemedel kan resa med hemolymfa till andra delar av bee kroppen. Hur denna fråga tas upp needs att bli informerad av frågorna. För vissa experiment anatomiska läge är irrelevant, medan det för andra är detta den enda frågan av betydelse. Det bästa sättet att lösa detta är att börja med system behandlingar och gradvis minska ner till en anatomisk plats genom att använda allt mer specifika metoder. Om beteendet som studeras är särskilt oförenligt med invasiva behandlingsmetoderna, kan det vara värt att försöka att dekonstruera den i enklare komponenter innan de gör en hel serie experiment med mycket specifika farmakologiska behandlingar.
Detta problem med läkemedelsläckage är ännu mer överdrivna med oral behandling av fritt flygande bin, där läkemedel kan påverka icke-mål bin. Fält honungsbin samla nektar på fältet för att föra tillbaka till sin koloni. De kommer att avlasta de flesta av deras sackaroslösning i kupan när han återvände snarare än absorbera det. I kupan är det packat i celler, dehydratiseras och lagras som honung. Därför attDetta kan läkemedel potentiellt påverka icke-mål bin. Med mer specifika metoder (t.ex. mikroinjektioner) har detta problem minimeras.
Med dessa varningar i åtanke, och hanteras på rätt sätt, kan neurofarmakologiska manipulation av honungsbin vara ett mycket kraftfullt verktyg. Medan transgena verktyg utvecklas för honungsbin 15, på grund av deras sociala liv är det osannolikt att transgena någonsin kommer att bli ett enkelt och tillförlitligt sätt att genomföra dessa typer av experiment. Det är därför troligt att farmakologi kommer att fortsätta att vara en viktig del av bee forskning i framtiden. Medan vissa bee forskare har gjort efterlyser standardiserade experimentella metoder 40, i detta fall skulle vara ett misstag. En del av kraften i bee systemet har alltid varit de olika experimentella metoder, och hur tekniker har utvecklats med verkliga biologiska frågor i åtanke snarare än tvärtom. Det är dock viktigt att vi ser tillanvändning av den lämpligaste metoden för att frågan till hands. Om jämförelser med tidigare studier är viktiga, måste standardiserade protokoll följas noga. Men att använda etablerade protokoll för den skull att använda standardiserade metoder får inte stå i vägen för utvecklingen av nya metoder som kan öppna nya experimentella möjligheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B.
- Søvik, E., Barron, A. B.
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662 (2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282 (2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P.
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288 (2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529 (2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
