Summary
בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.
Abstract
לקולטנים מצויים בתאי T (TCRs) משמשים קליני לכוון את הספציפיות של תאי T למקד גידולים כמו אופנות מבטיחות של אימונותרפיה. לכן, שיבוט TCRs הספציפית אנטיגנים סרטניים הקשורים שונים הייתה המטרה של מחקרים רבים. כדי לעורר תגובה של תאי T אפקטיבי, TCR חייב להכיר אנטיגן היעד עם זיקה אופטימלית. עם זאת, שיבוט כזה TCRs כבר אתגר ורבים זמין TCRs להחזיק זיקה תת אופטימלית עבור אנטיגן מאותו מקור. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה של שיבוט דה נובו זיקה גבוהה TCRs אנטיגן ספציפי באמצעות TCRs הקיים תוך ניצול מרכזיות hemichain. זה ידוע כי עבור חלק TCRs, כל TCRα או hemichain TCRβ לא לתרום באופן שווה הכרת אנטיגן, ואת hemichain הדומיננטי הוא המכונה hemichain הממוקדת. הראינו כי על ידי התאמת hemichain הממוקדת עם שרשרות דלפק שונות מדלפק השרשרת המקורית, אנו מסוגלים לשמור על אנטיגן specificity, תוך ויסות כוח האינטראקציה שלה עבור אנטיגן מאותו מקור. לפיכך, את הפוטנציאל הטיפולי של TCR נתון ניתן לשפר על ידי אופטימיזציה של זיווג בין hemichains ממוקדת הדלפק.
Introduction
לקולטנים המצויים בתאי T (TCRs) הם קולטנים החיסונית heterodimeric אדפטיבית שהביעו לימפוציטים מסוג T, מורכבת שרשרת TCRα ו TCRβ. הם מופקים באמצעות התארגנות סומטיים של V (D) קטעי גן J, המייצר רפרטואר מגוון מאוד מסוגל לזהות תצורות כמעט בלתי מוגבלות של מתחמי HLA / פפטיד. מבחינה קלינית, תאי T שהונדסו ספציפיים TCRs clonotypic עבור אנטיגנים גידולים הקשורים הוכיחו יעילות במגוון סוגי סרטן 1. עם זאת, רבי TCRs משובט למטרה זו חסרה זיקה מספקת את האנטיגן של עניין, מגבילות מריחות הטיפולית שלהם.
כאן, אנו מתארים שיטה להתגבר על מגבלה זו על TCRs הקיים תוך ניצול-מרכזיות שרשרת. זה כבר דווח כי hemichain אחד TCR יכול לשחק תפקיד דומיננטי יותר לאות הוקרה על האנטיגן היעד 2, כאן כינה מרכזית. ניתוחים מבניים קריסטל הראו כי ממוקד אחדhemichain של TCR יכול להסביר את רוב טביעת הרגל על פפטיד MHC / 3,4 המורכב. תוך שימוש בקונספט זה, שהראנו בעבר כי SIG35α TCRα תוכל לשייך את רפרטואר מגוון של שרשראות TCRβ ולתחזק תגובתיות כנגד פפטיד MART1 27-35 שהציג HLA-A2 5. תוצאות דומות התקבלו עם TAK1 TCR, שבו hemichain TCRβ ממוקדת זיווג עם שרשראות TCRα שונים ומתוחזק תגובתיות לייצור הפפטיד WT1 235-243 שהציג HLA-A24 6. שניהם MART1 ו WT1 הם אנטיגנים גידולים הקשורים. שרשרת-מרכזיות יושמה גם ללמוד ההכרה אנטיגן של הרוצח הטבעי משתנה-מוגבל CD1d (iNKT) TCRs, על ידי הצמדת שרשרת Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα משתנה של TCRs iNKT אדם עם 7 שרשראות Vβ11 TCRβ שונים.
בכל המקרים, הצלחנו ליצור רפרטואר דה נובו של TCRs על ידי טרנסמחוללות hemichain TCR ממוקדת לתאי T דם היקפיים, שבו hemichain הציג לזווג עם TCRα אנדוגני או נגד רשתות TCRβ. בעיקרו של דבר, hemichain הממוקדת משמשת פיתיון שיכול לשמש לזיהוי נגד השרשרות המתאימות, אשר כאשר לזווג יחד יוצרות TCRs המקיים את הספציפיות אנטיגן של עניין, עדיין משתנות זיקה. ברפרטואר הרומן אלה, הצלחנו לבודד TCRs clonotypic עם כוח אינטראקציה משופרת נגד אנטיגן היעד לעומת TCRs קיימים. לכן, אנו מאמינים בשיטה זו תאיץ את צנרת זיהוי TCRs האופטימלי עבור יישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת retroviral לבנות קידוד TCR Hemichain עניין
- Linearize וקטור PMX לאפשר החדרה של גנים TCR בשלבים הבאים. לעכל את ה- DNA פלסמיד עם אנזימי הגבלה EcoRI ו NotI ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (טבלה 1) 8.
- לבצע אלקטרופורזה של פלסמיד מתעכל על 1.2% ג'ל agarose. להקה ובלו של כ -4,500 זוגות בסיסים (bps), ו elute ב 30 μl מים סטריליים באמצעות ערכות חילוץ ג'ל זמינות מסחרי 9.
- פריימרים עיצוב 5 'ו 3' עבור הגן TCR של עניין כי גם לקודד 15-20 bps חופפים באתר העיכול EcoRI ו NotI של וקטור PMX, בהתאמה 8.
- להגביר גן TCR עם פריימרים. לבצע אלקטרופורזה של מוצר ה- PCR הלהקה elute של כ -1,000 bps כמתואר בשלב 1.2.
- Clone גן TCR לתוך וקטור מתעכל על ידי שילוב כל שבר ליניארי עם פלסמיד זמין מסחריהרכבת מיקס מאסטר מגיב דוגר על 50 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
הערה: עיין הפרוטוקול של היצרן עבור כרכים יחסיים של כל רכיב. שיטת ההרכבה זה מבוסס על הטכניקה המתוארת במקור על ידי גיבסון et al. 10. - (אופציונלי) הגן תג TCR לציון transduced תאים עם בגרסה מקוצרת של קולטן גורם הגדילה העצבי האדם (ΔNGFR, חומצות אמינו 1-277) 11 מופרדות האתר מחשוף furin, מקשר גליצין-סרין, ו 2A רצפים 12,13. רצפים קידוד פריימרים עיצוב חופפים את הקצוות שבר ולהרכיב פלסמיד כמתואר בשלבים 1.3-1.5.
הערה: אלה רצפים ניתן למצוא אזכור 11-13. - Transform כימי המוסמכות E. coli עם פלסמיד התאסף באי הפרוטוקול של יצרן 14. זרע טרנספורמציה חיידקים על צלחות אגר (20 מ"ג / מרק lysogeny מ"ל (LB), 15 מ"ג / מ"ל אגר, ו 1 מיקרוגרם / אמפיצילין מ"ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. תרבות מושבה חיידק יחיד 50 מ"ל של מדיום LB (20 מ"ג / מ"ל LB ו 1 מיקרוגרם / אמפיצילין מ"ל) במשך 16 שעות בתוך חממה רועד ב 37 ° C ו -200 סיבובים לדקה.
- לטהר פלסמידים באמצעות ערכות midiprep זמינות המסחרי הבאות הפרוטוקול של היצרן. לדלל פלסמיד ריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl.
הערה: פרוטוקול הטיהור פלסמיד מבוסס על שיטת חילוץ אלקליין 15.
2. יצירת שורת תאי אריזה יציבה
הערה: שניהם 293GPG ו PG13 תאים חסידים. תאי תרבות הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום עובר עגל 10% (FCS) ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. תרבות תאי 293GPG עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין לפני transfection. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בין כל השלבים.
- Transfect 293GPG אריזה תאים 16 בתרבית בבקבוק T75 עם וקטור hemichain קידוד שהושגו בשלב 1.9, using מגיב transfection זמין בעקבות פרוטוקול 1 7 של היצרן מסחרי. הערה: תאים Transfect 293GPG ב 50-60% confluency.
- לשאוב בינוני עבור 293GPG תאים ולהוסיף 10 מ"ל של transfection פוסט יום בינוני 1 טרי DMEM.
- קציר מיוצר וירוס זמני מתאי 293GPG טרנספקציה 2 ימים לאחר שלב 2.2 באמצעות העברת בינוני תרבות מזרק עובר דרך 0.45 מיקרומטר הסינון.
הערה: וירוס ניתן להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי. - תרבות 1 x 10 5 PG13 תאי בקבוק T25. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. אחרי יום אחד, בינוני תרבות לשאוב ולהוסיף 1.5 מ"ל של וירוס 293GPG הנגזרות משלב 2.3 ו -1.5 מ"ל DMEM בינוני, יחד עם 8 מיקרוגרם / מ"ל של polybrene.
- שינוי המדיום כמתואר בשלב 2.4 פעם ביום במשך 4 ימים, להקים רטרו-וירוס לייצר קו תא אריזת PG13 יציב קידוד hemichain עניין TCR.
- לשאוב בינוני ולהחליףעם מדיום DMEM טרי עבור שורות תאי PG13 24 שעות לאחר ההדבקה האחרונה לתרבות נוספת.
הערה: להקפיא או תת-תרבות תאים על ידי ניתוק עם 0.05% טריפסין-EDTA פתרון. - כדי לייצר וירוס שורות תאים transduced PG13, תרבות 2 x 10 6 תאים T75 בקבוקון עם 10 מ"ל DMEM בינוני, ווירוסים הקציר כמתואר בשלב 2.3 שלושה ימים לאחר זריעת התאים.
הערה: וירוס עדיף להשתמש מיד אבל יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים.
3. הפעלה ו התמרה של תאים האנושיים T
הערה: דגימות אדם מתקבלות ומשומשות בהתאם הפרוטוקולים שאושרו בועדת אתיקה של מוסד רפואי. תאים אנושיים העיקרי תרבות במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני בתוספת 10% נסיוב אדם במקום FCS ו -50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בין כל השלבים.
- לבודד תאי הדם היקפי mononuclear אדם (PBMC) על ידי צפיפותהפרדת שיפוע הבא הפרוטוקול של יצרן 18.
- הפעל תאי T לגרום התפשטות הנדרשת זיהום retroviral. תרבות 2 x 10 7 PBMC טרי או מופשר היטב לכל צלחת 6-היטב, ב 5 מ"ל של מדיום RPMI עם 100 IU / ml-2 interleukin אנושי רקומביננטי (rhIL-2) ו -50 ng / ml של נוגדנים חד שבטיים אנטי CD3 (שיבוט OKT3).
- שלושה ימים שלאחר גירוי, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. בטל supernatant וזרעי 0.5-1 x 10 6 T תאים לכל היטב צלחת 24 גם resuspended ב 1 מ"ל של וירוס PG13 משלב 2.7, ו 1 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 200 IU / ml של rhIL-2. צלחת צנטריפוגה XG ב 1000 ו -32 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לאחר 24 שעות, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. מחק תאים supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של וירוס PG13 משלב 2.7, ו 1 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 200 IU / ml של rhIL-2. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 6 להדביקיונים.
הערה: מספר הזיהומים צריך להיות מותאם בהתאם כייל של וירוס המיוצר על ידי אריזות קו סלולארי. במידת הצורך, מעבר בתאי T על ידי הסרת 20-30% של תאים בכל יום כדי למנוע צמיחת יתר. - 24 שעות לאחר ההדבקה האחרונה, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. מחק תאים supernatant ו resuspend במדיום RPMI עם 100 IU / ml של rhIL-2 לתרבות נוספת.
- 2-3 ימים לאחר שלב 3.5, תאי T הכתם עם multimer HLA על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז אנטי אנושי CD3 ו נוגדנים חד שבטיים לקולטן שיתוף (מבז) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לנתח ידי cytometry הזרימה. השתמש multimer הרלוונטי ו / או תאי untransduced שולט שלילי (איור 1 - 3) 19.
- אם hemichain ממוקדת הציג הינה רשת TCRα, ולנתח את השימוש Vβ של תאים חיוביים דה נובו multimer באמצעות זמינים מסחרית לוח נוגדן Vβ ספציפי על ידי זרימת cytometry 20.
4. שיבוט דה נובו TCR מתפרצות hemichains
- מיין האוכלוסייה החיובית דה נובו multimer בשלב 3.6 ידי מיון תא בסיוע זרימה.
- לבודד RNA מן תאים ממוינים T בשיטת החילוץ פנול, כלורופורם thiocyanate guanidinium חומצה 21,2 2.
הערה: RNA יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, אך צריך לשמש כדי ליצור cDNA בהקדם האפשרי. - לסנתז ספריית cDNA מ- RNA חילוץ באמצעות ערכות transcriptase-PCR הפוך זמינים מסחרית הבאים פרוטוקול של היצרן 23,24.
- אם שיבוט נגד רשתות TCRβ, לעצב גן Vβ ו פריימרים ספציפיים באזור קבוע TCRβ, כפי שנקבע בשלב 3.7, ולשכפל באורך מלא TCRβ גנים כמתואר בשלבים 1.3-1.9. ראה שלב 4.5 אם נגד שרשרת היא TCRα, אחרת המשך לשלב 5.1.
- זמין מסחרי נוגדני Vα הספציפיים מוגבלים, כך ששימוש גן Vα לא יכולשייקבע על ידי cytometry הזרימה. Clone TCRα נגד רשתות באמצעות הגברת 5'-מהירה של קצות cDNA (RACE) 25, באמצעות זמינים מסחריים 5 'RACE ערכות 6.
- לסנתז 5 'cDNA RACE התואם מ- RNA שחולץ בשלב 4.2 באי הפרוטוקול של היצרן.
- בצע -1 עגול PCR כמתואר בטבלה 2.
- לבצע אלקטרופורזה של מוצר PCR ו elute להקה של כ -1,100 bps, כמתואר בשלב 1.2.
- בצע 2 nd עגול PCR כמתואר בטבלה 3, באמצעות 1 מוצר PCR עגול רח כתבנית.
הערה: רצפים פריימר לראות תחת טבלה 3 תוכננו עבור שיבוט לתוך EcoRI ו NotI מתעכל וקטור PMX. - לבצע אלקטרופורזה של מוצר PCR ו elute להקה של כ -1,000 bps, כמתואר בשלב 1.2.
- גני Clone TCRα לתוך EcoRI ו NotI מתעכלים וקטור PMX ו פורהפלסמידים פ.י. כמתואר בשלבים 1.5-1.9.
5. רומן reconstituting אנטיגן ספציפי המשובטים TCR
הערה: תרבות Jurkat 76 תאים שורות תאים עוקבות במדיום RPMI בתוספת 10% FCS ו -50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בין כל השלבים.
- Transduce Jurkat 76 תאים 26 (או שווה ערך TCR - / - שורת תאי T אנושית) עם hemichain TCR הממוקד באמצעות וירוס 293GPG מיוצר בשלב 2.3. לקבלת Jurkat 76, זרע 5 x 10 4 תאים לכל היטב צלחת 24 גם עם 1 מ"ל של וירוסים 1 מ"ל של מדיום RPMI. צלחת צנטריפוגה XG ב 1000 ו -32 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- 24 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף Jurkat transduced hemichain 76 תאים על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. בטל supernatant ו resuspend במדיום RPMI טריים לתרבות נוספת.
- לטהר תאי transduced אם hemichain מולקולרית ניתן מתויג 2-3 ימים לאחר שלב 5.2, על ידי כתםing עם fluorophore מצומדות אנטי NGFR מב ואחריו בסיוע זרימה או תא מגנטי בסיוע מיון (אופציונלי) 27.
- בעקבות צעדים 2.1 כדי 2.3, לייצר וירוס 293GPG קידוד נגדי שרשרת TCR משובטת צעדים 4.4 או 4.5.
- להקים מחדש את TCR מלא, transduce שורת תאי T ביציבות המבטא את שנוצרה TCR hemichain הממוקדת בצעדים 5.1-5.3 באמצעות וירוס משלב 5.4. בצע התמרה כמתואר בשלבים 5.1-5.2.
- לטהר CD3 + transfectants באמצעות מיון התא מגנטי בסיוע אנטי CD3 הבאים פרוטוקול של היצרן, 2-3 ימים לאחר שלב 5.5 27.
- כדי לאמת סגוליות אנטיגן, להכתים את transfectants להביע TCRs clonotypic מורכב hemichain TCR ממוקדת זיווג עם-שרשראות הדלפק שונים, עם אנטי CD3 ו / או מבז קולטן שיתוף, ו- HLA multimer, 3-5 ימים שלאחר טיהור CD3. לנתח תאים על ידי cytometry זרימה (איור 4 - 5) 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ללא ידע מוקדם של אשר hemichain הוא שרשרת ממוקדת, שרשרת TCRα ו TCRβ צריך להיות משובטים בנפרד transduced לתאי T בדם ההיקפי, אשר נעשה במקרה של HLA-A24 / WT1 תגובתי TAK1 TCR (איור 1). תמרה של TAK1β ניב תדירות ניכר גבוהה של תאי T אנטיגן ספציפי. לעומת זאת, תמרה של hemichain הלא ממוקד לא תניב דה נובו multimer תאי T החיוביים, כפי שראה עם שרשרת TAK1α (איור 1). במהלך ניתוח, שער על תאי NGFR + אם גן TCR תויג לאבחון תאי transduced במיוחד (איור 1 - 2). מצד שני, את hemichain אחת ממוקדת ניתן transduced אם ידוע להיות דומיננטי, למשל SIG35α ורשתות Vα24 TCRα משתנה (איור 2 ו -3). T תאים ספציפיים עבור cogn בהתאמהאכול אנטיגן גדל בתדירות על תמרה של hemichain TCRα ממוקד. (איור 2 - 3). יחד, נתונים אלה מדגימים הקדמה לזה של hemichain TCRα או TCRβ ממוקד לתאי T דם היקפיים יכול ליצור דה נובו TCRs עם האנטיגן-הסגולי של עניין.
האוכלוסייה אנטיגן ספציפי ניתן למיין לפי התא זרימה בסיוע מיון hemichains TCR ניתן לשכפל כמתואר בסעיף פרוטוקול 4. נגד רשתות Clonotypic TCR ניתן מחדש בנפרד על קו תא T ביציבות המבטא את hemichain ממוקדת. Jurkat 76 transfectants, להביע משובטים חדשים TCRs הייחודי TAK1β או SIG35α ממוקד תאי T transduced hemichain, דיבוק משתנה להיטות האנטיגן מאותו מקור בהתאמה, כפי שנקבע על ידי HLA / פפטיד multimer מכתים 5,6. באופן ספציפי, הצלחנו לבודד דה נובו TCRα נגד רשתות tכובע כאשר יחד עם TAK1β הוכתמו או נמוך או בעוצמה גבוהה יותר על ידי המתחם אנטיגן WT1 מאשר זיווג TAK1αβ הורית (איור 4). באופן דומה, SIG35α זיווג עם-שרשרות דלפק ייחודיות מוכר HLA-A2 / MART1 בינונית עד גבוהה להיטות (איור 5). SIG35α שובט עצמאי של heterodimer 5 TCRαβ, ולכן זיווג הורי hemichain זה לא היה זמין להשוואה. חשוב לציין, נתונים אלה מצביעים על כך אפשר לווסת את הזיקה עבור אנטיגן היעד על ידי התאמת hemichain הממוקדת עם שרשרות דלפק שונות.
איור 1:. TAK1β כדוגמה HLA-מוגבל TCRβ ממוקדת hemichain TCRα או TCRβ hemichains של HLA-A24 / WT1 תגובתי TAK1 TCR תויגה עם rece גורם הגדילה העצבי קטוםptor (ΔNGFR), וכל אחד לחוד transduced לתאי T בדם ההיקפי. Transfectants הוכתמו PC5 מצומדות אנטי CD8 (133x מדולל) ו FITC- מצומדות אנטי NGFR (20x מדולל) נוגדנים חד שבטיים (מבז), והצביע HLA-A24 multimer (5 מיקרוגרם / מ"ל), בעקבות שני פעמים אנטיגן ספציפי גְרִיָה. סה"כ 6 תורמים נבדקו. כל הנתונים היו מגודרים על תאי NGFR +. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. SIG35α כדוגמה HLA-מוגבל TCRα ממוקדת hemichain שרשרת SIG35α TCRα מתוייגים עם ΔNGFR, או תג לבד, היה transduced לתאי T בדם ההיקפי. Transfectants הוכתם-שיתוף PC5njugated אנטי CD8 (133x מדולל) ו FITC- מצומדות אנטי NGFR (20x מדולל) מבז, והצביע multimer HLA-A2 (8 מיקרוגרם / מ"ל). סה"כ 4 תורמים נבדקו. כל הנתונים היו מגודרים על תאי NGFR +. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 5 (זכויות יוצרים 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. הרג טבעיים קבועים T (iNKT) תא קולטן Vα24 (Vα24i) כדוגמה hemichain ממוקדת TCRα-מוגבל CD1d שרשרת Vα24i TCRα היה transduced לתאי T בדם ההיקפי. Transfectants הוכתמו FITC מצומדות אנטי CD3 (20x מדולל) מב והצביע CD1d multimer (5 מיקרוגרם / מ"ל). CD1d פרק מוlecules הופק מתאי HEK293 ו-ליפידים עצמיים ידועים נוכחיים אנדוגני. iNKT TCR מוגדר על ידי הכרה CD1d הצגת α-GalCer או אנלוגי שלה PBS-57. סה"כ 4 תורמים נבדקו. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: נציג TCRα נגד רשתות משובטים TAK1β transduced תאי T T262 שיבוטים TCRα, A262, A186, A133, ו- T4 היו משובטים מן HLA-A24 / WT1 multimer חיובית transduced TAK1β תאים היקפיים T, וכל אחד לחוד מחדש על Jurkat 76 תאים. להביע CD8, יחד עם שרשרת TAK1β. Transfectants הוכתמו מב CD8 אנטי PC5 מצומדות (133x מדולל) והצביע HLA-A24multimer (5 מיקרוגרם / מ"ל). נתונים מייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. ברי שגיאה מצביעים מגוון. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: נציג TCRβ נגד רשתות משובטים SIG35α transduced תאי T שיבוטים TCRβ 413, 523, 788, 1086, 794, ו 830 היו משובטים מן HLA-A2 / MART1 multimer תאי T היקפי חיובית transduced SIG35α, ומשוחזר בנפרד על Jurkat. 76 תאים המבטאים CD8, יחד עם שרשרת SIG35α. DMF5 היה TCR זיקה גבוהה משובט בעבר הכרת HLA-A2 / MART1. Transfectants הוכתמו מב CD8 אנטי PC5 מצומדות (133x מדולל) והצביע multimer HLA-A2 (2 מיקרוגרם / מ 'יב). נתונים מייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. ברי שגיאה מצביעים מגוון. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 5 (זכויות יוצרים 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1:.. ההתקנה לעיכול וקטור PMX ריאגנטים ואמצעי אחסון בהתאמה מוצגים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
טבלה 2: תוכנית ההתקנה של 1 st ה -5 'RACE PCR. ריאגנטים ואמצעי אחסון בהתאמה, הגדרות PCR, ורצף פריימר מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
טבלה 3: תוכנית ההתקנה של 2 nd ה -5 'RACE PCR ריאגנטים ואמצעי אחסון בהתאמה, הגדרות PCR, רצפים פריימר מוצגים.. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדרישה הראשונה עבור יישום מוצלח של שיטה זו היא השיגה יעילות תמרה מספקת של תאי T העיקריים עם hemichain עניין. מניסיוננו, השילוב של שימוש PG13 כמו שורת תאי אריזת PMX כתוצאות וקטור retroviral בביטוי יציב ויעיל של הגן הציג בתאי T עיקריים אדם. תאי אריזות PG13 יכולים להיות משובט מתא בודד כדי לבחור עבור תאי אריזה גבוהה כייל כדי לשפר את היעילות התמר. יתר על כן, התפשטות של תאי T נדרש גם עבור יעילות התמרה גבוהה על ידי רטרו-וירוס. בפרוטוקול המתואר, גירוי עם OKT3 מב אנטי CD3 מסיס, יחד עם ריכוז גבוה של rhIL-2, מספק אותות ההפעלה הצורכים להשרות חלוקת תא. מונוציטים נדרשים עבור הקיבולת של גירוי OKT3 המסיס, סביר באמצעות קשירה עם קולטנים Fc. לכן, עיקר PBMC, ולא מטוהרים תאי T, נדרש פרוטוקול גירוי ספציפי זה. Tתאים צריכים להיות מתורבתים ב RPMI בתוספת סרום אנושי עבור תוצאות ניסוי אופטימליות. כל התאים האחרים המתוארים כאן יכול להיות מתורבת בנוכחות נסיוב עגל העובר.
שנית, דה נובו שנוצר TCRs אנטיגן ספציפי לבטא בתאי חייב להתגלות. לקבלת hemichains TCR מסוים, כגון TAK1β, דה נובו תאי מבטאי TCR הם רק לזיהוי לאחר גירוי עם תאי אנטיגן-פעם מציגי אנטיגן (נגמ"שים). לכן, אם TCRs אנטיגן ספציפי אינם מזוהים מיד לאחר התמרה של hemichain ממוקדת, הם יכולים להתגלות לאחר הרחבת ידי נגמ"שים. הערה התמרה לזה של hemichain הלא ממוקדת לא תניב דה נובו תאי T אנטיגן ספציפי גם לאחר הרחבת אנטיגן ספציפי עם נגמ"שים, כפי שניתן לראות עם hemichain TAK1α (איור 1). במחקרים שלנו, multimers HLA משמשים לגילוי, לעומת זאת, זה לא יהיה זמין עבור חלק TCRs, במיוחד מלימודי HLA השני המוגבלים TCRים. חלופה תהיה לזהות תגובות התפקודיות של תאי T. Hemichain transduced תאי T יכול להיות מגורה עם נגמ"שים פעמו עם האנטיגן של עניין. נגמ"שים-פעם רכב ותאי T untransduced יכולים לשמש שולטים. בתגובה תא T ניתן לאתר על ידי גברת ביטוי של סמני הפעלת משטח כגון CD107a, CD154, או CD137.
לבסוף, חשוב לאמת כי הרשתות ללא מרשם המשובט אל למעשה להכיר את האנטיגן של עניין כאשר יחד עם hemichain הממוקדת. הדבר חשוב במיוחד כאשר hemichain הממוקדת היא TCRβ שכנגד רשתות הן TCRα, מאז הדרה אללים גני TCRα היא דולפת ההערכה היא כי חלק ניכר של תאים היקפיים αβ T לבטא יותר מאחד TCRα שרשרת 28. תגובתיות ניתן לאשר עם מכתים multimer או למדוד את תגובתו הפונקציונלית לאחר גירוי עם נגמ"שים הצגת אנטיגן מאותו המקור.
limitati אחתעל הטכניקה הזו היא שלא כל TCR יהיה להלחין hemichain ממוקדת, שכן הן TCRα ו TCRβ לתרום וזהובה לאנטיגן הכרה ובמקרים מסוימים 3. לכן, תאי T היקפיים transduced עם hemichains כאלה שאינם ממוקדים לא עשויים להניב דה נובו TCRs אנטיגן ספציפי.
עם זאת, שיטה זו מייצגת התקדמות רעיונית על הגישה המקובלת כדי TCRs שיבוט, שבו שני גני TCRα ו TCRβ חייבים להיות משובטים התאמה נכונה יש להבטיח 29,30. בטכניקה שלנו, זיווג בין hemichains הוא כבר לא דאגה עיקרית ורק אחת מרשתות TCR צריך להיות משובט, בהתחשב בכך שהאחר הוא קבוע. בנוסף לכיתת HLA אני או TCRs-מוגבל CD1d, השיטה המתוארת יכולה לחול גם על הבידוד של כיתת HLA TCRs II-מוגבל עבור ריפוי גנטי TCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
