Summary
Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.
Abstract
T hücre reseptörleri (TCR'ler) immünoterapi gelecek vaat eden bir yöntem olarak tümör hedef T hücrelerinin özgüllük doğrudan klinikte kullanılmaktadır. Bu nedenle, çeşitli tümörle birleşmiş antijenler için spesifik klonlama TCRler birçok çalışma hedefi olmuştur. etkili bir T hücresi tepkisi ortaya çıkarmak için, TCR uygun afinite ile hedef antijeni tanımalıdır. Ancak, klonlama gibi TCR'ler bir meydan okuma ve birçok kullanılabilir TCR'ler olmuştur soydaş antijen sub-optimal yakınlığa sahip olmuştur. Bu protokol, hemichain flubelerde yararlanarak mevcut TCRler kullanılarak de novo, yüksek afinite antijen spesifik TCRlerin klonlanması için bir yöntem tarif eder. Bazı TCRler için, her TCRα ya TCRβ hemichain antijen tanınması eşit katkı anlaşılana ve baskın hemichain merkezli hemichain olarak adlandırılır. Biz orijinal karşı zincirinden farklı karşıt zincirleri ile merkezli hemichain eşleştirme, biz antijen s korumak mümkün olduğunu göstermiştirpecificity, aynı kökenli bir antijen için etkileşimi gücünü modüle ederken. Bu nedenle, belirli bir TCR'nin terapötik potansiyeli merkezli ve karşı hemichains arasında eşleşmeye optimize ederek arttırılabilir.
Introduction
T hücre reseptörleri (TCR'ler) bir TCRα ve TCRβ zinciri oluşan T lenfositler tarafından ifade heterodimerik adaptif bağışıklık reseptörleri vardır. Onlar HLA / peptit kompleksleri neredeyse sınırsız yapılandırmaları tanıyabilen oldukça çeşitli bir repertuar üreten V (D) J gen segmentlerinin, somatik düzenlenmesi yoluyla oluşturulur. Klinik olarak, tümörle birleşmiş antijenler için clonotypic TCR'ler spesifik ifade etmek üzere geliştirilen T hücreleri kanser 1 çeşitli etkinliğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu amaç için klonlanmış bir çok TCRler terapötik uygulama sınırlayan ilgili antijen için yeterlidir afiniteye sahip değildir.
Burada, zincir merkezlilik yararlanarak mevcut TCRler için bu sınırlamayı aşmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu bir TCR hemichain hedef antijenin 2 tanınması daha baskın bir rol oynayabileceğini rapor edilmiştir, burada flubelerde olarak adlandırılan. Kristal yapı analizleri bu bir Centric göstermiştirBir TCR hemichain 3,4 karmaşık MHC / peptit üzerinde ayak izi çoğunluğu için hesap verebilir. Bu kavram kullanılarak, daha önce SIG35α TCRα TCRβ zincirlerinin farklı bir repertuar ile eşleşmeye ve HLA-A2 tarafından sunulan 5 MART1 27-35 peptide karşı reaktiflik muhafaza olduğunu göstermiştir. Benzer sonuçlar merkezli TCRβ hemichain çeşitli TCRα zincirleri ile eşleştirilmiş ve HLA-A24 6 tarafından sunulan WT1 235-243 peptit için reaktivite muhafaza TAK1 TCR ile elde edilmiştir. MART1 ve WT1 Hem tümör bağlantılı antijenler vardır. Zincir merkezlilik farklı Vβ11 TCRβ zincirleri 7 insan iNKT TCRlerin değişmeyen Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα zinciri eşleyerek, CD1d kısıtlamalı değişmeyen Doğal Katil (iNKT) TCRlerin antijen tanıma çalışma uygulanmıştır.
Tüm durumlarda, trans göre TCRlerin de novo repertuarı üretmek mümkünkişiye hemichain endojen TCRα ya TCRβ karşı zincirleri ile eşleştirilmiş periferal kan T-hücreleri, merkezli TCR hemichain ducing. Aslında, merkezi hemichain birlikte eşleştirilmiş ilgi antijen özelliği muhafaza TCRlerin oluşturur, ancak afinite değişen uygun bir karşı-zincirleri, belirlemek için kullanılabilecek bir yem olarak hizmet vermektedir. Bu yeni repertuarların, biz önceden varolan TCRler göre hedef antijene karşı iyileştirilmiş bir karşılıklı etkileşim gücü olan clonotypic TCRlerin izole mümkün. Bu nedenle, bu yöntemin klinik uygulama için en uygun TCRler belirlenmesi boru hattı hızlandıracak inanıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. retroviral İlgi Kodlama TCR Hemichain Construct hazırlanması
- takip eden adımda TCR geninin yerleştirilmesine imkan vermek için Pmx vektör linearize. 3 saat 37 ° C (Tablo 1), EcoRI ve Notl kısıtlama enzimleri ile plazmid DNA Digest 8.
- % 1.2 agaroz jeli üzerinde sindirilmiş plasmidin elektroforez yapın. Tüketim yaklaşık 4.500 baz çifti (bps) bant ve elute 30 ul steril su içinde ticari olarak temin edilebilen jel özütleme kitleri 9 kullanarak.
- Ayrıca Pmx vektör, sırasıyla, 8, EcoRI ve Notl sindirimi sitesi örtüşen 15-20 bps kodlayan ilgi TCR gen için tasarım 5 've 3' primerleri.
- primerleri ile TCR gen yükseltmek. Adım 1.2'de tarif edildiği gibi, yaklaşık 1000 baz PCR ürünü ve elüt bandın elektroforez yapın.
- ticari olarak temin edilebilen plasmid ile her bir lineer fragmanı birleştirilerek sindirilmiş vektör içine TCR genini klonlamakMontaj Ana Karışım reaktif ve 1 saat 50 ° C'de inkübe.
NOT: Her bileşenin nispi hacimleri için imalatçının protokolüne bakınız. Bu montaj yöntemi başlangıçta Gibson ve ark. 10 tarafından tarif edilen tekniğe dayanmaktadır. - (İsteğe bağlı) Etiket TCR gen, insan sinir büyüme faktörü reseptörü, kesik biçiminde hücreleri kalıt işaretlemek (ΔNGFR, amino asitler 1-277) 11 furin klevaj, serin-glisin bağlayıcı ile ayrıldı ve 2A 12,13 dizileri. parçası uçlarının üst üste binen ve adımları 1.3-1.5 tarif edildiği gibi plazmid monte tasarım primerleri kodlayan dizileri içerir.
NOT: Bu diziler referanslar 11-13 bulunabilir. - Kimyasal olarak, yeterli E. Transform üreticinin protokolü 14 aşağıdaki monte plazmid ile E. coli. agar plakaları üzerinde Tohum dönüştürülmüş bakteriler (20 mg / ml lizojeni etsuyu (LB), 15 mg / ml agar ve 1 ug / ml ampisilin) ve 18 saat 37 ° C'de inkübe edin. Kültür, 37 ° C ve dakika başına 200 turda bir çalkalama inkübatöründe 16 saat 50 LB ortamında ml (20 mg / ml LB ve 1 ug / ml ampisilin) ve tek bir bakteri kolonisi.
- Üreticinin protokolü takip edilerek ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak Midiprep plazmidler arındırın. yaklaşık 1 ug / ul konsantrasyon plazmid seyreltilir.
NOT: plazmit anlaştırma protokolü alkali ekstraksiyon yöntemi 15 dayanır.
2. Elektrik üretim kararlı paketleme hücre soyu
NOT: 293GPG ve PG13 Hem hücreler yapışık. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde kültür hücreleri,% 10 fetal dana serumu (FCS) ve 50 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiştir. transfeksiyondan önce 1 ug / ml tetrasiklin ile kültür 293GPG hücreleri. Tüm adımlar arasında,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
- Aşama 1.9 USI elde hemichain kodlayan vektör ile T75 şişesi içinde 16 kültürlenmiş Transfect 293GPG paketleme hücreleriüreticinin protokolü 1 ila 7, aşağıdaki ticari olarak temin edilebilir transfeksiyon reaktifi ng. NOT:% 50-60 confluency Transfect 293GPG hücreleri.
- Aspire 293GPG hücreleri için orta ve taze DMEM ortamı 1 gün sonrası transfeksiyon 10 ml ekleyin.
- Hasat geçici 2 gün şırıngadan kültür ortamının aktarılması ve 0.45 um'lik bir filtreden geçirilerek adım 2.2 sonra transfekte 293GPG hücrelerden virüs üretilir.
Not: Virüs hemen kullanılmıştır veya ileride kullanılmak üzere -80 ° C'de muhafaza edilebilir. - T25 şişesi içinde kültür 1 x 10 5 PG13 hücreleri. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bir gün, aspirat kültür ortamı ve polibren 8 ug / ml ile birlikte, adım 2.3 ve 1.5 ml DMEM ortamı ile ilgili 293GPG türetilmiş virüs 1.5 mi ekledikten sonra.
- 4 gün boyunca günde bir kez adım 2.4 de tarif edildiği gibi ilgi TCR hemichain kodlayan stabil PG13 paketleme hücre hattı üretmek retrovirüs kurmak için orta değiştirin.
- Aspire orta ve değiştirme24 saat daha kültür için son enfeksiyondan sonra PG13 hücre hatları için taze DMEM ortamı ile.
Not:% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırarak dondurma ya da alt-kültür hücreleri. - Hücrelerin ekim sonra adım 2.3 üç gün açıklandığı gibi transduse PG13 hücre hatları virüsü, T75 2 x 10 6 hücre 10 ml DMEM orta ile şişeyi kültür ve hasat virüsü üretmek için.
Not: Virüs iyi hemen kullanılmıştır ama iki aya kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
3. Etkinleştirme ve transdüksiyon insan T hücrelerinin
NOT: İnsan örnekleri alındı ve kurumsal etik komitesi onaylı protokollere uygun olarak kullanılır. Roswell Park Memorial Institute Kültür primer insan hücreleri (RPMI) ortamında,% 10 insan serumu yerine FCS ve 50 | ig / ml gentamisin ile takviye edilmiştir. Tüm adımlar arasında,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
- yoğunluğuna izole insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC)üreticinin protokolü 18 aşağıdaki degrade ayırma.
- retroviral bir enfeksiyon için gerekli proliferasyonunu T hücrelerini aktive etmektedir. Rekombinant insan interlökin-2, anti-CD3 monoklonal antikoru (rhlL-2) ve 50 ng / ml, 100 IU / ml RPMI ortamında 5 ml 6 oyuklu plaka oyuk başına Kültür 2 x 10 7 taze veya çözülmüş PBMC, (klon OKT3).
- Üç gün, stimülasyon sonrası 4 dakika boyunca 350 xg'de pipetleme ve santrifüj T hücreleri toplamak. Süpernatant atılır ve adım 2.7 PG13 virüsü 1 ml yeniden süspansiyon haline getirildi, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 0.5-1 x 10 6 T hücrelerini tohum ve rhIL-2 200 lU / ml ile takviye edilmiş RPMI ortamı 1 mi. Santrifüj 1000 xg'de plakası ve 1 saat 32 ° C.
- 24 saat sonra, 4 dakika boyunca 350 xg'de pipetleme ve santrifüj ile T hücreleri toplamak. Aşama 2.7 PG13 virüsü 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri atın ve rhIL-2 200 lU / ml ile takviye edilmiş RPMI ortamı 1 mi. 6 Infect toplam için bu adımı yineleyiniyonları.
Not: enfeksiyonlarının sayısı hücre çizgisi paket tarafından üretilen virüsün titresi bağlı olarak optimize edilmelidir. Gerekirse, her gün hücrelerinin% 20-30 kaldırarak geçit T hücreleri büyümeyi engellemek için. - 24 saat son enfeksiyondan sonra, 4 dakika boyunca 350 xg'de pipetleme ve santrifüj T hücreleri toplamak. Daha fazla kültürü için rhlL-2, 100 lU / ml RPMI ortamında süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
- 2-3 gün adım 3.5, 15 dakika, 4 ° C 'de 30 dakika süre ile 4 ° C'de, daha sonra anti-insan CD3 de HLA multımer ve ko-reseptörü monoklonal antikorları (mAbs) ile leke T hücreleri daha sonra. flow sitometri ile analiz edin. 19 - alakasız multimer ve / veya negatif kontroller (3, Şekil 1) ve untransduced hücreleri kullanır.
- Kişiye merkezli hemichain bir TCRα zinciri ise, 20 akış sitometrisi ile ticari olarak temin edilebilir Vβ özgü antikor paneli kullanarak novo multimer pozitif hücrelerin Vβ kullanımını analiz.
4. Klonlama De Novo TCR Counter-hemichains
- Akış destekli hücre sıralama adım 3.6 sırala de novo multimeir olumlu nüfus.
- Asit guanidinyum thiosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi 21,2 2 kullanılarak kriteri T hücrelerinden RNA izole edin.
Not: RNA -80 ° C 'de muhafaza edilebilir, ancak en kısa sürede mümkün olan cDNA oluşturmak için kullanılır. - Üreticinin protokolü 23,24, aşağıdaki ticari olarak temin edilebilir ters transkriptaz-PCR kiti kullanılarak ekstre RNA'dan cDNA kütüphanesi sentez.
- TCRβ karşı zincirleri klonlanması durumunda, tam uzunlukta adım 3.7 belirlenen, Vβ geni ve TCRβ sabit bölümüne özgü primerler dizayn ve klon TCRβ adımda 1.3-1.9 tarif genler. Aksi 5.1 adıma geçin adım sayacı zinciri TCRα ise 4,5 bakın.
- Ticari olarak mevcut Vα özgü antikorlar sınırlıdır, bu nedenle Vα gen kullanımı olamazAkış sitometrisi ile belirlenir. CDNA uçlarının (RACE), 25 5'-hızlı amplifikasyonu ile klon TCRα karşı zincirler, 5 'RACE kit 6, ticari olarak temin edilebilen.
- üreticinin protokolü takip eden basamakta 4.2 ekstre RNA'dan 5 'RACE uyumlu bir cDNA sentez.
- Tablo 2'de tarif edildiği gibi 1. hafta PCR gerçekleştirin.
- PCR ürününün elektroforez yürütmek ve aşama 1.2'de tarif edildiği gibi, yaklaşık 1100 bps bant elüte.
- Şablon olarak 1. döngü PCR ürünü kullanılarak, Tablo 3'te tarif edildiği gibi 2. döngü PCR gerçekleştirin.
Not: Tablo 3 kapsamında gösterilen tetikleyici dizlerde EcoRI ve Notl klonlama için tasarlandı Pmx vektör ile sindirilmiş. - PCR ürününün elektroforez yürütmek ve aşama 1.2'de tarif edildiği gibi, yaklaşık 1000 bps bant elüte.
- EcoRI ve Notl Klon TCRα genleri Pmx vektör Puri sindirilmişolarak fy plazmidler adımlarda 1.5-1.9 açıklandığı.
5. sulandırma Roman Antijen spesifik TCR Klonlar
Not: RPMI ortamında kültür Jurkat 76 hücreleri ve daha sonra hücre çizgileri% 10 FCS ve 50 | ig / ml gentamisin ile takviye edilmiştir. Tüm adımlar arasında,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
- Adım 2.3'te üretilen 293GPG virüsü kullanılarak merkezli TCR hemichain ile (insan T hücre çizgisi - - / veya eşdeğer TCR) Jurkat 76 hücreleri 26 transdüksiyonu. Jurkat 76, tohum RPMI ortamı 1 virüsünün ve 1 ml içeren, 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 5 x 10 4 hücre için. Santrifüj 1000 xg'de plakası ve 1 saat 32 ° C.
- 24 saat enfeksiyondan sonra, 4 dakika boyunca 350 xg'de hemichain transduse Jurkat pipetle ve santrifüj ile 76 hücreleri toplamak. Daha fazla kültürü için taze RPMI ortamı supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- hemichain 2-3 gün adım 5.2 sonra etiketli moleküler ise leke, transduse hücreleri arındırmakAkış yardımlı veya manyetik destekli hücre (isteğe bağlı) 27 sıralayarak ardından anti-NGFR mAb konjuge fluorofor ile ing.
- adımlara 2.1 2.3 takiben, 293GPG virüs adımlarla 4.4 veya 4.5 klonlanmış bir TCR karşı zincirini şifreleyen üretirler.
- Tam TCR sulandırmak için, kararlı bir şekilde adım 5.4 virüs kullanarak adımlarda 5,1-5,3 oluşturulan merkezli TCR hemichain eksprese eden T hücre hattını transduce. adımda 5.1-5.2 tarif edildiği gibi transdüksiyonunu gerçekleştirme.
- 2-3 gün adım 5.5 27 sonra, imalatçının protokolü takip anti-CD3 manyetik destekli hücre sınıflandırma CD3 + transfektanları saflaştınlır.
- Antijen spesifikliği doğrulamak için, anti-CD3 ve / veya ko-reseptör mAb'leri, ve HLA multimer çeşitli karşı zincirleri ile eşleştirilmiş merkezli TCR hemichain oluşan clonotypic TCRler, eksprese eden transfektanlar leke, 3-5 gün CD3 saflaştırma sonrası. 19 - flow sitometri (5 Şekil 4) hücreleri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceden bilgi sahibi olmadan bu hemichain arasında TCRα ve TCRβ zinciri ayrı klonlanabilir ve HLA-A24 / WT1 reaktif TAK1 TCR (Şekil 1) söz konusu yapıldı periferal kan T-hücreleri, transduse gerekmektedir, zincir-merkezlidir. TAK1β transdüksiyonu antijen-spesifik T hücrelerinin belirgin daha yüksek bir frekans elde edildi. Tersine, olmayan bir merkezli hemichain transdüksiyon de novo multimer pozitif T hücreleri, TAK1α zinciri ile görüldüğü gibi (Şekil 1) elde değildir. Analiz sırasında, NGFR + hücreleri üzerinde kapısı TCR gen spesifik (- 2 Şekil 1) transduced hücreleri analiz etmek etiketlendi eğer. Hakim olduğu bilinmektedir Öte yandan, tek merkezli hemichain örneğin SIG35α ve değişmez Vα24 TCRα zincirleri (Şekil 2 ve 3) transduse edilebilir. ilgili Cogn için spesifik T hücreleriBir merkezli TCRα hemichain transdüksiyonu frekansta artan antijen yedi. (Şekil 2-3). Bununla birlikte bu veriler ilgi antijen spesifikliği de novo TCRlerin oluşturabilir periferal kan T-hücreleri, bir merkezli TCRα ya TCRβ hemichain bu giriş göstermektedir.
Antijene özel nüfus akış sıralama destekli hücre sıralanabilir ve 4 Clonotypic TCR tezgah zincirler ayrı ayrı stabil olarak merkezli hemichain eksprese eden bir T hücresi hattında sulandırılabilir Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, TCR hemichains klonlanabilir. Jurkat 76 transfektanları, yeni, TAK1β ya SIG35α merkezli hemichain kalıt aktarımlı T hücreleri özgün TCRlerin klonlanmış 5,6 boyama multimer HLA / peptit ile belirlenen şekilde, ilgili ortak kökenli bir antijen için avidite değişen sahipti. Özellikle, de novo TCRα karşı zincirler t izole başardıkTAK1β ile eşleştirilmiş şapka ebeveyn TAK1αβ eşleştirme daha WT1 antijen kompleksinin daha düşük ya da daha yüksek yoğunlukta (Şekil 4) her iki ile boyandı. Benzer şekilde, SIG35α özel karşı-zincirleri ile eşleştirilmiş yüksek aviditeli (Şekil 5) orta ile HLA-A2 / MART1 tanıdı. SIG35α bir TCRαβ heterodimer 5 bağımsız klonlandı, bu nedenle bu hemichain için ebeveyn eşleştirme karşılaştırma için kullanılamaz. Önemli olarak, bu veriler, çeşitli karşı zincirlerle merkezli hemichain eşleyerek, hedef antijen için yakınlığını modüle etmenin mümkün olduğunu göstermektedir.
Şekil 1:. TAK1β HLA-A24 / WT1 reaktif TAK1 TCR'nin HLA kısıtlı TCRβ merkezli hemichain TCRα ya TCRβ hemichains bir örnek olarak, kesik sinir büyüme faktörü rece ile etiketlendiptor (ΔNGFR), ve ayrı ayrı periferal kan T-hücrelerinin kalıt. Transfekte PY5-konjuge anti-CD8 (133x seyreltilmiş) ve (mAb 'ler) (20 X seyreltilmiş) monoklonal antikorlar, anti-NGFR FITC-konjüge ile boyanmış ve belirtilmiştir multimer, HLA-A24, iki kat antijene özgü aşağıdaki gibidir (5 ug / ml), uyarım. 6 vericiden toplam test edildi. Tüm veriler NGFR + hücreleri üzerinde geçitlendi. Şekil yeniden basılmış referans 6 izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. SIG35α HLA kısıtlı TCRα merkezli hemichain bir örnek olarak SIG35α TCRα ΔNGFR ile etiketlenmiş zinciri, ya da tek başına etiketi periferal kan T-hücreleri transdüse edilmiştir. Transfekte PY5-CO ile boyanmıştırnjugated anti-CD8 (133x seyreltilmiş) ve FITC-konjuge anti-NGFR mAb (20x seyreltilmiş) ve HLA-A2 multimer (8 ug / ml) göstermektedir. 4 donörlerin toplam test edildi. Tüm veriler NGFR + hücreleri üzerinde geçitlendi. Şekil yeniden basılmış referans 5 (Copyright 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc.) izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücre reseptörü Vα24 (Vα24i) CD1d kısıtlı TCRα merkezli hemichain bir örnek olarak Vα24i TCRα zincirli periferal kan T-hücreleri transdüse edilmiştir. Transfektanlar FITC-konjuge anti-CD3 (20x seyreltilmiş) mAb ile boyanmış ve CD1d multimer (5 ug / ml) belirtilmiştir. Yüksüz CD1d molecules HEK293 hücreleri ve endojen bilinmiyor kendini lipidlerden üretildi. iNKT TCR α-GalCer veya analogu, PBS-57 sunulması CD1d tanınması ile tanımlanır. 4 donörlerin toplam test edildi. Şekil yeniden basılmış referans 7 izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. TAK1β klonlanan Örnek TCRα karşı zincirleri TCRα klonlar T262, A262, A186, A133 T hücrelerini transduse ve T4, HLA-A24 / WT1 klonlandı multimer pozitif TAK1β kalıt periferal T hücreleri, ve ayrı ayrı Jurkat 76 hücreleri ile yeniden TAK1β zinciriyle birlikte, CD8 ifade. Transfekte PY5-konjuge anti-CD8 mAb (133x seyreltilmiş) ile boyandı ve HLA-A24 belirtilmiştirMultımer (5 ug / ml). Veriler temsilcisi iki bağımsız deneyler. Hata çubukları, alanı göstermektedir. Şekil yeniden basılmış referans 6 izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: SIG35α klonlanan Örnek TCRβ karşı zincirleri T hücrelerinin kalıt TCRβ klon 413, 523, 788, 1086 794 ve 830, HLA-A2 / MART1 gelen multimer pozitif SIG35α kalıt periferal T hücreleri klonlanır, ve ayrı ayrı Jurkat üzerinde yeniden oluşturuldu. SIG35α zinciriyle birlikte, CD8 eksprese 76 hücreleri. DMF5 HLA-A2 / MART1 tanıyan daha önce klonlanmış yüksek afiniteli TCR oldu. Transfekte PY5-konjuge anti-CD8 mAb (133x seyreltilmiş) ile boyanmış ve HLA-A2 multimer (2 ug / m belirtilmiştirl). Veriler, iki bağımsız deneyin temsilcisidir. Hata çubukları, alanı göstermektedir. Şekil yeniden basılmış referans 5 (Copyright 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc.) izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1:.. PMX vektör sindirimi için Kur Reaktifler ve ilgili birimler gösterilmektedir Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 2: 1. round 5 'RAC KurE PCR. Reaktifler ve ilgili birimler, PCR ayarları ve primer sekans gösterilmiştir. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 3:.. 2 nd 5 'RACE PCR Reaktifler ve ilgili birimler, PCR ayarları ve primer dizileri gösterilmiştir yuvarlak Kur bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin başarılı bir uygulama için ilk şartı ilgi hemichain birincil T hücrelerinin yeterli transdüksiyon verimliliği elde edilir. Deneyimlerimize göre, insan primer T hücrelerinde, katılan genin kararlı ve etkili ekspresyonu için retroviral vektör sonuçları gibi paketleme hücre hattı ve Pmx olarak PG13 kullanarak kombinasyon halinde. PG13 paketleme hücreleri transdüksiyon verimliliği artırmak için, yüksek titre ambalaj hücreleri seçmek için klonlanmış tek hücre olabilir. Bundan başka, T hücrelerinin çoğalması ayrıca retrovirüs yüksek transdüksiyon verimliliği için gereklidir. anlatılan protokolde, rhlL-2'nin yüksek konsantrasyonu ile birlikte çözünür anti-CD3 mAb OKT3 ile uyarma, hücre bölünmesini uyarmak için gerekli olan aktivasyon sinyallerini içerir. Monositler olasılıkla Fc reseptörlerine bağlanma yoluyla, çözünür OKT3 uyarıcı kapasitesi gerekmektedir. Bu nedenle, dökme PBMC, olup T hücrelerini saflaştınldı bu özel stimülasyon protokolü için gereklidir. TRPMI, mükemmel deneysel sonuçlar, insan serumu ile desteklenmiş hücreler kültürlendi olmalıdır. Burada tarif edilen bütün diğer hücreler, fetal buzağı serumu varlığında kültüre edilebilir.
İkinci olarak, eksprese eden hücreler de novo üretilen antijene spesifik TCRler gözlenemez bir seviyede olmalıdır. Bu TAK1β gibi bazı TCR hemichains için de novo TCR ifade eden hücreler antijen darbeli antijen sunan hücreler (APC'ler) ile uyarıldıktan sonra, sadece tespit edilebilir. antijene spesifik TCRler merkezli hemichain transdüksiyonu hemen sonra algılanmaz Dolayısıyla, eğer bu APC 'ler tarafından genişlemesinden sonra tespit olabilir. TAK1α hemichain (Şekil 1) ile görüldüğü gibi, daha da APC 'ler ile Antijene özel genleşme sonrasında novo antijen-spesifik T hücrelerini elde olmaz olmayan merkezli hemichain bu transdüksiyon edin. Çalışmalarda, HLA multimerleri tespiti için kullanılır, ancak bu bazı TCR'lerinin, TCR kısıtlı özellikle HLA sınıf II için geçerli olmayabilirs. Alternatif bir T hücresi işlevsel yanıtları algılamak için olacaktır. Hemichain kalıt aktarımlı T hücreleri ilgili antijen ile doldurulan APC 'ler ile uyarılabilir. Araç-darbeli APC'ler ve untransduced T hücreleri kontrol olarak da kullanılabilir. Yanıt T-hücreleri, CD 107a, CD154, CD137 ve yüzey aktivasyon markerlerinin regülasyonu ile tespit edilebilir.
Son olarak, merkezli hemichain ile eşleştirilmiş klonlanmış karşı zincirler aslında ilgi antijeni tanıyan emin doğrulamak için önemlidir. TCRα genleri için alelik dışlama sızan ve periferal αβ T hücrelerinin önemli bir bölümü, birden fazla TCRα zinciri 28 eksprese olduğu tahmin edilmektedir, çünkü merkezli hemichain TCRβ ve karşı-zincirleri TCRα olduğunda bu özellikle önemlidir. Reaktivite multimer lekelenme veya soydaş antijen sunan APC 'ile uyarıldıktan sonra işlevsel tepki ölçme teyit edilebilir.
Bir limitatiTCRα ve TCRβ bazı durumlarda her ikisini 3 tanıma antijen nispeten katkıda beri bu tekniğin üzerinde, her TCR bir merkezli hemichain oluşturacaktır değil olmasıdır. Bu nedenle, sigara merkezli hemichains ile transduse periferal T-hücreleri de novo antijene spesifik TCRlerin vermeyebilir.
Bununla birlikte, bu yöntem, TCRα ve TCRβ her iki gen klonlanmış olması ve doğru eşleşme 29,30 sağlanmalıdır klonlama TCRler, geleneksel yaklaşım üzerine kavramsal bir gelişmeyi temsil etmektedir. Bizim teknikte, hemichains arasındaki eşleştirme artık temel kaygı ve TCR zincirlerinin sadece bir sabit olduğu göz önüne alındığında, klonlanacak gerekiyor. HLA sınıf I veya CD1d kısıtlı TCRler ek olarak, tarif edilen yöntem aynı zamanda, TCR gen terapisi için HLA sınıf II kısıtlı TCRlerin izolasyonuna uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
