Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

Abstract

O Instituto Nacional de ImageJ da Saúde é um poderoso disponível gratuitamente suite de software, processamento de imagem. ImageJ tem algoritmos de análise de partículas completas que podem ser utilizadas eficazmente para contar várias partículas biológicas. Ao contar um grande número de amostras de células, o hemocitómetro apresenta um gargalo em relação ao tempo. Da mesma forma, contando membranas a partir de ensaios de migração / invasão com o contador celular ImageJ plugin, embora precisa, é um trabalho excepcionalmente intensa, subjetiva, e famoso por causar dor no pulso. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos dois plugins dentro ImageJ para a única tarefa de hemocitômetro automatizado (ou volume conhecido) e contagem de células migração / invasão. Ambos os encaixes assentam na capacidade de adquirir micrografias de alta qualidade com o mínimo de fundo. Eles são fáceis de usar e otimizado para contagem rápida e análise de grandes tamanhos de amostra com ferramentas de análise de embutidas para ajudar a calibração de contagens. Ao combinar o princípio fundamentals de contador de células com uma análise de algoritmo de contagem e contagem de pós-automatizado, o que aumenta grandemente a facilidade com que os ensaios de migração podem ser processadas sem qualquer perda de precisão.

Introduction

Na contagem de células in vitro é uma técnica básica importante em uma ampla gama de experiências de cultura de tecido. Precisão da determinação do número de células numa cultura é essencial para a reprodutibilidade experimental e ^1,2 normalização. A contagem das células pode ser realizada manualmente utilizando um hemocitómetro, bem como utilizando uma variedade de métodos automatizados, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens ^3,4,5. A maioria dos métodos automatizados para contagem de células pertencer a uma das duas classes, os que utilizam o princípio de Coulter ou citometria de fluxo. contadores Coulter tirar vantagem das células de resistência elétrica para determinar o número e tamanho das células. Eles são rápidos, precisos e mais baratos do que citómetros de fluxo. No entanto, eles raramente são usados apenas para contagem de células devido ao seu custo considerável em comparação com a contagem manual ^3. Fluxo citómetros, por outro lado, são caros, mas eles têm muitas aplicações, tais como a contagem celular, análise da forma de células, rructure e célula de medição interna marcadores de ^4,5. As máquinas que utilizam qualquer um destes dois princípios estão disponíveis de vários fabricantes. Contagem manual é acessível, mas demorado e sujeito a polarização, enquanto os métodos automáticos vêm com uma fracção do tempo requerido para a contagem manual, mas utilizando máquinas caras ^6.

Outros procedimentos de cultura de células são comum em ensaios de motilidade das células in vitro, isto é, a migração celular e invasão ^7. Os ensaios de migração e invasão são comumente utilizados para investigar a mobilidade celular e capacidade invasiva, em resposta a uma resposta quimiotáctica. Além disso, eles são amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento embrionário, a diferenciação, a resposta inflamatória, e a metástase de vários tipos de células ^7-11. As células que migraram ou invadem através da membrana porosa de um ensaio de migração pode ser quantificada de duas formas diferentes. Em primeiro lugar, por coloração das células com um corante fluorescente, de dissociação from a membrana, e a quantificação utilizando um leitor fluorescente ^12. Uma limitação deste método de quantificação é que nenhuma ficha pode ser retida de membranas e não há nenhuma possibilidade para análise posterior ^13. O segundo método de quantificação é de migraram / células a serem fixadas e coradas com corante fluorescente ou, mais comumente, com corantes citológicos como cristal violeta, toluidine corante azul ou hematoxilina invadidos; em seguida, as células são quantificados usando manualmente imagens microscópicas invertidos destas membranas que é uma tarefa demorada muito ^12,13.

Para ultrapassar os inconvenientes da contagem manual de células, foram desenvolvidos dois contadores de células automatizado fiáveis ​​e precisos para a concentração de células e para o ensaio de migração. Estes contra algoritmos celulares automatizados foram desenvolvidos para ImageJ como um plug-in utilizando a linguagem de programação Java da Oracle. ImageJ é uma ferramenta de processamento de imagem pública e amplamente utilizado, desenvolvido pelo Instituto Nacional de HeaLTH (NIH) ^14,15; Assim, escrever esses plugins para ImageJ facilita a fácil integração com a comunidade biológica.

Automatização de contagem de células garante alto rendimento e reprodutibilidade em relação à contagem manual. Embora outro software disponível e encaixes podem ser utilizados para calcular a concentração de células por meio de análise de imagem ^5,16,17, celular Concentração de encaixe calculadora é rápido e pode também lidar com diluições de células e tratamentos. Além disso, todos os resultados e cálculos destes dois contadores podem ser salvos e exportados. Os dois encaixes descritos no presente documento são optimizados para o uso de um microscópio de contraste de fase para imagens de células vivas e grande campo de visão (toda a captura de membrana) de imagiologia para membranas ensaio de migração através do uso de um escopo de dissecação. Os plugins estão disponíveis gratuitamente para download com instruções de instalação a partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. Composto Microscópio e Configurar (Calculadora Concentração celular)

1. Aumentar o brilho da lâmpada ao pleno com o botão de ajuste de luz, mudar para a lente objetiva de 4X e garantir filtros de contraste de fase são selecionadas.
   NOTA: Qualquer microscópio de contraste de fase invertida para cultura de tecidos com um fundo escuro, por exemplo, contraste de fase PHP, pode ser usado de acordo com procedimentos de microscópio e câmera padrão.
2. Dentro de software do microscópio, definir configurações de captura de imagem para os valores padrão.
   NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para encontrar a localização dessas configurações.
   1. Definir 'brilho', 'contraste', e 'saturação' a ​​100% e 'gamma' e 'ganho' para 1.0.
      NOTA: Dependendo do software, "brilho" e "contraste" pode padrão para um valor de 0% em vez de 100%.
   2. Definir imagens sejam capturadas em preto e branco usando o availabl mais alta resoluçãoe (1.600 x 1.200 pixels (px) ou mais).
      NOTA: A 'saturação' de 0% é suficiente se um cenário preto e branco não está disponível.
3. Coloque um hemocitómetro padrão sobre a platina do microscópio e capturar uma imagem conforme representado na (Figura 1A); esta é a "imagem de Calibração Volume '. Ajustar o tempo de exposição, conforme necessário.

Calibração Volume 2. Imagem

1. Abrir ImageJ e, no menu Plugins, iniciar a Calculadora celular Concentração (CCC) plugin, por exemplo, Plugins> Analisador> 'Calculadora celular Concentração'.
   1. Se o painel do lado direito 'imagem de volume de calibração' não estiver visível, clique em 'Calibrar' para mostrá-lo.
2. No ImageJ, abra a "imagem Volume Calibration 'a partir do passo 1.3 (' Arquivo '>' Abrir ') e CCC, clique no botão" Obter Imagem Dimensão ".
   NOTA: Este irá preencher tanto Largura da imagem ecaixas de texto altura, com a resolução da imagem em pixels automaticamente.
3. No ImageJ, selecione a 'Ferramenta Linha Reta "ao lado de ferramentas de seleção e desenhar uma linha reta ao longo de todo o comprimento do hemocitômetro primário (P) quadr demonstrado em (Figura 1B), clicando e arrastando o cursor.
   1. Pressione a tecla 'M' para exibir a janela de resultados contendo as medições de linha reta. Digite o valor da coluna Comprimento na caixa de texto 'P-Quadrado De Corpo' em CCC (Figura 1B).
   2. Clique no botão 'calcular o volume de imagens "para a saída do volume de imagem na caixa de texto imagem de volume. Como alternativa, se o volume da imagem já é conhecido, digite o volume em NL na caixa de texto imagem de volume.
4. Clique no botão "Salvar".
   NOTA: O plugin está calibrado.

Calibração de Exposição 3. Câmara

1. Na sequência de colheita de células paracontando via hemocitômetro, carga de 10 ml de células em uma câmara do hemocitômetro e colocá-lo para o palco microscópio.
2. Usando as mesmas configurações da etapa 1.2, ajustar o tempo de exposição de modo que as linhas de fundo do hemocitómetro desaparecer.
   1. Ajustar o foco de modo que o interior das células é mais escura do que a membrana celular, indicando o foco dentro da secção transversal central da célula e não os pólos.
   2. Além disso ajustar a exposição de modo que as células não são sobrexposta e assemelham-se aos representados na (Figura 1C).
      NOTA: As linhas hemocit�etro ligeiramente visíveis são aceitáveis. Recomenda-se para salvar ou gravar essas configurações para manter a precisão e reprodutibilidade.

4. Aquisição de Imagem

1. Para cada amostra de células, carga de 10 mL em ambas as câmaras do hemocitômetro para aumentar o poder inferência estatística ^2. Coloque a hemocitómetro na platina do microscópiopara imagiologia.
   Nota: A resolução e ampliação de cada imagem deve ser a mesma que a "imagem de Calibração Volume '. O plugin conta todas as imagens de qualquer pasta selecionada; manter as imagens a serem contados em conjunto na mesma pasta.
   1. Se uma função de nome de arquivo de incremento automático está disponível, ligá-lo e certificar-se de cada imagem não é mostrada após a captura para aumentar o rendimento.
      NOTA: salvar manualmente e fechar cada imagem irá diminuir dramaticamente o processo. Consulte o manual do usuário do microscópio para obter informações sobre a disponibilidade de uma função de auto-incremento.
   2. Capturar pelo menos três imagens não sobrepostas da região central do hemocitômetro embora mais (5-10) é recomendada para aumentar a precisão.
      NOTA: a evitar tanto áreas superior e inferior das câmaras, como as células tendem a aumentar em densidade em ambos os locais. Tome o mesmo número de imagens para cada câmara. Isto é necessário para o funcionamento adequado do encaixe durante a contagem.

   5. Contagem imagem e diluições

   1. No CCC, clique em "contagem de células 'e observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione uma pasta para ser contado.
   2. Observe a caixa de entrada o número da amostra depois de selecionar uma pasta. Digite o número de imagens captadas por câmaras, ou seja, 4.1.2 e clique em 'Ok'. O plug-in agora contar todas as jpg, tiff, e imagens PNG na pasta selecionada em ordem alfabética.
      NOTA: Ao clicar no botão 'Visualizador Sample' abrirá a janela do Visualizador de exemplo exibindo informações sobre as amostras contadas. concentração da amostra é a concentração média de todas as imagens captadas por câmaras. As amostras com concentrações sem unidade pode ser adicionado a esta lista, tal como a adição de uma droga ou um pequeno tratamento molécula.
      1. Contar as amostras de células se as concentrações variam significativamente dentro contagens das mesmas amostras (Seção 4).
         NOTA: Para calcular diluições para todo tele contou-amostras, CCC utiliza automaticamente a fórmula C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Utilizar o cenário de semeadura de 15.000 células por 200 uL em 30 cavidades de uma placa de 96 poços + 1 adicional:
      1. Defina a caixa de texto à direita do rótulo C2 a 15.000 eo volume caixa de texto concentração para 200, a alteração da unidade de caixa de combinação ao lado 'ul'.
         NOTA: O plugin acabará por calcular a concentração em células / mL.
      2. Marca (volume final) se a caixa de combinação o volume tenha V2 selecionado e na caixa de texto à direita entra 6200 (200 mL x (30 + 1)), seleccionando 'ul' na caixa de combinação da unidade de volume.
   4. Clique em "Calcular Diluição 'para adicionar a diluição entrou atualmente para a caixa de listagem inferior esquerdo.
      NOTA: Para cada diluição acrescentou, será resolvido para cada amostra e exibido no diagrama de árvore para a direita. Dê um duplo clique em cada entrada para expandir.
   5. Clicando tele 'Save' botão abaixo do botão 'Visualizador de Amostra' para escrever para arquivar todos os dados de amostras e diluições.
   6. NOTA: Estes dados podem ser recuperados a qualquer momento, clicando em 'Load' e selecionando o arquivo salvo.

   6. Migração e Invasão (Contador)

   1. Realizar os ensaios de migração e invasão usando o método de câmara de Boyden padrão ^7-9.
   2. Depois de células migraram / invadido, remova cuidadosamente os meios de comunicação dentro do inserto, invertendo e gentilmente tocar. Wick fora qualquer excesso de materiais aderida à parte inferior da membrana por tocar a borda de uma toalha de papel.
      NOTA: Não toque na membrana-se à toalha, isso pode desalojar células aderidas.
   3. Fix e manchar as células como relatado ^7-9 em uma placa de 24 poços configurado com cada linha contendo ~ 500 mL de uma solução diferente, por exemplo, fixador, uma mancha, mancha 2, e água bidestilada _(ddH2O). Encha uma segunda placa com 1x PBS to colocar as inserções em antes de cortar.
   4. Lavam-se as inserções, colocando-os em poços cheios com _ddH2O e encher o inserto com ddH ₂ O. Drenar a água antes de esfregar distância células por inversão.
   5. Use um aplicador de algodão limpo para remover as células un-migrou / un-invadiu a partir do topo da membrana tomando cuidado para não danificar a membrana. Ser completo em torno dos bordos da membrana.
   6. Corte da membrana utilizando uma lâmina de barbear ou um bisturi e transferir cuidadosamente a membrana (do lado de baixo para cima) sobre uma lâmina de vidro limpa.
   7. Adicionar uma pequena gota de solução de montagem por baixo e por cima da membrana e cobrir com uma lamela de cobertura fina.
      NOTA: Evite bolhas de interceptação dentro da solução de montagem para preservar a precisão das contagens.

   7. Dissecando Âmbito e da Câmara Configuração

   1. Ligue fonte de luz do microscópio e câmera.
      NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para instruções detalhadas.
   2. inteligênciahin de software, defina as configurações de captura a imagem do microscópio para os valores padrão.
      NOTA: Se uma função de média Existe, um valor de quatro é recomendado. Este é um bom compromisso entre o grau de compensação e de aquisição de imagem tempo. Da mesma forma, um pequeno grau de afiamento pode aumentar a fidelidade da imagem.
      1. Definir 'brilho', 'contraste', e 'saturação' a ​​100% e 'gamma' e 'ganho' para 1.0.
         NOTA: Dependendo do software, "brilho" e "contraste" pode padrão para um valor de 0% em vez de 100%.
      2. exibição definido (em tempo real) e resolução de captura para suas configurações máximas (1.600 x 1.200 px e 2.592 x 1.944 px, respectivamente).
         NOTA: Resolução do display pode ser ajustada conforme necessário, se a taxa de atualização é muito lento. resoluções mais baixas irá torná-lo mais difícil focar com precisão, mas aumentar a taxa de atualização.
   3. Para a fase do escopo de dissecação, usar um sólido branco background; um fundo preto ou de vidro é insuficiente.
   4. Use a fonte de luz do palco antes, de preferência a partir de duas luzes LED flexível à direita e à esquerda do palco.
      NOTA: A infra-stage fonte de luz vai iluminar os poros na membrana ensaio de migração que pode influenciar negativamente a precisão das contagens posteriores.
   5. Coloque uma lâmina de membrana ensaio de migração concluída no palco. Olhando para a imagem em tempo real exibida pelo software, ajustar a ampliação com o botão de ajuste de zoom para que as bordas de uma única membrana são apenas dentro do campo de visão da câmera.
      NOTA: Colocar o slide em uma placa de vidro overtop o branco estágio fundo faz com que seja mais fácil de manobrar o slide para a imagem latente.
   6. Ajustar as posições de luz de origem (7.6.1) e tempos de exposição para reproduzir o mais próximo possível a imagem ideal representado na Figura 2A. Dependendo do brilho, tempos de exposição de 5-60 ms deve ser suficiente.
      NOTA:O objectivo é o de produzir uma imagem com tão pouco quanto possível a cor do fundo e uma membrana iluminada uniformemente, sem reduzir a fidelidade da imagem, isto é, sobre-exposição que conduz a uma perda de células visíveis.
      1. Posicionar as fontes de luz esquerdo e direito a um baixo ângulo em relação ao slide. Isto ajudará a remover a mancha de fundo e as aberrações cromáticas. Tente manter cada fonte de luz em frente ao outro.
         NOTA: Durante a manobra de cada fonte de luz para a posição, a outra fora. Isto ajuda a centrar a área de iluminação para a membrana se mais facilmente e com precisão.
   7. Remover o slide e balanço de branco a imagem usando um único clique de botão no software microscópio.
      NOTA: O microscópio está calibrado. Salvar tantas configurações possíveis para uso futuro e tomar nota das posições fonte de luz e intensidade.

   8. Aquisição de Imagem e Flatfield

   1. Dentro do software, definidoa localização da pasta de captura e captura de uma imagem por membrana. Nomear as imagens seguindo o modelo geral: Nome - ###, por exemplo, Control - 001.tif, Control - 002.tif, droga Test - 001.tif, e assim por diante.
      NOTA: Para obter os melhores resultados de imagem, salvar o tipo de arquivo de imagem como tiff em relação a outros formatos com perdas, como jpeg.
      NOTA: As imagens não segue o modelo geral, ainda será contada, mas não estará sujeita a agrupamento automatizado e Fielding plana.
      1. Se a correção Flatfield é desejado, para cada slide encontrar uma área vazia e dar uma imagem em branco, seguindo a convenção de nomenclatura: Nome - em branco.
         NOTA: Um espaço em branco é uma área no slide que contém nenhuma membrana e representa a iluminação de fundo.
      2. Imediatamente antes de imagem, alise cada membrana, aplicando pressão sobre a lamela e remover o maior número de bolhas de ar possível.
   2. No ImageJ, vá para Plugins e abra o plug-in TC; por exemplo, Plugins> Analisar> & #39; Transwell Contador '.
   3. Dentro TC, clique no botão 'Flatfield' e observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione a pasta onde as imagens de membrana foram salvos.
      NOTA: Apenas as imagens guardadas com o modelo geral acima serão automaticamente Flatfield corrigida e guardada em uma nova pasta chamada Flatfield dentro da pasta escolhida. Ver Figura 2B para um exemplo de uma imagem Flatfield corrigido.

   9. Definições de configuração

   1. Abrir a imagem da membrana um ensaio de migração no ImageJ ( 'Arquivo'> 'Abrir') e selecione Image> Adjust> 'Limite de Cor ...'. Observe a janela Limiar de cores para ajustar as cores que serão filtrados da imagem.
      1. Na parte inferior da janela, defina o método Limiarização para 'Shanbhag', cor Limiar para 'White', e no espaço de cores para 'RGB' (vermelho verde azul); Fundo escuro desmarque se selecionado.
      2. Ajuste o toposliders, clicando e arrastando os marcadores a 0 e os controles deslizantes inferiores a 255 (deixar os controles deslizantes de fundo a 255). Certifique-se de que a imagem é totalmente branco.
   2. Ajuste os controles deslizantes superiores verdes e vermelhas até que apenas os núcleos são visíveis.
      NOTA: As definições seleccionadas irão variar inteiramente sobre a mancha celular usado. Veja a Figura 2C.
   3. No plug-in TC, introduzir os valores dos principais controles deslizantes RGB em "RGB limiar" caixas de texto As definições de configuração associados. Clique no botão "Adicionar / Modificar" e substituir a configuração.
      1. Deixe os valores Gama Inferior e Superior Tamanho a 1 - Infinito.
   4. Dentro do painel de definições de configuração, clique em "Salvar" para gravar as configurações para o disco rígido.

   10. Contando Imagens e Calibração

   1. Abra o plugin TC (8.2) e clique em "Contar Pasta 'e observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione a pasta a ser contado and esperar que ela termine.
   2. Cada amostra contada é automaticamente adicionada à tabela principal. colunas de chave são 'Count', 'Qualidade' e 'Calibrar?'.
      NOTA: O Conde calibrado-un é o número de partículas por membrana dentro da área exibida na coluna 'gama Area'.
      Nota: A qualidade varia de aproximadamente -0,8 para 1,7; Q ≥ 0,5 é aceitável.
      1. Observar uma marca na 'Calibrar? coluna se uma imagem é apanhado em calibração com base na sua semelhança com as métricas ideais.
         NOTA: qualidade e calibração pode sugerir que as configurações atuais são possivelmente insuficiente. Se depois de adequada 'Color Limiarização' e 'Tamanho Ranges' foram selecionados e calibração ainda é sugerido, inspeção do original e contou imagens deve ser o determinante final de uma contagem válida.
   3. Selecione todas as amostras na Tabela Marcado para a calibração.
      1. Botão direito do mouse em tEle tabela e selecione Recount> 'Tamanho sugerido'. Isto irá recontar as imagens com uma área de partícula mínimo sugerido.
      2. Botão direito do mouse novamente e selecione 'Show Plot'. Observe o gráfico de dispersão frequência das áreas de partículas. Uma imagem ideal terá um gráfico semelhante a uma distribuição de longo direito de cauda normal, ou seja, a curva do sino. Ver a Figura 3B.
      3. Ajuste o intervalo de tamanho menor, se necessário, selecionando a amostra, botão direito do mouse e selecionando Recount> 'Configurações Manual ". Observe a janela de configuração manual. Digite as configurações desejadas e clique em Contar para contar a imagem com as novas configurações.
   4. Para ajustar a contagem manualmente, selecione as amostras, o botão direito na tabela e selecione "Abrir imagem com contagens". Observe a imagem original com os marcadores vermelhos que representam cada partícula contados pelo plugin.
      NOTA: Recount> 'Show contou imagem binária "pode ​​ser útil para verificar o quão bem eucélulas ndividual estão sendo resolvidos pelo limiar de cor.
      1. Para adicionar uma contagem, segure "Ctrl" e clique esquerdo. Observar um marcador na localização do cursor que será adicionada às amostras de contagem total. Para remover um marcador, clique direito da imagem. O plugin irá remover o marcador mais próximo do cursor.
      2. Para remover um grupo de marcadores, use uma ferramenta de seleção em ImageJ para selecionar uma região de interesse (ROI). Enquanto segura 'Ctrl', clique direito na imagem e todos os marcadores dentro do ROI serão removidos. Observe o número de células na coluna 'Count'.

   11. Saving / Abertura Resultados e exportar para CSV

   1. Na TC, vá para a barra de menu e clique em "Arquivo"> ​​"Salvar resultados '. Observe a caixa de diálogo Resultados Save. Escolha um nome e destino e clique em "Salvar".
      1. Use 'Arquivo'> 'Abrir resultados' para carregar um arquivo contendo todos os dados exibidos na tabela principal, incluindg o enredo.
         NOTA: O arquivo de resultados salva os diretórios as imagens são guardadas em Se as imagens originais são movidos depois de salvar, a "imagem original Open 'e' Abrir imagem com contagens de" funções falhará..
      2. Para repor o diretório de imagem, selecione as amostras, clique direito na tabela e selecione 'Reset diretório de imagens'. Observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione a nova pasta e caso se verifiquem as imagens, os diretórios serão repostas. Re-salvar o arquivo de resultados.
   2. Para salvar um arquivo Comma Separated Values ​​(CSV), na barra de menu ir para 'Arquivo'> 'Exportar para .csv'. Isso produz um arquivo com amostras organizados em grupos de estatística com a contagem média e erro padrão da média; seu layout foi concebido para a representação gráfica rápida em programas de gráficos comuns.
      NOTA: Os grupos de estatística baseiam-se nos grupos criados dentro do TC.
      1. Se as amostras seguir o modelo geral de nomenclatura, selecione as amostras a ser grouped, clique direito e selecione "agrupamento Auto '. Isto adiciona amostras com o mesmo "Nome" para o mesmo grupo. Usando o exemplo de Controle - 1, Control - 2, Tratamento - 1, Tratamento - 2: ambos os controles seria adicionado ao grupo 'Control' e tratamentos para 'tratamento'.
      2. Adicionar amostras manualmente para grupos com um duplo clique celular e tipagem da amostra 'Grupo' em nome do grupo. Selecione as amostras a serem adicionados a este grupo, clique direito e selecione "Adicionar ao grupo '.

Representative Results

Calculadora celular Concentração

A Figura 1 apresenta o processo global de calibração CCC e aquisição de imagem contáveis. Figura 1A e 1B mostram a imagem de calibração P-quadrado e cálculo do comprimento P-quadrado em pixels. CCC determina a concentração de células num dado volume utilizando a fórmula:

P-quadrado de um hemocitómetro tem um volume de 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) Dada esta constante, o volume total da imagem pode ser calculado após conversão de pixels para mm. Figura 1C é uma imagem contável ideal com em foco células exibindo a iluminação de fase característica e não graduações fundo hemocitômetro. Finalmente, o gráfico de dispersão dos Figure 1D mostra uma altamente correlacionada, manual ou de contagem automática de células a partir de 57 imagens tiradas ao longo de várias experiências e tipos de células, incluindo HTR8, ES-2, e Swan71. De nota, o intervalo máximo de concentração foi ~ 5,6 x 10 ⁶ células / mL com uma extremidade baixa de ~ 2,3 x 10 ³ células / mL (≈ 5 células por imagem). Sugere-se que se as contagens são abaixo 10-15 células por imagem, a amostra deve ser suspenso em um volume menor para aumentar o poder estatístico.

Aquisição e processamento de imagens para as Migrações Ensaio Contador

Centenas de membranas de ensaio de migração foram fotografadas ao longo de muitas experiências, todos os quais foram semeados com a linha de células de trofoblasto humano HTR8, Swan71, ou linha celular de cancro do ovário ES-2. Dessas imagens, múltiplos foram escolhidos para representar uma série de categorias de muito pobre a excelente qualidade com base no brilho, clareza e cor da stainecélulas d, e o grau de coloração de fundo e partículas indesejáveis ​​(ruído). Usando essas imagens, as definições de cor RGB limite padrão (≈ 150, 120, 0) foram determinados (Figura 2C) e usado como uma linha de base em todos os desenvolvimentos subsequentes do algoritmo. O objectivo era maximizar a cor nuclear a proporção total de cor, isto é, a maioria dos pixels coloridos deve estar dentro de núcleos celulares. O painel superior na Figura 2A representa o brilho ideal de imagem, célula clareza núcleos e cor, e insignificante ruído de fundo. O brilho da imagem é importante para garantir que há um grande contraste suficiente entre a célula e de fundo para produzir uma imagem binária a preto e branco.

Se esta diferença não for cumprido, as áreas grandes ou imprevisíveis podem ser contados pelo ImageJ Analisar função de partículas; o melhor cenário é um fundo completamente branco. Em oposição, o painel inferior Fifigura 2A tem coloração de fundo extrema e células que são quase indistinguíveis. Membranas com este grau de coloração provavelmente irá produzir resultados pouco fiáveis ​​do contador de ensaio de migração.

Em alguns casos, aumentar o brilho para o nível ideal pode afectar a fidelidade da imagem por overexposing a imagem. Da mesma forma, a alta exposição ou o brilho podem produzir efeitos cromáticos sistêmicos com regiões escuras luz progressiva ou irregular e. Com correcção Flatfield, estes efeitos podem ser minimizados ou totalmente removido como mostrado na Figura 2B (superior vs. painel inferior). Além disso, a correção Flatfield é uma boa maneira de equalizar o brilho de imagens múltiplas de membrana.

Calibração e Validação de Migração Ensaio Contador

Para ajudar os EUAer em melhor determinar se as imagens de membrana ensaio de migração cumprir os critérios exigidos para uma contagem precisa, dois qualificadores foram concebidos, a qualidade, designado por imagem (Q), e calibração recomendação (CR). É importante ressaltar que ambos os qualificadores, como o nome sugere CR, são apenas recomendações e atuam como guias em vez de juízes absolutos da responsabilização de cada imagem. Ambos Q e CR têm por base as métricas do gráfico de dispersão de frequência da área das partículas (10.3.2). Por razões de simplificação, uma métrica podem ser consideradas como as várias formas da curva que compõem o gráfico de frequência. A métrica desejada de um Q adequado (≥0.5) foi determinada pela distribuição normal aproximada observada do tamanho da célula. Geralmente, as células que são insolúveis entre si, sobre-coradas, ou apenas particularmente grande, a deslocar skewedness a uma distribuição normal com cauda à direita (Figura 3B). Como tal, esta é a métrica ideal de uma imagem calibrada típico. Coma adição de ruído de fundo, isto normalmente conduz a um grande número de partículas na gama de 1-5 área pixel (Figura 3A). A fim de calcular as métricas de enredo, os dados estão equipados com dez Savitzky-Golay curvas suavizadas de diferentes graus polinomiais produzidos pela Biblioteca Java Científico do Dr. Michael Thomas Flanagan (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Java/). Essencialmente, isso cria vários pontos da região aproximada de cada extremo. Através de uma série de mapas de cluster densidade de mínimos locais e máximos, um quadro geral das métricas de enredo pode ser computado como uma lista ordenada, ou seja, mínimo, máximo, mínimo / máximo sobreposição, ..., n ^º extremo. Em breve, o grau em que as curvas suavizadas ajustar os dados de frequência determina quão firmemente embalada os extremos são pontos. Quanto maior a agregação de extremos não sobrepostos, maior se torna Q. Em teoria, Q representa clareza geral da imagem com base em tele distribuição de tamanhos de partículas distintas.

Se o booleano CR é verdade ou não depende da seqüência de Extrema. A partir da Figura 3A, a lista ordenada seria mínimo, o máximo, e uma sequência de sobreposição de extremos com base nas propriedades da curva Savitzky-Golay. Desde Figura 3A representa uma imagem não calibrada, esta sequência geral de bandeiras Extrema CR como verdadeiros, sugerindo ao utilizador que a imagem pode precisar de calibração. Movendo-se para a frente, pode ser visto que a partir da Figura 3B, esta lista seriam idênticos, mas com a exclusão do primeiro mínimo. Assim, foram determinadas as métricas de imagens não calibradas e calibrado ideais. Desvios destas métricas geralmente sinalizar uma imagem para a calibração e reduzir Q ≤ 0, como é o caso com a membrana de ruído de fundo elevado na Figura 3C. Aplicando estes qualificadores para uma seleçãode modesto para excelentes imagens, com relação à luminosidade e ruído de fundo, é claro que a contagem de imagem calibrados são significativamente mais perto de contagens manuais que não calibrada (1,9% ± 0,3 vs 21,7% ± 2,9, respectivamente; Figura 3D, E). Dada a elevada qualidade geral das imagens escolhidas para análise (não calibrada = 0,71 ± 0,04; significa ± SE), houve um aumento modesto esperado somente em Q após a calibração ( = 0,90 ± 0,04). Tomados em conjunto, Q sugere o potencial global responsabilização de uma imagem enquanto CR é um forte indicador de que a calibração for bem sucedida ou não.

Cronometrando comparações de ambos contador de células Concentração e Migração Ensaio Contador

Figura 4A compara tempo de calibração CCC entre User 1 e 2. Como esperado, User 1 foi substancialmente mais rápido do que o usuário 2, em conjunto, levando em média cerca de cinco minutos para a calibração do CCC. A fim de comparar contagem em hemocitómetro manual e automatizado taxas, a taxa de contagem manual usando um contador de contagem foi comparado com o tempo que levou a tomar nove imagens da câmara de hemocitómetro e contados em CCC (Figura 4B). Uma concentração típica de células de 1,15 x 10 ⁶ células / ml foi usada para comparar intervalos, levando a uma média de aumento na taxa de transferência 1x. Esta taxa pode variar dependendo do número de células carregadas nohemocitómetro como o tempo total necessário para capturar imagens e processá-los é independente do número de células.

Por último, os horários que abrangem a aquisição de imagens de membranas, quantificação dentro de TC e ajustes manuais destas imagens foi medida na Figura 4C. Notavelmente, 12 membranas ensaio de migração com baixo número de células (Total = células 10.571) e coloração de fundo substancial e restos celulares foram escolhidas para facilitar o pior cenário que exigiria ajustes manuais número de células. Isso se reflete no ajuste Figura 4C coluna (ADJ) onde ele teve uma média de 13 min para remover as contagens indesejadas e adicionar células perdidas. Para comparação com contagem manual, as taxas de contagem de células óptimas foram determinadas com contador de células; imagens de membrana de alta qualidade com elevada densidade celular foram usadas (resultados não mostrados). Isto rendeu uma taxa máxima média entre User 1 e 2 de 9,1 x 10 ³ células / h(~ 2,5 células / s). Utilizando estes números, as membranas a partir de Figura 4C foram contadas 4,4 vezes mais rápido com o CT do que seria esperado a taxa máxima Manual. A economia de tempo são directamente dependentes do número de células e qualidade de imagem, contando membranas de migração que exigiam pouca ou nenhuma adaptação e alta densidade celular (~ 7.000 células / membrana), TC gerado contagem de células 1,395x mais rápido do que a taxa de manual de máxima.

Figura 1: Calculadora Concentração celular. Micrografia de contraste (A) Fase da praça principal central do hemocitômetro tomada em 40X total. A barra de escala representa 200 fim. (B) A versão da imagem recortada de (A) que descreve o que o comprimento para medir a hemocitômetro. A coluna Comprimento janela de resultados foi destacada para fácil identificação. barra amarela= 1 mm. (C) Uma micrografia ideal de um hemocitômetro contendo células HTR8 após microscópio e software de calibração em 40X ampliação total com uma resolução de 1.600 x 1.200 px. Barra de escala = 200 pm. (D) Um gráfico de dispersão comparando contagens manuais usando o contador ImageJ plug-in celular em comparação com a contagem automatizada de as mesmas imagens que usa a calculadora celular Concentração. n = 57 imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ensaio de Migração contrariar imagens representativas. (A) O painel superior é uma parte de um oitavo de um total de membrana que descreve uma imagem ideal com fundo mínima; Barra de escala = 200 pm. opainel inferior contém uma imagem com significativa coloração de fundo que afeta gravemente a precisão da contagem automática; Barra de escala = 585 pm. (B) O painel superior representa uma imagem escura de boa qualidade que produziu contagens imprecisas. O painel inferior é uma versão contáveis ​​da mesma imagem após a correcção Flatfield. Barras de escala = 593 pm. (C) O painel superior representa uma vista ampliada em de uma membrana típica. O painel inferior é a mesma imagem seguido pela thresholding cor desejada ImageJ (RGB Limiar = 150, 120, 0) para remover o fundo intercelular e a maioria do citoplasma visivelmente manchadas. Todas as imagens foram tomadas em 1.35X total de ampliação com um escopo de dissecação calibrado com uma resolução de 2.592 x 1.944 px partir de múltiplas invasões ensaio de migração de HTR8 corados com hematoxilina. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para viewa versão maior desta figura.

Figura 3: Calibração e validação de ensaio de migração c ounter. (A) Um exemplo típico de uma imagem não calibrada de alta qualidade. (B) A versão calibrada de (A) usando Recount migração do contador de ensaio> 'Tamanho sugerido'. (C) Um gráfico de frequência típica de uma membrana de baixa qualidade de imagem com mancha de fundo significativa ou escuridão total. (D) Um gráfico de dispersão comparando a contagem manual usando o ImageJ Contador plug-in celular e migração contador ensaio contagens automatizadas. (E) Um gráfico de barras que mostra a diferença percentual média de calibrado contra contagens automatizadas não calibrados. Os dados são média ± SE. P <0,0001, n = 30, teste-t não emparelhado com Corre de Welchcção. As mesmas imagens foram utilizadas para D e E. Calibração de ambos foi feito com o Recount> 'Tamanho sugerido "e Recount>' Configurações manuais 'para refinar ainda mais o tamanho mínimo contados e limite de cor. Nenhum ajuste contagem manual foram feitas usando o "Abrir imagem com contagens 'função. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Tempo de contador de células Concentração e uso contador ensaio de migração. (A) A comparação dos tempos de calibração CCC (etapas 1 e 2) entre User 1 (CCC / expert TC) e User 2 (CCC / TC iniciante). (B) tempos de contagem de células manual foram em média ao longo de cinco ensaios e expressa em células contadas por min. automatic contagens foram calculados por vezes em média para capturar nove imagens de uma câmara de hemocitômetro e contou com CCC. A concentração celular foi usado ~ 1,15 x 10 ⁶ células / ml. Os dados são média ± SE. n = 5. (C) Transwell Contador horários foram comparados mais de três categorias: aquisição (ACQ; as etapas 7 e 8), a quantificação (QNT; passos 10.1-10.3.3 usando definições de configuração padrão) e ajuste manual (Adj; passos 10,4 -1.4.2). As membranas quantificados tinha um elevado grau de coloração de fundo e detritos, a fim de necessitar de ajuste manual substancial para contagens precisas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

As etapas críticas, solução de problemas e limitações

A própria natureza de métodos computacionais automatizados, especificamente aqueles de análise de partículas, requer a habilidade matemática para definir essas partículas. Consequentemente, a precisão de ambos Calculator celular Concentração e contra ensaio de migração é majoritariamente dependente de fidelidade de imagem, ou seja, o quanto a imagem capturada se assemelha a membrana amostra celular ou ensaio de migração. Por isso, é da maior importância para seguir microscópio e protocolos de calibração de software associados da melhor forma possível. Isto inclui limitar o ruído de fundo, reduzindo partículas indesejáveis, capturando uniformemente imagens em foco brilhante e, e salvar em formatos de arquivo sem perdas, como TIFF. Assim, ambos os plugins são susceptíveis de produzir resultados errados se estes requisitos não são cumpridos. É, portanto, sempre uma boa prática para contagem de células Verifique para determinar se eles correspondem às expectativas visuais quando em Dupt. Se de fato os resultados não corresponderem, comparando a imagem original com a imagem binária pode ajudar a elucidar a questão (10,4 nota). Em alguns casos, mais escuras imagens ensaio de migração podem conter grandes áreas que foram contados devido a valores de pixels que caem dentro dos limites limite de cor. Em geral, usando uma imagem de Flatfield irá remover escuridão e blotchiness e evitar contagens mais indesejadas devido a irregularidades cromáticas.

Dadas estas questões possíveis e relativamente comuns, é importante seguir as orientações integridade de imagem padrão, como os propostos pelo Grupo e outros Publishing Nature ^13. Para manter a contagem consistente, qualquer ajuste a uma imagem devem ser aplicadas igualmente a todos os outros. Isto inclui, mas não está limitado ao contraste, a saturação, o brilho, o ganho, tais como filtros de média e nitidez, e os filtros de cor. Ajuste de gamma deve ser evitado, pois aplica uma alteração não linear da cor do pixel e assim pode afetar cada imagem diferentely ^14. Ao aplicar-se um tempo de exposição comum para imagens com poucas células (<1,000), isto pode conduzir a sobre-exposição e perda de fidelidade da imagem. Por outro lado, uma membrana com milhares de células pode exigir tempos de exposição mais elevados para evitar subexposição. Assim, é melhor prática para ajustar as imagens tão pouco quanto possível, e somente quando necessário, para manter a alta fidelidade de imagem possível.

Mesmo com uma alta fidelidade imagem, verdadeiros contagens de partículas pode ser severamente distorcida por partículas indesejadas. Quando usando a calculadora celular Concentração, se uma amostra contém quantidades significativas de restos celulares, especificamente de áreas semelhantes às de células em suspensão, esta pode enviesar o resultado. Em alguns casos, isto pode impedir análise automatizada, se os detritos não pode ser minimizada. Da mesma forma, as membranas ensaio de migração que contêm níveis elevados de coloração da cor de fundo semelhantes a células coradas ou não removidas células da parte traseira da membrana, provavelmente produzirá iresultados nPrecisão. Estas partículas indesejáveis ​​podem normalmente ser removidos em algumas maneiras: aumentando o brilho de origem ou tempo de exposição de luz, modificar o limiar de cores para ser mais rigorosas, ou removidas manualmente via 'Abrir imagem com contagens "(10.4). É importante notar que este protocolo produz a melhor qualidade de imagem necessária para CCC e TC para manter a precisão. No entanto, a TC é capaz de contar imagens de significativamente menos qualidade, ampliações diferentes, ou diferentes manchas de cor, geralmente somente exigindo mais tempo gasto em ajustes manuais (10.4).

Durante a calibração de qualquer imagem membrana ensaio de migração, é importante levar em consideração a resolução da imagem e o tamanho relativo das células. Conforme descrito anteriormente, Qualidade de Imagem (Q) ea recomendação de Calibração (CR) são dependentes de métricas gráfico de frequência de área de partículas. Das imagens analisadas, cada célula ocupa, em média, 1 / 100.000 doárea total da imagem. Quando se utiliza apenas imagens de milhões de pixels, com uma relação de tamanho de célula pequena, a variação no tamanho das células também é pequena. Isto é, a variação apenas poderá variar 10-60 px. Mas à medida que a área da célula a relação de área de imagem torna-se maior, a distribuição dos tamanhos de célula aumenta, a redução da curtose de uma distribuição normal de tamanho de células, diminuindo a frequência de uma determinada área. Este por sua vez pode fazer cálculo automático de área celular mais difícil ou impossível porque uma área mínima definida não pode ser determinada. Da mesma forma, isso também se aplica a imagens com poucos números de células, onde a frequência de diferentes tamanhos de células pode ser muito baixa (<50). Como resultado, quando a análise de imagens com diferentes resoluções que as utilizadas neste estudo ou diferentes distribuições do tamanho das células, pode ser necessário identificação manual da gama de tamanho de célula (10.3.3).

Significado e Direções Futuras

O ImageJ plug-in celular Counter foi inicialmente released em 2001 pelo Dr. Kurt De Vos e tem servido como um grampo para contagem de células manual para este dia. Para continuar a tendência de ferramentas disponíveis gratuitamente para a comunidade biológica, calculadora celular Concentração e contra ensaio de migração oferecem o próximo passo na ferramentas gratuitas para ajudar a aumentar a produtividade e reprodutibilidade inter-experimental de ensaios de migração. O resultado final de ensaios de migração é altamente dependente do número de células semeadas. Ergo uma contagem de células de confiança é uma necessidade para reprodutibilidade. Desta forma, CCC oferece tanto maior precisão, devido à maior certeza estatística de concentração de células e contagem de tempos mais curtos preservando a saúde das células.

Além disso, o resultado final de ambos os encaixes é uma contagem do número de células e não um índice relativo, tais como fluorescência. Vários outros protocolos que existem fluorescência medida após coloração, mas estes métodos sofrem de falta de sensibilidade ^13. Photoshop da Adobe oferece a sua própria análise de partículas tool mas o programa deve ser adquirido para uso e não oferece a análise pós-contagem disponíveis a partir da migração contador de ensaio ^20. Ambos os plugins contar com o recurso de contagem de partículas de ImageJ e, consequentemente, pode ser modificado pelo usuário final, editando as macros usadas por ImageJ. Isto oferece maior flexibilidade para o usuário para expandir o escopo dos plugins para outras partículas, criando novas macros. Maior desenvolvimento para aumentar a amplitude de partículas contáveis ​​e incorporar contribuições dos usuários finais é o próximo passo lógico. Ao combinar os princípios fundamentais do contador de células com uma análise algoritmo de contagem e pós-contagem automatizada, o que aumenta consideravelmente a facilidade com que os ensaios de migração pode ser processado sem qualquer perda de precisão. Os plugins estão disponíveis gratuitamente para download com instruções de instalação a partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required