Summary
Dit manuscript beschrijft meerdere protocollen voor het toedienen van farmacologische middelen aan de bijen, waaronder eenvoudige niet-invasieve methoden voor vrij vliegende bijen, evenals meer invasieve varianten die precies gelokaliseerde behandeling van ingehouden bijen mogelijk.
Abstract
Honingbijen demonstreren verbazingwekkend leervermogen en geavanceerde sociaal gedrag en communicatie. Bovendien is hun hersenen is klein, eenvoudig te visualiseren en te bestuderen. Daarom hebben de bijen al lang een geliefd model onder neurobiologists en neuroethologists voor het bestuderen van de neurale basis van sociaal en natuurlijk gedrag. Het is echter belangrijk dat de experimentele technieken voor bijen studie niet interfereren met het gedrag bestudeerd. Hierdoor was het noodzakelijk om een reeks van technieken voor farmacologische manipulatie van honingbijen ontwikkelen. In dit artikel tonen we aan methoden voor de behandeling van ingehouden of vrij vliegende honingbijen met een brede waaier van farmacologische middelen. Deze omvatten zowel niet-invasieve methoden zoals orale en topische behandelingen, evenals meer invasieve methoden maken het precies geneesmiddelafgifte in zowel systemische of gelokaliseerde wijze. Tot slot bespreken we de voor- en nadelen van elke methode en beschrijfvoorkomende hindernissen en de beste manier om te overwinnen hen. We sluiten af met een discussie over het belang van het aanpassen van de experimentele methode om de biologische vragen in plaats van andersom.
Introduction
Sinds Karl von Frisch toegelicht hun danstaal 1, hebben de bijen een populaire studie soort bleef voor onderzoekers in het gedrag van dieren en neurobiologie. In de afgelopen jaren een groot aantal nieuwe disciplines zijn ontstaan op de kruising van deze twee gebieden, en diverse andere disciplines (zoals moleculaire biologie, genomics, en informatica) hebben samen met hen ontstaan. Dit heeft geleid tot een snelle ontwikkeling van nieuwe modellen is te begrijpen hoe gedrag resulteert uit activiteit in het zenuwstelsel. Vanwege het unieke lifestyle, rijke gedragsrepertoire, en het gemak van de experimentele en farmacologische manipulatie, hebben de bijen in de voorhoede van deze revolutie bleef.
Honingbijen worden gebruikt om fundamentele neurobiologische vragen zoals die ten grondslag liggen aan leren en geheugen 2,3, besluitvorming 4, olfactorische 5 of visuele verwerking 6 bestuderen. In de afgelopen jaren, de honey bee is zelfs gebruikt als een model voor de studie onderwerpen algemeen gereserveerd voor medisch onderzoek, zoals de effecten van verslavende drugs 7-11, slaap 12, 13 veroudering, of de onderliggende mechanismen narcose 14.
In tegenstelling tot de klassieke genetische modelorganismen (bijvoorbeeld D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), zijn er maar weinig genetische hulpmiddelen beschikbaar voor het manipuleren neurale functies honingbijen, hoewel dit nog verandert 15. In plaats daarvan hebben honingbij studies vooral vertrouwd op farmacologische manipulaties. Dit is zeer succesvol geweest; De diversiteit van bijenonderzoek zodanig dat verschillende werkwijzen voor farmacologische toediening nodig. Onderzoek met honingbijen behandelt de meest uiteenlopende vragen, wordt bestudeerd door onderzoekers uit verschillende disciplines en achtergronden, en maakt gebruik van een verscheidenheid aan experimentele benaderingen. veel reseboog vragen vereisen bijen ofwel vrij vliegen, vrij interactie in hun kolonie, of beide. Dit kan het moeilijk maken om bij te houden van de afzonderlijke proefdieren te houden, en maakt terughoudendheid of infusen onhaalbaar.
Om de diversiteit van de honingbij onderzoek tegemoet te komen, een verscheidenheid van drug delivery methoden nodig, waardoor robuuste en flexibele administratie met dien verstande dat de farmacokinetische en farmacodynamische profielen, invasiviteit van de methode en de betrouwbaarheid, past het paradigma in kwestie. Vanwege deze uiteenlopende behoeften, hebben de meeste onderzoeksgroepen hun eigen unieke Drug Administration methoden ontwikkeld. Tot nu toe, dit is een sterkte van de bij onderzoeksgemeenschap; het heeft geleid tot de ontwikkeling van reeksen methoden waardoor toediening van hetzelfde geneesmiddel in verschillende omstandigheden. Ons doel is om geen enkele gestandaardiseerde methode voor farmacologische manipulatie van bijen te ontwikkelen, maar om methoden te benadrukken dathebben bewezen bijzonder succesvol te zijn, en helpen onderzoekers nemen deze. We bespreken de basisprincipes van hun werking en hun voordelen en nadelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drug Administration voor Uitgeruste Bees
- orale behandeling
- Bereid 1,5 M sucrose oplossing door het mengen van 257 g sucrose met 500 ml water (het is gemakkelijker om deze hoeveelheid sucrose oplossen in kokend water). Bewaar sucrose-oplossing bij 4 ° C tot gebruik.
OPMERKING: Sucrose-oplossing biedt een zeer gastvrije omgeving voor bepaalde micro-organismen, en dus gemakkelijk verontreinigd raakt en onverteerbaar voor bijen. Bulk sucrose oplossing kan worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. - Beslis over een geschikte dosis drug (hoe het te bereiken, komt aan bod in de discussie hieronder), en voor te bereiden een oplossing zodanig dat de dosis geprefereerde geneesmiddel wordt opgelost in 20 ui sucrose-oplossing (bijvoorbeeld om te leveren 20 ug, verdunnen drug in een verhouding van 1 mg / ml). Harness bijen volgens Felsenberg et al. (2011) 16. Doe deze stap ten minste 12 uur voor behandeling met geneesmiddelen om ervoor te zorgen dat de bijen niet meer gestresst out van gebruik te maken van wanneer het geneesmiddel oplossing wordt gepresenteerd.
OPMERKING: Voor meer consistente resultaten, het beste bijen verhongeren (door ingezet bijen in een incubator bij 34 ° C en 70% luchtvochtigheid) O / N. - Met behulp van een micropipet, raakt een daling van 1,5 M sucrose water om de antenne van een benut bij. Als de snuit is verlengd, raakt een 20 ul druppel 1,5 M sucrose die het geneesmiddel rechtstreeks aan de slurf van de honingbij. Zorg ervoor dat de bijen verteert alles. Als controle voertuig te gebruiken 1,5 M sucrose oplossing zonder toegevoegde geneesmiddelen.
LET OP: De hoeveelheid sucrose oplossing zou moeten worden aangepast op basis van experimentele plannen. Als appetitive conditioning is bedoeld, het voeden van de bijen gewoon voor de training zal bemoeien met responsiviteit bijen. - Gooi of terzijde bijen dat niet alle van de sucrose verbruiken.
LET OP: Als een groot aantal bijen niet aan de sucrose-oplossing te drinken, moet het voederen schema aan te passen.
- Bereid 1,5 M sucrose oplossing door het mengen van 257 g sucrose met 500 ml water (het is gemakkelijker om deze hoeveelheid sucrose oplossen in kokend water). Bewaar sucrose-oplossing bij 4 ° C tot gebruik.
- Injectie in de thorax
- Bereid drug in honingbij de Bel 17 als volgt:
- Mix en autoclaaf 7,45 g NaCl, 0,448 g KCI, 0,812 g MgCl2, 0,735 g CaCl2, 54,72 g sucrose, 4,95 g D-glucose en 2,48 g HEPES in 1000 ml water. Wees voorzichtig bij het opslaan van de Bel als het gemakkelijk is besmet. Aliquot en bewaar Ringer bij -20 ° C tot gebruik.
- Los het geneesmiddel in Ringer-oplossing en vervolgens verdund zodat de gewenste hoeveelheid aanwezig is 5 ul. Als voorbeeld, wanneer de bijen worden behandeld met 5 ug van een geneesmiddel, 1 g kan aanvankelijk worden opgelost in 1 ml Ringer, alvorens te worden verdund 1: 1000 in Ringer voor een definitieve oplossing van 1 ug / ul.
OPMERKING: U handel verkrijgbaar PBS (fosfaat-gebufferd Salin) kan worden gebruikt in plaats van Ringer oplossing.
- Maak een microscalpel door het afbreken van de hoek van een tweesnijdend scheermesje meteen bladhouder. Bevestig het blad fragment van een mes houder, zodat het een mooi mes met een scherpe eindpunt.
- Onder een stereomicroscoop, zorgvuldig gebruik microscalpel een 2 mm gat juist boven het schildje naast de achterste vleugel werkwijze thorax een bijen. Vermijd het snijden te diep, omdat dit zou kunnen verwonden vlucht spieren, en wees voorzichtig aan de vleugel scharnieren te voorkomen. Idealiter alleen knippen drie zijden, zodat de flap van cuticula later kan worden teruggevouwen naar de plaats van letsel te sluiten.
- Met behulp van een micropipet, depot 5 μlL gekleurde (of PBS) die het geneesmiddel bovenop de opening in de thorax. nauwlettend onder de microscoop om ervoor te zorgen het hele druppel wordt geabsorbeerd in de hemolymfe. Gebruik van de Bel (of PBS) als een controle voertuig.
- Indien mogelijk, bewegen de cuticula flap terug over het gat. Na 5-10 uur, zal het opnieuw te bevestigen en te verzegelen.
Opmerking: Als alternatief voor deze techniek injecteren 1 pi rechtstreeks in de thorax met een glazen injectiespuit, na het openen van eell gat in het midden van de frenum (dwarslijn in het achterste gedeelte van het schildje) met een injectienaald (diameter: 0,6 mm, G: 23). Dit omzeilt de noodzaak om eerst de thorax gesneden met een scalpel en de injectieplaats kleiner, maar deze methode zal de injectieplaats blootgesteld verlaten.
- Bereid drug in honingbij de Bel 17 als volgt:
- ocellus injectie
LET OP: Dit is een methode geschikt is voor het leveren van moleculen in de hele kop capsule, in de hemolymfe.- Bereid drugs zoals in 1.2.1, maar aan te passen geneesmiddel concentraties zodanig dat de gewenste dosis zullen worden opgenomen in 1 pl van Ringer of PBS (minder volume kan worden geabsorbeerd door de ocellus gat dan door de thorax).
- Bereid een microscalpel als in 1.2.2. Onder een stereomicroscoop, blokkeer je de kop van een ingezet bij in plaats van het vullen van de nek spleet met was. Gebruik lage temperatuur smeltende was (bijvoorbeeld tandheelkundige wax) om schadelijke antennal olfactorische receptoren of andere cellen die ik kan voorkomenmportant voor de beoordeling van het gedrag (bijvoorbeeld, olfactorische leren). Dan voorzichtig de lens van de mediaan ocellus door de tip van de microscalpel onder de lens en de lens voorzichtig breken vrij van de kop capsule.
LET OP: Het is ook mogelijk om de was zorgvuldig te plaatsen over de antennes om verplaatsing te voorkomen. - Voorzichtig pipet geneesmiddel op de ocellus gat. Wacht tot alle in de kop capsule wordt genomen. Verwijder tandheelkundige was van de antennes en laat de bijen om te rusten voor een tijdje voordat de voortzetting van de experimentele procedure. Gebruik van de Bel (of PBS) als een controle voertuig.
- Injectie in de ocellar darmkanaal
NB: De ocellar darmkanaal bevat grote vezels, aan te sluiten op de meeste regio's van de centrale hersenen 18. Deze behandelmethode maakt aanbrengen verbindingen alleen de hersenen, maar niet gericht op specifieke subregio's van de hersenen.- Bereid bijtje als in 1.3.2. en verwijder de lens van de mediaan ocellus met de tip van een microscalpel als in 1.3.3.
LET OP: Dit kan worden gedaan om 2 uur voor de injectie. Op basis van onze ervaring, gevoed bijen zijn beter in staat om te gaan met deze operatie dan uitgehongerd bijen - Vul een 10 ul glazen injectiespuit met een kleine overdruk (bijvoorbeeld 33, diameter: 210 pm) naald met geneesmiddeloplossing bereid zoals in 1.3.1.
- Met behulp van een handmatige micromanipulator, plaatst de spuittip door de ocellar netvlies in het hoofd capsule tot een diepte van 50 urn en injecteer 250 nl oplossing.
- Spoel na gebruik de injectiespuit 3 maal met gedestilleerd water en 3 maal met 75% ethanol.
- Bereid bijtje als in 1.3.2. en verwijder de lens van de mediaan ocellus met de tip van een microscalpel als in 1.3.3.
- Micro-injectie in bepaalde hersenstructuren
OPMERKING: Naast de bovengenoemde systematische behandelingen, is het mogelijk om micro-injecties uitvoeren naar bepaalde hersenstructuren. Dit zorgt voor farmacologische manipulatie van één of meer hersenen, terwijl anderen beïnvloed. Dit werkthet beste met hersengebieden die gemakkelijk te herkennen uit de voorste hersenen oppervlak (bijv antennaal lobben, champignon lichaam calyces of verticale lobben, of de optische kwabben) zijn, maar ook andere regio's zijn gericht. Houd er rekening mee dat de oriëntatie (anterior / posterior, dorsale / ventrale) verwijst naar het lichaam as, in plaats van, dan naar de neuraxis 19.- Bereid het geneesmiddel in Ringer of PBS op dezelfde wijze als in 1.2.1, toevoegen van een fluorescerend (bijvoorbeeld 0,5 mg / ml dextran, Alexa 546 of 568 fluor) of niet-fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld, 1 mM methyleenblauw).
LET OP: De toevoeging van een fluorescerende kleurstof zal de verificatie van de injectie locatie kan worden na het experiment voorbij is (met behulp van confocale microscopie, volgende hersenen dissectie), terwijl niet-fluorescerende kleurstoffen mogelijk directe controle tijdens het experiment. - Om glazen pipetten voor injectie te maken, plaatst glas haarvaten van de juiste diameter in de houder klemmen van een elektrode trekker (1,0 mm voor de standaard holder opgenomen voor de in de lijst genoemde materialen microinjector). Pas pull en temperatuurinstellingen tot een ongeveer 0,5 cm lang tip produceren (instellingen verschillend voor elke trekker, zelfs als hetzelfde model wordt gebruikt).
OPMERKING: Idealiter twee pipetten getrokken uit een glazen moet dezelfde lengte en vorm hebben, zodat beide kunnen worden gebruikt. - Onder een stereomicroscoop, breken de uiteinden een buitendiameter van ongeveer 10-15 urn, gebaseerd op visuele schatting met een weegschaal op een raster ingevoegd in het oculair. De stappen op de schaal worden bepaald door de fabrikant kan worden gecorrigeerd voor de vergroting gebruikt.
- Vervolgens vul het glas pipetten met de oplossing te injecteren. Als glazen capillairen met filamenten worden gebruikt, vul de pipet door het plaatsen van de achterkant in de drug oplossing, anders tip te vullen met behulp van microloader tips.
- Plaats de gevulde glazen pipet in de capillaire houder van een microinjectie, die wordt bestuurd door een handmatig of elektronisch micromanipulator.
- Kalibreer de microinjector het gewenste volume te injecteren (0,5-2 nl, afhankelijk van de grootte van de hersenstructuur getarget). Hiervoor direct te injecteren in een kleine petrischaal met minerale olie en de diameter van de druppel met het raster. Wijzig instellingen totdat het gewenste volume is bereikt.
- Bevestig de kop van een ingezet bij gebruik zachte tandheelkundige was zoals in 1.3.2, voor het snijden van een opening in het voorste deel van het hoofd capsule, met een microscalpel, met drie delen: een net onder de mediaan ocellus (ventrale), een voor de rand van de rechter- of linkeroog en boven de antenne stengels (dorsale). Gebruik een stuk van tandheelkundige wax aan de geopende klep op zijn plaats houden.
- Duw klieren en de luchtpijp die bovenop de hersenen vernietigd met behulp van fijne pincet, vervolgens een kleine breuk in de neurilemma (zeer dun vlies rond de hersenen) boven de beoogde hersenstructuur.
NB: Als er veel bijen in een keer worden behandeld, deze procedurekan eerder worden uitgevoerd; Maar wees voorzichtig om niet bijen in deze toestand te lang (niet meer dan 30 min) te verlaten, omdat hun hersenen zouden kunnen uitdrogen. - Steek de punt in het gewenste gebied van de hersenen, en pas de diepte loodrecht op de hersenen oppervlak (bijvoorbeeld 60 micrometer voor paddestoel lichaam kelken). Injecteer de vooraf ingestelde volume. Voor laterale gebieden van de hersenen, injecteren bilateraal (dwz u een injectie om elk halfrond). Als een niet-fluorescerende kleurstof wordt gebruikt, zorgen de injectie plaatsvond op de juiste regio van observatie tijdens het injecteren. Als een fluorescerende kleurstof wordt gebruikt hetzelfde doen bij tl-licht met behulp van een stereomicroscoop met een fluorescentie-viewing-systeem.
- Daarna plaatst u de geopende klep terug over het hoofd van de bijen. Smelt een kristal van eicosaan, die ongeveer 1 mm in diameter, met een dunne draad rond het uiteinde van een micro soldeerbout (smelttemperatuur is 35-37 ° C) en sluit de sneden. Dit zal sterk verminderen van de sterfte.
- Laat de ... Losbee van het harnas voor gedragsanalyse (maar zie bespreking), of te houden in het harnas voor experimenten op ingetogen bijen - bijvoorbeeld proboscis extensie reflex (PER) testen 20.
- Als een fluorescerende kleurstof werd gebruikt, ervoor zorgen dat de injectie raakte het gebied van belang na het experiment is boven het gebruik van een confocale laser scanning microscoop (Fig. 1).
LET OP: Dit is vooral handig wanneer de doelgroep diepere hersengebieden (waar het moeilijk zou zijn om niet-fluorescerende kleurstof te zien tijdens de injectie fase).
- Bereid het geneesmiddel in Ringer of PBS op dezelfde wijze als in 1.2.1, toevoegen van een fluorescerend (bijvoorbeeld 0,5 mg / ml dextran, Alexa 546 of 568 fluor) of niet-fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld, 1 mM methyleenblauw).
2. Drug Administration Methoden voor Free-flying Bees
- orale behandeling
- Bereid geneesmiddel op dezelfde manier als in stappen 1.1.1-1.1.2. Voeg drug oplossing voor een feeder en plaats in de koelkast voor opslag.
OPMERKING: Elke feeder zal doen, zoals een omgekeerde dop van de fles of een potje omgekeerd op vloeipapier. - Train bijen aan een zwaartekracht feeder met 1 M of 0,5M sucrose oplossing door een feeder dichtbij de korf. Zodra bijen beginnen fourageren op de feeder, geleidelijk verder weg, tot het op een comfortabele afstand om te voorkomen dat gestoken (minimum 5 m).
- Paint-mark bijen om bij te houden van de individuele bijen te houden. Maak een lijst van alle kleurencombinaties die zullen worden gebruikt. Wanneer een honingbij landt op de feeder, zorgvuldig markeren haar buik met twee kleuren, en noteer op de lijst die de combinatie wordt genomen.
- Wissel de zwaartekracht feeder voor een feeder die het geneesmiddel / sucrose-oplossing. Let op de gemarkeerde bijen die de feeder te bezoeken. Vang elke ongemarkeerde bij een bezoek aan de feeder als bijen zijn productief recruiters, en de nummers van de bijen een bezoek aan de gedrogeerde feeder kan snel uit de hand. Dit is vooral problematisch wanneer hetzelfde experiment wordt uitgevoerd op opeenvolgende dagen, naïef bijen niet langer naïef kunnen zijn.
LET OP: Als een alternatief voor het trainen van individuele bijen aan een feeder, vorige auteurs hebben met succes fed-drug geregen sucrose water om een hele korf 21-23.
- Bereid geneesmiddel op dezelfde manier als in stappen 1.1.1-1.1.2. Voeg drug oplossing voor een feeder en plaats in de koelkast voor opslag.
- plaatselijke behandeling
Opmerking: Het doel is om de verbinding van belang te lossen in een oplosmiddel dat de wasachtige insect cuticula kunnen dringen. Verschillende oplosmiddelen kunnen worden gebruikt voor dit doel. De meest gebruikte omvatten aceton, dimethylformamide (DMF) en dimethylsulfoxide (DMSO).- Beoordelen welke oplosmiddel het beste werkt voor de verbinding bij de hand. Als er een sterke fenotype wordt verwacht van overdosering (bijvoorbeeld verlamming of de dood), behandel bijen (stap 2.2.2) met een hoge dosis (bijvoorbeeld 20 ug cocaïne 7) opgelost in elk van de verschillende oplosmiddelen en nauwlettend totdat verlamming of de dood.
- Met een 1 pi microcapillaire (of een injectiespuit, die op geschikte herhalende dispenser monteerbaar) en microcapillaire houder trekken 1 pl van de geneesmiddeloplossing (bijvoorbeeld 381, g / ul cocaïne) in de capillair. Verdrijf de druppel, en zorgvuldig schilderen op de thorax van een duidelijke bee. Bedek groot als van een gebied met een mogelijke oplossing, in plaats van het verlaten van een vaste druppel, als bij is dan waarschijnlijk te verzorgen af. Wees voorzichtig niet om de verbinding contact opnemen met de vleugel scharnieren, of dit kan het tekenen van de thorax en langs de vleugels, waar het zonder te worden opgenomen in de hemolymfe zal verdampen.
OPMERKING: Afhankelijk van het onderzoeksdoel, kan deze methode ook gebruikt worden om medicijnen toe te dienen aan de buik van de bijen. Echter, drugs bereikt het CZS sneller en in grotere hoeveelheden wanneer toegepast op de thorax 24 .Het werkwijze werkt evengoed met ingezet als bij vrij vliegende bijen.
- verdampte behandeling
- Ontbinden drugs (voorheen deze methode is gebruikt om cocaïne leveren honingbijen 10) in 100% ethanol. Oplosbaarheid gen mag een hydrochloride of andere zoutvormen van het nietdrug indien mogelijk. Bij een verdunning te bereiden, zodat de hoeveelheid aan een bij te leveren is aanwezig in 100 pl. Gebruik pure ethanol als een controle voertuig.
- Om een filament maken, gebruikt u dezelfde procedure als McClung en Hirsh 25.
- Kort toegelicht: liquideren nichroom draad strak om een spijker en hechten aan twee elektrische draden (één aan elk uiteinde van de gloeidraad). Verwijder de nagel. De resterende nichroom spoel wordt aangeduid als de gloeidraad.
- Leid de twee draden goed door gaten in het deksel van een 50 ml centrifugebuis, die resistent zijn tegen de gekozen temperatuur dient. Lijm de draden op zijn plaats met vloeibare siliconen.
LET OP: Dit zal de buis luchtdicht te maken. Dit is essentieel om secundaire blootstelling aan het experiment en kunnen de bijen worden behandeld met het geschikte dosis.
- Bevestig de kabels van de gloeidraad op een voedingsbron. Met behulp van een thermokoppel om de temperatuur te meten vanhet filament, experimenteren met verschillende spanning / stroom combinatie totdat die resulteert in een geschikt temperatuurprofiel voor het geneesmiddel in kwestie, idealiter, die zorgt voor 10 sec verwarming of minder. Dit is zeer belangrijk, het relevante literatuur (bijvoorbeeld, zodat cocaïne vluchtig moet worden verwarmd tot ten minste 200 ° C, maar bij temperaturen boven 350 ° C wordt afgebroken tot secundaire verbindingen 26).
- pipet zorgvuldig 100 pl geneesmiddel bevattende ethanol oplossing op de gloeidraad. Verdeel de vloeistof over zoveel filament oppervlak mogelijk, omdat dit de verdamping efficiency zal toenemen. Laat het filament bloot bij kamertemperatuur totdat alle ethanol verdampt.
Opmerking: Als de ethanol onvoldoende is verdampt, zal bijen worden behandeld met zowel het middel van keuze en ethanol. Bijen zijn uiterst gevoelig voor ethanol en sommige geneesmiddelen hebben synergistische interacties met ethanol stellen die voorspanning experimental resultaten. - Zodra de ethanol volledig verdampt (drug neerslag kan meestal worden gezien op de droge vezel onder een microscoop), vang een vrij vliegende bij in een 50 ml buis. sluit voorzichtig het deksel met de gloeidraad.
- Schakel de stroom gedurende 10 seconden, schakel de stroom uit en wacht nog eens 50 sec (zodat de vervluchtigde verbinding te koelen en daardoor condenseren of borg). Laat de bijen.
OPMERKING: Hoewel deze behandeling methode werkt uitstekend voor free-vliegende bijen, kan het net zo goed met de bijen ingezet worden gebruikt. Eenvoudigweg de spande bijen in een 50 ml buis. Reload de gloeidraad, zoals beschreven in 2.3.4 tussen bijen. Voor hogere doorvoer kan meerdere filamenten parallel worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een selectie van representatieve resultaten van de hierboven beschreven werkwijzen zijn getoond, primair te tonen dat de werkwijzen maken farmacologische middelen naar de hersenen bereiken en beïnvloeden honingbij gedrag.
Specifieke effecten op hersenen processen kunnen gemakkelijk worden verkregen na injectie thorax.
Omdat farmacologische middelen geïnjecteerd door de thorax kunnen werken op meerdere doelen in het lichaam, en worden verdund in het lichaam voor het bereiken van de hersenen, kan deze techniek kunnen specifieke rijzen. Niettemin is het op grote schaal gebruikt in de literatuur te bemoeien met cognitieve processen, zonder de noodzaak om zeer hoge doses die belangrijke neveneffecten kan opleveren gebruiken. Zo hebben blokkers transcriptie toegediend met deze techniek, teneinde fasen geheugen dat gen vereisen identificerenuitdrukking. Thorax injectie van dergelijke moleculen Geschikt overleving enkele dagen 27, waardoor de potentiële toxische werking op andere doelen kunnen worden beperkt, mits de concentratie goed gekozen. In dergelijke omstandigheden, kan selectieve en tijdsafhankelijke op geheugen worden verkregen, daarmee aangevend doelmatige afstemming van de hersenen (Fig. 2).
Diffusie van moleculen in de kop hemolymfe leidt tot snelle en dosisafhankelijke effecten.
Ocellus injectie is een manier om een snelle diffusie van moleculen van interesse mogelijk in de gehele kop door de hemolymfe, vooral als ze vele wijdverspreide doelen kunnen hebben in de hersenen. Deze methode werd gebruikt om allatostatins, neuropeptiden die ook als neurohormones 28 kan optreden) beheren. Bijgevolg werd een verminderde werking waargenomen bij een olfactorisch leren assay, in overeenstemming metde voorgestelde aanwezigheid van allatostatin receptoren in verschillende betrokken olfactorische verwerking hersengebieden en 28 leren. Een dosis-afhankelijke curve voor dit effect kon worden vastgesteld, door het injecteren van verschillende concentraties aan onafhankelijke groepen parallel (figuur. 3).
Verschillende manieren van toediening kunnen geven vergelijkbare effecten op de hersenfunctie.
Emetine, een blokker van eiwitsynthese, wordt gebruikt om de vorming van vroege olfactorische geheugen op lange termijn geheugen, die typisch uitgedrukt 1-2 dagen na blootstelling beïnvloeden. In de meeste gepubliceerde studies is geïnjecteerd in de thorax 29. We toonden aan dat soortgelijke effecten kunnen worden verkregen door het direct toedienen aan de hersenen via de ocellar kanaal (fig. 4): het verschaffen van een aanpassing van inspuitparameters (kleiner volume, hogere concentratie en korterevertraging voordat conditioning), een afname (~ 20%) vergelijkbaar met die in de literatuur met dezelfde hoeveelheid geneesmiddel (10 nM) verkregen wij - vergelijk figuur 4 in Stollhoff et al, 2005 29..
De effecten van gelokaliseerde injecties zijn beperkt in tijd en ruimte
Om de ruimtelijke en temporele eigenschappen van drugs micro-injectie in specifieke gebieden van de hersenen te testen, werden ingezet bijen opgeleid in een olfactorische PER conditionering paradigma, en vervolgens geïnjecteerd bilateraal met 0,5 nl van 740 mM procaïne (een verdoving) in de paddestoel lichaam kelken of verticale lobben ( zoutoplossing werd gebruikt als controle). Wanneer bijen achtereenvolgens werden getest op gevoeligheid 1, 2, en 3 uur na injectie werd alleen prestaties verminderd bij bijen bilaterale injecties in de lobben (fig. 5). Intacte neurale uitvoer van de lobben, maar niet van de kelken, is bekendvereist voor de olfactorische geheugen ophalen, zodat dit suggereert dat procaine blijft gelokaliseerd in het kwab waarin het was geïnjecteerd ten minste 3 uur. Ook blijkt dat, bij injectie in de kelken, diffusie in de buurt lobben beperkt dezelfde periode, omdat een calycal injectie van procaïne niet tot blokkade van de lobben.
Behavioral fenotypes na toediening van het geneesmiddel vaak contextafhankelijk
Eerdere experimenten hebben aangetoond dat na behandeling met cocaïne bijen overschatten de kwaliteit van een sucroseoplossing 10,30. Om te zien of dit effect afhankelijk van de context (hier, basislijn sucrose kwaliteit) was, werden vrij vliegende honingbijen behandeld met verdampte cocaïne. Individueel gemerkte vrij vliegende honingbijen mochten foerageren op een feeder met 1 M sucrose-oplossing. Bij de voeder, werden bijen voorzichtig meegenomen ineen 50 ml centrifugebuis zoals ze waren op het punt om uit te stappen feeder. Bijen werden behandeld met 100 ug freebase cocaïne of controle over het voertuig (verdampt ethanol). Na behandeling werd de sucrose feeder hetzij vervangen door een 0,5 M of 2,0 M sucrose feeder, en kost verzamelaars terug naar de feeder opgenomen. Met behulp van dit paradigma, cocaïne behandeld bijen verhoogden hun foerageergebied inspanningen op het 0,5 M feeder, maar niet op de 2,0 M feeder (figuur 6). Het verschil in effect te zien met de twee sucrose concentraties mooi toont het belang van het nemen van omgevingsfactoren rekening houden bij het bestuderen van gedrag van de bijen.
Figuur 1: confocale laser scanning Afbeelding van de injectieplaats. Alexa 546-gelabeld dextran samen geïnjecteerd met de geneesmiddeloplossing (rood). Om de neuropil identificerensa contra-kleuring met DAPI wordt toegevoegd (groen). In de rechterhelft werd de injectieplaats in de verticale nok (VL), als voorbeeld voor een succesvolle injectie. In de linker hemisfeer is de injectieplaats bevindt dorsale van de verticale kwab in de ring neuropil, als voorbeeld voor een mislukte injectie. Schaal bar = 100 micrometer, MB: Mushroom Bodies, AL: Antennaal lobben, d: rug-, v: ventrale, l: links, r:. Rechter Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Time-afhankelijke effect van Actinomycine D (transcriptie Blocker) op de lange-termijn geheugen, wanneer geïnjecteerd in de Thorax Op verschillende vertragingen volgende appetitive olfactorische Condi. neren (6, 9 of 12 h), 1 pl actinomycine D (1,5 mM in PBS) werd geïnjecteerd in de thorax. Lange termijn geheugen (LTM) retrieval werd vastgesteld 3 d na blootstelling (n = 25-65). Geheugenprestaties werd gereduceerd in een tijdsafhankelijke wijze, vergeleken met dat van PBS-behandelde controles: het effect was significant wanneer injectie te plaatsen 6 uur na blootstelling (χ 2 = 18,04, p <0,005), maar niet bij langere vertragingen ( 9 h: χ 2 = 0,95; 12 h: χ 2 = 0,47), wat suggereert dat LTM vorming vereist een golf van transcriptie die plaatsvindt gedurende een bepaalde tijdsvenster na conditionering. Fout balken geven standaard fouten. De gegevens werden eerder gepubliceerd op 27 en wordt hier opnieuw gemaakt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
Figuur 3:. Dosisafhankelijke remming van leerprestaties Na Ocellar Injectie van een neuropeptide De neuropeptide allatostatin C werd geïnjecteerd in de kop hemolymfe (200 nl in PBS), door middel van de mediaan ocellus, 1 uur voor olfactorische conditionering. Onafhankelijke groepen dieren geïnjecteerd met verschillende concentraties (of PBS controles) werden getraind. Allatostatin C behandeling leidde tot een afname van de leerprestaties, zoals beoordeeld door het percentage geconditioneerde responsen in de laatste conditionering, op een dosis-afhankelijke wijze na een U-vormige curve (n = 70-78). Deze daling was significant bij 10 -6 M maar niet bij andere concentraties. Fout balken geven standaard fouten. De gegevens werden eerder gepubliceerd 28, en wordt hier aangepast met toestemming. Klik hier om een grotere ver te bekijkending van dit cijfer.
Figuur 4:. Blokkade van 1 D ay Memory na injectie van Emetine (Vertaling Inhibitor) door de Ocellar Tract De eiwitsynthese remmer emetine (50 mM in PBS, 200 nl) werd geïnjecteerd in de hersenen, door de ocellar darmkanaal, 20 minuten voor olfactorische conditionering. Geheugen werd vervolgens 24 uur later getest. De behandeling significant verminderde geheugenbehoud (χ 2 = 7,03, p <0,01) in vergelijking met PBS-behandelde controles (n = 57-70). Fout balken geven standaard fouten. JM Devaud, ongepubliceerde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Anatomische en Temporal specificiteit van micro-injecties Na appetitive olfactorische conditionering, procaine werd bilateraal geïnjecteerd in ofwel de paddestoel lichaam kelken of verticale lobben. Geheugen ophalen werd beoordeeld 1 uur na injectie en werd alleen beïnvloed door procaine injecties in de lobben (1 uur na behandeling: vs. zoutoplossing: χ 2 = 10,00, p <0,005; vs. procaïne calyces: χ 2 = 32,92, p < 0.005). Het effect kan nog te zien 2 uur (χ 2 = 6,65, p <0,01) en 3 (χ 2 = 27,22, p <0,005) na injectie, en nog locatiespecifieke (2 uur: χ 2 = 8,60, p < 0,05; 3 uur: χ 2 = 17,15, p <0,0001), hetgeen suggereert dat alleen het geïnjecteerde gebied werd beïnvloed door procaïne. Verhoudingen zijn ten opzichte van conditionering niveau during de laatste conditionering trial. Fout balken geven standaard fouten (n = 23-28). De gegevens werden eerder gepubliceerd 31, en wordt hier opnieuw gemaakt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Effecten van cocaïne op Free-flying Bees Visitatie (aantal bezoeken van een bepaalde bee / gemiddelde bezoeken voor alle bijen tijdens de testperiode) werd verhoogd na vluchtig cocaïne behandeling bij een lage kwaliteit bron (0,5 M: t 70 = 5,0710, p = 0,00003), maar niet op een hoge kwaliteit bron (2M: t 70 = -0,2087, p = 0,8353). De boxen vertegenwoordigen 1 e en 3 e kwartielen met de middellijn met de mediaan. De snorharen uitgebreid tot 1,5x de interkwartielafstand. Uitbijters niet uitgezet als alle afzonderlijke gegevenspunten zijn gesuperponeerd. De gegevens werden eerder gepubliceerd 10, en wordt hier opnieuw gemaakt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Behandeling | Kan worden gedaan met het vrij vliegende bijen? | Pros | Cons |
| orale behandeling | Ja. | Gemakkelijk, minimaal invasieve. | Bee spijsvertering is niet eenvoudig |
| plaatselijke behandeling | Ja. | Makkelijk, minimaal invasieve, snel. | Herhaalde behandelingen kunnen problematisch zijn. |
| Injectie in de thorax | Ingewikkeld,beïnvloedt bijen vliegen vaardigheden | Consistent en robuust. | Enigszins invasieve. Potentiële te schaden / spanning bij. |
| Injectie in de mediaan ocellus | Niet aangeraden. | Consistent en robuust, ietwat gelokaliseerd. | Enigszins invasieve. Potentiële te schaden / spanning bij. |
| Injectie in de ocellar darmkanaal | Niet aangeraden. | zeer lokaal | Zeer invasieve. Potentiële te schaden / spanning bij. |
| Micro-injectie in gebieden van de hersenen | Niet aangeraden. | zeer lokaal | Zeer invasieve, moeilijk uit te voeren. Potentiële te schaden / spanning bij. |
| Verdampte drug delivery | Ja. | Makkelijk, minimaal invasieve, snel. | Werkt niet voor alle drugs. |
Tabel 1: Comparizoon van de verschillende behandelmethoden en hun eigenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven methoden kunt eenvoudige, effectieve en robuuste behandeling van ofwel free-flying of benut honingbijen. Deze werkwijzen kunnen op tal experimentele paradigma en biologische bevat (Tabel 1). Alle free-flying werkwijzen kunnen eenvoudig worden toegepast op benut bijen. Het omgekeerde is minder succesvol, maar omdat tijdelijke beperking en invasieve behandelmethoden vaak compromis vliegende vermogen bijen.
De methoden zijn gepresenteerd vanuit een brein-centric perspectief. Dit is niet te wijten aan inherente beperkingen van de technieken, maar eerder als gevolg van persoonlijke belangen van de auteurs. Er is geen reden waarom deze werkwijzen niet kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van andere organen. Echter mogelijk kleine aanpassingen nodig de werkwijze meer geschikt voor andere orgaansystemen te maken. Terwijl bijvoorbeeld topicale behandeling ondergaan om de hersenen te bereiken wordt gewoonlijk aangebracht op de thorax, misschien beter te passen this de buik of het beoogde doel de eierstokken. Evenzo kunnen injecties gemakkelijk worden toegepast op andere gebieden dan de thorax of het hoofd (bijvoorbeeld buikorganen kan worden gericht door het injecteren tussen de abdominale sklerieten).
In termen van welke verbindingen kunnen worden toegediend aan bijen, er zijn echt geen grenzen. Typisch, hebben de mensen farmacologische stoffen toegediend, zoals signaalmoleculen 21 of hun antagonisten 32, en op maat gemaakte peptiden 28. Echter, er is een recente toename van het toedienen aan bijen verbindingen met toegepaste vragen in het achterhoofd, zoals pesticiden 33 en antropogene verontreinigingen 34. Recentelijk verbindingen toegediend begonnen met RNA-moleculen die interfereren met gen expressie direct, zoals dsRNA activeren van de RNA interferentie pad 35 of zelfs 36 en microRNA antagomirs 37 omvatten. Niet alle methoden werken even goed voor alle verbindingen.Dit is misschien het best geïllustreerd door bittere of zure verbindingen die suikerwater onverteerbaar voor bijen te maken, waardoor ze niet consumeert. Fragile moleculen, zoals RNA's of bepaalde polypeptiden worden afgebroken bij verhitting tijdens een vervluchtiging procedure of in een harde oplosmiddel zoals DMF. Het is daarom belangrijk om de chemie van wat wordt toegediend om te waarborgen dat de behandelingsprocedure overleeft begrijpen.
Het krijgen van een farmacologisch middel in een honingbij is het makkelijke gedeelte, maar er zijn drie grote bezorgdheid dat mag nooit lichtvaardig bij het uitvoeren van de farmacologische experimenten worden genomen. De eerste is het uitzoeken van een goede dosis voor het experiment in kwestie. Afhankelijk van het geneesmiddel, kan er al literatuur bekend, maar voor het grootste deel, zal dit worden opgelost door een mengsel van literatuuronderzoek, hoogte gissen en dosis-respons curves. Afhankelijk van hoe ingewikkeld het experimentele protocol is, kan het nuttig zijneerst het genereren van een dosis-respons curve in een eenvoudiger bioassay (bijvoorbeeld het kwantificeren van de totale beweging of overleving) om een beter idee van een dosis-range proberen waard in een meer uitgebreide bioassay te krijgen. In ons laboratorium, wordt een startdosering ofwel gevonden in de bijen literatuur of door het doen van een mg / kg conversie gebaseerd op de data van het knaagdier literatuur. Vanuit dit uitgangspunt, worden de bijen behandeld met de startdosering, plus 2 of 3 doses 10 keer groter en kleiner dan de startdosering (bijvoorbeeld als de startdosis is 1 mg, 0,01, 0,1, 10 en 100 mg zou ook gebruikt), en natuurlijk een passende controle over het voertuig.
Het tweede probleem is iets kieskeurig: drug specificiteit. De meeste geneesmiddelen zijn niet ontwikkeld met bijen of andere insecten, in gedachten. Hierdoor off-target treden vaak (bijvoorbeeld, mianserine, een vertebraat serotoninereceptor antagonist 38 is lang gedacht dat een insect octopaminergic receptorantagonist, maar recente Fi-bevindingen tonen aan dat in bijen het ook een dopamine receptorantagonist 39). Een gebruikelijke oplossing voor dit probleem is, in plaats van te vertrouwen op slechts één geneesmiddel om hetzelfde experiment met een reeks geneesmiddelen die het doelwit van belang gemeen herhalen. In principe, als meerdere geneesmiddelen is bekend dat een bepaald doel te blokkeren, waarnemen overeenkomstige resultaten tussen verschillende geneesmiddelen moet meer vertrouwen dat het geneesmiddel het verwachte effect, aangezien verschillende geneesmiddelen vaak unieke off-target profielen geven.
Het laatste nummer gaat ervoor te zorgen dat het geneesmiddel optreedt, waar het hoort te handelen. In dit verband zal er altijd een compromis tussen specificiteit en invasiviteit zijn. Systematische behandelingsmethoden zijn over het algemeen de minst invasieve, maar er is geen controle waar in het lichaam bij het geneesmiddel waarvan de werking. Zelfs voor micro-injectie van doelweefsel geneesmiddelen kunnen reizen met de hemolymfe naar andere delen van het lichaam bij. Hoe dit probleem wordt verholpen needs te worden geïnformeerd door de gestelde vragen. Voor bepaalde experimenten anatomische locatie is niet relevant, terwijl voor anderen is dit de enige vraag van belang. De beste manier om dit aan te pakken is om te beginnen met systemische behandelingen en geleidelijk terug te brengen tot een anatomische locatie door het gebruik van steeds meer specifieke methoden. Als het gedrag wordt onderzocht is met name onverenigbaar met invasieve behandelmethoden, is het misschien de moeite waard om te deconstrueren in eenvoudiger componenten voor het doen van een hele reeks van experimenten met zeer specifieke farmacologische behandelingen.
Dit probleem van lekkage geneesmiddel nog overdreven met orale behandeling van vrij vliegende bijen, waarbij geneesmiddelen kunnen beïnvloeden doelsoort bijen. Forager honingbijen verzamelen nectar in het veld om hun kolonie terug te brengen. Zij zullen de meerderheid van hun sucrose-oplossing in de korf offload bij terugkeer in plaats van absorberen. In de korf wordt verpakt in cellen, uitgedroogd, en opgeslagen als honing. Omdatdit kan drugs kunnen beïnvloeden non-target bijen. Met meer specifieke methoden (zoals micro-injecties) dit probleem geminimaliseerd.
Met deze kanttekeningen in het achterhoofd, en goed aangepakt, kan neurofarmacologisch manipulatie van honingbijen een zeer krachtig instrument zijn. Terwijl transgene instrumenten worden ontwikkeld voor honingbijen 15, vanwege hun sociale leven is het onwaarschijnlijk dat transgenen steeds een gemakkelijke en betrouwbare manier om dergelijke experimenten wordt. Het is daarom waarschijnlijk dat de farmacologie zal blijven een belangrijk onderdeel van de honingbij onderzoek in de toekomst. Terwijl sommige bee onderzoekers oproepen tot gestandaardiseerde experimentele methodes 40 hebben gemaakt, in dit geval het zou een vergissing zijn. Een deel van de kracht van de honingbij systeem heeft altijd de diversiteit van experimentele benaderingen geweest, en hoe technieken zijn ontwikkeld met echte biologische vragen in het achterhoofd in plaats van andersom. Toch is het belangrijk dat we ervoor zorgengebruik van de meest geschikte methode om de vraag bij de hand. Als vergelijkingen met eerdere studies zijn de belangrijkste, moet gestandaardiseerde protocollen strikt worden opgevolgd. Echter, gebruik vastgesteld protocol omwille van het gebruik van gestandaardiseerde methoden mogen niet in de weg van de ontwikkeling van nieuwe methodes die nieuwe experimentele mogelijkheden open kunnen staan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B.
- Søvik, E., Barron, A. B.
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662 (2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282 (2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P.
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288 (2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529 (2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
