Summary
כתב יד זה מתאר כמה פרוטוקולים לניהול סוכנים תרופתיים כדי דבורי דבש, כולל בשיטות לא פולשניות פשוט לדבורים חינם-עף, כמו גם הגירסות פולשני יותר המאפשרות טיפול מקומי מדויק של דבורים מאופקות.
Abstract
דבורי דבש להפגין יכולת למידה מדהימה והתנהגות חברתית מתקדמת ותקשורת. בנוסף, המוח שלהם הוא קטן, קל לדמיין ללמוד. לכן, דבורים כבר זמן רב מודל מועדף בקרב neurobiologists ו neuroethologists ללימוד הבסיס העצבי של התנהגות חברתית טבעית. חשוב, עם זאת, כי השיטות הניסיוניות בשימוש ללמוד דבורים לא להפריע התנהגויות נלמדות. בגלל זה, זה כבר צורך לפתח מגוון של טכניקות מניפולציה תרופתית של דבורי דבש. במאמר זה אנו מדגימים שיטות לטיפול מאופקים או ללא עף דבורי דבש עם מגוון רחב של סוכנים תרופתיים. אלה כוללים הם בשיטות לא פולשניות כגון טיפולי בעל פה ו אקטואלי, כמו גם שיטות פולשניות יותר המאפשרות משלוח סמים מדויק או אופנה מערכתית או מקומית. לבסוף, אנו דנים את היתרונות והחסרונות של כל שיטה ולתארמשוכות נפוצות וכיצד להתגבר עליהם הכי טוב. נסיים דיון על החשיבות של התאמת שיטת הניסוי לשאלות הביולוגיות ולא להיפך.
Introduction
מאז קרל פון פריש הובהר שפת המחול שלהם 1, דבורי הדבש נותרו מין מחקר פופולרי עבור חוקרים בהתנהגות בעלי חיים ונוירוביולוגיה. בשנים האחרונות מספר עצום של תחומים חדשים צמחו בצומת של שני מישורים אלו, וכמה דיסציפלינות אחרות (למשל, ביולוגיה מולקולארית, גנומיקה, ומדעי מחשב) שהתעוררו לצידם. זה הוביל להתפתחות המהירה של תיאוריות ומודלים חדשים להבנת התנהגות שמקורו בפעילות בתוך מערכת העצבים. בגלל אורח החיים הייחודיים, הרפרטואר ההתנהגותי עשיר, וקלות המניפולציה ניסויית תרופתית, דבורים נותרו בחזית המהפכה הזו.
דבורי דבש נמצאים בשימוש בחקר שאלות הנוירוביולוגי בסיסיות כגון אלה למידה שבבסיס וזיכרון 2,3, קבלת החלטות 4, 5 חוש ריח, או חזותי עיבוד 6. בשנים האחרונות, כבדבורת EY יש גם שמשה כמודל נושאים לומדים שמורים בדרך כלל למחקרים רפואיים, כגון השפעת הסמים ממכרים 7 - 11, השינה 12, הזדקנות 13, או מנגנוני הרדמה 14.
בניגוד עבור אורגניזמים מודל גנטי הקלסיים (למשל, melanogaster ד, C. elegans, musculus מ), יש מעט מאוד כלים גנטיים זמינים עבור מניפולציה בתפקודים עצביים בקרב דבורי דבש, אם כי זה כרגע בשינוי 15. במקום זאת, מחקרי דבורת הדבש הסתמכו בעיקר על מניפולציות תרופתיות. זה היה מוצלח מאוד; עם זאת, המגוון של מחקר דבורה הוא כזה מגוון של שיטות ממשל תרופתי נדרש. מחקר עם דבורי דבש מתמודד עם שאלות מגוונות מאוד, הוא למד על ידי חוקרים מדיסציפלינות שונות ורקעים, ומשתמש במגוון גישות ניסיוניות. rese רבשאלות קשתות דורשות דבורים להיות או-טיסה חינם, אינטראקצית המושבה שלהם בחופשיות, או שניהם. זה יכול להקשות כדי לעקוב אחר בחיות מעבדה הפרט, ועושה איפוק או cannulation ישים.
כדי להכיל את המגוון של מחקר דבש דבורים, במגוון שיטות משלוח הסמים יש צורך, המאפשר ממשל חזק וגמיש תוך הקפדה כי pharmacokinetic ופרופילי pharmacodynamic, הפולשנות של השיטה, והאמינות שלו, להתאים את הפרדיגמה מדובר. בגלל הצרכים המגוונים הללו, רוב קבוצות מחקר פיתחו שיטות והתרופות ייחודי משלהם. עד כה, זה כבר כוח של קהילת מחקר דבורה; זה הוביל להתפתחות של מערכים של שיטות המאפשרות מתן התרופה הזהה בנסיבות שונות. מטרתנו כאן אינה לפתח שיטה סטנדרטית אחת עבור מניפולציות תרופתיות של דבורים, אלא כדי להדגיש שיטותהוכח להיות מוצלח במיוחד, וחוקר עזרה לאמץ אלה. אנו דנים את העקרונות הבסיסיים של איך הם עובדים, כמו גם היתרונות והחסרונות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מינהל התרופות עבור דבורים רתם
- טיפול אוראלי
- הכן 1.5 M תמיסת סוכרוז על ידי ערבוב 257 גרם של סוכרוז עם 500 מ"ל מים (זה קל יותר לפזר סכום זה של סוכרוז במים רותחים). אחסן תמיסת סוכרוז על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
הערה: פתרון סוכרוז מספק סביבת מסבירים מאוד עבור מיקרואורגניזמים מסוימים, וכך בקלות הופך מזוהם והקשה לעיכול לדבורים. ניתן aliquoted ומאוחסנים תמיסת סוכרוז גורפת ב -20 ° C עד השימוש. - החלט על מינון תרופה מתאים (ואיך להשיג את זה, מופנה בסעיף הדיון בהמשך), ולהכין פתרון כזה כי מינון התרופה המועדף הוא מומס 20 μL פתרון סוכרוז (למשל, כדי לספק 20 מיקרוגרם, לדלל סמים בבית יחס של 1 מ"ג / מ"ל). דבורים רתמו פי Felsenberg et al. (2011) 16. לעשות את הצעד הזה לפחות 12 שעות לפני הטיפול תרופתי על מנת להבטיח כי דבורים הם כבר לא הדגישו out מרתימה כאשר פתרון התרופה מוצג.
הערה: לקבלת תוצאות עקביות יותר, עדיף להרעיב דבורים (על ידי הצבת דבורים רתם באינקובטור ב 34 מעלות צלזיוס ו -70% לחות) O / N. - שימוש micropipette, לגעת טיפת המים סוכרוז 1.5 M לאנטנה של דבורה רתמה. כאשר החוטם מוארך, לגעת טיפת 20 μl של 1.5 M סוכרוז המכיל את התרופה ישירות החדק של הדבורה. ודא הדבורה צורכת הכל. כפי בקרת רכב לשימוש פתרון 1.5 M סוכרוז ללא תרופות הוסיפו.
הערה: כמות תמיסת סוכרוז אולי צריכה להיות מותאמת על בסיס תוכניות ניסיוניות. אם מיזוג appetitive מיועד, האכלת הדבורים רק לפני אימון תפריע "היענות הדבורים. - בטל או להפריש דבורים שאינם צורכים כל סוכרוז.
הערה: אם מספר רב של דבורים להיכשל לשתות את תמיסת סוכרוז, את לוח זמני ההאכלה אולי צריך להיות מותאמים.
- הכן 1.5 M תמיסת סוכרוז על ידי ערבוב 257 גרם של סוכרוז עם 500 מ"ל מים (זה קל יותר לפזר סכום זה של סוכרוז במים רותחים). אחסן תמיסת סוכרוז על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הזרקת לתוך בית החזה
- כן תרופת דבורת דבש Ringer 17 כדלקמן:
- מערבבים החיטוי 7.45 גרם NaCl, 0.448 גרם KCl, 0.812 גרם MgCl 2, 0.735 גרם CaCl 2, 54.72 סוכרוז גרם, 4.95 גרם D- גלוקוז, ו 2.48 HEPES גרם ל -1000 מ"ל של מים. היזהר בעת אחסון רינגר כפי שהוא מזוהם בקלות. Aliquot ולאחסן רינגר ב -20 ° C עד השימוש.
- ממס את התרופה בתמיסת רינגר ואז לדלל כך את הכמות הרצויה שוהה 5 μl. כדוגמה, אם הדבורים יטופלו עם 5 מיקרוגרם של תרופה, 1 גרם ניתן להמיס תחילה 1 מ"ל רינגר, לפני דילול 1: 1,000 ב רינגר לפתרון סופי של 1 מיקרוגרם / μl.
הערה: לחלופין, זמינה מסחרי PBS (פוספט שנאגר סאלין) יכולה לשמש במקום פתרון רינגר.
- ערכו microscalpel ידי ניתוק בפינה של סכין גילוח פיפיות עםבעל להב. צרף שבר הלהב לבעל להב כך שהוא עושה להב נחמד עם נקודת קצה חדה.
- תחת סטראו, בזהירות להשתמש microscalpel לחתוך חור 2 מ"מ מעל scutellum, לצד תהליך האגף האחורי של בית החזה של דבורה. הימנע חיתוך עמוק מדי, שכן הדבר עלול לפגוע שרירי תעופה, ולהיות זהיר כדי למנוע את צירי הכנף. באופן אידיאלי, לחתוך רק משלושה צדדים, כך הדש של לציפורן יכול להיות מאוחר יותר קפל לסגור את האתר של פציעה.
- שימוש micropipette, הפקדה 5 μlL Ringer (או PBS) המכיל את התרופה על גבי החור בבית החזה. בזהירות לפקח תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את הירידה כולו נספג לתוך hemolymph. השתמש Ringer (או PBS) כביקורת רכב.
- במידת האפשר, הזז את דש לציפורן בחזרה מעל החור. לאחר 5-10 שעות, זה יהיה לצרף ולאטום.
הערה: כחלופה טכניקה זו, להזריק 1 μl ישירות לתוך בית החזה באמצעות מזרק זכוכית, לאחר פתיחת SMAll חור באמצע frenum (הקו הרוחבי באזור האחורי של scutellum) עם מחט מזרק (קוטר: 0.6 מ"מ, G: 23). זה עוקף את הצורך הראשון לחתוך את החזה עם אזמל הזריקה הוא קטן יותר, אך שיטה זו תעזוב את הזריקה חשופה.
- כן תרופת דבורת דבש Ringer 17 כדלקמן:
- הזרקת Ocellus
הערה: זוהי שיטה מתאימה להעברת מולקולות ברחבי הקפסולה הראש, לתוך hemolymph.- הכן תרופות כמו 1.2.1, אבל להתאים ריכוזי התרופה כך המינון הרצוי יהיה הכלול 1 μl של רינגר או PBS (נפח פחות יכול להיספג דרך חור ocellus שלא דרך בית החזה).
- כן microscalpel כמו 1.2.2. תחת סטראו, לנעול את ראש הדבורה רתמה במקום על ידי מילוי נקיק הצוואר בשעווה. השתמש שעוות היתוך בטמפרטורה נמוכה (למשל, שעוות שיניים) על מנת למנוע קולטני ריח מחושים מזיקים או תאים אחרים שעשויה להיות אניmportant להערכת התנהגות (למשל, למידת חוש ריח). אז בזהירות להסיר את העדשה של ocellus החציוני על ידי החדרת קצה microscalpel תחת העדשה בעדינות לשבור את העדשה ללא הקפסולה הראש.
הערה: אפשר גם למקם שעווה בזהירות מעל האנטנות כדי למנוע תנועה. - בזהירות פיפטה תרופה לתוך החור ocellus. חכו עד שכל נלקחת הקפסולה הראש. סר שעוות שיניים מ האנטנות ולאפשר הדבורה לנוח לזמן מה לפני המשך ההליך הניסיון. השתמש Ringer (או PBS) כביקורת רכב.
- הזרקה לתוך בדרך ocellar
הערה: מערכת ocellar מכילה סיבים גדולים, חיבור ברוב אזורי המוח המרכזי 18. שיטת טיפול זו מאפשרת החלת תרכובות למוח בלבד, אבל לא מיקוד אזורי משנה מסוים של המוח.- הכן דבורה כמו 1.3.2. ולהסיר את העדשה של ocellus החציוני עם tip של microscalpel כמו 1.3.3.
הערה: ניתן לעשות זאת עד 2 שעות לפני הזריקה. בהתבסס על הניסיון שלנו, דבורים הפד מסוגלים יותר להתמודד עם הניתוח הזה מאשר דבורים מורעבים - ממלאי מזרק זכוכית 10 μl מצויד מד קטן (למשל, 33, קוטר: מיקרומטר 210) מחט עם פתרון תרופה מוכנה כמו 1.3.1.
- באמצעות micromanipulator ידני, להכניס את קצה המזרק דרך הרשתית ocellar לתוך הקפסולה ראש עד לעומק של 50 מיקרומטר ו להזריק 250 nl של פתרון.
- לאחר השימוש, יש לשטוף את המזרק 3 פעמים עם מים מזוקקים, ולאחר מכן 3 פעמים עם אתנול 75%.
- הכן דבורה כמו 1.3.2. ולהסיר את העדשה של ocellus החציוני עם tip של microscalpel כמו 1.3.3.
- Microinjection לתוך מבנים מוחיים בפרט
הערה: בנוסף הטיפולים השיטתיים שהוזכרו לעיל, ניתן לבצע microinjections לתוך מבנים מוחיים בפרט. זה מאפשר מניפולציה תרופתית של אזורי מוח אחד או יותר, תוך השארה לאחרים מעושה. זה עובדהכי טוב עם אזורים במוח, כי הם קלים לזהות ממשטח המוח הקדמי (למשל, אונות מחושים, calyces גוף פטריות או אונות אנכיות, או האונות האופטיות), אבל באזורים אחרים היו ממוקד. שימו לב כי הכיוון (קדמית / אחורית, הגב / הגחון) מתייחס לציר הגוף, ליתר דיוק, מאשר כל צירי העצבים 19.- מכינים את התרופה רינגר או PBS באותו אופן כמו 1.2.1, הוספת ניאון (למשל, 0.5 מ"ג / מ"ל Dextran, Alexa 546 או 568 פלואוריד) או לצבוע nonfluorescent (למשל, 1 מתילן מ"מ כחול).
הערה: תוספת של צבע פלואורסצנטי יאפשר אימות על המיקום הזרקת לאחר הניסוי נגמר (באמצעות מיקרוסקופ confocal, בעקבות לנתיחה המוח), ואילו צבעים nonfluorescent לאפשר ניטור ישיר במהלך הניסוי. - כדי להפוך טפטפות זכוכית להזרקה, הכנס נימי כוס בקוטר הנכון לתוך מלחציים בעל חולץ אלקטרודה (1.0 מ"מ עבור האחיזה הרגילהאה כלול עבור microinjector נזכרת ברשימת החומרים). התאימו את הגדרות משיכה וחומות לייצר טיפ 0.5 סנטימטרים כ (הגדרות תהיינה שונות עבור כל חולץ, גם אם אותו המודל משמש).
הערה: באופן אידיאלי, שתי טפטפות משך מהכוס אחד צריך להיות אותו אורך וצורה, כך הן יוכלו לשמש. - תחת סטראו, לשבור את הטיפים כדי להשיג בקוטר חיצוני של כ 10-15 מיקרומטר, על סמך הערכה ויזואלית באמצעות סולם על graticule מוכנס לתוך העין. השלבים בסולם מוגדרים על ידי היצרנית ניתן לתקן עבור ההגדלה.
- לאחר מכן, למלא את טפטפות זכוכית עם הפתרון להזריק. אם נימי זכוכית עם חוטים משמשות, למלא את פיפטה על ידי נחת הצד האחורי לתוך תמיסת התרופה, אחרת למלא קצה באמצעות טיפי microloader.
- הכנס את פיפטה זכוכית המלאה לתוך החזיק הנימים של microinjector, אשר נשלט על ידי מיל ידני או אלקטרוניcromanipulator.
- כייל את microinjector להזריק את העוצמה הרצויה (0.5-2 NL, תלוי בגודל של מבנה המוח ממוקד). לשם כך, להזריק ישירות לתוך צלחת קטנה פטרי המכילה שמן מינרלים ולמדוד את הקוטר של רביב עם graticule. שינוי הגדרות עד להשגת העוצמה הרצויה.
- תקן ראש הדבורה רתמה באמצעות שעוות שיניים רכה כמו 1.3.2, לפני החיתוך פתח אל החלק הקדמי של הקפסולה הראש, באמצעות microscalpel, עם שלושה חתכים: אחד ממש מתחת ocellus החציוני (גחון), אחד בכל הגבול של הזכות או עין שמאל אחת מעל האנטנה נובעת (הגבה). השתמש חתיכת שעוות שיניים להחזיק את דש פתח במקום.
- לחצו בעדינות בלוטות קנו נשימה שוכבת על החלק העליון של המוח הצידה באמצעות מלקחיים בסדר, ולאחר מכן לבצע קרע קטן לתוך neurilemma (קרום דק מאוד סביב המוח) מעל מבנה המוח הממוקד.
הערה: אם יטופלו דבורים רבות בו-זמנית, הליך זהניתן לבצע קודם לכן; עם זאת, יש להיזהר לא להשאיר דבורים במצב זה ארוך מדי (לא יותר מ -30 דקות), המוח שלהם עלול לייבש. - הכנס את הקצה לתוך האזור במוח הרצוי, ולהתאים עומק בניצב לפני השטח במוח (למשל, 60 מיקרומטר עבור calyces פטריות גוף). להזריק את הנפח הקבוע מראש. עבור אזורים במוח לרוחב, להזריק בילטרלי (כלומר לעשות זריקה אחת לכל מוחי). אם צבע nonfluorescent משמש, להבטיח את ההזרקה התרחשה באזור התקין עם תצפית בזמן ההזרקה. אם צבע פלואורסצנטי משמש לעשות את אותו הדבר תחת אור הניאון באמצעות סטראו עם מערכת צפיית קרינה.
- לאחר מכן, למקם את דש גב הפתוח מעל לראשו של הדבורה. ממיסים גביש של eicosane, המהווה כ 1 מ"מ קוטר, באמצעות חוט דק עטוף סביב קצה מלחם מיקרו (נמס הטמפרטורה היא 35-37 מעלות צלזיוס) ואת החותם את הקיצוצים. זה יקטין תמותה מאוד.
- שחרר אתדבורה מן הרתמה לניתוח התנהגותי (אך ראה דיון), או לשמור בתוך הרתמה לניסויים על דבורים מרוסנות - למשל, רפלקס רחבת חוטם (PER) בדיקה 20.
- אם צבע פלואורסצנטי שימש, להבטיח כי הזרקת פקדה את האזור של עניין לאחר הניסוי נגמר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (איור. 1).
הערה: תכונה זו שימושית במיוחד כאשר המיקוד אזורי מוח עמוקים יותר (איפה זה יהיה קשה לראות לצבוע nonfluorescent במהלך שלב ההזרקה).
- מכינים את התרופה רינגר או PBS באותו אופן כמו 1.2.1, הוספת ניאון (למשל, 0.5 מ"ג / מ"ל Dextran, Alexa 546 או 568 פלואוריד) או לצבוע nonfluorescent (למשל, 1 מתילן מ"מ כחול).
2. שיטות ותרופות עבור דבורים חינם-עף
- טיפול אוראלי
- כן תרופה באותו אופן כמו צעדים 1.1.1-1.1.2. הוסף פתרון התרופה מזין ומניחים במקרר לאחסון.
הערה: כל מזין יעשה, כגון מכסה בקבוק הפוך או צנצנת ההפוכה על נייר טישו. - לאמן דבורים מזין הכבידה המכיל 1 M או 0.5M סוכרוז פתרון על ידי הצבת מזין קרוב אל הכוורת. לאחר דבורים להתחיל ליקוט במתקן ההאכלה, בהדרגה להזיז אותו רחוק עד שהוא במרחק נוח כדי למנוע עקץ (מינימום 5 מ ').
- דבורי צביעה-סימן כדי לעקוב אחר דבורי דבש פרט. ערכו רשימה של כל שילובי צבעים אשר ישמשו. כאשר אדמות דבורה במתקן ההאכלה, בזהירות לסמן בטן שלה עם שני צבעים, ורושמים ברשימה שהשילוב נלקח.
- להחליף את המזין הכביד עבור מזין המכיל את פתרון הסמים / סוכרוז. שים לב הדבורים המסומנים הפוקדים את המזין. לא יתפוס אף דבורה לא מסומנת ביקור המזין כמו דבורים הם מגייסים פורים, ומספרים של דבורי ביקור המזין המסומם יכול לצאת מכלל שליטה במהירות. זה בעייתי במיוחד אם אותו הניסוי הוא להתבצע על ימים רצופים, כמו דבורים נאיביים אולי כבר לא יהיו נאיביים.
הערה: כחלופת אימון דבורי פרט מזין, המחבר קודםהים טפח בהצלחת מי סוכרוז- שלב תרופת כוורת שלמה 21 - 23.
- כן תרופה באותו אופן כמו צעדים 1.1.1-1.1.2. הוסף פתרון התרופה מזין ומניחים במקרר לאחסון.
- טיפול מקומי
הערה: המטרה היא לפזר את המתחם של עניין ממס שיכול לחדור לציפורן חרקים דונגי. ניתן להשתמש ממסים שונים למטרה זו. הנפוץ ביותר כוללים אצטון, dimethylformamide (DMF) ו dimethylsulphoxide (DMSO).- הערך אילו ממס עובד הכי טוב במתחם בהישג יד. אם הפנוטיפ חזק צפוי ממנת יתר (למשל, שיתוק או מוות), דבורי פינוק (שלב 2.2.2) עם מינון גבוה (למשל, 20 מיקרוגרם קוק 7) מומסת כל אחד הממסים השונים לנטר בקפידה זמן עד שיתוק או מוות.
- באמצעות microcapillary 1 μL (או microsyringe, אשר יכול להיות מצויד על מנפק חוזר מתאים) בעל microcapillary, לצייר 1 μl של פתרון התרופה (למשל, 381; g / μl של קוק) לתוך הנימים. לגרש את הירידה, ובזהירות לצייר אותו על החזה של דבורה ניכרת. מכסים כמו גדול איזור אפשרי עם הפתרון, ולא להשאיר טיפה מוצקה, כמו הדבורה עשויה מכן מטפח את זה. היזהר שלא לאפשר במתחם לפנות לאגף צירים, או זו עשויה למשוך אותו אל מחוץ החזה ולאורך כנפיים במקום זה יתאדה מבלי להיטמע לתוך hemolymph.
הערה: בהתאם יעדי המחקר, שיטה זו יכולה לשמש גם על מנת להחדיר תרופות אל הבטן של הדבורה. עם זאת, תרופות להגיע CNS מהר ובכמויות גדולות כאשר נמרח על שיטת 24 .זה החזה עובד באותה מידה עם רתם כמו דבורים חינם טוס.
- טיפול Volatilized
- ממיסים סמים (בעבר בשיטה זו נעשה שימוש כדי לספק קוקאין דבורי הדבש 10) באתנול 100%. כדי להבטיח מסיסות, לא להשתמש hydrochloride או צורות מלח שניות שלהתרופה במידת האפשר. בעת ביצוע דילול להכין אותו כך שהסכום שיימסר דבורה שוהה 100 μl. השתמש אתנול טהור כביקורת רכב.
- כדי ליצור נימה, השתמש בפרוצדורה זהה כמו מק-קלאנג והירש 25.
- בקצרה הסביר: לסכם תחילי ניכרום בחוזקה סביב מסמר ולצרף שני חוטי חשמל (אחד בכל קצה של חוט להט). הסר את המסמר. סליל nichrome נותר המכונה הנימה.
- השחל את שני חוטים דרך חורים שנקדחו בקפידה במכסה של צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר, שאמורה להיות עמיד לטמפרטורה הנבחרת. מדביקים את החוטים במקום עם סיליקון נוזלי.
הערה: פעולה זו תהפוך את הצינור אטום. זה חיוני כדי להימנע מחשיפה משנית הנסיין ולהבטיח כי הדבורים מטופלות עם המינון המתאים.
- חבר את החוט שמוביל הנימה למקור חשמל. שימוש תרמי כדי למדוד את הטמפרטורה שלהנימה, ניסוי עם שילובי מתח שונה / נוכחיים עד אחד שתוצאתו פרופיל טמפרטורה מתאים התרופה שבמחלוקת, באופן אידיאלי, אחד המאפשר עבור 10 שניות של חימום או פחות. זה מאוד חשוב, עיין ספרות רלוונטית (למשל, על מנת קוק לנדוף זה צריך להיות מחומם ל לפחות 200 ° C, אך בטמפרטורות מעל 350 מעלות צלזיוס הוא נשבר למתחמים משני 26).
- בזהירות פיפטה 100 μl של תרופה המכילה פתרון אתנול על הנימה. מורח את הנוזל על פני שטח נימה ככל האפשר כמו זה יהיה להגביר את יעילות אידוי. השאר את הנימה החשופה בטמפרטורת חדר עד שכל אתנול התאדה.
הערה: אם אתנול הוא לא התאדה מספיק, דבורים יטופלו הן תרופת הבחירה ואתנול. דבורים רגישים במיוחד אתנול, וכמה יש תרופות אינטראקציות סינרגיסטי עם אתנול, אשר יהיה לשעבר הטיהתוצאות perimental. - לאחר אתנול התאדה לחלוטין (משקע תרופה בדרך כלל ניתן לראות על הנימה היבשה תחת מיקרוסקופ), לתפוס דבורה חינם-עף בתוך שפופרת 50 מיליליטר. בזהירות ולסגור את המכסה המכיל הנימה.
- הפעילו את המחשב במשך 10 שניות, כבה את החשמל ומתן עוד 50 שניות (כדי לאפשר במתחם volatilized להתקרר ובכך לדחוס או פיקדון). שחרר את הדבורה.
הערה: בעוד שיטת טיפול זו עובדת מצוינת עבור דבורים חינם-עף, ניתן להשתמש בו רק בצורה יעילה עם דבורים רתמו. כל שעליך לעשות הוא לחבר את דבורה רתם בתוך שפופרת 50 מ"ל. רענן נימה כמתואר 2.3.4 בין דבורים. עבור תפוקה גבוהה יותר, כמה חוטים יכולים לשמש במקביל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבחר תוצאות נציגי השיטות שתוארו לעיל נראה לעין, בעיקר על מנת להוכיח כי השיטות לאפשר סוכנים תרופתיים כדי להגיע למוח להשפיע על התנהגות דבורת דבש.
השפעות ספציפיות על תהליכים מוחיים ניתן להשיג בקלות לאחר הזרקת חזה.
בגלל סוכנים תרופתיים מוזרק דרך החזה עשוי לפעול נגד מטרות מרובות בגוף, ולקבל מדולל לתוך הגוף לפני להגיע למוח, טכניקה זו עלולה להעלות ספקות סגוליים אפשריים. אף על פי כן, זה כבר נעשה שימוש נרחב בספרות כדי להפריע לתהליכים קוגניטיביים, ללא הצורך להשתמש במינונים גבוהים מאוד שעשוי להניב השפעות משניות גדולות. לדוגמא, חוסמים של שעתוק כבר מנוהלים באמצעות טכניקה זו, על מנת לזהות שלבי הזיכרון הדורשים גןביטוי. הזרקת Thorax של מולקולות כאלה תואמת הישרדות במשך כמה ימים 27, כלומר הפעולה הרעילה הפוטנציאל שלהם על מטרות אחרות יכולה להיות מוגבלת, בתנאי הריכוז נבחר היטב. בתנאים כאלה, סלקטיבית זמן תלוי השפעות על זיכרון ניתן להשיג, וכך להראות מיקוד יעיל של המוח (האיור. 2).
דיפוזיה של מולקולות לתוך hemolymph ראש מוביל אפקטים מהירים, תלוי במינון.
הזרקת Ocellus היא דרך לאפשר דיפוזיה מהירה של מולקולות של עניין לתוך הראש כולו דרך hemolymph, במיוחד אם הם יכולים להיות בעלי מטרות נפוצות רבות במוח. שיטה זו שימשה לנהל allatostatins, נוירופפטידים, שגם היא יכולה לשמש neurohormones 28). כתוצאה מכך, הופעה מופחתת נצפתה ב assay למידת חוש ריח, עולה בקנה אחד עםהנוכחות הציעה allatostatin קולטנים באזורי מוח שונים המעורבים בעיבוד הרחה ולמידת 28. עקומת מינון תלוי עבור האפקט הזה ניתן להקים, על ידי הזרקה בריכוזים שונים לקבוצות עצמאיות להריץ במקביל (איור. 3).
דרכים שונות של הממשל יכול להיכנע השפעות דומות על תפקוד המוח.
Emetine, חוסם של סינתזת חלבון, משמש לפגוע ההיווצרות של זיכרון לטווח ארוך זיכרון מוקדם חוש ריח, שהוא בדרך כלל לידי ביטוי 1-2 ימים לאחר המיזוג. במחקרים שפורסמו ביותר זה כבר מוזרק 29 החזה. הראינו כי השפעות דומות יכולות להיות מושגת על ידי מתן אותו ישירות אל המוח דרך מערכת ocellar (איור 4).: מתן התאמה פרמטרי הזרקה (נפח קטן יותר, ריכוז גבוה יותר וקצרעיכוב לפני מיזוג), השגנו ירידה (~ 20%) דומה לזה שנמצא בספרות באמצעות אותה כמות התרופה (10 ננומטר) - להשוות עם איור 4 ב Stollhoff ואח ', 2005 29..
ההשפעות של זריקות מקומיות מתוחמות בזמן ובמרחב
כדי לבחון את המאפיינים במרחב ובזמן של תרופות microinjected לתוך איזורים מסוימים במוח, דבורים רתמו הוכשרו בתוך ריח PER הפרדיגמה מיזוג, ולאחר מכן מוזרק בילטרלי עם 0.5 nl של פרוקאין 740 מ"מ (הרדמה) ב calyces פטריות הגוף או אונות אנכיות ( מלוחים שימש כביקורת). כאשר דבורים נבדקו ברציפות לשחזור 1, 2, ו -3 שעות לאחר הזרקה, ביצועים נפגמו רק בדבורים עם זריקות הבילטרליים לתוך האונות (איור. 5). תפוקה עצבית ללא פגע מן האונות, אך לא מן calyces, ידועהלהיות הכרחי יחזור זיכרון ריח, אז זה מצביע על כך פרוקאין נשאר מקומי באונה שבו היה מוזרק זה במשך שעה לפחות 3. הוא גם מראה כי, כאשר הוא מוזרק לתוך calyces, דיפוזיה אל תוך האונות הסמוכות הוגבלה לעומת התקופה מקבילה, מאז זריקת calycal של פרוקאין לא להוביל מצור של האונות.
פנוטיפים התנהגותיים הבאים ותרופות הם לעתים קרובות תלוי קשר
ניסויים קודמים הראו כי לאחר טיפול עם דבורי קוק יתר להעריך את האיכות של תמיסת סוכרוז 10,30. כדי לראות אם האפקט הזה היה תלוי בהקשר (כאן, איכות סוכרוז בסיס), דבורי דבש חינם-עפו טופלו קוק volatilized. בנפרד דבורי דבש חינם-עף מסומנים הורשו ללקט בכל מזין המכיל 1 M פתרון סוכרוז. במתקן ההאכלה, דבורים נתפסו בעדינותצינור צנטריפוגות 50 מ"ל כשעמדו לרדת ממזין. דבורים טופלו או 100 מיקרוגרם של קוקאין טהור או שליטה ברכב (אתנול התאדו). לאחר טיפול, מזין סוכרוז הוחלף גם על ידי 0.5 M או מזין 2.0 M סוכרוז, ואת לקטי השיעור חזרו למזין נרשם. באמצעות פרדיגמה זו, דבורים שטופלו קוקאין עלה מאמץ הליקוט שלהם במתקן ההאכלה 0.5 M, אבל לא על 2.0 M מזין (איור 6). ההבדל בתוקף לראות עם שני הריכוזים סוכרוז יפה ממחיש את החשיבות של נטילה לגירויים סביבתיים בחשבון כאשר לומדים התנהגות דבורה.
איור 1: תמונה סריקת לייזר Confocal של הזריקה. אלקסה dextran 546 שכותרתו מוזרק יחד עם פתרון התרופה (אדום). כדי לזהות את neuropilsa נגד מכתים עם DAPI מתווסף (ירוק). במחצית המוח הימני הזריקה הייתה ממוקמת באונה האנכית (VL), המוצג כדוגמא עבור זריקה מוצלחת. בשנת האונה השמאלית הזריקה הייתה ממוקמת הגבי של האונה האנכית בטבעת neuropil, לראות כדוגמא עבור זריקה לא מוצלחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר, MB: פטריות גופים, AL: מחושים אונות, ד: הגבי, v: הגחון, l: עזבו, r:. תקין אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תלוי בזמן השפעת actinomycin D (תמלול חוסם) על זיכרון לטווח ארוך, כאשר הוא מוזרק לתוך בית החזה בשעת עיכובים שונים הבא קונדי הרחת תיאבון. תיפקוד (6, 9 או 12 שעות), 1 μL actinomycin D (1.5 מ"מ ב PBS) שהוזרק לתוך בית החזה. יחזור זיכרון לטווח ארוך (LTM) הוערך 3 ד לאחר מיזוג (n = 25 - 65). ביצועי זיכרון הופחתו באופן תלוי-זמן, בהשוואה לזו של בקרות שטופלו PBS: האפקט היה משמעותי כאשר הזרקה מדי למקם 6 שעות לאחר המיזוג (χ 2 = 18.04, p <0.005), אך לא על עיכובים ארוכים יותר ( 9 שעות: χ 2 = 0.95; 12 שעות: χ 2 = 0.47), דבר המצביע על כך היווצרות LTM דורשת גל של שעתוק המתרחש במהלך חלון זמן מוגדר לאחר מיזוג. ברי שגיאה מייצגים סטיות התקן. הנתונים פורסם 27 בעבר ונבנו מחדש כאן באישורו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
איור 3:. עיכוב תלוי מינון של ביצועי למידה בעקבות הזרקת Ocellar של נוירופפטידים ונוירופפטידים allatostatin C הוזרק hemolymph ראש (200 NL ב PBS), דרך ocellus החציוני, 1 שעות לפני מיזוג חוש הריח. קבוצות עצמאיות של חיות מוזרקות עם ריכוזים שונים (או PBS עבור פקדים) הוכשרו. טיפול Allatostatin C הביא לירידה בביצועים למידה, כפי שהוערך על ידי אחוז התשובות מתל לביצוע המיזוג האחרון, באופן תלוי מינון הבא עקום U-צורה (n = 70-78). ירידה זו היתה משמעותית ב 10 -6 M אבל לא בריכוזים אחרים. ברי שגיאה מייצגים סטיות התקן. נתונים פורסם בעבר 28, והוא מותאם כאן באישורו. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול Verשיאון של נתון זה.
איור 4:. מצור של זיכרון 1 D ay בעקבות הזרקת Emetine (תרגום מונע) דרך מערכת Ocellar מעכב סינתזת חלבון emetine (50 המ"מימ ב PBS, 200 NL) שהוזרק לתוך המוח, דרך מערכת ocellar, 20 דקות לפני מיזוג חוש ריח. זיכרון נבדק ואחר כך 24 שעות. שייר זיכרון הטיפול משמעותי הלקוי (χ 2 = 7.03, p <0.01) בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופלה PBS (n = 57-70). ברי שגיאה מייצגים סטיות התקן. JM Devaud, נתונים שלא פורסמו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. אנטומיים Temporal ספציפי של microinjections בעקבות מיזוג הרחת תיאבון, פרוקאין הוזרק בילטרלי לתוך גם את calyces פטריות הגוף או אונות אנכיות. יחזור זיכרון הוערך 1 שעות לאחר הזרקה והושפע רק על ידי זריקות פרוקאין האונות (1 שעות לאחר טיפול: לעומת מלוחים: χ 2 = 10.00, p <0.005; לעומת פרוקאין כדי calyces: χ 2 = 32.92, p < 0.005). ההשפעה יכולה עדיין לראות 2 hr (χ 2 = 6.65, p <0.01) ו -3 (χ 2 = 27.22, p <0.005) לאחר ההזרקה, ועדיין היה למיקום ספציפי (2 hr: χ 2 = 8.60, p < 0.05; 3 שעות: χ 2 = 17.15, p <0.0001), דבר המצביע על כך באזור המוזרק רק הושפע פרוקאין. פרופורציות ביחס לרמת מיזוג duלצלצל במשפט המיזוג האחרון. ברי שגיאה מייצגים סטיות התקן (n = 23-28). נתונים פורסם בעבר 31, ונבנו מחדש כאן באישורו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. השפעות של קוק על דבורים חינם-עף שיעור ביקור (מספר הביקורים ידי / דבורת נתון ביקורים ממוצעים עבור כל הדבורים במהלך תקופת בוחן) הוגדל לאחר טיפול קוק volatilized בכל מקור באיכות נמוכה (0.5M: T-70 = 5.0710, p = 0.00003), אך לא מקור באיכות גבוהה (2M: T-70 = -0.2087, p = 0.8353). התיבות לייצג -1 ו -3 rd רבעונים עם קו האמצע מראה את החציון. הזיפים להאריך 1.5x את טווח בין-רבעוני. חריגים אינם זממו כמו כל נקודות המידע הקשור חופפות זו לזו. נתונים פורסם בעבר 10, ונבנו מחדש כאן באישורו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| יַחַס | האם ניתן לעשות עם דבורים מעופפים חופשיים? | Pros | חסרונות |
| טיפול אוראלי | כן. | קל, זעיר-פולשנית. | עיכול דבורה אינו פשוט |
| טיפול מקומי | כן. | קל, זעיר-פולשנית, מהירה. | טיפולים חוזרים ונשנים עלולים להיות בעייתיים. |
| הזרקת לתוך בית החזה | מסובך,משפיע דבורים מעופפים היכולות | עקבי ויציב. | קצת פולשני. פוטנציאל לפגוע / דבורה מתח. |
| הזרקת לתוך ocellus החציוני | לא מומלץ. | עקבי ויציב, מקומי במקצת. | קצת פולשני. פוטנציאל לפגוע / דבורה מתח. |
| הזרקה לתוך בדרך ocellar | לא מומלץ. | מאוד מקומי | מאוד פולשני. פוטנציאל לפגוע / דבורה מתח. |
| הזרקת מיקרו לתוך אזורים במוח | לא מומלץ. | מאוד מקומי | מאוד פולשני, קשה לבצע. פוטנציאל לפגוע / דבורה מתח. |
| משלוח סמים Volatilized | כן. | קל, זעיר-פולשנית, מהירה. | לא עובד עבור כל התרופות. |
טבלה 1: Compariבנו של שיטות הטיפול השונות ותכונותיהן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שתוארו לעיל מאפשרות טיפול פשוט, יעיל ויציב של כל אחד חופשי-עף או דבורי דבש רתמו. שיטות אלו עולות בקנה האחד עם פרדיגמות ניסוי רבים ושאלות ביולוגיות (טבלה 1). כל השיטות-טיסה חינם ניתן ליישם בקלות לדבורים רתמו. ההפך הוא פחות מוצלח, לעומת זאת, מאז איפוק זמני ושיטות טיפול פולשני לעתים קרובות יכולים להתפשר היכולת עפה של הדבורים.
השיטות הוצגו מנקודת מבט מוח ממוקד. זה לא בשל מגבלות מובנות של הטכניקות, אלא בגלל האינטרסים האישיים של המחברים. אין שום סיבה מדוע שיטות אלה לא יכולים לשמש ללימוד איברים אחרים. עם זאת, שינויים קטנים עשויים להידרש כדי ליצור השיטה מתאימה יותר למערכות איברים אחרות. לדוגמה, בעוד מיועד לטיפול מקומי להגיע למוח מוחל בדרך כלל על החזה, זה יכול להיות טוב יותר כדי להחיל תיים אל הבטן אם המטרה המיועדת היא השחלות. באופן דומה, זריקות יכולות להיות מיושמות בקלות לאזורים אחרים מאשר החזה או הראש (למשל, אברי בטן יכולים להיות ממוקדים על ידי הזרקה בין sclerites הבטן).
במונחים של אשר תרכובות יכולות להיות מנוהלות על דבורים, באמת אין גבולות. בדרך כלל, אנשים מנוהלים תרכובות תרופתיות כגון מולקולות איתות 21 או יריביהם 32, ופפטידים מחוייט 28. עם זאת, חלה עלייה אחרונה בניהול לתרכובות דבורים בשאלות שיושמו מוח, כגון חומרי הדברה ומזהמים 33 אנתרופוגניים 34. לאחרונה, תרכובות מנוהל החלו לכלול מולקולות RNA שמפריעים ביטוי גנים ישירות, כגון dsRNA הפעלת מסלול התערבות RNA 35 או אפילו מיקרו RNA 36 ו antagomiRs 37. לא כל שיטות עבודה לא פחות טובה עבור כל התרכובות.זה אולי ההמחשה הטובה תרכובות מרירות או חמוצות שהופכות מי סוכר לעיכול לדבורים, ובכך מנע מהם לצרוך אותו. מולקולות שבירות, כגון RNAs או פוליפפטידים מסוימים, מפורק כאשר מחוממים במהלך הליך volatilization או להציב בתוך ממס קשה כמו DMF. לכן חשוב להבין את הכימיה של מה זה להיות מנוהל על מנת שיעשה שורד את הליך הטיפול.
קבלת סוכן תרופתי לתוך דבורה היא חלק הקל, אבל יש שלושה חששות גדולים כי אף פעם לא צריך לזלזל בעת ביצוע ניסויים תרופתיים. הראשון הוא להבין מנה הגונה עבור הניסוי מדובר. בהתאם התרופה, שאולי כבר יפורסם ספרות קיימת, אך על פי רוב, זה יצטרך להיפתר על ידי תערובת של חיפושים בספרות, ניחושים הודיעו, ועקומות מנת תגובה. בהתאם לאופן מסובך פרוטוקול הניסוי הוא, זה עשוי להועילראשון ליצור עקומת מנה-תגובה בתוך מבדק פשוט (למשל, לכימות תנועה או הישרדות כלל) כדי לקבל מושג טוב יותר של מנסה שווה-טווח במינון מבדק משוכלל יותר. במעבדה שלנו, מנת מוצא נמצאת גם בספרות הדבורה או על ידי ביצוע המרת מ"ג / קילו המבוסס על נתונים מהספרות המכרסמות. מנקודת מוצא זו, דבורי מטופלות עם המינון ההתחלתי, בתוספת 2 או 3 מנות 10 פעמים גדולות יותר ויותר מאשר המינון ההתחלתי (למשל, אם המינון ההתחלתי הוא 1 מ"ג, 0.01, 0.1, 10, ו 100 מ"ג יהיה גם בשימוש), וכמובן פקד רכב מתאים.
הבעיה השנייה היא קצת יותר בררנית: סגוליות תרופה. רוב התרופות לא פותחו עם דבורי דבש, או לכל חרק אחר, בראש. בגלל זה, השפעות חוץ-היעד נפוץ (למשל, mianserin, אנטגוניסט לקולטן חוליות סרוטונין 38, נחשב ארוך להיות חרק octopaminergic אנטגוניסט לרצפטור, אבל fi האחרונהממצאים מראים כי בדבורים הוא גם אנטגוניסט לרצפטור דופאמין 39). פתרון משותף לבעיה זו הוא, ולא להסתמך על תרופה נוספת אחת בלבד, לחזור על אותו הניסוי עם חבילה של סמים ידועים כבעל היעד של עניין משותף לשניהם. בעיקרון, אם מספר תרופות ידועות ככאלה החוסמות מטרה מסוימת, התבוננות תוצאות דומות ברחבי תרופות שונות צריך לתת ביטחון רב יותר על כך שלתרופה את ההשפעה הצפויה, מאז תרופות שונות לעתים קרובות יש פרופילים מחוץ יעד ייחודיים.
הנושא האחרון כרוך בהבטחה כי התרופה פועלת במקום בו הם אמורים להיות משחק. בהקשר זה, תמיד יהיה trade-off בין הספציפיות הפולשנות. שיטות טיפול שיטתיות הן בדרך כלל לפחות פולשני, אבל אין שליטה היכן בגוף הדבורה התרופה אותותיו. אפילו עבור microinjection של רקמות ממוקדות סמים יכולים לנדוד עם hemolymph לחלקים אחרים של גוף הדבורה. איך בבעיה מתייחסת לביתds שאז נודע לו מפי השאלות שנשאלו. בניסויים מסוימים המיקום האנטומי אינו רלוונטי, ואילו עבור אחרים זה השאלה היחידה בעלת חשיבות. הדרך הטובה ביותר להתמודד עם זה היא להתחיל עם טיפולים מערכתיים ובהדרגה לצמצם למיקום האנטומי באמצעות שיטות ספציפיות יותר ויותר. אם ההתנהגות נחקרת אינה עולה בקנה אחד במיוחד עם שיטות טיפול פולשני, זה יכול להיות שווה לנסות לפרק אותה לרכיבים פשוטים יותר לפני כן עושה סדרה שלמה של ניסויים עם טיפולים תרופתיים מאוד ספציפיים.
בעיה זו של דליפת תרופה עוד יותר מוגזמת עם טיפול פומי של דבורים חינם-עף, שבו תרופות יכולות להשפיע דבורי היעד הלא. דבורי הדבש Forager לאסוף צוף בתחום להחזיר המושבה שלהם. הם לפרוק את רוב תמיסת סוכרוז שלהם בכוורת בשובו ולא לקלוט אותו. בכוורת הוא ארוז בתאים, מיובש, ומאוחסן כדבש. בגללזו, סמים עלולים להשפיע דבורי היעד הלא. עם שיטות ספציפיות יותר (כגון microinjections) בעיה זו ממוזערת.
עם אזהרות אלה בחשבון, ופנה כראוי, מניפולציה neuropharmacological של דבורי הדבש יכול להיות כלי רב עוצמה. בעוד כלי מהונדס מפותח עבור דבורי דבש 15, בגלל אורח החיים החברתיים שלהם אין זה סביר כי transgenics אי פעם תהיה דרך קלה ואמינה לנהל סוגים אלה של ניסויים. לכן סביר להניח כי פרמקולוגיה ימשיך להיות מרכיב חשוב של מחקר דבורה בעתיד. בעוד כמה חוקרי דבורים הפכו קריאות שיטות סטנדרטיות ניסיון 40, במקרה זה זו תהיה טעות. חלק מכוחו של מערכת הדבורה מאז ומתמיד את המגוון של גישות ניסיוניות, וכיצד טכניקות פותחו עם שאלות ביולוגיות אמיתיות לזכור ולא להיפך. זה בכל זאת חשוב לנו להבטיחהשימוש בשיטה המתאימה ביותר עבור השאלה שעל הפרק. אם השוואות למחקרים קודמים הן מפתח, פרוטוקולים סטנדרטיים חייבים להיות מלווה בקפדנות. עם זאת, ניצול פרוטוקול הוקם למען בשיטות סטנדרטיות אסורים לעמוד בדרכה של פיתוח שיטות חדשות היכול לפתוח אפשרויות ניסוי חדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B.
- Søvik, E., Barron, A. B.
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662 (2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282 (2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P.
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288 (2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529 (2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
