Summary
Ce manuscrit décrit plusieurs protocoles pour l'administration d'agents pharmacologiques pour les abeilles, y compris des méthodes non invasives simples pour les abeilles en vol libre, ainsi que des variantes plus invasives qui permettent le traitement des abeilles sobres localisé précis.
Abstract
Les abeilles démontrent les capacités d'apprentissage étonnantes et le comportement social de pointe et de la communication. En outre, leur cerveau est petit, facile à visualiser et à étudier. Par conséquent, les abeilles ont longtemps été un modèle privilégié parmi les neurobiologistes et neuroethologists pour étudier les bases neurales du comportement social et naturel. Il est important, cependant, que les techniques expérimentales utilisées pour étudier les abeilles ne pas interférer avec les comportements à l'étude. À cause de cela, il a été nécessaire de développer une gamme de techniques pour la manipulation pharmacologique des abeilles. Dans cet article, nous démontrons des méthodes pour traiter les abeilles sobres ou en vol libre avec une large gamme d'agents pharmacologiques. Ceux-ci comprennent à la fois des méthodes non invasives telles que les traitements oraux et topiques, ainsi que des méthodes plus invasives qui permettent l'administration de médicaments précis, soit de manière systémique ou localisée. Enfin, nous discutons des avantages et des inconvénients de chaque méthode et de décrireobstacles et la meilleure façon de les surmonter communs. Nous concluons par une discussion sur l'importance d'adapter la méthode expérimentale aux questions biologiques plutôt que l'inverse.
Introduction
Depuis Karl von Frisch élucidé leur langue de danse 1, les abeilles sont restés une espèce d'étude populaire pour les chercheurs dans le comportement des animaux et de la neurobiologie. Ces dernières années , une myriade de nouvelles disciplines ont vu le jour à l'intersection de ces deux domaines, et plusieurs autres disciplines (par exemple, la biologie moléculaire, la génomique et l'informatique) se sont posés à côté d' eux. Cela a conduit à un développement rapide de nouvelles théories et des modèles pour comprendre comment le comportement résulte de l'activité au sein des systèmes nerveux. En raison du mode de vie unique, riche répertoire comportemental, et la facilité de manipulation expérimentale et pharmacologique, les abeilles sont restés à l'avant-garde de cette révolution.
Les abeilles sont utilisées pour étudier les questions neurobiologiques de base telles que celles d' apprentissage sous - jacente et de la mémoire 2,3, la prise de décision 4, olfactive 5 ou traitement visuel 6. Au cours des dernières années, le députéey abeille a même été utilisé comme modèle pour l' étude des sujets généralement réservés pour la recherche médicale, tels que les effets des drogues toxicomanogènes 7 - 11, le sommeil 12, le vieillissement 13, ou les mécanismes sous - jacents anesthésie 14.
Contrairement aux modèles génétiques classiques organismes (par exemple, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), il existe très peu d' outils génétiques disponibles pour manipuler les fonctions neurales dans les abeilles, bien que cela soit en train de changer 15. Au lieu de cela, des études d'abeilles ont surtout compté sur des manipulations pharmacologiques. Cela a été un grand succès; toutefois, la diversité de la recherche d'abeilles est telle que toute une gamme de procédés pour une administration pharmacologique sont nécessaires. La recherche avec des abeilles mellifères aborde très diverses questions, est étudiée par des chercheurs de différentes disciplines et d'horizons, et utilise une variété d'approches expérimentales. Beaucoup reseles questions arc exigent des abeilles à être soit en vol libre, interagir librement dans leur colonie, ou les deux. Cela peut rendre difficile de garder la trace des animaux de laboratoire individuels, et rend retenue ou cathétérisme irréalisable.
Pour tenir compte de la diversité de la recherche du miel d'abeille, une variété de méthodes d'administration de médicaments sont nécessaires, permettant une administration robuste et flexible tout en assurant que les profils pharmacocinétique et pharmacodynamique, invasivité de la méthode, et sa fiabilité, conviennent le paradigme en question. En raison de ces divers besoins, la plupart des groupes de recherche ont mis au point leurs propres méthodes d'administration de médicaments uniques. Jusqu'à présent, cela a été une force de la communauté de recherche des abeilles; elle a conduit au développement de réseaux de méthodes permettant l'administration du même médicament dans des circonstances différentes. Notre but ici est de ne pas développer une seule méthode normalisée pour les manipulations pharmacologiques des abeilles, mais plutôt de mettre en évidence les méthodes quise sont avérés particulièrement efficaces, et aider les chercheurs à adopter ces. Nous discutons des principes de base de la façon dont ils travaillent, ainsi que leurs avantages et leurs inconvénients.
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Protocol
1. Drug Administration pour Bees harnachés
- Le traitement oral
- Préparer une solution 1,5 M de saccharose en mélangeant 257 g de saccharose par 500 ml d'eau (il est plus facile à dissoudre cette quantité de saccharose dans de l'eau bouillante). Stockez solution de saccharose à 4 ° C jusqu'à utilisation.
REMARQUE: solution sucrose fournit un environnement très accueillant pour certains micro-organismes, et devient ainsi facilement contaminés et désagréable pour les abeilles. une solution de saccharose en vrac peut être aliquote et stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation. - Décider d'une dose de médicament approprié (comment y parvenir, est abordée dans la section de discussion ci - dessous), et préparer une solution telle que la dose préférée de médicament est dissous dans 20 ul solution de saccharose (par exemple, pour délivrer 20 ug, diluer la drogue à un raison de 1 mg / ml). abeilles Harnais selon Felsenberg et al. (2011) 16. Effectuez cette opération au moins 12 heures avant le traitement de la drogue pour faire en sorte que les abeilles ne sont plus stressés out de tirer parti lorsque la solution de médicament est présenté.
NOTE: Pour des résultats plus cohérents, il est préférable de mourir de faim les abeilles (en plaçant les abeilles attelés dans un incubateur à 34 ° C et 70% d'humidité) O / N. - En utilisant une micropipette, touchez une baisse de 1,5 M d'eau de saccharose à l'antenne d'une abeille harnaché. Lorsque le proboscis est prolongée, touchez une gouttelette de 20 pi de 1,5 M de saccharose contenant le médicament directement à la trompe de l'abeille. Assurez-vous que l'abeille consomme tout. Comme le contrôle du véhicule en utilisant 1,5 M solution de saccharose sans médicaments ajoutés.
NOTE: La quantité de solution de saccharose peut avoir besoin d'être ajustée en fonction de plans expérimentaux. Si appétitif conditionné est destiné, nourrir les abeilles juste avant la formation va interférer avec la réactivité des abeilles. - Jeter ou mis de côté les abeilles qui ne consomment pas la totalité du saccharose.
NOTE: Si un grand nombre d'abeilles ne parviennent pas à boire la solution de saccharose, le programme d'alimentation pourrait être nécessaire d'ajuster.
- Préparer une solution 1,5 M de saccharose en mélangeant 257 g de saccharose par 500 ml d'eau (il est plus facile à dissoudre cette quantité de saccharose dans de l'eau bouillante). Stockez solution de saccharose à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Injection dans le thorax
- Préparer la drogue dans le miel d' abeille Ringer 17 comme suit:
- Et mélanger l' autoclave 7,45 g de NaCl, 0,448 g de KCl, 0,812 g de MgCl2, 0,735 g de CaCl2, 54,72 g de saccharose, 4,95 g de D-glucose et 2,48 g d' HEPES dans 1000 ml d'eau. Soyez prudent lors de l'enregistrement de la sonnerie comme il est facilement contaminé. Aliquoter et stocker Ringer à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Dissoudre le médicament dans une solution de Ringer, puis diluée de telle sorte que la quantité souhaitée est présente dans 5 ul. A titre d'exemple, si les abeilles doivent être traitées avec 5 ug d'un médicament, 1 g peut être initialement dissous dans 1 ml de Ringer, avant d'être dilué 1: 1000 dans une solution de Ringer pour une finale de 1 pg / pl.
NOTE: Vous pouvez également disponible dans le commerce PBS (Phosphate-tamponnée Salin) peut être utilisé au lieu de la solution de Ringer.
- Faire un micro-scalpel en cassant le coin d'une lame à double tranchant rasoir avecun porte-lame. Fixer le fragment de lame à un porte-lame de sorte qu'il fasse une belle lame avec un point d'extrémité pointue.
- En vertu d'un stéréomicroscope, utiliser avec précaution le micro-scalpel pour découper un trou de 2 mm au-dessus du scutellum, à côté du processus de l'aile postérieure du thorax d'une abeille. Évitez de couper trop profond car cela pourrait blesser les muscles de vol, et prendre soin d'éviter les charnières de l'aile. Idéalement, seulement couper trois côtés, de sorte que le volet de la cuticule peut ensuite être replié pour fermer le site de la lésion.
- En utilisant une micropipette, dépôt de 5 μlL Ringer (ou PBS) contenant le médicament sur le dessus du trou dans le thorax. surveiller avec soin sous un microscope afin d'assurer la totalité de goutte est absorbée dans l'hémolymphe. Utilisez Ringer (ou PBS) comme un contrôle du véhicule.
- Si possible, déplacer le volet de la cuticule en arrière sur le trou. Après 5-10 heures, il rattachez et sceller.
Remarque: Comme une alternative à cette technique, injecter 1 ul directement dans le thorax à l'aide d'une seringue en verre, après l'ouverture d'une small trou au milieu du frein (ligne transversale dans la région postérieure du scutellum) avec une aiguille de seringue (diamètre: 0,6 mm, G 23). Cela évite la nécessité de réduire d'abord le thorax avec un scalpel et le site d'injection est plus petit, mais cette méthode va quitter le site d'injection exposée.
- Préparer la drogue dans le miel d' abeille Ringer 17 comme suit:
- injection ocellus
NOTE: Ceci est une méthode appropriée pour délivrer des molécules à travers la capsule de la tête, dans l'hémolymphe.- Préparer les médicaments comme en 1.2.1, mais ajuster les concentrations de médicament de telle sorte que la dose souhaitée sera contenue dans 1 pl de Ringer ou PBS (moins de volume peut être absorbé par le trou ocellus que par le thorax).
- Préparer un micro-scalpel comme dans 1.2.2. En vertu d'un stéréomicroscope, verrouiller la tête d'une abeille harnaché en place en remplissant le sillon du cou avec de la cire. Utilisez à faible température de fusion de la cire (par exemple, la cire dentaire) afin d'éviter d' endommager les récepteurs olfactifs antennaires ou d' autres cellules qui peuvent être important pour évaluer le comportement (par exemple, l' apprentissage olfactif). Ensuite, retirez soigneusement la lentille de l'ocelle médian en insérant l'extrémité de la micro-scalpel sous la lentille et de briser doucement la lentille libre de la capsule de la tête.
NOTE: Il est également possible de placer la cire avec soin sur les antennes pour empêcher le mouvement. - Pipetter prudemment médicament sur le trou de ocellus. Attendez jusqu'à ce que tout est pris dans la capsule de la tête. Retirer la cire dentaire des antennes et laissez l'abeille se reposer pendant un certain temps avant de poursuivre la procédure expérimentale. Utilisez Ringer (ou PBS) comme un contrôle du véhicule.
- Injection dans le tractus ocellaire
NOTE: Le tube ocellaire contient de grandes fibres, la connexion à la plupart des régions du cerveau central 18. Cette méthode de traitement permet d'appliquer les composés au cerveau seulement, mais de ne pas cibler les sous-régions spécifiques du cerveau.- Préparer l'abeille comme dans 1.3.2. et retirer la lentille du ocelle médian avec le tip d'un micro-scalpel comme dans 1.3.3.
NOTE: Cela peut être fait jusqu'à 2 heures avant l'injection. D'après notre expérience, les abeilles nourris sont mieux en mesure de faire face à ce type de chirurgie que les abeilles affamées - Remplir une seringue en verre de 10 pi muni d'un petit calibre (par exemple, 33, diamètre: 210 pm) avec aiguille solution médicamenteuse préparée comme au point 1.3.1.
- L'utilisation d'un micromanipulateur manuel, insérez la pointe de la seringue à travers la rétine ocellaire dans la capsule de la tête à une profondeur de 50 um et injecter 250 nl de solution.
- Après utilisation, rincer la seringue 3 fois avec de l'eau distillée, puis 3 fois avec 75% d'éthanol.
- Préparer l'abeille comme dans 1.3.2. et retirer la lentille du ocelle médian avec le tip d'un micro-scalpel comme dans 1.3.3.
- Microinjection en particulier des structures cérébrales
NOTE: En plus des traitements systématiques mentionnés ci-dessus, il est possible de réaliser des micro-injections dans certaines structures du cerveau. Ceci permet une manipulation pharmacologique d'une ou plusieurs régions du cerveau, tout en laissant les autres intacts. Cela marchemieux avec les régions du cerveau qui sont faciles à reconnaître à partir de la surface du cerveau antérieur (par exemple, les lobes antennaires, champignon calices du corps ou lobes verticaux, ou les lobes optiques), mais d' autres régions ont été ciblées. S'il vous plaît noter que l'orientation (antérieure / postérieure, dorsal / ventral) se réfère à l'axe du corps, plutôt que de 19 neuraxis.- Préparer le médicament dans Ringer ou PBS de la même manière que dans 1.2.1, l' ajout d' un fluorescent (par exemple, 0,5 mg / ml de dextran, Alexa 546 ou 568 fluor) ou un colorant non fluorescent (par exemple, 1 mM de bleu de méthylène).
NOTE: L'ajout d'un colorant fluorescent permettra la vérification de l'emplacement d'injection après l'expérience est terminée (en utilisant la microscopie confocale, après dissection du cerveau), alors que les colorants non fluorescents permettent la surveillance directe pendant l'expérience. - Pour pipettes en verre pour injection, insérer des capillaires en verre de diamètre correct dans des pinces de maintien d'un extracteur d'électrode (1,0 mm pour la cale normeer inclus pour le microinjecteur mentionné dans la liste des matériaux). Régler les paramètres de traction et de la chaleur pour produire un environ 0,5 cm de long bout (paramètres seront différents pour chaque tirage, même si le même modèle est utilisé).
NOTE: Idéalement, les deux pipettes tiré d'un verre devrait avoir la même longueur et la forme, de sorte que les deux peuvent être utilisés. - En vertu d'un stéréomicroscope, briser les conseils pour obtenir un diamètre extérieur d'environ 10-15 um, basée sur l'estimation visuelle en utilisant une échelle sur un réticule inséré dans l'oculaire. Les étapes de l'échelle sont définies par le fabricant et peuvent être corrigées pour le grossissement utilisé.
- Ensuite, remplissez les pipettes en verre avec la solution à injecter. Si capillaires en verre avec des filaments sont utilisés, remplir la pipette en plaçant la face arrière dans la solution médicamenteuse, sinon remplir des informations en utilisant des conseils microloader.
- Insérer la pipette en verre rempli dans le support capillaire d'un micro-injecteur qui est commandé par un mi manuel ou électroniquecromanipulator.
- Calibrer le micro-injecteur pour injecter le volume désiré (0,5 à 2 nl, en fonction de la taille de la structure du cerveau ciblée). Pour cela, injecter directement dans une petite boîte de Pétri contenant de l'huile minérale et de mesurer le diamètre de la gouttelette avec le réticule. Modifier les paramètres jusqu'à ce que le volume désiré soit atteint.
- Fixer la tête d'une abeille attelée à la cire dentaire douce comme dans 1.3.2, avant de couper une ouverture dans la partie antérieure de la capsule de la tête, en utilisant un micro-scalpel, avec trois coupes: un juste en dessous du ocelle médian (ventrale), un à la frontière du droit ou de l'œil gauche et l'autre au-dessus de l'antenne tiges (dorsale). Utilisez un morceau de cire dentaire pour maintenir le volet ouvert en place.
- Poussez doucement les glandes et la trachée située au-dessus du cerveau en utilisant une pince fine côté, puis faire une petite rupture dans la neurilemma (membrane très mince autour du cerveau) au-dessus de la structure du cerveau ciblée.
NOTE: Si beaucoup d'abeilles sont à traiter à la fois, cette procédurepeut être effectuée plus tôt; Cependant, attention à ne pas laisser les abeilles dans cet état trop longtemps (pas plus de 30 min), que leurs cerveaux pourraient dessécher. - Insérez la pointe dans la région du cerveau désirée, et d' ajuster la profondeur perpendiculaire à la surface du cerveau (par exemple, 60 um pour calices du corps de champignon). Injecter le volume préréglé. Pour les régions du cerveau latérales, injecter bilatéralement (ie faire une injection à chaque hémisphère). Si un colorant non fluorescent est utilisé, assurer l'injection produite dans la bonne région sur l'observation pendant l'injection. Si un colorant fluorescent est utilisé faire la même chose sous une lumière fluorescente en utilisant un stéréomicroscope avec un système de fluorescence de visualisation.
- Ensuite, placez le rabat ouvert en arrière sur la tête de l'abeille. Faire fondre un cristal de eicosane, qui est d'environ 1 mm de diamètre, en utilisant un fil mince enroulé autour de la pointe d'un fer à souder micro (température de fusion est de 35-37 ° C) et sceller les coupes. Cela permettra de réduire considérablement la mortalité.
- Relachez leabeille du harnais pour l' analyse comportementale (mais voir la discussion), ou de garder dans le harnais pour les expériences sur les abeilles sobres - par exemple, l' extension du proboscis réflexe (PER) à tester 20.
- Si un colorant fluorescent a été utilisée, s'assurer que l'injection a atteint la zone d'intérêt après que l'expérience est terminée en utilisant un microscope confocal à balayage laser (figure. 1).
NOTE: Ceci est particulièrement utile lors du ciblage des zones cérébrales profondes (où il serait difficile de voir colorant nonfluorescent pendant la phase d'injection).
- Préparer le médicament dans Ringer ou PBS de la même manière que dans 1.2.1, l' ajout d' un fluorescent (par exemple, 0,5 mg / ml de dextran, Alexa 546 ou 568 fluor) ou un colorant non fluorescent (par exemple, 1 mM de bleu de méthylène).
2. drogues Méthodes d'administration pour les abeilles en vol libre
- Le traitement oral
- Préparer des médicaments de la même manière que dans les étapes 1.1.1-1.1.2. Ajouter une solution de médicament à un dispositif d'alimentation et placer au réfrigérateur pour le stockage.
REMARQUE: Tout chargeur fera, comme un bouchon de la bouteille à l'envers ou un pot inversé sur papier de soie. - Former les abeilles à un dispositif d'alimentation par gravité contenant 1 M ou 0,5M solution de saccharose en plaçant un dispositif d'alimentation à proximité de la ruche. Une fois que les abeilles commencent à la recherche de nourriture à la mangeoire, se déplacer peu à peu plus loin jusqu'à ce qu'il soit à une distance confortable pour éviter d'être piqué (minimum 5 m).
- Peinture de marques abeilles afin de garder une trace des abeilles individuelles. Faites une liste de toutes les combinaisons de couleurs qui seront utilisées. Quand une abeille se pose à la mangeoire, marquent soigneusement son abdomen avec deux couleurs, et de faire une note sur la liste que la combinaison est prise.
- Remplacez le chargeur de gravité pour une alimentation contenant la solution de médicament / saccharose. Prenez note des abeilles marquées qui visitent la mangeoire. Attrapez toute abeille banalisée visitant le chargeur comme les abeilles sont les recruteurs prolifiques, et le nombre d'abeilles qui visitent le chargeur drogué peut rapidement devenir hors de contrôle. Cela est particulièrement problématique si la même expérience doit être effectuée plusieurs jours de suite, que les abeilles naïfs pourraient ne plus être naïf.
NOTE: Comme une alternative à la formation des abeilles individuelles à un dispositif d'alimentation, auteur précédentes ont alimenté avec succès l' eau de sucrose drogue lacées à toute une ruche 21 - 23.
- Préparer des médicaments de la même manière que dans les étapes 1.1.1-1.1.2. Ajouter une solution de médicament à un dispositif d'alimentation et placer au réfrigérateur pour le stockage.
- Le traitement topique
NOTE: L'objectif est de dissoudre le composé d'intérêt dans un solvant qui peut pénétrer l'insecte cuticule cireuse. Différents solvants peuvent être utilisés à cette fin. Les plus couramment utilisés comprennent l'acétone, le diméthylformamide (DMF) et le diméthylsulfoxyde (DMSO).- Évaluer ce qui fonctionne le mieux solvant pour le composé à portée de main. Si un phénotype fort est attendu d'un surdosage (par exemple, la paralysie ou la mort), les abeilles traiter (étape 2.2.2) avec une dose élevée (par exemple, 20 pg de cocaïne 7) dissous dans chacun des différents solvants et surveiller attentivement le temps jusqu'à ce que la paralysie ou la mort.
- L' utilisation d' un microcapillaire 1 pi (ou une microseringue, qui peut être monté sur un distributeur de répétition approprié) et porte-microcapillaire, tirer 1 pl de la solution de médicament (par exemple, 381, g / pl de la cocaïne) dans le capillaire. Expulser la goutte, et peindre soigneusement sur le thorax d'une abeille marquée. Couvrir aussi grande d'une zone d'un possible avec la solution, plutôt que de laisser une goutte solide, comme l'abeille est alors susceptible de le toiletter off. Veillez à ne pas permettre au composé de contacter l'aile charnières, ou cela peut soutirer le thorax et le long des ailes où il va évaporer sans être absorbé dans l'hémolymphe.
REMARQUE: En fonction de l'objectif de la recherche, cette méthode peut également être utilisé pour administrer des médicaments à l'abdomen de l'abeille. Cependant, les médicaments atteignent le SNC plus rapidement et en plus grande quantité lorsqu'il est appliqué sur le thorax méthode 24 .Cet fonctionne aussi bien avec harnaché comme avec les abeilles en vol libre.
- traitement volatilisé
- Dissoudre les médicaments (auparavant cette méthode a été utilisée pour fournir de la cocaïne pour les abeilles 10) dans 100% d' éthanol. Pour assurer la solubilité, ne pas utiliser un chlorhydrate ou d'autres formes de sel de lamédicament si possible. Lorsque vous faites une dilution préparer pour que le montant à être livré à une abeille est présente dans 100 pi. Utiliser de l'éthanol pur sous la forme d'un contrôle du véhicule.
- Pour créer un filament, utiliser la même procédure que McClung et Hirsh 25.
- Brièvement expliqué: enrouler le fil de nichrome étroitement autour d'un clou et le joindre à deux fils électriques (un à chaque extrémité du filament). Retirer le clou. La bobine nichrome restante est désignée comme le filament.
- Enfiler les deux fils à travers des trous percés dans soigneusement le couvercle d'un tube de centrifugation de 50 ml, ce qui doit être résistant à la température choisie. Coller les fils en place avec du silicone liquide.
NOTE: Cela rendra étanche à l'air du tube. Cela est essentiel pour éviter l'exposition secondaire à l'expérimentateur et veiller à ce que les abeilles sont traitées avec la dose appropriée.
- Attacher les fils conduisant au filament à une source d'alimentation. À l'aide d'un thermocouple pour mesurer la température dele filament, l'expérience avec tension différente / combinaisons actuelles jusqu'à ce que celui qui se traduit par un profil de température approprié pour le médicament en question, idéalement, qui permet pendant 10 sec du chauffage ou moins. Ceci est très important, se référer à la documentation pertinente (par exemple, pour que la cocaïne se volatiliser , il doit être chauffé à au moins 200 ° C, mais à des températures supérieures à 350 ° C , il se décompose en composés secondaires 26).
- Pipetter prudemment 100 ul de médicament contenant une solution d'éthanol sur le filament. Passez le liquide sur la surface autant de filaments que possible car cela va augmenter l'efficacité de l'évaporation. Laisser le filament exposé à la température ambiante jusqu'à ce que tout l'éthanol est évaporé.
NOTE: Si l'éthanol est pas suffisamment évaporé, les abeilles seront traités à la fois avec le médicament de choix et de l'éthanol. Les abeilles sont extrêmement sensibles à l'éthanol, et certains médicaments ont des interactions synergiques avec de l'éthanol, ce qui polarise exles résultats expérimentaux. - Une fois que l'éthanol a complètement évaporé (médicament précipité peut généralement être vu sur le filament sec sous un microscope), attraper une abeille en vol libre dans un tube de 50 ml. Bien refermer le couvercle contenant le filament.
- Allumez la puissance pendant 10 secondes, tournez la mise hors tension et attendre un autre 50 sec (pour permettre au composé volatilisé refroidir et ainsi de condenser ou de dépôt). Relâchez l'abeille.
REMARQUE: Bien que cette méthode de traitement fonctionne très bien pour les abeilles en vol libre, il peut être utilisé tout aussi efficacement avec les abeilles attelés. Il suffit de fixer l'abeille harnaché dans un tube de 50 ml. Recharger le filament comme décrit dans 2.3.4 entre les abeilles. Pour un débit élevé, plusieurs filaments peuvent être utilisés en parallèle.
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Representative Results
Une sélection de résultats représentatifs pour les méthodes décrites ci-dessus sont présentés, principalement pour démontrer que les méthodes permettent aux agents pharmacologiques pour atteindre le cerveau et influent sur le comportement des abeilles.
Effets spécifiques sur les processus du cerveau peuvent être facilement obtenues après l'injection thorax.
Parce que les agents pharmacologiques injectés à travers le thorax peut agir sur des cibles multiples dans le corps, et d'être diluée dans l'organisme avant d'atteindre le cerveau, cette technique peut poser des problèmes de spécificité possibles. Néanmoins, il a été largement utilisé dans la littérature pour interférer avec les processus cognitifs, sans la nécessité d'utiliser des doses très élevées qui pourraient donner des effets secondaires majeurs. Par exemple, les inhibiteurs de la transcription ont été administrées à l'aide de cette technique, afin d'identifier les phases de mémoire qui nécessitent gèneexpression. Injection de Thorax de telles molécules est compatible avec la survie pendant plusieurs jours 27, ce qui signifie que leur action toxique potentiel sur d' autres cibles peut être limitée, à condition que la concentration est bien choisi. Dans ces conditions, les effets sélectifs et dépendant du temps sur la mémoire peuvent être obtenus, montrant ainsi un ciblage efficace du cerveau (Figure. 2).
Diffusion de molécules dans l'hémolymphe de tête conduit à des effets rapides, dose-dépendante.
injection Ocellus est un moyen de permettre une diffusion rapide des molécules d'intérêt dans l'ensemble de la tête par l'hémolymphe, surtout si elles peuvent avoir de nombreuses cibles répandues dans le cerveau. Cette méthode a été utilisée pour administrer allatostatines neuropeptides, qui peuvent également agir comme neurohormones 28). En conséquence, une baisse de performance a été observée dans un test d'apprentissage olfactif, en accord avecla présence suggérée de allatostatine récepteurs dans différentes régions du cerveau impliquées dans le traitement olfactif et l' apprentissage 28. Une courbe dose-dépendante de cet effet a pu être établie, en injectant des concentrations différentes à des groupes indépendants exécuter en parallèle (Fig. 3).
Différentes voies d'administration peuvent produire des effets similaires sur la fonction cérébrale.
Émétine, un inhibiteur de la synthèse des protéines, est utilisé pour altérer la formation de la mémoire olfactive mémoire à long terme précoce, ce qui est généralement exprimée 1-2 jours après le conditionnement. Dans la plupart des études publiées , il a été injecté dans le thorax 29. Nous avons montré que des effets similaires pourraient être obtenus en administrant directement au cerveau à travers le tube ocellaire (figure 4).: Fournir un ajustement des paramètres d'injection (volume réduit, une concentration plus élevée et plus courtesdélai avant le conditionnement), nous avons obtenu une diminution (~ 20%) similaire à celle trouvée dans la littérature en utilisant la même quantité de drogue (10 nM) - comparer avec la figure 4 dans Stollhoff et al, 2005 29..
Les effets des injections localisées sont limitées dans le temps et l'espace
Pour tester les propriétés spatiales et temporelles des médicaments microinjection dans des régions spécifiques du cerveau, les abeilles attelés ont été formés dans un olfactive PER paradigme de conditionnement, puis injectées bilatéralement avec 0,5 nl de procaine 740 mM (un anesthésique) dans les calices du corps de champignon ou lobes verticaux ( du sérum physiologique a été utilisé comme témoin). Lorsque les abeilles ont été successivement testés pour rappel 1, 2 et 3 heures après l' injection, la performance n'a été altérée chez les abeilles avec des injections bilatérales dans les lobes (figure. 5). la production de neurones intacts des lobes, mais pas des calices, est connu pournécessaire pour la récupération de la mémoire olfactive, de sorte que cela suggère que la procaine restée localisée au lobe dans lequel il a été injecté pendant au moins 3 h. Elle montre aussi que, lorsqu'il est injecté dans les calices, la diffusion dans les lobes à proximité a été limitée au cours de la même période, étant donné qu'une injection calycal de procaine n'a pas conduit au blocage des lobes.
Phénotypes comportementaux après l' administration du médicament sont souvent dépendantes du contexte
Des expériences antérieures ont montré que , après le traitement avec des abeilles de cocaïne sur-estimer la qualité d'une solution de saccharose 10,30. Pour voir si cet effet était dépendant du contexte (ici, la qualité de base de saccharose), en vol libre abeilles ont été traitées avec de la cocaïne volatilisé. Individuellement les abeilles en vol libre marqués ont été autorisés à se nourrir à un chargeur contenant 1 M solution de saccharose. À la mangeoire, les abeilles ont été capturées doucementun tube de centrifugeuse de 50 ml comme ils étaient sur le point de descendre de la mangeoire. Les abeilles ont été traités avec 100 ug de cocaïne freebase ou le contrôle du véhicule (éthanol évaporé). Après traitement, le dispositif d'alimentation en saccharose est soit remplacé par un 0,5 M ou un dispositif d'alimentation de saccharose à 2,0 M, et les foragers de taux est retourné au dispositif d'alimentation a été enregistré. En utilisant ce paradigme, les abeilles de cocaïne traités ont augmenté leur effort de recherche de nourriture à la mangeoire 0,5 M, mais pas à la mangeoire 2,0 M (figure 6). La différence d'effet vu avec les deux concentrations de saccharose démontre bien l'importance de prendre des signaux environnementaux en compte lors de l'étude du comportement des abeilles.
Figure 1: confocal à balayage laser image du site d'injection. Alexa 546 dextran marqué est injecté conjointement avec la solution médicamenteuse (rouge). Pour identifier le neuropilesa contre-coloration avec DAPI est ajouté (vert). Dans l'hémisphère droit du site d'injection a été localisé dans le lobe vertical (VL), présentée comme un exemple pour une injection réussie. Dans l'hémisphère gauche du site d'injection a été localisé dorsale du lobe vertical dans le neuropile anneau, présentée comme un exemple pour une injection sans succès. Barre d'échelle = 100 um, MB: Plans de champignons, AL: antennaires Lobes, d: dorsale, v: ventral, L: gauche, r:. Droit S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Effet en fonction du temps de actinomycine D (Blocker Transcription) sur la mémoire à long terme, lorsqu'il est injecté dans le Thorax A différents retards suivants condi olfactive appétitive. nement (6, 9 ou 12 h), 1 ul d'actinomycine D (1,5 mM dans du PBS) ont été injectés dans le thorax. Mémoire à long terme (LTM) la récupération a été évaluée 3 d après conditionnement (n = 25-65). Performances de la mémoire a été réduite d'une manière dépendante du temps, par rapport à celle des témoins traitées avec du STP: l'effet est significatif lorsque l' injection trop mettre 6 h après le conditionnement (χ 2 = 18,04, p <0,005), mais pas à des délais plus longs ( 9 h: χ 2 = 0,95; 12 h: χ 2 = 0,47), ce qui suggère que la formation LTM nécessite une vague de transcription qui a lieu pendant une fenêtre de temps définie après conditionnement. Les barres d'erreur représentent les erreurs standard. Les données ont été précédemment publié 27 et est recréé ici avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3:. Inhibition dose-dépendante de l' apprentissage Performance Après injection ocellaires d'un neuropeptide Le neuropeptide allatostatine C a été injecté dans l'hémolymphe de la tête (200 nl en PBS), à travers l'ocelle médian, 1 h avant le conditionnement olfactif. Des groupes indépendants d'animaux injectés avec des concentrations différentes (ou PBS pour les contrôles) ont été formés. traitement allatostatine C conduit à une diminution des performances d'apprentissage, évaluée par le pourcentage de réponses conditionnées au cours du dernier conditionnement, d'une manière dose-dépendante qui suit une courbe en forme de U (n = 70-78). Cette diminution est significative à 10 -6 M , mais pas à d' autres concentrations. Les barres d'erreur représentent les erreurs standard. Les données ont été précédemment publié 28, et est adapté ici avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 4:. Blockade de 1 D ay mémoire après injection d'émétine (Inhibiteur de la traduction) à travers le ocellaires Tract emetina inhibiteur de la synthèse des protéines (50 mM dans du PBS, 200 nl) a été injecté dans le cerveau, à travers le tube ocellaire, 20 min avant conditionnement olfactif. Memory a ensuite été testé 24 h plus tard. Le traitement altération significative de la rétention de la mémoire (χ 2 = 7,03, p <0,01) par rapport aux témoins traités avec du PBS (n = 57-70). Les barres d'erreur représentent les erreurs standard. JM Devaud, données non publiées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Anatomical et Temporal Spécificité de microinjections Après conditionnement olfactif appétitive, procaine a été injectée bilatéralement soit dans les calices du corps de champignon ou lobes verticaux. La récupération de la mémoire a été évaluée 1 heure après l' injection et a été seulement affectée par les injections de procaïne dans les lobes (1 h après le traitement: par rapport à une solution saline: χ 2 = 10,00, p <0,005; vs. procaine à calices: χ 2 = 32,92, p < 0,005). L'effet pourrait encore être vu 2 h (χ 2 = 6,65, p <0,01) et 3 (χ 2 = 27,22, p <0,005) après l' injection, et était encore l' emplacement spécifique (2 h: χ 2 = 8,60, p < 0,05; 3 h: χ 2 = 17,15, p <0,0001), ce qui suggère que seule la zone d' injection a été affectée par la procaine. Les proportions sont par rapport au niveau de conditionnement dusonner le dernier essai de conditionnement. Les barres d'erreur représentent les erreurs standard (n = 23-28). Les données ont été précédemment publié 31, et est recréé ici avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Effets de la cocaïne sur les abeilles en vol libre taux de visites (nombre de visites a donné abeilles / visites en moyenne pour toutes les abeilles pendant la période d'essai) a été augmenté après le traitement de la cocaïne volatilisé à une source de faible qualité (0,5M: t 70 = 5,0710, p = 0,00003), mais pas à une source de haute qualité (2M: t 70 = -0,2087, p = 0,8353). Les boîtes représentent 1 er et 3 ème quartiles avec la ligne médiane montrant la médiane. Les moustaches étendent à 1,5x l'intervalle interquartile. Outliers ne sont pas tracées en tant que tous les points de données individuels sont superposés. Les données ont été précédemment publié 10, et est recréé ici avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Traitement | Peut être fait avec les abeilles volants Free-? | Avantages | Les inconvénients |
| Le traitement oral | Oui. | Facile, mini-invasive. | Bee digestion est pas simple |
| Le traitement topique | Oui. | Facile, peu invasive, rapide. | Des traitements répétés peuvent être problématiques. |
| Injection dans le thorax | Compliqué,affecte les abeilles capacités de vol | Cohérente et robuste. | Un peu invasive. Potentiel de nuire / le stress abeille. |
| L'injection dans l'ocelle médian | Non recommandé. | Cohérente et robuste, peu localisée. | Un peu invasive. Potentiel de nuire / le stress abeille. |
| Injection dans le tractus ocellaire | Non recommandé. | Très localisée | Très invasive. Potentiel de nuire / le stress abeille. |
| La micro-injection dans des régions cérébrales | Non recommandé. | Très localisée | Très invasive, difficile à effectuer. Potentiel de nuire / le stress abeille. |
| l'administration de médicaments volatilisé | Oui. | Facile, peu invasive, rapide. | Ne fonctionne pas pour tous les médicaments. |
Tableau 1: Comparifils des méthodes de traitement différentes et leurs propriétés.
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Discussion
Les méthodes décrites ci-dessus permettent un traitement simple, efficace et robuste soit en vol libre ou les abeilles attelés. Ces méthodes sont compatibles avec de nombreux paradigmes expérimentaux et les questions biologiques (tableau 1). Toutes les méthodes de vol libre peut facilement être appliqué pour les abeilles attelés. L'inverse est moins de succès, cependant, puisque la retenue temporaire et les méthodes de traitement invasives peuvent souvent compromettre la capacité de vol des abeilles.
Les méthodes ont été présentées dans une perspective de cerveau-centrique. Cela ne veut pas en raison des limites inhérentes aux techniques, mais plutôt parce que des intérêts personnels des auteurs. Il n'y a aucune raison pour que ces méthodes ne peuvent pas être utilisés pour l'étude d'autres organes. Cependant, de petites modifications peuvent être nécessaires pour rendre le procédé plus adapté à d'autres systèmes d'organes. Par exemple, alors que le traitement topique destiné à atteindre le cerveau est généralement appliquée au thorax, il pourrait être préférable d'appliquer this à l'abdomen si la cible est prévu des ovaires. De même, les injections peuvent facilement être appliqués à d' autres domaines que le thorax ou la tête (par exemple, les organes abdominaux peuvent être ciblés en injectant entre les sclérites abdominaux).
En termes de laquelle les composés peuvent être administrés pour les abeilles, il y a vraiment pas de limites. En règle générale, les gens ont administré des composés pharmacologiques tels que des molécules de signalisation 21 ou 32 leurs antagonistes, des peptides et des 28 faits sur mesure. Cependant, il y a eu une augmentation récente de l' administration à des composés des abeilles avec des questions appliquées à l' esprit, comme les pesticides et les 33 contaminants anthropiques 34. Récemment, composés administrés ont commencé à inclure des molécules d'ARN qui interfèrent avec l' expression des gènes directement, comme ARNdb activant la voie de l' interférence ARN 35 ou même 36 microARN et antagomirs 37. Toutes les méthodes fonctionnent aussi bien pour tous les composés.Ceci est peut-être mieux illustrée par des composés amers ou acides qui rendent l'eau sucrée désagréable pour les abeilles, les empêchant ainsi de consommer. molécules fragiles, telles que des ARN ou certains polypeptides, sont décomposés lorsqu'ils sont chauffés au cours d'une procédure de volatilisation ou placé dans un solvant dur comme DMF. Il est donc important de comprendre la composition chimique de ce qui est administré à s'assurer qu'elle survit à la procédure de traitement.
Obtenir un agent pharmacologique dans une abeille est la partie facile, mais il y a trois grandes préoccupations qui ne devraient jamais être prises à la légère lors de l'exécution des expériences pharmacologiques. La première est de trouver une bonne dose pour l'expérience en question. Selon le médicament, il pourrait déjà être publié littérature disponible, mais pour la plupart, cela devra être résolu par un mélange de recherches documentaires, conjecture éclairée, et les courbes dose-réponse. En fonction de la complexité du protocole expérimental est, il pourrait être utile d'd' abord générer une courbe dose-réponse dans un test biologique simple (par exemple, la quantification de mouvement global ou la survie) pour obtenir une meilleure idée d'une dose de gamme intéressant d' essayer dans un essai biologique plus élaborée. Dans notre laboratoire, une dose de départ est soit trouvée dans la littérature d'abeille ou en faisant un mg / kg conversion basée sur les données de la littérature des rongeurs. De ce point de départ, les abeilles sont traitées avec la dose de départ, ainsi que 2 ou 3 doses 10 fois plus grandes et plus petites que la dose initiale (par exemple, si la dose initiale est de 1 mg, 0,01, 0,1, 10 et 100 mg serait également utilisé), et bien sûr un contrôle approprié du véhicule.
Le deuxième problème est un peu plus capricieux: la spécificité de la drogue. La plupart des médicaments ne sont pas développés avec les abeilles, ou tout autre insecte, à l'esprit. De ce fait , les effets hors-cible sont communs (par exemple, la miansérine, un vertébré antagoniste des récepteurs de la sérotonine 38, a longtemps été pensé pour être un insecte octopaminergique antagoniste des récepteurs, mais récente ficonstatations montrent que chez les abeilles , il est également un antagoniste des récepteurs dopaminergiques 39). Une solution commune à ce problème est, plutôt que de compter sur un seul médicament, de répéter la même expérience avec une suite de médicaments connus pour avoir la cible d'intérêt en commun. Fondamentalement, si plusieurs médicaments sont connus pour bloquer une certaine cible, en observant des résultats similaires dans les différents médicaments devrait donner une plus grande confiance que le médicament a l'effet escompté, puisque les différents médicaments ont souvent des profils hors-cibles uniques.
La dernière question consiste à veiller à ce que le médicament agit là où il est censé agir. À cet égard, il y aura toujours un compromis entre la spécificité et l'invasivité. Méthodes de traitement systématiques sont généralement les moins invasive, mais il n'y a aucun contrôle de l'endroit où dans le corps de l'abeille le médicament est d'avoir son effet. Même pour la micro-injection des tissus ciblés médicaments peuvent se déplacer avec l'hémolymphe d'autres parties du corps de l'abeille. Comment cette question est traitée needs pour être informé par les questions posées. Pour certaines expériences localisation anatomique est sans importance, alors que pour d'autres c'est la seule question d'importance. La meilleure façon de répondre est de commencer avec les traitements systémiques et progressivement réduire à un emplacement anatomique en utilisant des méthodes de plus en plus spécifiques. Si le comportement étudié est particulièrement incompatible avec les méthodes de traitement invasives, il pourrait être intéressant d'essayer de déconstruire en éléments plus simples avant de faire toute une série d'expériences avec des traitements pharmacologiques très spécifiques.
Ce problème de fuite de médicament est encore plus exagérée avec le traitement par voie orale de vol libre abeilles, où les médicaments peuvent affecter les abeilles non-cibles. Forager abeilles recueillent le nectar dans le domaine de ramener à leur colonie. Ils se décharger de la majorité de leur solution de saccharose dans la ruche au retour plutôt que de l'absorber. Dans la ruche, il est emballé dans des cellules, déshydraté, et stocké sous forme de miel. En raison decela, les médicaments peuvent potentiellement affecter les abeilles non-cibles. Avec des méthodes plus spécifiques (comme microinjections) ce problème est minimisé.
Avec ces mises en garde à l'esprit, et traitées de façon appropriée, la manipulation neuropharmacologiques des abeilles peut être un outil très puissant. Bien que les outils transgéniques sont mis au point pour les abeilles 15, en raison de leur mode de vie sociale , il est peu probable que la transgénèse ne sera jamais un moyen facile et fiable pour mener ce genre d'expériences. Il est donc probable que la pharmacologie continuera d'être un élément important de la recherche des abeilles dans l'avenir. Alors que certains chercheurs d'abeilles ont fait appel à des méthodes expérimentales normalisées 40, dans ce cas , ce serait une erreur. Une partie de la puissance du système d'abeille a toujours été la diversité des approches expérimentales, et comment les techniques ont été développées avec des questions biologiques réelles à l'esprit plutôt que dans l'autre sens. Il est néanmoins important que nous nous assurionsl'utilisation de la méthode la plus appropriée pour la question à portée de main. Si les comparaisons avec les études antérieures sont essentielles, des protocoles normalisés doivent être strictement respectées. Cependant, en utilisant le protocole établi pour le bien de l'utilisation de méthodes normalisées ne doivent pas être autorisés à se tenir dans la voie du développement de nouvelles méthodes qui peuvent ouvrir de nouvelles possibilités expérimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
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