Summary
Dette håndskrift beskriver flere protokoller til administration farmakologiske agenter til honningbier, herunder simple noninvasive metoder til fritflyvende bier, samt mere invasive varianter, der tillader præcis lokaliseret behandling af fastholdte bier.
Abstract
Honningbier demonstrere forbløffende indlæringsevne og avanceret social adfærd og kommunikation. Desuden deres hjerne er lille, let at visualisere og studere. Derfor har bier længe været et yndet model blandt neurobiologer og neuroethologists til at studere det neurale grundlag for social og naturlige adfærd. Det er imidlertid vigtigt, at de eksperimentelle teknikker, der anvendes til at studere bier ikke forstyrrer den adfærd, der undersøges. På grund af dette, har det været nødvendigt at udvikle en række teknikker til farmakologisk manipulation af honningbier. I dette papir demonstrerer vi fremgangsmåder til behandling tilbage eller fritflyvende honningbier med en lang række farmakologiske midler. Disse omfatter både ikke-invasive fremgangsmåder, såsom orale og topiske behandlinger, såvel som mere invasive metoder, der giver mulighed for præcis lægemiddelafgivelse i enten systemisk eller lokaliseret måde. Endelig vil vi diskutere fordele og ulemper ved hver metode og beskrivefælles forhindringer og hvordan man bedst overvinde dem. Vi konkluderer med en diskussion om betydningen af at tilpasse den eksperimentelle metode til de biologiske spørgsmål snarere end den anden vej rundt.
Introduction
Da Karl von Frisch belyst deres dans sprog 1, har honningbier forblevet en populær undersøgelse art for forskere i dyrs adfærd og neurobiologi. I de senere år et utal af nye discipliner er opstået i skæringspunktet mellem disse to områder, og flere andre discipliner (f.eks, molekylær biologi, genomforskning og datalogi) er opstået sammen med dem. Dette har ført til en hurtig udvikling af nye teorier og modeller til at forstå, hvordan adfærd skyldes aktivitet inden nervesystem. På grund af den unikke livsstil, rige adfærdsmæssige repertoire, og let eksperimenterende og farmakologisk manipulation, har bierne været på forkant med denne revolution.
Honningbier bliver brugt til at studere grundlæggende neurobiologiske spørgsmål som dem, der ligger til grund for indlæring og hukommelse 2,3, beslutningstagning 4, olfaktoriske 5 eller visuel bearbejdning 6. I de seneste år har honey bi er endda blevet brugt som model til at studere emner generelt forbeholdt medicinsk forskning, såsom virkningerne af vanedannende stoffer 7 - 11, sove 12, ældning 13, eller de mekanismer, der ligger til grund anæstesi 14.
I modsætning til de klassiske genetiske modelorganismer (f.eks D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), der er meget få genetiske værktøjer til rådighed for at manipulere neurale funktioner i honningbier, selv om dette er i øjeblikket ændrer 15. I stedet har honningbi undersøgelser primært påberåbt farmakologiske manipulationer. Det har været meget vellykket; imidlertid, mangfoldigheden af bi forskning er således, at der er brug for en række fremgangsmåder til farmakologisk administration. Forskning med honningbier adresser meget forskellige spørgsmål, er undersøgt af forskere fra forskellige discipliner og baggrunde, og bruger en række eksperimentelle tilgange. Mange research spørgsmål kræver bier til enten være fri-flyvende, frit interagere i deres koloni, eller begge dele. Dette kan gøre det svært at holde styr på de enkelte forsøgsdyr, og gør tilbageholdenhed eller kanylering umuligt.
For at imødekomme de mange forskellige honningbi forskning, er der behov for en bred vifte af narkotika leveringsmetoder, der giver mulighed for robust og fleksibel administration og samtidig sikre, at den farmakokinetiske og farmakodynamiske profiler, invasionsevne af metoden, og dens pålidelighed, passer det paradigme pågældende. På grund af disse forskellige behov, har de fleste forskergrupper udviklet deres egne unikke Drug Administration metoder. Hidtil har dette været en styrke bi forskerkredse; det har ført til udviklingen af arrays af fremgangsmåder, der muliggør administration af samme lægemiddel i forskellige omstændigheder. Vores mål her er ikke at udvikle en enkelt standardiseret metode til farmakologiske manipulationer af bier, men snarere at fremhæve metoder,har vist sig at være særdeles vellykket, og hjælpe forskere vedtage disse. Vi diskuterer de grundlæggende principper for, hvordan de arbejder, samt deres fordele og ulemper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drug Administration for spændte Bier
- Oral behandling
- Forbered 1,5 M saccharoseopløsning ved blanding 257 g sucrose med 500 ml vand (det er lettere at opløse denne mængde sucrose i kogende vand). saccharoseopløsning ved 4 ° C indtil brug opbevares.
BEMÆRK: Saccharose løsning giver en meget gæstfri miljø for visse mikroorganismer, og dermed let bliver forurenet og ubehagelig for bier. Bulk saccharoseopløsning kan alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. - Beslut en passende dosis lægemiddel (hvordan man opnår det, er rettet i diskussionen nedenfor), og forberede en løsning, således at den foretrukne dosis narkotika opløses i 20 uL saccharoseopløsning (f.eks til at levere 20 ug, fortynde narkotika på et forhold på 1 mg / ml). Harness bier ifølge Felsenberg et al. (2011) 16. Gør dette trin mindst 12 timer før lægemiddelbehandling at sikre, at bier ikke længere er stresset out fra at udnytte, når lægemidlet løsning præsenteres.
BEMÆRK: For mere konsistente resultater, er det bedst at sulte bier (ved at placere styrkes med bier i en inkubator ved 34 ° C og 70% luftfugtighed) O / N. - Med en mikropipette røre en dråbe 1,5 M sucrose vand til antennen af en udnyttes bi. Når snabel udvides, skal du trykke en 20 pi dråbe af 1,5 M sucrose indeholdende lægemidlet direkte til snabel af bi. Sørg for, at bi forbruger alt. Som kontrol køretøj anvende 1,5 M saccharoseopløsning uden tilsatte stoffer.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere på grundlag af eksperimentelle planer Mængden af saccharose løsning. Hvis appetitive condition er beregnet, vil fodre bierne lige før træning forstyrre biernes lydhørhed. - Kassér eller afsætte bier, der ikke forbruger alle af saccharose.
BEMÆRK: Hvis et stort antal bier undlader at drikke saccharose løsning, måske skal justeres fodring tidsplan.
- Forbered 1,5 M saccharoseopløsning ved blanding 257 g sucrose med 500 ml vand (det er lettere at opløse denne mængde sucrose i kogende vand). saccharoseopløsning ved 4 ° C indtil brug opbevares.
- Injektion i thorax
- Forbered lægemiddel i honningbi Ringer 17 som følger:
- Bland og autoklaven 7,45 g NaCl, 0,448 g KCI, 0,812 g MgCl2, 0,735 g CaCl2, 54,72 g saccharose, 4,95 g D-glucose og 2,48 g HEPES i 1000 ml vand. Vær forsigtig, når opbevaring Ringer da det let forurenet. Alikvot og opbevares Ringer ved -20 ° C indtil anvendelse.
- Opløs lægemidlet i Ringer-opløsning og derefter fortyndes således at den ønskede mængde er til stede i 5 pi. Som et eksempel, hvis bier er at blive behandlet med 5 ug af et lægemiddel, 1 g kan indledningsvis opløses i 1 ml i Ringer, før den blev fortyndet 1: 1.000 i Ringer til en endelig opløsning af 1 pg / pl.
BEMÆRK: Alternativt kan kommercielt tilgængelige PBS (phosphatpufret Salin) anvendes i stedet for Ringer-opløsning.
- Lav en microscalpel ved at bryde ud i hjørnet af et tveægget barberblad meden knivholder. Fastgør klingen fragmentet til en bladholder, så det gør en nice klinge med en skarp endepunkt.
- Under et stereomikroskop, omhyggeligt bruge microscalpel til at skære et 2 mm hul lige over skjoldet, ved siden af den bageste fløj processen med en bi thorax. Undgå at skære for dybt, da dette kan skade flyvning muskler, og være omhyggelig med at undgå de fløj hængsler. Ideelt skåret kun tre sider, således at flappen af kutikula senere kan foldes tilbage for at lukke læsionsstedet.
- Med en mikropipette indskud 5 μlL Ringer (eller PBS) indeholdende lægemidlet på toppen af hullet i brystkassen. overvåge omhyggeligt under mikroskop for at sikre, at hele dråbe absorberes i hæmolymfe. Brug Ringer (eller PBS) som en vehikelkontrol.
- Hvis det er muligt, skal du flytte neglebånd flap tilbage over hullet. Efter 5-10 timer, vil det vedhæfte og forsegle.
BEMÆRK: Som et alternativ til denne teknik injiceres 1 pi direkte i thorax ved anvendelse af en glassprøjte, efter åbning af en SMAll hul i midten af frenum (tværgående linie i det posteriore område af skjoldet) med en sprøjtenål (diameter: 0,6 mm, G: 23). Dette omgår behovet for først at skære brystkassen med en skalpel og injektionsstedet er mindre, men denne fremgangsmåde vil forlade injektionsstedet blotlagt.
- Forbered lægemiddel i honningbi Ringer 17 som følger:
- ocellus injektion
BEMÆRK: Dette er en fremgangsmåde egnet til levering molekyler hele hovedet kapsel, i hæmolymfe.- Forbered narkotika som i 1.2.1, men juster medikamentkoncentrationer således at den ønskede dosis vil være indeholdt i 1 pi Ringer eller PBS (mindre volumen kan optages gennem ocellus hul end gennem brystkassen).
- Forbered en microscalpel som i 1.2.2. Under et stereomikroskop, låse hovedet af en udnyttes bi på plads ved at fylde hals sprække med voks. Brug lav temperatur smeltende voks (f.eks dental voks) for at undgå skadelige antennal olfaktoriske receptorer eller andre celler, der kan være iVIGTIG til vurdering adfærd (f.eks olfaktoriske læring). Fjern derefter forsigtigt linsen af medianen ocellus ved at indsætte spidsen af microscalpel under linsen og forsigtigt bryde linsen fri fra hovedet kapsel.
BEMÆRK: Det er også muligt at placere voks forsigtigt over antenner for at forhindre bevægelse. - pipettere forsigtigt stof på ocellus hul. Vent indtil alt tages i hovedet kapsel. Fjern dental voks fra antenner og lad bien til at hvile i et stykke tid, før du fortsætter den eksperimentelle procedure. Brug Ringer (eller PBS) som en vehikelkontrol.
- Injektion i ocellar tarmkanalen
BEMÆRK: ocellar tarmkanalen indeholder store fibre, der forbinder til de fleste regioner i den centrale hjerne 18. Denne behandlingsmetode muliggør påføring forbindelser til kun hjernen, men ikke rettet mod specifikke underregioner af hjernen.- Forbered bi som i 1.3.2. og tag linsen af medianen ocellus med tip af en microscalpel som i 1.3.3.
BEMÆRK: Dette kan gøres op til 2 timer før injektionen. Baseret på vores erfaringer, fodret bier er bedre i stand til at klare denne operation end Starved bier - Fyld en 10 pi glassprøjte udstyret med en lille gauge (fx 33, diameter: 210 um) nål med lægemiddelopløsning fremstillet som i 1.3.1.
- Ved hjælp af en manuel mikromanipulator, Før sprøjten gennem ocellar retina ind i hovedet kapsel til en dybde på 50 um og injicere 250 nl af opløsning.
- Efter brug skylles sprøjten 3 gange med destilleret vand, derefter 3 gange med 75% ethanol.
- Forbered bi som i 1.3.2. og tag linsen af medianen ocellus med tip af en microscalpel som i 1.3.3.
- Mikroinjektion i bestemte hjernens strukturer
BEMÆRK: Ud over de systematiske ovennævnte behandlinger, er det muligt at udføre mikroinjektioner i bestemte hjernens strukturer. Dette giver mulighed for farmakologisk manipulering af en eller flere områder af hjernen, mens andre upåvirket. Dette virkerbedst med områder af hjernen, der er nemme at genkende fra den forreste hjerne overflade (f.eks antennal lapper, champignon krop calyces eller lodrette lapper, eller de optiske lapper), men andre regioner er blevet rettet. Bemærk venligst, at orienteringen (anterior / posterior, dorsal / ventral) henviser til kroppens akse, snarere end at i centralnervesystemet 19.- Forbered lægemidlet i Ringers eller PBS på samme måde som i 1.2.1, tilsætte et fluorescerende (f.eks 0,5 mg / ml dextran, Alexa 546 eller 568 fluor) eller ikke-fluorescerende farvestof (fx 1 mM methylenblåt).
BEMÆRK: Tilføjelsen af et fluorescerende farvestof vil tillade kontrol af injektionen placering efter eksperimentet er slut (ved hjælp af konfokal mikroskopi, efter hjerne dissektion), mens ikke-fluorescerende farvestoffer tillader direkte overvågning under eksperimentet. - For at gøre glas pipetter til injektion, indsætte glaskapillarer af korrekt diameter i holderen klemmer af en elektrode aftrækker (1,0 mm for standard holdis inkluderet for den i listen materialer mikroinjektor). Juster pull og varme indstillinger til at producere en ca 0,5 cm lang spids (indstillinger vil være forskellige for hver aftrækker, selv hvis der anvendes den samme model).
BEMÆRK: Ideelt set de to pipetter trukket fra en glas skal have samme længde og form, således at begge kan bruges. - Under et stereomikroskop, bryde tips til at opnå en ydre diameter på omkring 10-15 um, baseret på visuel vurdering under anvendelse af en skala på et gradnet indsat i okulære. Trinene på skalaen defineres af fabrikanten og kan korrigeres for forstørrelsen anvendes.
- Derefter fylde glas pipetter med den løsning at injicere. Hvis der anvendes glaskapillarer med filamenter, fylde pipetten ved at placere bagsiden i lægemiddelopløsningen, ellers fylde spids hjælp microloader tips.
- Sæt den fyldte glas pipette ind i kapillære indehaver af en mikroinjektor, som styres af en manuel eller elektronisk micromanipulator.
- Kalibrer mikroinjektor at injicere det ønskede volumen (0,5-2 nl, afhængigt af størrelsen af hjernen struktur målrettet). Til dette, injiceres direkte ind i en lille petriskål indeholdende mineralolie og måle diameteren af dråben med stregglasset. Skift indstillinger, indtil den ønskede lydstyrke er nået.
- Fastgør hovedet af en udnyttes bi hjælp blød dental voks som i 1.3.2, før opskæring en åbning ind i den forreste del af hovedet kapsel, ved hjælp af en microscalpel, med tre snit: en lige under medianen ocellus (ventrale), en ved grænsen til højre eller venstre øje og den ene over antennen stilke (dorsale). Brug et stykke dental voks til at holde den åbnede klap på plads.
- Skub forsigtigt kirtler og luftrør liggende oven på hjernen side ved hjælp fine tænger, derefter foretage en lille brud i neurilemma (meget tynd membran omkring hjernen) over den målrettede hjernens struktur.
BEMÆRK: Hvis mange bier skal behandles på en gang, denne procedurekan udføres tidligere; dog være omhyggelig med at ikke forlade bier i denne tilstand for lang (ikke mere end 30 min), da deres hjerner kan tørre ud. - Sæt spidsen i det ønskede hjerneregion, og justere dybden vinkelret på hjernen overflade (f.eks 60 um for svamp body calyces). Sprøjt den forudindstillede lydstyrke. For laterale områder af hjernen, injicere bilateralt (dvs. gøre én injektion til hver halvkugle). Hvis der anvendes et ikke-fluorescerende farvestof, sikre tilførsel forekom i den rigtige region ved observation under injektion. Hvis der anvendes et fluorescerende farvestof gøre det samme under fluorescerende lys ved anvendelse af et stereomikroskop med et fluorescens-visning system.
- Bagefter placere den åbne flap tilbage over biens hoved. Smelt en krystal af eicosan, der er ca. 1 mm i diameter, ved anvendelse af en tynd ledning viklet omkring spidsen af en mikro loddekolbe (smeltetemperatur er 35-37 ° C) og forsegle udskæringerne. Dette vil i høj grad reducere dødeligheden.
- Slipbi fra selen for adfærdsanalyse (men se diskussion), eller holde sig i selen for eksperimenter på tilbageholdende bier - f.eks snabel forlængelse refleks (PER) test 20.
- Hvis der blev anvendt et fluorescerende farvestof, at injektionen ramte område af interesse efter eksperimentet er forbi anvendelse af et konfokalt laserscanningsmikroskop (fig. 1).
BEMÆRK: Dette er især nyttigt, når du målretter dybere områder i hjernen (hvor det ville være svært at se fluorescerende farvestof under injektionen fase).
- Forbered lægemidlet i Ringers eller PBS på samme måde som i 1.2.1, tilsætte et fluorescerende (f.eks 0,5 mg / ml dextran, Alexa 546 eller 568 fluor) eller ikke-fluorescerende farvestof (fx 1 mM methylenblåt).
2. Drug Administration Metoder til fritflyvende Bees
- Oral behandling
- Forbered lægemiddel på samme måde som i trin 1.1.1-1.1.2. Tilføj drug løsning på et feeder og placere i køleskabet til opbevaring.
BEMÆRK: Enhver feeder vil gøre, såsom en på hovedet flaske hætte eller en krukke omvendt på silkepapir. - Træn bier til en tyngdekraft feeder indeholdende 1 M eller 0,5M saccharoseopløsning ved at placere en feeder tæt på stadet. Når bierne begynder fouragerer på feeder, gradvist flytte den længere væk, indtil det er i behagelig afstand for at undgå at blive stukket (minimum 5 m).
- Maling-mark bier for at holde styr på individuelle honningbier. Lav en liste over alle farvekombinationer der vil blive anvendt. Når en bi lander på feeder, markere omhyggeligt sin mave med to farver, og gøre et notat på listen, at kombinationen er taget.
- Swap tyngdekraften feeder til en feeder indeholdende lægemidlet / rørsukkeropløsning. Vær opmærksom på de markerede bier der besøger feeder. Fang enhver umærket bi besøger feeder som bier er frodig personalekonsulenter, og antallet af bier besøger bedøvet feeder kan hurtigt komme ud af kontrol. Dette er især problematisk, hvis det samme forsøg skal udføres på hinanden følgende dage, som naive bier ikke længere kan være naive.
BEMÆRK: Som et alternativ til at træne de enkelte bier til en feeder, tidligere forfatters har med succes fodret lægemiddel-snøret sakkarose vand til en hel bikube 21 - 23.
- Forbered lægemiddel på samme måde som i trin 1.1.1-1.1.2. Tilføj drug løsning på et feeder og placere i køleskabet til opbevaring.
- topisk behandling
BEMÆRK: Målet er at opløse forbindelsen af interesse i et opløsningsmiddel, der kan trænge ind i voksagtige insekt kutikula. Forskellige opløsningsmidler kan anvendes til dette formål. Den mest almindeligt anvendte indbefatter acetone, dimethylformamid (DMF) og dimethylsulfoxid (DMSO).- Evaluere hvilket opløsningsmiddel der fungerer bedst for forbindelsen ved hånden. Hvis der forventes en stærk fænotype af en overdosis (f.eks, lammelse eller død), behandle bier (trin 2.2.2) med en høj dosis (f.eks 20 ug kokain 7) opløst i hver af de forskellige opløsningsmidler og omhyggeligt overvåge tid indtil paralyse eller død.
- Anvendelse af en 1 pi mikrokapillære (eller mikrosprøjte som kan monteres på en passende gentagen dispenser) og mikrokapillær indehaveren, tegne 1 pi af medikamentopløsningen (f.eks 381 g / pl af kokain) ind i kapillarrøret. Pres drop, og omhyggeligt male det på brystkassen af en markant bi. Dække så stort et område en mulig med opløsningen i stedet for at efterlade en fast dråbe, som bien derefter sandsynligvis soignere det af. Pas på ikke at tillade forbindelsen til at kontakte vingen hængsler, eller det kan trække det fra brystkassen og langs vingerne, hvor det fordamper uden at blive absorberet i hemolymph.
BEMÆRK: Afhængigt af forskning mål, kan denne metode også bruges til at administrere lægemidler til biens mave. Lægemidler imidlertid nå CNS hurtigere og i større mængder, når de anvendes på thorax 24 .Denne metode fungerer lige godt med udnyttes som med fritflyvende bier.
- forflygtiges behandling
- Opløs lægemidler (tidligere denne metode er blevet anvendt til at levere kokain til honningbier 10) i 100% ethanol. For at sikre opløselighed, skal du ikke bruge en hydrochlorid eller andre saltformer aflægemiddel, hvis muligt. Når der foretages en fortynding forberede det således at mængden, der skal leveres til en bi er til stede i 100 pi. Brug ren ethanol som et køretøj kontrol.
- For at oprette en glødetråd, bruge samme fremgangsmåde som McClung og Hirsh 25.
- Kort forklaret: vind op nichromtråd stramt omkring et søm og tillægger to elektriske ledninger (en i hver ende af glødetråden). Fjern neglen. Den resterende nichrom spole omtales som glødetråden.
- Tråd de to ledninger gennem omhyggeligt borede huller i låget på et 50 ml centrifugerør, som bør være modstandsdygtigt over for den valgte temperatur. Lim ledningerne på plads med flydende silikone.
BEMÆRK: Dette vil gøre røret lufttæt. Dette er afgørende for at undgå sekundær udsættelse for forsøgslederen og sikre, at bier bliver behandlet med den passende dosis.
- Fastgør ledningerne, der fører til endeløse til en strømkilde. Anvendelse af et termoelement til at måle temperaturen afglødetråden, eksperimentere med forskellige spænding / strøm kombinationer indtil en, der resulterer i en passende temperaturprofil for lægemidlet pågældende ideelt set en, der giver mulighed for 10 sekunders opvarmning eller mindre. Dette er meget vigtigt, henvises til relevant litteratur (f.eks, for kokain at fordampe det skal opvarmes til mindst 200 ° C, men ved temperaturer over 350 ° C er det opdelt i sekundære forbindelser 26).
- omhyggelig pipettering 100 pi lægemiddelholdige ethanolopløsning på glødetråden. Spred væsken over så meget filament overflade som muligt, da dette vil øge fordampningen effektivitet. Efterlad glødetråden eksponeret ved stuetemperatur, indtil al ethanol er afdampet.
BEMÆRK: Hvis ethanol ikke er tilstrækkeligt fordampet, vil bierne blive behandlet med både det foretrukne stof og ethanol. Bier er ekstremt følsomme over for ethanol, og nogle lægemidler har synergistiske interaktioner med ethanol, hvilket vil forspænde extelle resultater. - Når ethanol er helt fordampet (lægemiddel bundfald kan normalt ses på den tørre glødetråd under mikroskop), fange en frit flyvende bi i et 50 ml rør. lukke omhyggeligt låget indeholdende filamentet.
- Tænd for strømmen i 10 sek, slukke for strømmen og vente yderligere 50 sek (for at gøre det muligt for flygtiggjorte forbindelse til at afkøle og derved kondensere eller depositum). Slip bi.
BEMÆRK: Selv om denne behandling metode virker udmærket for fritflyvende bier, kan den bruges lige så effektivt med udvundet bier. Du skal blot vedhæfte udnyttes bi inde i et 50 ml rør. Opdater glødetråden som beskrevet i 2.3.4 mellem bier. For højere gennemløb kan flere filamenter anvendes parallelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et udvalg af repræsentative resultater for de ovenfor beskrevne metoder er vist, primært for at vise, at de metoder, tillader farmakologiske agenter til at nå hjernen og påvirke honningbi adfærd.
Specifikke virkninger på hjernens processer kan let opnås efter thorax injektion.
Fordi farmakologiske midler injiceres gennem brystkassen kan virke på flere mål i kroppen, og få fortyndet i kroppen, før den når hjernen, kan denne teknik tage mulige specificitet bekymringer. Alligevel har det været meget anvendt i litteraturen til at interferere med kognitive processer, uden det er nødvendigt at anvende meget høje doser, som vil kunne give større sekundære virkninger. For eksempel har blokkere af transskription blevet administreret ved hjælp af denne teknik, for at identificere faser af hukommelse, der kræver genetudtryk. Thorax injektion af sådanne molekyler er kompatibel med overlevelse i flere dage 27, hvilket betyder, at deres potentielle toksiske virkning på andre mål kan begrænses, forudsat at koncentrationen er velvalgt. Under sådanne forhold kan der opnås selektive og tidsafhængige virkninger på hukommelse, hvilket viser en effektiv målretning af hjernen (fig. 2).
Diffusion af molekyler ind i hovedet hæmolymfe fører til hurtige, dosisafhængige virkninger.
Ocellus injektion er en måde at muliggøre en hurtig diffusion af molekyler af interesse i hele hovedet gennem hæmolymfe, især hvis de kan have mange udbredte mål i hjernen. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at administrere allatostatins, neuropeptider, der også kan virke som neurohormones 28). Som følge heraf blev nedsat kraft observeret i en olfaktoriske læring assay i overensstemmelse medden foreslåede tilstedeværelse af allatostatin receptorer i forskellige områder af hjernen er involveret i olfaktoriske forarbejdning og læring 28. En dosisafhængig kurve for denne effekt kunne etableres, ved at indsprøjte forskellige koncentrationer til uafhængige grupper kører parallelt (figur. 3).
Forskellige måder at administrationen kan give efter for lignende virkninger på hjernens funktion.
Emetin, en blokker af proteinsyntese, der bruges til at forringe dannelsen af tidlig olfaktoriske hukommelse langtidshukommelse, som typisk er udtrykt 1-2 dage efter konditionering. I de fleste publicerede undersøgelser er det blevet injiceret i thorax 29. Vi viste, at tilsvarende virkninger kunne opnås ved at administrere det direkte til hjernen gennem ocellar tarmkanalen (fig. 4): tilvejebringelse af en justering af injektion parametre (mindre volumen, højere koncentration og kortereforsinkelse, før konditionering), vi opnåede et fald (-20%) svarende til den fundet i litteraturen under anvendelse af samme lægemiddel beløb (10 nM) - sammenlign med figur 4 i Stollhoff et al, 2005 29..
Virkningerne af lokaliserede injektioner er begrænset i tid og rum
For at teste de rumlige og tidslige egenskaber af lægemidler mikroinjiceret i specifikke områder af hjernen, blev styrkes med bier trænet i en olfaktoriske PER condition paradigme, og derefter injiceres bilateralt med 0,5 nl af 740 mM procain (bedøvelse) i champignon krop calyces eller lodrette lapper ( saltvand blev anvendt som kontrol). Når bierne blev successivt testet for tilbagekaldelse 1, 2, og 3 timer efter injektion, blev præstationer kun forringet i bier med bilaterale injektioner i de lapper (figur. 5). Intakt neurale output fra lapperne, men ikke fra calyces, er kendt for atvære nødvendigt for olfaktoriske hukommelse hentning, så dette tyder på, at procain forblev lokaliseret til lap, hvor det var blevet injiceret i mindst 3 timer. Det viser også, at når injiceres i calyces blev diffusion ind i de nærliggende lapper begrænset i samme periode, da en calycal injektion af procain ikke førte til blokade af lapper.
Adfærdsmæssige fænotyper efter administration af lægemidlet er ofte kontekstafhængig
Tidligere forsøg har vist, at efter behandling med kokain bier overvurdere kvaliteten af en saccharoseopløsning 10,30. For at se, om denne virkning var afhængig af kontekst (her, baseline kvalitet saccharose), blev fritflyvende honningbier behandlet med fordampede kokain. Individuelt markerede fritflyvende honningbier fik lov at fouragere på en feeder indeholdende 1 M saccharoseopløsning. På feeder blev bier forsigtigt fanget ien 50 ml centrifugerør, som de var ved at stige ud feeder. Bier blev behandlet med enten 100 ug fri base kokain eller vehikelkontrol (fordampet ethanol). Efter behandling blev saccharose feeder enten erstattet af en 0,5 M eller en 2,0 M sucrose feeder, og satsen finsnittere tilbage til feeder blev registreret. Ved hjælp af dette paradigme, kokain-behandlede bier øget deres fouragering indsats på 0,5 M feeder, men ikke på 2,0 M feeder (figur 6). Forskellen i effekt set med de to saccharose koncentrationer pænt viser betydningen af at tage miljømæssige stikord i betragtning, når studere biadfærd.
Figur 1: Konfokal Laser scanning Billede af injektionsstedet. Alexa 546-mærket dextran injiceres sammen med lægemiddelopløsningen (rød). At identificere neuropilsa counter-farvning med DAPI tilføjes (grøn). I højre hjernehalvdel injektionsstedet blev anbragt i det lodrette lap (VL), vist som et eksempel for en vellykket injektion. I venstre hemisfære injektionsstedet lå dorsale af den lodrette lap i ringen neuropilen vist som et eksempel for et mislykket injektion. Scale bar = 100 um, MB: Mushroom Organer, AL: Antennal lapper, d: dorsal, v: ventrale, l: venstre, r:. Højre Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Time-afhængige Effekt af actinomycin D (Transcription Blocker) på langtidshukommelsen, når sprøjtes ind i Thorax På forskellige forsinkelser efter appetitive olfaktoriske betin. gerende (6, 9 eller 12 h), 1 pi actinomycin D (1,5 mM i PBS) blev injiceret i brystkassen. Langsigtet hukommelse (LTM) hentning blev vurderet 3 d efter konditionering (n = 25-65). Hukommelsesydeevne blev reduceret i en tidsafhængig måde, sammenlignet med den PBS-behandlede kontroller: effekten var signifikant, når injektionen også placere 6 timer efter konditionering (χ 2 = 18.04, p <0,005), men ikke ved længere forsinkelser ( 9 h: × 2 = 0,95; 12 h: χ 2 = 0,47), hvilket tyder på, at LTM dannelse kræver en bølge af transskription, der finder sted i løbet af en defineret tid vindue efter konditionering. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. Data, er tidligere blevet udgivet 27 og er genskabt her med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
Figur 3:. Dosisafhængig inhibering af Learning Performance Efter Ocellar Injektion af et neuropeptid Neuropeptidet allatostatin C blev injiceret i hovedet hæmolymfe (200 nl i PBS), gennem median ocellus, 1 time før olfaktoriske condition. Uafhængige dyregrupper injiceret med forskellige koncentrationer (eller PBS for kontroller) blev trænet. Allatostatin C behandling førte til et fald i læringsprocessen ydeevne, som vurderet ved procentdelen af betingede reaktioner i sidste condition, i en dosisafhængig måde efter en U-form kurve (n = 70-78). Dette fald var signifikant på 10 -6 M, men ikke på andre koncentrationer. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. Data, er tidligere blevet udgivet 28, og er tilpasset her med tilladelse. Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 4:. Blokade af 1 D ay Memory efter injektion af emetin (Oversættelse Inhibitor) gennem Ocellar Tract proteinsynteseinhibitoren emetin (50 mM i PBS, 200 nl) blev injiceret i hjernen, gennem ocellar tarmkanalen, 20 min før olfaktoriske condition. Hukommelse blev derefter testet 24 timer senere. Behandlingen væsentligt forringet hukommelse retention (χ 2 = 7,03, p <0,01) sammenlignet med PBS-behandlede kontroller (n = 57-70). Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. JM Devaud, upubliceret data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Anatomisk og Temporal Specificitet af Mikroinjektioner Efter appetitive olfaktoriske condition, blev procain injiceret bilateralt i enten champignon krop calyces eller lodrette lapper. Hukommelse hentning blev vurderet 1 time efter injektion og blev kun påvirket af procaine injektioner i de lapper (1 time efter behandling: vs saltvand: χ 2 = 10,00, p <0,005; vs. procain til calyces: χ 2 = 32,92, p < 0,005). Effekten kunne stadig ses 2 timer (χ 2 = 6,65, p <0,01) og 3 (χ 2 = 27,22, p <0,005) efter injektion, og var stadig stedsspecifikke (2 timer: χ 2 = 8,60, p < 0,05; 3 timer: χ 2 = 17,15, p <0,0001), hvilket antyder, at kun det injicerede område var påvirket af procain. Proportioner er relative til konditionering niveau during sidste condition forsøget. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser (n = 23-28). Data, er tidligere blevet udgivet 31, og er genskabt her med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Effekter af kokain på fritflyvende bier Visitation rate (antal besøg af en given bi / gennemsnitlige besøg for alle bier under testperioden) blev forøget efter forflygtiges kokain behandling ved en kilde lav kvalitet (0,5 M: t 70 = 5,0710, p = 0,00003), men ikke ved en høj kvalitet kilde (2M: t 70 = -0,2087, p = 0,8353). Boksene repræsenterer 1. og 3. kvartiler med midterlinjen viser medianen. De whiskers udvides til 1,5x den interkvartile område. Outliers er ikke afbildet som alle individuelle datapunkter er overlejret. Data, er tidligere blevet udgivet 10, og er genskabt her med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Behandling | Kan gøres med fri- flyvende bier? | Pros | Ulemper |
| Oral behandling | Ja. | Nemt, minimalt invasiv. | Bee fordøjelse er ikke ligetil |
| topisk behandling | Ja. | Nemt, minimalt invasiv, hurtig. | Gentagne behandlinger kan være problematisk. |
| Injektion i thorax | kompliceret,påvirker bier flyvende evner | Konsekvent og robust. | Noget invasiv. Potentiale til at skade / stress bi. |
| Injektion i median ocellus | Ikke anbefalet. | Konsekvent og robust, noget lokaliseret. | Noget invasiv. Potentiale til at skade / stress bi. |
| Injektion i ocellar tarmkanalen | Ikke anbefalet. | meget lokaliseret | Meget invasiv. Potentiale til at skade / stress bi. |
| Mikro-injektion i hjerneområder | Ikke anbefalet. | meget lokaliseret | Meget invasive, svært at udføre. Potentiale til at skade / stress bi. |
| Flygtiggjorte lægemiddeladministration | Ja. | Nemt, minimalt invasiv, hurtig. | Fungerer ikke for alle stoffer. |
Tabel 1: Comparisøn af de forskellige behandlingsmetoder og deres egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderne er skitseret ovenfor tillader enkel, effektiv og robust behandling af enten frit flyvende eller styrkes med honningbier. Disse metoder er kompatible med mange eksperimentelle paradigmer og biologiske spørgsmål (tabel 1). Alle de fritflyvende metoder kan nemt anvendes på styrkes med bier. Det omvendte er mindre vellykket, men da midlertidig tilbageholdenhed og invasive behandlingsmetoder ofte kan kompromittere biernes flyvende evne.
Metoderne er blevet præsenteret fra en hjerne-centreret perspektiv. Dette skyldes ikke iboende begrænsninger ved de teknikker, men snarere på grund af forfatternes personlige interesser. Der er ingen grund til, at disse metoder ikke kan anvendes til at studere andre organer. Imidlertid kan små ændringer være nødvendige for at gøre metoden mere egnet til andre organsystemer. For eksempel, mens topisk behandling for at nå hjernen påføres typisk på thorax, kan det være bedre at anvende this til maven hvis den påtænkte mål er æggestokkene. På samme måde kan injektioner nemt anvendes på andre områder end brystkassen eller hoved (f.eks abdominal organer kan målrettes ved at indsprøjte mellem de abdominale sclerites).
Med hensyn til hvilke forbindelser kan administreres for bier, der virkelig er ingen grænser. Typisk har folk administreret farmakologiske forbindelser såsom signalmolekyler 21 eller deres antagonister 32 og skræddersyede peptider 28. Imidlertid har der været en nylig stigning i administration til bier forbindelser med anvendte spørgsmål i tankerne, såsom pesticider 33 og menneskeskabte forureninger 34. For nylig er indgivne forbindelser begyndt at omfatte RNA-molekyler, som interfererer med genekspression direkte, såsom dsRNA aktivere RNA-interferens pathway 35 eller endda microRNA 36 og antagomiRs 37. Ikke alle metoder virker lige godt for alle forbindelser.Dette er måske bedst illustreres ved bitre eller sure forbindelser, der gør sukker vand ubehagelig for bier, hvilket forhindrer dem i at forbruge det. Skrøbelige molekyler, såsom RNA'er eller visse polypeptider, nedbrydes når det opvarmes under en forflygtigelse procedure eller anbringes i en barsk opløsningsmiddel, såsom DMF. Det er derfor vigtigt at forstå kemien af hvad der bliver administreret til sikre den overlever proceduren behandling.
Kom et farmakologisk middel i en bi er den nemme del, men der er tre store bekymringer, som aldrig bør tages alvorligt, når du udfører farmakologiske eksperimenter. Den første er at finde ud af en god dosis for eksperimentet pågældende. Afhængigt af narkotika, er der måske allerede blive offentliggjort litteratur, men for det meste, vil dette skulle løses af en blanding af litteratursøgning, informeret gætteri og dosis-respons kurver. Afhængigt af hvor kompliceret forsøgsprotokollen er, kan det være nyttigt atførst generere en dosis-respons-kurve på en enklere bioassay (f.eks kvantificering samlede bevægelse eller overlevelse) for at få en bedre idé om en dosis-range værd at prøve i en mere omfattende bioassay. I vores laboratorium, er en startdosis enten findes i bi litteratur eller ved at gøre en mg / kg konvertering baseret på data fra den gnaver litteratur. Fra dette udgangspunkt, er bier behandles med startdosis, plus 2 eller 3 doser 10 gange større og mindre end startdosis (fx hvis startdosis er 1 mg, 0,01, 0,1, 10, og 100 mg ville også være anvendes), og naturligvis en passende vehikelkontrol.
Det andet problem er lidt mere kræsen: drug specificitet. De fleste lægemidler blev ikke udviklet med honningbier eller andre insekt, i tankerne. På grund af dette, ikke-tilsigtede virkninger er almindelige (fx mianserin, et hvirveldyr serotoninreceptorantagonist 38, blev længe anset for at være et insekt octopaminergic receptorantagonist, men nylige findings viser, at i bier er det også en dopaminerg receptorantagonist 39). En almindelig løsning på dette problem er, i stedet for at forlade sig på kun ét stof, for at gentage det samme eksperiment med en suite af lægemidler, der vides at have målet af interesse tilfælles. Dybest set, hvis flere lægemidler er kendt for at blokere en bestemt mål, observere lignende resultater på tværs af forskellige lægemidler bør lægge større tillid til, at lægemidlet har den forventede effekt, da forskellige lægemidler ofte har unikke off-target profiler.
Det sidste spørgsmål drejer sikre, at lægemidlet handler, hvor det er meningen at handle. I denne forbindelse vil der altid være en afvejning mellem specificitet og invasiv. Systematiske behandlingsmetoder er almindeligvis den mindst invasive, men der er ingen kontrol med, hvor i bi legeme medikamentet har sin virkning. Selv for mikroinjektion af målrettede væv lægemidler kan være vis på hæmolymfe til andre dele af bi kroppen. Hvordan dette spørgsmål behandles needs at blive underrettet af de stillede spørgsmål. For bestemte forsøg anatomiske placering er irrelevant, mens den for andre dette er det eneste spørgsmål om betydning. Den bedste måde at håndtere dette er at starte med systemiske behandlinger og gradvist indsnævre til et anatomisk sted ved anvendelse af stigende mere specifikke metoder. Hvis adfærden blive undersøgt er især uforenelig med invasive behandlingsmetoder, kan det være værd at forsøge at dekonstruere den til simplere komponenter før gør en hel række forsøg med meget specifikke farmakologiske behandlinger.
Dette problem for lækage stof er endnu mere overdrevet med oral behandling af fritflyvende bier, hvor medicin kan påvirke uden for målgruppen bier. Finsnittere honningbier indsamler nektar i feltet for at bringe tilbage til deres koloni. De vil aflaste hovedparten af deres saccharoseopløsning i hiven efter vender tilbage snarere end absorbere den. I bikuben er det pakket i celler, dehydreret, og lagres som honning. På grund afdette, kan medicin potentielt påvirke uden for målgruppen bier. Med mere specifikke metoder (såsom mikroinjektioner) dette problem er minimeret.
Med disse forbehold in mente, og behandles korrekt, kan neurofarmakologiske manipulation af honningbier være et meget kraftfuldt værktøj. Mens transgene værktøjer er ved at blive udviklet til honningbier 15, på grund af deres sociale livsstil er det usandsynligt, at transgene nogensinde vil være en nem og pålidelig måde at gennemføre den slags eksperimenter. Det er derfor sandsynligt, at farmakologi fortsat vil være et vigtigt element i bi forskning i fremtiden. Mens nogle bi forskere har foretaget opkald til standardiserede eksperimentelle metoder 40, i dette tilfælde det ville være en fejltagelse. En del af kraften i bi-systemet har altid været mangfoldigheden af eksperimentelle metoder, og hvordan teknikker er blevet udviklet med rigtige biologiske spørgsmål i tankerne snarere end den anden vej rundt. Det er ikke desto mindre vigtigt, at vi sikrerbrug af den mest hensigtsmæssige metode til spørgsmålet ved hånden. Hvis sammenligninger til tidligere undersøgelser er nøglen, skal standardiserede protokoller følges nøje. Men at udnytte etablerede protokol af hensyn til ved hjælp af standardiserede metoder må ikke få lov til at stå i vejen for udviklingen af nye metoder, der kan åbne nye eksperimentelle muligheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B.
- Søvik, E., Barron, A. B.
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662 (2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282 (2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P.
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288 (2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529 (2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
