Summary
Heri vi beskrive en ny fremgangsmåte for å generere antigen-spesifikke T-celle-reseptorer (TCR) etter sammenkobling TCRα eller TCRβ av en eksisterende TCR, som har antigen-spesifisitet av interesse, med komplementære hemichain av den perifere T-cellereseptoren repertoar. De novo generert TCR beholde antigen-spesifisitet med varierende affinitet.
Abstract
T-celle-reseptorer (TCR) anvendes klinisk for å dirigere spesifisiteten til T-celler for å målrette mot svulster som et lovende modalitet av immunterapi. Derfor har klonings TCR som er spesifikke for forskjellige tumorassosierte antigener vært målet for mange studier. For å fremkalle en effektiv T-cellerespons, må den TCR gjenkjenne mål-antigenet med optimal affinitet. Imidlertid har kloning slik TCR vært en utfordring og mange tilgjengelige TCR har sub-optimal affinitet for beslektet antigen. I denne protokollen beskriver vi en metode for å klone de novo høy affinitet antigen-spesifikke TCR eksisterende TCR ved å utnytte hemichain fokus. Det er kjent at for enkelte TCR, trenger hver TCRα eller TCRβ hemichain ikke bidrar like mye til gjenkjenning av antigen, og den dominerende hemichain er referert til som den sentriske hemichain. Vi har vist at ved sammenkobling sentriske hemichain med counter-kjedene som avviker fra den opprinnelige disken-kjeden, er vi i stand til å opprettholde antigenet specificity, mens moduler dets interaksjon styrke for beslektet antigen. Således kan det terapeutiske potensialet for en gitt TCR forbedres ved å optimalisere paring mellom de sentriske og telleren hemichains.
Introduction
T-celle reseptorer (TCR) er heterodimere adaptive immun reseptorer uttrykt av T-lymfocytter, består av en TCRα og TCRβ kjeden. De er generert via somatisk rearrangement av V (D) J gensegmenter, som frembringer en svært mangfoldig repertoar stand til å gjenkjenne nesten ubegrenset konfigurasjoner av HLA / peptid-komplekser. Klinisk har T-celler konstruert for å uttrykke clonotypic TCR spesifikke for tumorassosierte antigener viste effekt i en rekke krefttyper 1. Men mange TCR klonede for dette formål mangle tilstrekkelig affinitet for antigenet av interesse, noe som begrenser deres terapeutiske anvendelse.
Her beskriver vi en metode for å overvinne denne begrensningen for eksisterende TCR ved å utnytte kjede-fokus. Det har blitt rapportert at en TCR hemichain kunne spille en mer dominerende rolle i erkjennelsen av målet antigen 2, her betegnet fokus. Crystal strukturelle analyser har vist at en sentriskhemichain av en TCR kunne stå for mesteparten av fotavtrykk på MHC / peptid kompleks 3,4. Ved hjelp av dette konseptet, har vi tidligere vist at SIG35α TCRα kan pare med et mangfoldig repertoar av TCRβ kjeder og opprett reaktivitet mot MART1 27-35 peptid presentert av HLA-A2 5. Lignende resultater ble oppnådd med den TAK1 TCR, hvor den sentriske TCRβ hemichain paret med ulike TCRα kjeder og opprettholdt reaktivitet for WT1 235-243 peptidet presentert av HLA-A24 6. Både MART1 og WT1 er tumorassosierte antigener. Kjede centricity ble også brukt til å studere antigen anerkjennelse av CD1d-bundne invariante natural killer (INKT) TCR, ved sammenkobling invariant Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα kjede av menneskelige INKT TCR med ulike Vβ11 TCRβ kjedene 7.
I alle tilfeller, vi var i stand til å generere en de novo repertoar av TCR av transducing den sentriske TCR hemichain til perifert blod T-celler, hvor det innføres hemichain forbundet med den endogene TCRα eller TCRβ counter-kjedene. I hovedsak fungerer den sentriske hemichain som et agn som kan brukes til å identifisere de passende counter-kjeder, som når paret sammen danner TCR som opprettholder den antigenet spesifisiteten av interesse, men som varierer i affinitet. Fra disse nye repertoar, var vi i stand til å isolere clonotypic TCR med forbedret samhandling styrke mot målet antigen i forhold til eksisterende TCR. Derfor tror vi denne metoden vil akselerere rørledningen for å identifisere optimale TCR for klinisk anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klarretroviral Konstruer Encoding TCR Hemichain av interesse
- Linear pMX vektor for å tillate innsetting av en TCR-genet i etterfølgende trinn. Fordøye plasmid DNA med EcoRI og Notl-restriksjonsenzymer ved 37 ° C i 3 timer (tabell 1) 8.
- Utføre elektroforese av det spaltede plasmidet på 1,2% agarosegel. Vesenet band av ca 4500 basepar (bps), og eluatet i 30 mL sterilt vann ved hjelp av kommersielt tilgjengelige gel utvinning kits 9.
- Design 5 'og 3' primere for TCR genet av interesse som også koder for 15-20 bps overlappende EcoRI og NotI fordøyelse side pMX vektor, henholdsvis 8.
- Forsterke TCR genet med primere. Utføre elektroforese av PCR-produktet og elute bånd på omtrent 1000 bp som beskrevet i trinn 1.2.
- Klone TCR gen inn fordøyd vektor ved å kombinere hver lineære fragment med kommersielt tilgjengelig plasmidsammenstilling masterblanding reagens og inkubering ved 50 ° C i 1 time.
MERK: Se produsentens protokoll for relative volumer av hver komponent. Denne sammenstilling metoden er basert på teknikken som opprinnelig er beskrevet av Gibson et al., 10. - (Valgfritt) Tag TCR genet for å markere transduced celler med avkortet form av menneskelig nerve vekstfaktor reseptor (ΔNGFR, aminosyrer 1-277) 11 adskilt av Furin kuttesete, serin-glysin linker, og 2A sekvenser 12,13. Design primere kodende sekvenser som overlapper de fragmentender og montere plasmid som beskrevet i trinn 1,3-1,5.
MERK: Disse sekvensene kan bli funnet i referanser 11-13. - Transform kjemisk kompetente E. coli med montert plasmid følge produsentens protokoll 14. Seed transformerte bakterier på agarplater (20 mg / ml lysogeni buljong (LB), 15 mg / ml agar, og 1 ug / ml ampicillin) og inkuber ved 37 ° C i 18 timer. Kultur en enkelt bakterie koloni i 50 ml LB medium (20 mg / ml LB og 1 ug / ml ampicillin) i 16 timer i en rysteinkubator ved 37 ° C og 200 runder pr min.
- Rens plasmider ved hjelp av kommersielt tilgjengelige midiprep kits følgende produsentens protokoll. Spe plasmid til konsentrasjon på rundt 1 ug / ul.
MERK: Plasmidet renseprotokoll er basert på den alkaliske ekstraksjon metode 15.
2. Generering Stabil emballasje cellelinje
MERK: Både 293GPG og PG13 cellene er tilhenger. Kultur celler i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 50 ug / ml gentamicin. Kultur 293GPG celler med 1 mikrogram / ml tetracyklin før transfeksjon. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO 2 mellom alle trinn.
- Transfektere 293GPG emballasje-celler 16 dyrket i T75-kolbe med hemichain-kodende vektor oppnådd i trinn 1.9, using kommersielt tilgjengelig transfeksjon reagens følge produsentens protokoll 1 7. MERK: transfektere 293GPG celler på 50-60% konfluens.
- Sug medium for 293GPG celler og tilsett 10 ml fersk DMEM medium 1 dag etter transfeksjon.
- Avling transient produsert virus fra transfekterte celler 293GPG 2 dager etter trinn 2.2 ved å overføre kulturmedium for å sprøyte og passerer gjennom 0,45 um filter.
MERK: Virus kan brukes umiddelbart eller oppbevares ved -80 ° C for fremtidig bruk. - Kultur 1 x 10 5 PG13 celler i T25 kolbe. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Etter en dag, aspirate kulturmedium og tilsett 1,5 ml av 293GPG-avledet virus fra trinn 2.3 og 1,5 ml DMEM-medium, sammen med 8 ug / ml polybrene.
- Skift medium som beskrevet i trinn 2.4 en gang per dag i 4 dager, for å etablere stabile PG13 pakkecellelinje som produserer retrovirus som koder for TCR hemichain av interesse.
- Aspirer medium og erstattemed friskt DMEM-medium for PG13 cellelinjer 24 timer etter siste infeksjon for ytterligere kultur.
MERK: Freeze eller sub-kultur celler ved å koble med 0,05% trypsin-EDTA løsning. - For å produsere virus fra transdusert PG13 cellelinjer, kultur 2 x 10 6 celler i T75 kolbe med 10 ml DMEM-medium, og høste-virus som beskrevet i trinn 2.3 tre dager etter utsåing av cellene.
MERK: Virus er best brukt umiddelbart, men kan lagres ved -80 ° C i opptil to måneder.
3. Aktivering og transduksjon av humane T-celler
MERK: Menneske prøvene er innhentet og brukt i samsvar med de institusjonelle etiske komité godkjente protokoller. Kultur primære humane celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplementert med 10% humant serum istedenfor FCS og 50 ug / ml gentamicin. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO 2 mellom alle trinn.
- Isoler humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) av tetthetgradient separasjon etter produsentens protokoll 18.
- Aktivere T-celler for å indusere proliferasjon som kreves for retroviral infeksjon. Kultur 2 x 10 7 fersk eller tinet PBMC per brønn på 6-brønners plate i 5 ml RPMI-medium med 100 IU / ml rekombinant, humant interleukin-2 (rhIL-2) og 50 ng / ml anti-CD3 monoklonalt antistoff (klone OKT3).
- Tre dager etter stimulering, samle T-celler ved pipettering og sentrifuger ved 350 xg i 4 min. Fjern supernatant og frø 0,5-1 x 10 6-T-celler per brønn i 24-brønns plate ble resuspendert i 1 ml av PG13 virus fra trinn 2.7, og 1 ml RPMI-medium supplert med 200 IU / ml av rhIL-2. Sentrifuger plate ved 1000 xg og 32 ° C i 1 time.
- Etter 24 timer, samle T-celler ved pipettering og sentrifuger ved 350 xg i 4 min. Fjern supernatant og resuspender cellene i 1 ml PG13 virus fra trinn 2.7, og 1 ml RPMI-medium supplert med 200 IU / ml av rhIL-2. Gjenta dette trinnet for totalt seks infisereioner.
MERK: Antall infeksjoner bør optimaliseres avhengig titer av virus produsert av emballasje cellelinje. Hvis det er nødvendig, for å passasje T-celler ved å fjerne 20-30% av cellene hver dag forhindre overvekst. - 24 timer etter den siste infeksjon, samle T-celler ved pipettering og sentrifuger ved 350 xg i 4 min. Kast supernatant og resuspender celler i RPMI medium med 100 IE / ml rhIL-2 for videre kultur.
- 2-3 dager etter trinn 3.5, flekk T-celler med HLA-multimer ved 4 ° C i 30 min, deretter ble anti-human CD3 og ko-receptor-monoklonale antistoffer (mAbs) ved 4 ° C i 15 min. Analyser ved strømningscytometri. Bruk irrelevant multimer og / eller untransduced celler som negative kontroller (Figur 1-3) 19.
- Hvis introdusert sentriske hemichain er en TCRα kjede, analysere vp bruken av de novo multimer positive celler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige vp-spesifikt antistoff panel av flowcytometri 20.
4. Kloning De Novo TCR Kontrings hemichains
- Sorter de novo multimer positiv befolknings i trinn 3.6 av flow-assistert celle sortering.
- Isolere RNA fra sortert T-celler ved hjelp av syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon 21,2 metode 2.
MERK: RNA kan oppbevares ved -80 ° C, men bør brukes til å generere cDNA så snart som mulig. - Syntetisere cDNA bibliotek fra ekstrahert RNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reverse transkriptase-PCR kits følgende produsentens protokoll 23,24.
- Ved kloning TCRβ counter-kjeder, utforme vp-genet og TCRβ konstant regionspesifikke primere, som bestemt i trinn 3.7, og klon i full lengde TCRβ gener som beskrevet i trinnene 1,3-1,9. Se trinn 4.5 om kontra kjeden er TCRα, ellers fortsetter du til trinn 5.1.
- Kommersielt tilgjengelige Vα-spesifikke antistoffer er begrenset, ikke kan således Vα genbehandlingbli bestemt ved flow-cytometri. Clone TCRα counter-kjedene via 5'-rask forsterkning av cDNA ender (RACE) 25, ved hjelp av kommersielt tilgjengelig 5 'RACE kits 6.
- Syntetisere 5 'RACE kompatibel cDNA fra RNA pakket ut i trinn 4.2 etter produsentens protokoll.
- Utfør en st runde PCR som beskrevet i tabell 2.
- Utføre elektroforese av PCR-produktet og eluer bånd på omtrent 1100 bp, som beskrevet i trinn 1.2.
- Utføre 2. runde PCR som beskrevet i Tabell 3, ved hjelp av en st runde PCR-produkt som templat.
MERK: Primer sekvenser vist i Tabell 3 ble utformet for kloning i EcoRI og Noti fordøyd pMX vektor. - Utføre elektroforese av PCR-produktet og eluer bånd på omtrent 1000 bp, som beskrevet i trinn 1.2.
- Clone TCRα gener i EcoRI og Noti fordøyd pMX vektor og puriFy plasmider som beskrevet i trinn 1,5-1,9.
5. rekonstituering Novel Antigen-spesifikke TCR Clones
Merk: Kultur Jurkat 76 celler og etterfølgende cellelinjer i RPMI-medium supplert med 10% FCS og 50 ug / ml gentamicin. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO 2 mellom alle trinn.
- Transduce Jurkat-celler 76 26 (eller tilsvarende TCR - / - human T-cellelinje) med sentrisk TCR hemichain ved hjelp 293GPG virus fremstilt i trinn 2.3. For Jurkat 76, frø 5 x 10 4 celler per brønn i 24-brønns plate med en ml av virus og 1 ml RPMI-medium. Sentrifuger plate ved 1000 xg og 32 ° C i 1 time.
- 24 timer etter infeksjon, samle hemichain transdusert Jurkat 76 celler ved pipettering og sentrifuger ved 350 xg i 4 min. Kast supernatant og resuspender i frisk RPMI medium for ytterligere kultur.
- Rens transduced celler hvis hemichain er molekylært tagget 2-3 dager etter trinn 5.2, ved flekkening med fluorophore konjugert anti-NGFR mAb etterfulgt av flow-assistert eller magnetisk assistert cellesortering (valgfritt) 27.
- Etter trinn 2,1 til 2,3, produsere 293GPG virus som koder for en TCR mot kjeden klonet fra trinn 4.4 eller 4.5.
- For å få fullt rekonstituere TCR, transduce T cellelinje som stabilt uttrykker sentriske TCR hemichain generert i trinn 5,1-5,3 ved hjelp av virus fra trinn 5.4. Utføre transduksjon som beskrevet i trinn 5,1-5,2.
- Rens CD3 + transfektanter bruker anti-CD3 magnetisk-assistert celle sortering følge produsentens protokoll, 2-3 dager etter trinn 5,5 27.
- For å validere antigen spesifisitet, beis transfektanter uttrykker clonotypic TCR består av sentriske TCR hemichain sammen med ulike counter-kjeder, med anti-CD3 og / eller co-reseptor mAbs, og HLA multimer, 3-5 dager etter CD3 rensing. Analyser celler ved flowcytometri (figur 4-5) 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uten forutgående kunnskap om hvilke hemichain er kjede-sentrisk, TCRα og TCRβ kjeden bør være separat klonet og omformet til perifert blod T-celler, som ble gjort i tilfelle av HLA-A24 / WT1 reaktiv TAK1 TCR (figur 1). Transduksjon av TAK1β ga en merkbart høyere frekvens av antigen-spesifikke T-celler. Motsatt, transduksjon av en ikke-sentrisk hemichain ville ikke gi de novo-multimer positive T-celler, som vist med TAK1α kjede (figur 1). Under analysen, gate på NGFR + celler hvis TCR-genet ble merket for å analysere spesifikt transduserte celler (figur 1 - 2). På den annen side kan den ene sentriske hemichain skal omformes hvis den er kjent for å være dominerende, for eksempel SIG35α og invariante Vα24 TCRα kjeder (figur 2 og 3). T-celler som er spesifikke for den respektive cognspiste antigen økt i hyppighet ved transduksjon av en sentrisk TCRα hemichain. (Figur 2 - 3). Sammen utgjør disse data viser at innføringen av en sentrisk TCRα eller TCRβ hemichain til perifere blod T-celler kan generere de novo TCR med det antigen-spesifisitet av interesse.
Antigen-spesifikk populasjon kan sorteres ved flow-assistert cellesortering og TCR hemichains kan klones som beskrevet i protokollen seksjon 4. Clonotypic TCR-mot-kjedene kan være individuelt rekonstituert på en T-cellelinje som stabilt uttrykker den sentriske hemichain. Jurkat 76 transfektanter, uttrykker nylig klonet unike TCR fra TAK1β eller SIG35α sentriske hemichain transduced T-celler, besatt varierende avidity for den respektive beslektet antigen, som bestemmes av HLA / peptid multimer flekker 5,6. Spesielt var vi i stand til å isolere de novo TCRα counter-kjeder tlue da sammen med TAK1β ble farget med enten lavere eller høyere intensitet av WT1 antigen kompleks enn foreldre TAK1αβ sammenkobling (figur 4). Tilsvarende SIG35α sammen med unike counter-kjedene anerkjent HLA-A2 / MART1 med moderat til høy aviditet (figur 5). SIG35α ble klonet uavhengig av en TCRαβ heterodimer 5, derfor en foreldre sammenkobling for dette hemichain var utilgjengelig for sammenligning. Viktigere, disse dataene indikerer at det er mulig å modulere affinitet for målantigenet ved sammenkobling sentriske hemichain med ulike counter-kjedene.
Figur 1:. TAK1β som et eksempel på HLA-bundne TCRβ sentriske hemichain TCRα eller TCRβ hemichains av HLA-A24 / WT1 reaktiv TAK1 TCR ble merket med avkortet nervevekstfaktor receptor (ΔNGFR), og individuelt omformet til perifert blod T-celler. Transfektanter ble farget med PC5-konjugert anti-CD8 (133x fortynnet) og FITC-konjugert anti-NGFR (20x fortynnet) monoklonale antistoffer (mAbs), og indikerte HLA-A24-multimer (5 ug / ml), etter to ganger antigen-spesifikke stimulering. Totalt 6 donorer ble testet. Alle data ble separert på NGFR + celler. Figur re-trykt med tillatelse fra referanse seks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: SIG35α som et eksempel på HLA-begrenset TCRα sentriske hemichain SIG35α TCRα kjede merket med ΔNGFR, eller merkelappen alene, ble transdusert til perifere blod-T-celler. Transfektanter ble farget med PC5-conjugated anti-CD8 (133x fortynnet) og FITC-konjugert anti-NGFR (20x) fortynnet mAbs, og indikerte HLA-A2-multimer (8 ug / ml). Totalt 4 donorer ble testet. Alle data ble separert på NGFR + celler. Figur re-trykt med tillatelse fra referanse 5 (Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc.). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Invariant natural killer T (INKT)-cellereseptoren Vα24 (Vα24i) som et eksempel på CD1d begrensede TCRα sentriske hemichain Vα24i TCRα kjeden ble transdusert til perifere blod-T-celler. Transfektanter ble farget med FITC-konjugert anti-CD3 (20x fortynnet) mAb og indikerte CD1d multimer (5 ug / ml). Losset CD1d molecules ble produsert fra HEK293 celler og presentere endogene ukjente selv lipider. INKT TCR er definert av anerkjennelse av CD1d presentere α-GalCer eller dens analoge PBS-57. Totalt 4 donorer ble testet. Figur re-trykt med tillatelse fra referanse 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant TCRα counter-kjedene klonet fra TAK1β transduced T-celler TCRα kloner T262, A262, A186, A133, og T4 ble klonet fra HLA-A24 / WT1 multimer positive TAK1β omsatte perifere T-celler, og individuelt tilberedt på Jurkat 76 celler. uttrykker CD8, sammen med TAK1β kjeden. Transfektanter ble farget med PC5-konjugert anti-CD8 mAb (133x utvannet) og indikerte HLA-A24multimer (5 ug / ml). Dataene er representative to uavhengige forsøk. Feilfelt angir rekkevidde. Figur re-trykt med tillatelse fra referanse seks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representant TCRβ counter-kjedene klonet fra SIG35α transduced T-celler TCRβ kloner 413, 523, 788, 1086, 794, og 830 ble klonet fra HLA-A2 / MART1 multimer positiv SIG35α transduced perifere T-celler, og individuelt tilberedt på Jurkat. 76 celler som uttrykker CD8, sammen med SIG35α kjeden. DMF5 var en tidligere klonet høy affinitet TCR gjenkjenner HLA-A2 / MART1. Transfektanter ble farget med PC5-konjugert anti-CD8 mAb (133x utvannet) og indikerte HLA-A2 multimer (2 mikrogram / ml). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. Feilfelt angir rekkevidde. Figur re-trykt med tillatelse fra referanse 5 (Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc.). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1:.. Oppsett for pMX vektor fordøyelsen Reagenser og respektive volumer vises Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 2: Oppsett for en st rundt 5 'RACE PCR. Reagenser og respektive volumer, PCR innstillinger og primer sekvens vises. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 3: Oppsett for 2. runde 5 'RACE PCR reagenser og respektive volumer, PCR innstillinger og primer sekvenser vises.. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første forutsetning for vellykket bruk av denne fremgangsmåte er å oppnå tilstrekkelig effektivitet transduksjon av primære T-celler med den hemichain av interesse. Etter vår erfaring er kombinasjonen av å bruke PG13 som pakkecellelinje og pMX som retrovirale vektor resulterer i stabil og effektiv ekspresjon av det innførte gen i humane primære T-celler. PG13 emballasje celler kan være enkelt-celle klonet for å selektere for høy-titer pakkingscellene for å forbedre effektiviteten transduksjon. Videre er proliferasjon av T-celler også nødvendig for høy transduksjon effektivitet av retrovirus. I den beskrevne protokoll, stimulering med løselig anti-CD3 mAb OKT3, sammen med høye konsentrasjoner av rhIL-2, gir de nødvendige aktiveringssignaler for å fremkalle celledeling. Monocytter er nødvendig for den stimulerende kapasitet av løselig OKT3, sannsynligvis ved binding til Fc-reseptorer. Derfor bulk PBMC, og ikke rensede T-celler er nødvendig for denne stimulering protokollen. Tcellene skal være dyrket i RPMI supplert med humant serum for optimale forsøksresultater. Alle andre celler som er beskrevet her kan bli dyrket i nærvær av føtalt kalveserum.
For det andre må de novo generert antigen-spesifikke TCR uttrykker cellene være synlig. For visse TCR hemichains, slik som TAK1β, de novo TCR-uttrykkende celler er bare påvises etter stimulering med antigen-pulset antigen-presenterende celler (APC). Dermed, hvis antigen-spesifikke TCR ikke oppdages umiddelbart etter transduksjon av sentrisk hemichain, kan de være påvisbar etter ekspansjon av APC. Legg merke til at transduksjon av en ikke-sentrisk hemichain ville ikke gi de novo antigen-spesifikke T-celler, selv etter antigen-spesifikk utvidelse med APC-ene, som vist med den TAK1α hemichain (figur 1). I våre studier, er HLA multimerer brukes for deteksjon, men dette kan ikke være tilgjengelig for noen TCR, spesielt HLA klasse II begrenset TCRs. Et alternativ vil være å påvise T-celle-funksjonelle responser. Hemichain transdusert T-celler kan stimuleres med APC pulsert med antigenet av interesse. Kjøretøy-pulset APCer og untransduced T-celler kan bli anvendt som kontroller. Responderende T-celler kan påvises ved oppregulering av overflateaktiveringsmarkører som CD107a, CD154 eller CD137.
Endelig er det viktig å validere at klonede counter-kjedene gjør faktisk gjenkjenne antigen av interesse når paret med sentriske hemichain. Dette er spesielt viktig når sentriske hemichain er TCRβ og counter-kjedene er TCRα, siden allel eksklusjon for TCRα gener er lekk, og det er anslått at en betydelig del av perifere αβ T-celler uttrykker mer enn en TCRα kjede 28. Reaktivitet kan bekreftes med multimer flekker eller måle funksjonell respons etter stimulering med APC presentere beslektet antigen.
en limitatipå med denne teknikken er at ikke alle TCR vil komponere en sentrisk hemichain, ettersom både TCRα og TCRβ bidra forhold til antigen gjenkjennelse i noen tilfeller 3. Derfor kan perifere T-celler transdusert med slike ikke-sentrisk hemichains ikke gi de novo antigen-spesifikke TCR.
Likevel representerer denne metoden en konseptuell avansement på den konvensjonelle tilnærmingen til kloning TCR, hvor både TCRα og TCRβ gener skal klones og riktig sammenkobling må sikres 29,30. I vår teknikk, er sammenkoblingen mellom hemichains ikke lenger er et hovedanliggende og bare en av de TCR-kjedene må klones, gitt at den andre er fast. I tillegg til HLA-klasse I eller CD1d fattig TCR, kan den beskrevne fremgangsmåten også bli brukt til isolering av HLA klasse II-begrenset TCR for TCR genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
