Automatiserad kvantifiering och analys av cellräkning Rutiner Använda ImageJ Plugins

Abstract

National Institute of Health ImageJ är en kraftfull, fritt tillgänglig bildbehandlingsprogram svit. ImageJ har omfattande partikelanalysalgoritmer som kan användas på ett effektivt sätt att räkna olika biologiska partiklar. Vid räkning stort antal cellprover, presenteras den hemocytometer en flaskhals med avseende på tiden. Likaså räknar membran från migration / invasionsanalyser med ImageJ plugin Cell Counter, även om korrekt, är exceptionellt arbetsintensiv, subjektivt, och ökända för att orsaka smärta i handleden. För att lösa detta behov har vi utvecklat två plugins i ImageJ för den enda uppgiften att automatisk hemocytometer (eller känd volym) och migration / invasion cellräkning. Båda plugins lita på förmågan att förvärva högkvalitativa mikrofotografier med minimal bakgrund. De är lätta att använda och optimerad för snabb räkning och analys av stora provstorlekar med inbyggda analysverktyg för att hjälpa kalibrering av räkningar. Genom att kombinera principen kärnans of Cell Counter med en automatiserad räkningsalgoritm och posträkningsanalys, ökar detta i hög grad den lätthet med vilken migrationsanalyser kan bearbetas utan någon förlust av noggrannhet.

Introduction

In vitro cellräkning är en viktig grundteknik i ett brett spektrum av vävnadsodlingsexperiment. Noggrann bestämning av antalet celler i en kultur är väsentlig för experimentell reproducerbarhet och standardisering ^1,2. Cellräkning kan utföras manuellt med hjälp av en hemocytometer samt med hjälp av en mängd olika automatiserade metoder, alla med sina egna fördelar och nackdelar ^3,4,5. De flesta av de automatiserade metoder för cellräkning tillhör en av två klasser, de som använder Coulter princip eller flödescytometri. Coulter räknare utnyttja celler elektriskt motstånd för att bestämma cellantalet och storlek. De är snabba, korrekta och billigare än flödescytometrar. Men de är sällan används för endast cellräkning på grund av deras betydande kostnader jämfört med manuell räkning ^3. Flödescytometrar, å andra sidan, är dyra, men de har många tillämpningar, såsom cellräkning, analys av celler form, structure och mätning intern cellmarkörer ^4,5. Maskiner som använder någon av dessa två principer finns tillgängliga från många tillverkare. Manuell räkning är prisvärda men tidskrävande och föremål för partiskhet medan automatiserade metoder kommer med en bråkdel av den tid som krävs för manuell räkning men med hjälp av dyra maskiner ^6.

Andra vanliga cellodlingsförfaranden i cellrörlighet vitro, nämligen migration cell och invasion ^7. Migration och invasionsanalyser används ofta för att undersöka cellrörligheten och invasivitet som svar på en kemotaktisk respons. Dessutom är de allmänt används för att studera embryonal utveckling, differentiering, inflammatoriskt svar, och metastas av multipla celltyper ^7-11. Celler som har migrerat eller invaderade genom det porösa membranet av en migrationsanalys kan kvantifieras på två olika sätt. För det första genom färgning av cellerna med ett fluorescerande färgämne, dissociation from membranet, och kvantifiering med hjälp av en fluorescerande läsare ^12. En begränsning med denna metod för kvantifiering är att ingen post kan kvarhållas av membranen och det finns ingen möjlighet för ytterligare analys ^13. Den andra kvantifiering metod för migreras / invaderade celler som skall fixeras och färgas med fluorescerande färg eller mer allmänt, med cytologiska färgämnen såsom kristallviolett, toluidinblått eller hematoxylin; då celler kvantifieras manuellt med inverterade mikroskopiska bilder av dessa membran som är en mycket tidskrävande uppgift ^12,13.

För att övervinna nackdelarna med manuell cellräkning genomfördes två tillförlitlig och exakt automatiserade cellräknare för cellkoncentrationen och för analysen migration utvecklats. Dessa automatiserade cellräknare algoritmer utvecklades för ImageJ som en plugin med hjälp av Oracles Java datorspråk. ImageJ är en offentlig och allmänt använd bildbehandling verktyg som utvecklats av National Institute of Health (NIH) ^14,15; alltså, skriver dessa plugins för ImageJ underlättar enkel integrering i den biologiska.

Automatisering av cellräkning säkerställer hög genomströmning och reproducerbarhet jämfört med manuell räkning. Även andra tillgängliga program och plugins kan användas för att beräkna cellkoncentrationen genom bildanalys ^5,16,17, cellkoncentration Calculator plugin är snabb och kan även hantera utspädningar av celler och behandlingar. Dessutom kan alla resultat och beräkningar från dessa två diskar sparas och exporteras. De två plugins som beskrivs i detta dokument är optimerade för användning av ett faskontrastmikroskop för levande cell imaging och stort synfält (hela membran capture) avbildning för migration analysmembran med hjälp av en dissekera omfattning. De plugins är fritt tillgängliga för nedladdning med installationsanvisningar från: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. Förening Mikroskop och kamerainställningar (cellkoncentrationen Calculator)

1. Öka glödlampa ljusstyrka till full med ljusinställningsratten, växla till 4X objektiv, och se till fas kontrastfilter väljs.
   OBS: Alla inverterad faskontrastmikroskop för vävnadsodling med en mörk bakgrund, till exempel, PHP faskontrast, kan användas enligt standard mikroskop och kameraförfaranden.
2. Inom mikroskop programvara, ställa in bildtagningsinställningar till standardvärden.
   OBS: Se till mikroskopets instruktionsbok för att hitta platsen för dessa inställningar.
   1. Ställ in "ljusstyrka", "kontrast" och "mättnad" till 100% och "gamma" och "vinst" till 1,0.
      OBS: Beroende på programmet, "ljusstyrka" och "kontrast" kan standard till ett värde av 0% i stället för 100%.
   2. Ställ bilder som ska fångas i svartvitt med den högsta upplösningen tillgänglig före (1.600 x 1200 pixlar (px) eller högre).
      OBS: En "mättnad" på 0% är tillräckligt om en svartvit inställning är tillgänglig.
3. Placera en standard hemocytometer på mikroskop scenen och ta en bild som visas i (Figur 1A); detta är den "Volume Kalibrering bild". Justera exponeringen timing som krävs.

2. Bild Volym Kalibrering

1. Öppen ImageJ och från Plugins-menyn starta cellkoncentrationen Calculator (CCC) plugin, t.ex. Plugins> Analyzer> 'cellkoncentrationen Calculator ".
   1. Om den högra sidan "Image Volym Kalibrering 'panelen inte är synlig, klicka på" Kalibrera "för att visa det.
2. I ImageJ, öppna "Volume Kalibrering bild" från steg 1,3 (Arkiv> "Öppna") och i CCC klicka på "Hämta Bild Dimension" -knappen.
   OBS: Detta kommer att fylla i både bildbredd ochHöjd textrutor med bildupplösningen i pixlar automatiskt.
3. I ImageJ väljer du "Straight fodra bearbetar" bredvid markeringsverktygen och dra en rak linje tvärs över hela längden av hemocytometer primära (P) fyrkant visas i (Figur 1B) genom att klicka och dra markören.
   1. Tryck på "M" för att visa resultatfönstret innehåller de raka mätningar linjer. Skriv in värdet från Length kolumnen i "P-square Längd" textrutan i CCC (Figur 1B).
   2. Klicka på "Beräkna Image Volym" för att mata ut bildvolymen i bildvolymen textrutan. Alternativt, om volymen av bilden redan är känt, skriver volymen i nL i bildvolymen textrutan.
4. Klicka på "Spara".
   OBS: Insticksprogrammet är nu kalibrerad.

3. Kameraexponerings Kalibrering

1. Efter cell skörd förräkning via hemocytometer, belastning 10 mikroliter av celler till en kammare av hemocytometer och placera den på mikroskop scenen.
2. Med samma inställningar från steg 1,2, justera exponeringstiden så att bakgrunden linjer hemocytometer försvinna.
   1. Justera fokus så att det inre av cellerna är mörkare än cellmembranet, vilket tyder på fokus inom det centrala tvärsnittet av cellen och inte polerna.
   2. Ytterligare justera exponeringen så att cellerna inte är överexponerad och liknar de som visas i (Figur 1C).
      OBS: Svagt synliga hemocytometer linjer är acceptabla. Det rekommenderas att spara eller spela in dessa inställningar för att bibehålla noggrannhet och reproducerbarhet.

4. Image Acquisition

1. För varje cellprov, för att lasta 10 mikroliter i båda kamrarna i hemocytometer öka statistisk slutledning makt ^2. Placera hemocytometer på mikroskop scenenför avbildning.
   OBS: Upplösningen och förstoring av varje bild måste vara densamma som "Volume Kalibrering bild". Insticksprogrammet räknar alla bilder av alla valda mappen; håller bilder som ska räknas samman i samma mapp.
   1. Om ett filnamn automatisk ökning funktion är tillgänglig, slå på den och se till att varje bild visas inte efter att fånga för att öka genomströmningen.
      OBS: manuellt spara och stänga varje bild kommer att drastiskt fördröja processen. Se mikroskopet bruksanvisning för information om tillgängligheten av en automatisk ökningsfunktionen.
   2. Fånga åtminstone tre icke-överlappande bilder av den centrala delen av den hemocytometer även om mer (5-10) rekommenderas för att öka noggrannheten.
      OBS: Undvik både de övre och nedre områdena i kamrarna som celler tenderar att öka i densitet på båda platserna. Ta samma antal bilder för varje kammare. Detta krävs för väl fungerande plugin vid uppräkning.

   5. Bild Räkning och Späd

   1. I CCC, klicka på "Räkna celler" och observera Välj Directory dialogrutan. Välj en mapp som ska räknas.
   2. Observera antalet stickprov inmatningsrutan efter att ha valt en mapp. Ange antalet bilder som är tagna per kammare, det vill säga, 4.1.2, och klicka på "OK". Insticksprogrammet kommer nu att räkna alla JPG, TIFF och PNG-bilder i den valda mappen i alfabetisk ordning.
      OBS: Om du klickar på "Sample Viewer" knappen kommer att ta upp provvisningsfönstret visar information om de räknade prover. Provkoncentration är den genomsnittliga koncentrationen av alla bilder som tas per kammare. Prover med enhetslös koncentrationer kan läggas till denna lista, såsom tillsats av ett läkemedel eller liten molekyl behandling.
      1. Räkna cellprover om halterna varierar kraftigt inom räkningar av samma prov (avsnitt 4).
         OBS: För att beräkna späd för alla than räknade-prover, använder CCC automatiskt formeln C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Använd scenario av sådd 15.000 celler per 200 mikroliter i 30 brunnar i en 96-brunnar + 1 extra:
      1. Ställa in textrutan till höger om C2 märke till 15.000 och koncentrationen volymtextrutan till 200, ändra den intilliggande kombinationsrutan enhet till 'il'.
         OBS! Plugin slutändan kommer att beräkna koncentrationen i celler / ml.
      2. Se till kombinationsvolymrutan har V2 väljs (slutlig volym) och i textrutan till höger anger 6200 (200 pl x (30 + 1)), välja 'il' i kombinationsvolymenhet rutan.
   4. Klicka på "Beräkna Utspädning" för att lägga den för tillfället in utspädning till det nedre vänstra listrutan.
      OBS: För varje spädning tillsätts, kommer att lösas för varje prov och visas i träddiagrammet till höger. Dubbelklicka på varje post för att expandera.
   5. klicka than "Spara" knappen under "Sample Viewer" för att skriva till filen alla exempeldata och utspädningar.
   6. OBS: Dessa data kan återvinnas när som helst genom att klicka på "Load" och välja den sparade filen.

   6. Migration och Invasion (Counter)

   1. Utför migration och invasionsanalyser med hjälp av standard Boyden kammarmetod ^7-9.
   2. Efter celler har migrerat / invaderat försiktigt bort media i insatsen genom att vända och försiktigt knacka. Transportera bort eventuellt överskott av medier vidhäftade till botten av membranet genom att röra kanten till en pappershandduk.
      OBS: Rör inte membranet sig handduken, detta kan rubba vidhäftade celler.
   3. Fix och färga cellerna som rapporterats ^7-9 i en 24-brunnar ställa upp med varje rad innehåller ~ 500 mikroliter av en annan lösning, t.ex. Fixative, Stain 1 Stain 2, och dubbeldestillerat vatten (DDH ₂ O). Fyll en andra platta med 1x PBS to placera skären i före kapning.
   4. Tvätta insatserna genom att placera dem i brunnar fyllda med DDH ₂ O och fylla insatsen med DDH ₂ O. Töm vattnet innan badda bort celler genom inversion.
   5. Använd en ren bomull applikator för att avlägsna un-migrerade / un-invaderade celler från toppen av membranet noga med att inte skada membranet. Var noggrann runt kanterna på membranet.
   6. Skär membranet med hjälp av en rakkniv eller en skalpell och noggrant överföra membran (uppochned) på en ren glasskiva.
   7. Tillsätt en liten droppe monteringslösning under och på toppen av membranet och täck med ett tunt täckglas.
      OBS: Undvik att droppa bubblor inom monteringslösning för att bevara noggrannheten hos räknas.

   7. dissekera omfattning och kamerainställningar

   1. Slå på mikroskopets ljuskälla och kamera.
      OBS: Se till mikroskop bruksanvisning för detaljerade anvisningar.
   2. Kvickhethin Mikroskopet mjukvaru, som bildtagningsinställningar till standardvärden.
      OBS: Om en medelvärdesfunktion finns, rekommenderas ett värde av fyra. Detta är en bra kompromiss mellan graden av medelvärdes och bildinhämtningstiden. På samma sätt kan en liten grad av skärpning öka bildåtergivning.
      1. Ställ in "ljusstyrka", "kontrast" och "mättnad" till 100% och "gamma" och "vinst" till 1,0.
         OBS: Beroende på programmet, "ljusstyrka" och "kontrast" kan standard till ett värde av 0% i stället för 100%.
      2. Ställ display (realtid) och en upplösning på sin maximala inställningar (1600 x 1200 px och 2592 x 1944 px, respektive).
         OBS: Upplösning kan justeras efter behov om uppdateringsfrekvensen är för långsam. Lägre upplösningar kommer att göra det svårare att fokusera exakt men ökar uppdateringsfrekvensen.
   3. För stadiet dissekera omfattning, använd en solid vit background; en svart eller glas bakgrund är otillräcklig.
   4. Använda ovanstående steg ljuskälla, företrädesvis från två flexibla LED-lampor till höger och vänster om scenen.
      OBS: A nedan steg ljuskälla lyser porerna inom migrationsanalysen membran som negativt kan påverka riktigheten i efterföljande räkningar.
   5. Placera en färdig migration analysmembran glida på scenen. Om man tittar på realtidsbild visas av programvaran, justera förstoringen med zoomjusteringen ratten så att kanterna på en enda membran är bara inom kamerans synfält.
      OBS: Att placera objektglaset på en glasplatta overtop den vita bakgrunden steget gör det lättare att manövrera sliden för avbildning.
   6. Justera ljuskällepositioner (7.6.1) och exponeringstider för att så nära som möjligt den ideala bilden som visas i fig 2A. Beroende på ljusstyrkan, bör exponeringstider på 5-60 ms vara tillräckligt.
      NOTERA:Målet är att producera en bild med så lite bakgrundsfärg som möjligt och en likformigt belyst membran utan att minska bildåtergivning, dvs., överexponering leder till en förlust av synliga celler.
      1. Placera vänster och höger ljuskällor vid en låg vinkel i förhållande till bilden. Detta kommer att bidra till att undanröja bakgrund fläck och kromatisk aberration. Försök att hålla varje ljuskälla direkt motsatt till den andra.
         OBS: Även om manövrering varje ljuskälla på plats, vrid den andra utanför. Detta hjälper till att centrera området för belysningen på membranet självt enklare och noggrannare.
   7. Ta bilden och vitbalansen bilden med en enda knapptryckning i mikroskop programvara.
      OBS: Mikroskopet är nu kalibrerad. Rädda så många inställningar som möjligt för framtida bruk och ta del av ljuskällan positioner och intensitet.

   8. Image Acquisition och Flatfield

   1. Inom programmet, ställplats infångningsmappen, och fånga en bild per membran. Namnge bilderna enligt den allmänna mall: Namn - ###, till exempel, Control - 001.tif, Control - 002.tif, testläkemedel - 001.tif, och så vidare.
      OBS: För bästa bildresultat, spara typ bildfil som tiff över andra förstörande format som JPEG.
      OBS! Bilder som inte följer den allmänna mallen kommer fortfarande räknas men kommer inte att bli föremål för automatisk gruppering och platt Fielding.
      1. Om flatfield korrigering önskas, för varje bild finns en tom yta och ta en bakgrundsbild efter namnkonvention: Namn - Blank.
         OBS: En tom är ett område på bilden som innehåller något membran och representerar bakgrundsbelysningen.
      2. Omedelbart före avbildning, plattar varje membran genom att applicera tryck över täck och ta bort så många instängda bubblor som möjligt.
   2. I ImageJ, gå till Plugins och öppna TC plugin; t.ex. Plugins> Analysera> & #39, Transwell Counter ".
   3. Inom TC, klicka på "Flatfield knappen och observera Välj Directory dialogrutan. Välj den mapp där membran bilderna sparas.
      OBS! Endast bilder som sparats med den allmänna mallen ovan kommer automatiskt flatfield korrigeras och sparas i en ny mapp med namnet Flatfield inom den valda mappen. Se figur 2B för ett exempel på en flatfield korrigerad bild.

   9. konfigurationsinställningar

   1. Öppna en migrering analysmembran bild i ImageJ ( "File"> "Öppna") och välj Bild> Justera> 'Färg Threshold ... ". Observera Threshold fönster färg för att justera vilka färger kommer att filtreras ut ur bilden.
      1. Längst ner i fönstret, ställa Tröskling metod för att "Shanbhag" Threshold färg till "vita", och färgrymd till "RGB" (röd grön blå); avmarkera mörk bakgrund om vald.
      2. Justera toppenreglagen genom att klicka och dra markörerna till 0 och botten reglagen till 255 (lämna botten reglagen på 255). Se till att bilden är helt vit.
   2. Justera gröna och röda topp reglagen tills endast kärnorna är synliga.
      OBS: Inställningarna som väljs ut kommer att variera helt på cell fläcken används. Se figur 2C.
   3. I TC plugin, mata in värdena för RGB bästa reglagen till de tillhörande konfigurationsinställningar "RGB tröskel" textrutor. Klicka på "Lägg till / Ändra" knappen och skriva konfigurationen.
      1. Låt Storlekar undre och övre värdena på en - Infinity.
   4. Inom konfigurationsinställningar, klicka på "Spara" för att skriva inställningarna till hårddisken.

   10. Räkna bilder och kalibrering

   1. Öppna TC plugin (8,2) och klicka på "Räkna mapp" och observera Välj Directory dialogrutan. Välj den mapp som ska räknas ennd vänta tills den är klar.
   2. Varje räknade-prov läggs automatiskt till huvudtabellen. Nyckelkolumner är "Count", "kvalitet" och "Kalibrera?".
      OBS! Okalibrerade Count är antalet partiklar per membran inom området som visas i kolumnen "Area intervall".
      OBS: Kvalitet varierar från cirka -0,8 till 1,7; Q ≥ 0,5 är acceptabelt.
      1. Observera en bock i "Kalibrera? kolonn om en bild flaggas för kalibrering baserad på dess likhet med den ideala mätvärden.
         OBS: Både kvalitet och kalibrering kan tyda på att de aktuella inställningarna är möjligen otillräckligt. Om efter lämplig "Color Tröskling" och "storleksintervall" har valts ut och kalibrering fortfarande föreslås, kontroll av den ursprungliga och räknade bilder ska vara den sista faktorn för en giltig räkning.
   3. Välj alla prover i tabellen flaggade för kalibrering.
      1. Högerklicka i than tabell och väljer omräkning> 'Föreslagen storlek ". Detta kommer att berätta bilderna med en föreslagen minsta partikel område.
      2. Högerklicka igen och välj "Visa Plot". Observera frekvenspunktdiagram av partikel områden. En perfekt bild kommer att ha en graf som liknar en lång höger tailed normalfördelning, dvs kurvan. Se figur 3B.
      3. Justera lägre storleksintervall om så erfordras, genom att välja prov, högerklicka och välja omräkning> "Manuella inställningar". Observera manuell dialogrutan inställningar. Ange önskade inställningar och klicka på Räkna att räkna bilden med de nya inställningarna.
   4. Att justera räknas manuellt väljer proverna, högerklicka på tabellen och välj "Öppna bild med räknas". Observera den ursprungliga bilden med röda markeringar som representerar varje partikel räknas av plugin.
      OBS: Redovisa ärligt> 'Visa räknade binär bild "kan vara användbart för att kontrollera hur väl jagndividual celler håller på att lösas av färgtröskel.
      1. För att lägga till en räkning, hålla "Ctrl" och vänsterklicka. Observera en markör vid markören som kommer att läggas till proven total räkna. För att ta bort en markör, högerklicka på bilden. Insticksprogrammet kommer att ta bort markeringen närmast markören.
      2. För att ta bort en grupp av markörer använder ett markeringsverktyg i ImageJ för att välja ett område av intresse (ROI). Håll "Ctrl", högerklicka på bilden och alla markörer inuti ROI kommer att tas bort. Observera mobilnummer i "Greven" kolumnen.

   11. Spara / Öppna Resultat och exportera till CSV

   1. I TC, gå till menyraden och klicka på "Arkiv"> "Spara resultat". Observera dialogrutan Spara Resultat ruta. Välj ett namn och destination och klicka på "Spara".
      1. Använd "Arkiv"> "Öppna resultat" för att ladda en fil som innehåller alla data som visas i huvudtabellen, including tomten.
         OBS: Resultaten filen sparas kataloger bilderna sparas i Om originalbilderna flyttas efter att ha sparat, "Öppna originalbilden" och "Öppna bild med räknas 'funktioner kommer att misslyckas..
      2. För att återställa bildkatalogen, välj proverna, högerklicka på tabellen och välj "Återställ bildkatalog". Observera Välj Directory dialogrutan. Välj den nya mappen och om bilderna finns, kommer katalogerna återställas. Åter spara resultatfilen.
   2. Om du vill spara en kommaseparerade värden (CSV-fil), i menyraden gå till "Arkiv"> "Exportera till CSV". Detta ger en fil med prover organiserade i statistiska grupper med medelvärdet räkna och standardfelet för medelvärdet; dess layout är utformad för snabb graf i vanliga grafiska program.
      OBS: De statistiska grupperna är baserade på grupper som har skapats i TC.
      1. Om proverna följer den allmänna namn mallen väljer proverna vara grouped, högerklicka och välj "Auto gruppering". Detta lägger prover med samma "namn" till samma grupp. Använda exempel Control - en, Control - 2, behandling - en, behandling - 2: båda kontrollerna skulle läggas till i gruppen "kontroll" och behandlingar för att "behandling".
      2. Lägg prover manuellt till grupper genom att dubbelklicka provets "grupp" cell och skriva in gruppnamnet. Välj de prover som ska läggas till denna grupp, högerklicka och välj "Lägg till i grupp".

Representative Results

Cellkoncentrationen Calculator

Figur 1 visar den övergripande processen med CCC kalibrering och uppräknelig bildtagning. Figur 1A och 1B skildrar P-square kalibreringsbild och beräkning av P-square längd i pixlar. CCC bestämmer cellkoncentrationen i en given volym med hjälp av formeln:

En hemocytometer s P-ruta har en volym av 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) och med tanke på denna konstant, kan den totala bildvolymen beräknas efter omvandling pixlar till mm. Figur 1C är en idealisk uppräknelig bild med fokus celler visar den karakteristiska fasen belysning och inga bakgrunds hemocytometer graderingar. Slutligen punktdiagram av Figure 1D visar en starkt korrelerade, manuell kontra automatisk räkning av celler från 57 bilder tagna under olika experiment och celltyper inklusive HTR8, ES-2, och Swan71. Notera den övre gränsen för koncentrationen var ~ 5,6 x 10 ⁶ celler / ml med en låg slutet av ~ 2,3 x 10 ³ celler / ml (≈ 5 celler per bild). Det föreslås att om räkningar är under 10-15 celler per bild, bör provet suspenderas i en mindre volym för att öka den statistiska styrkan.

Förvärv och bearbetning av bilder för migration analys Counter

Hundratals migrationsanalysmembran avbildades under många experiment, som alla ympades med den mänskliga trofoblasten cellinjen HTR8, Swan71, eller äggstockscancer-cellinje ES-2. Av dessa bilder, flera valdes att representera ett antal kategorier från mycket dålig till utmärkt kvalitet baserad på ljusstyrka, klarhet och färg av stained celler, och graden av bakgrundsfärgning och oönskade partiklar (buller). Med hjälp av dessa bilder, standard RGB Threshold färginställningar (≈ 150, 120, 0) bestämdes (figur 2C) och används som en baslinje i alla efterföljande utvecklingen av algoritmen. Målet var att maximera kärn färg till total färgförhållande, det vill säga, bör majoriteten av färgade pixlar vara inom cellkärnor. Den övre panelen i figur 2A visar den idealiska ljusstyrka, cell kärnor klarhet och färg, och försumbar bakgrundsljud. Ljusstyrkan på bilden är viktigt att se till att det finns en tillräckligt stor kontrast mellan cell och bakgrund för att producera en svartvit binär bild.

Om denna skillnad inte uppfylls, kan stora eller oförutsägbara områden räknas av ImageJ analysera partiklar funktion; bästa fall är en helt vit bakgrund. I opposition, den undre panelen av Figur 2A har extrem bakgrundsfärgning och celler som är nästan omöjliga att särskilja. Membran med denna grad av färgning kommer sannolikt leder till otillförlitliga resultat från migrationsanalysen räknaren.

I vissa fall kan öka ljusstyrkan till en idealisk nivå påverkar bildåtergivning genom överexponera bilden. På liknande sätt kan hög exponering eller ljusstyrka producera system kromatiska effekter med progressiv eller oregelbunden ljusa och mörka områden. Med flatfield korrigering, kan dessa effekter minimeras eller avlägsnas helt och hållet, såsom visas i figur 2B (övre vs. undre panelen). Dessutom är flatfield korrigering ett bra sätt att utjämna ljusstyrkan flera membran bilder.

Kalibrering och validering av migrations analys Counter

Att hjälpa osser i bättre avgöra om migration analysmembran bilder uppfyller de nödvändiga kriterierna för noggrann räkning, var två kval utformade, som kallas bildkvalitet (Q), och kalibrering rekommendation (CR). Viktigt är båda kval, som namnet CR antyder, är endast rekommendationer och fungerar som guider snarare än absoluta domare i countability av varje bild. Både Q och CR är baserade på statistik från frekvenspunktdiagram av partikelområdet (10.3.2). För enkelhetens skull kan en metrisk betraktas som olika former av kurvan som utgör frekvens tomt. Den önskade måttenheten av en adekvat Q (≥0.5) bestämdes med den observerade approximativa normal fördelning av cellstorlek. Vanligen, celler som är olöslig från varandra, över färgade eller bara särskilt stor, flytta skewedness till en höger tailed normalfördelning (figur 3B). Som sådan, är detta den perfekta mått på en typisk kalibrerad bild. Medtillsats av bakgrundsbrus, leder detta normalt till ett stort antal partiklar i 5/1 pixelområde intervall (Figur 3A). För att beräkna tomten mätvärden, är data försedda med tio Savitzky-Golay utjämnade kurvor med olika polynom grader produceras av Michael Thomas Flanagan Java Scientific Library (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /java/). I huvudsak skapar detta flera punkter i det ungefärliga området av varje extrem. Genom en serie av densitet kluster kartor över lokala minima och maxima, kan en allmän bild av tomten mätvärden beräknas som en ordnad lista, det vill säga, minimum, maximum, minimum / maximum överlappningen, ..., n: ^te extremum. I korthet, i vilken grad de utjämnade kurvor passar datafrekvensen avgör hur tätt packade extrempunkter är. Ju större kluster av icke överlappande extrema blir större Q. I teorin, Q representerar bildskärpan baserat på than fördelning av olika partikelstorlekar.

Huruvida Boolean CR är sant eller inte beror på sekvensen av extrem. Från figur 3A, skulle den ordnade listan vara minimum, maximum, och en sekvens av överlappande extrem baserat på egenskaperna hos den Savitzky-Golay-kurvan. Eftersom figur 3A representerar en okalibrerad bild, denna allmänna sekvens av Extrema flaggor CR som sanna, vilket tyder på att användaren att bilden kan behöva kalibreras. Rör sig framåt, kan det ses att från figur 3B, skulle denna lista vara identiska men med uteslutande av den första minimum. Således statistik från ideala okalibrerade och kalibrerade bilder bestämdes. Avvikelser från dessa mätvärden i allmänhet flaggar en bild för kalibrering och minska Q ≤ 0, såsom fallet med den höga bakgrundsljud membran i figur 3C. Tillämpningen av dessa kval till ett urvalblygsamma utmärkta bilder, med avseende på ljusstyrka och bakgrundsljud, är det klart att kalibrerade bild räknas är betydligt närmare manuella räkningar än okalibrerade (1,9% ± 0,3 jämfört med 21,7% ± 2,9 respektive Figur 3D, E). Med tanke på den övergripande hög kvalitet på bilder som valts för analys (okalibrerade = 0,71 ± 0,04; medelvärde ± SE), fanns det en förväntad måttlig ökning endast i Q efter kalibrering ( = 0,90 ± 0,04). Sammantaget föreslår Q den totala countability potentialen hos en bild medan CR är en stark indikator på om kalibreringen lyckas eller inte.

Tids Jämförelser av både cell Koncentration Counter och migration analys Counter

Figur 4A jämför CCC kalibreringstiden mellan Användare 1 och 2. Som förväntat, Användare 1 var betydligt snabbare än Användare 2, tillsammans med i genomsnitt cirka fem minuter för CCC kalibrering. För att kunna jämföra manuell hemocytometer räkna och automatiserade priser, var den manuella hastighet att räkna med hjälp av en räknare jämfört med den tid det tog att ta nio bilder av hemocytometer kammaren och räknas i CCC (Figur 4B). En typisk cellkoncentration av 1,15 x 10 ⁶ celler / ml användes för att jämföra tidsinställningar, vilket leder till ett genomsnitt på 1x ökad genomströmning. Denna hastighet kommer att variera beroende på antalet celler laddas ihemocytometer som den totala tid det tar att ta bilder och bearbeta dem är oberoende av cellantalet.

Slutligen har timings omfattar bildupptagning av membran, kvantifiering inom TC, och manuella justeringar av dessa bilder mätt i figur 4C. Noterbart var 12 migration analys membran med låg cellantal (Total = 10,571 celler) och betydande bakgrundsfärgning och cellrester valt att underlätta ett värsta scenario som skulle kräva manuella justeringar mobilnummer. Detta återspeglas i figur 4C justering kolonn (adj) där det tog i genomsnitt 13 minuter för att avlägsna oönskade räknas och lägga missade celler. För jämförelse med manuell räkning, har optimala cellräkningshastigheter bestämdes med Cell Counter; membran bilder med hög celldensitet av hög kvalitet användes (resultat ej visade). Detta gav en genomsnittlig maximal hastighet mellan Användare 1 och 2 av 9,1 x 10 ³ celler / h(~ 2,5 celler / s). Med dessa värden, membranen från figur 4C räknade 4.4x snabbare med TC än vad som skulle förväntas vid maximal manuell hastighet. Tidsbesparingen är direkt beroende av antalet celler och bildkvalitet, genom att räkna migrationsmembran som krävs liten eller ingen anpassning och hög celltäthet (~ 7000 celler / membran), TC genererade celltal 1,395x snabbare än den maximala manuell hastighet.

Figur 1: cellkoncentrationen Calculator. (A) faskontrast mikroskop av den centrala primär kvadraten på hemocytometer tagen vid 40X total förstoring. Skala stapel representerar 200 nm. (B) beskurna delen av bilden från (A) visar vilken längd för att mäta på hemocytometer. Resultatfönstret Längd kolonn uppmärksammades för enkel identifiering. yellow bar= 1 mm. (C) En idealisk mikrofotografi av en hemocytometer innehållande HTR8 celler efter mikroskop och mjukvarukalibrering vid 40X total förstoring med en upplösning på 1600 x 1200 px. Skalstreck = 200 | j, m. (D) En punktdiagram som jämför manuella räkningar med hjälp av ImageJ plugin Cell Counter jämfört med automatiserade räkningar av samma bilder med hjälp av cellkoncentrationen Calculator. n = 57 bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Migration analysen motverka representativa bilder. (A) Den övre panelen är en en åttondel del av en total membran som visar en ideal bild med minimal bakgrund; Skalstreck = 200 | j, m. Deundre panelen innehåller en bild med betydande bakgrundsfärgning som allvarligt påverkar riktigheten i den automatiska räkningen; Skalstreck = 585 | j, m. (B) Den övre panelen representerar en mörk bild av god kvalitet som producerade felaktiga räkningar. Den nedre panelen är en uppräknelig version av samma bild efter flatfield korrigering. Skalstrecken = 593 | j, m. (C) Den övre panelen representerar en inzoomad bild av en typisk membran. Den undre panelen är samma bild, följt av den önskade ImageJ färg tröskling (RGB Threshold = 150, 120, 0) för att avlägsna intercellulär bakgrund och majoriteten av den synbart färgade cytoplasman. Alla bilder togs vid 1.35X total förstoring med en kalibrerad dissekera omfattning med en upplösning på 2592 x 1944 px från flera migrationsanalys invasioner av HTR8 färgade med hematoxylin. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att tävlawa större version av denna siffra.

Figur 3: Kalibrering och validering av migrationsanalys c ounter. (A) typiskt exempel på en okalibrerad bild av hög kvalitet. (B) Den kalibrerade version av (A) med hjälp av migrationsanalys räknarens omräkning> 'Föreslagen storlek ". (C) En typisk frekvens tomt på en låg bildkvalitet membran med betydande bakgrund fläck eller totalt mörker. (D) En punktdiagram som jämför manuella räkningar med hjälp av ImageJ plugin Cell Counter och migration analysräknaren automatiserade räknas. (E) ett stapeldiagram som visar den genomsnittliga procent skillnaden kalibrerad mot okalibrerade automatiserade räknas. Data är medelvärde ± SE. P <0,0001, n = 30, oparat t-test med Welch correction. Samma bilder användes för D och E. Kalibrering av båda gjordes med omräkningen> 'Föreslagen storlek "och omräkning>' Manuella inställningar" för att ytterligare förfina den minsta storleken räknas och tröskel färg. Inga manuella justeringar räkna gjordes med hjälp av "Öppna bild med räknas 'funktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Tidpunkt för cellkoncentrationen Counter och migration analys motverka användning. (A) Jämförelse av CCC kalibrerings gånger (steg 1 och 2) mellan Användare 1 (CCC / TC expert) och Användare 2 (CCC / TC nybörjare). (B) manuell cellräkning tider medelvärde under fem försök och uttrycks i celler räknade per min. automac räknar beräknades genom genomsnitt gånger för att ta nio bilder av en hemocytometer kammare och räknades med CCC. Cellkoncentrationen som användes var ~ 1,15 x 10 ⁶ celler / ml. Data är medelvärde ± SE. n = 5. (C) Transwell Counter tider jämfördes över tre kategorier: förvärv (Acq, steg 7 och 8), kvantifiering (Ant, steg 10.1-10.3.3 använder standardkonfiguration) och manuell justering (Adj; stegen 10,4 -1.4.2). Membranen kvantifieras hade en hög grad av bakgrundsfärgning och skräp för att göra det nödvändigt väsentlig manuell justering för noggranna räknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Kritiska steg, felsökning och begränsningar

Själva karaktären av automatiserade beräkningsmetoder, särskilt de av partikelanalys, kräver den matematiska förmåga att definiera dessa partiklar. Följaktligen är riktigheten i både cellkoncentrationen Calculator och migration analysräknaren majorly beroende på bilden trohet, det vill säga hur nära den tagna bilden liknar provcellen eller migrationsanalys membran. Det är därför av yttersta vikt att följa mikroskop och tillhörande programvarukalibreringsprotokoll så bra som möjligt. Detta inkluderar att begränsa bakgrundsljud, minska oönskade partiklar, fånga ljus och enhetligt i fokus bilder, och spara i icke-förstörande filformat som TIFF. Således, båda plugins kommer sannolikt att ge felaktiga resultat om dessa krav inte uppfylls. Det är därför alltid bra att dubbelkolla kroppar för att bestämma om de matchar visuella förväntningar när dubbt. Om det verkligen resultaten inte stämmer överens, att jämföra den ursprungliga bilden med den binära bilden kan hjälpa belysa frågan (10,4 not). I vissa fall kan mörkare migration analys bilder innehåller stora områden som har räknats på grund av pixelvärden som faller inom tröskelfärggränser. I allmänhet kommer att använda en flatfield bild bort mörkret och blotchiness och förhindra mest oönskade räknas på grund av kromatisk oegentligheter.

Med tanke på dessa möjliga och relativt vanliga problem, är det viktigt att följa standardbildintegritets riktlinjer som de som föreslagits av Nature Publishing Group och andra ^13. För att hålla räknas konsekvent, om någon justering av en bild tillämpas lika för alla andra. Detta inkluderar, men är inte begränsat till kontrast, mättnad, ljusstyrka, förstärkning, filter, såsom medelvärdes och skärpa, och färgfilter. Justering av gamma bör undvikas eftersom det gäller en icke-linjär förändring av pixel färg och så kan påverka varje bild olikaly ^14. Vid tillämpning av ett gemensamt exponeringstid för bilder med få celler (<1000), detta kan leda till överexponering och förlust av bild trohet. Omvänt kan ett membran med tusentals celler kräver högre gånger exponering för att förhindra underexponering. Följaktligen är det bästa praxis att justera bilder så lite som möjligt, och endast när det behövs, för att upprätthålla den högsta bildåtergivning uppnås.

Även med en high fidelity bild, kan sanna partikelräkningar vara allvarligt skev av oönskade partiklar. Vid användning av cellkoncentrationen kalkylator, om ett prov innehåller betydande mängder cellspillror, speciellt i regioner som liknar dem av suspenderade celler, kan detta skeva resultatet. I vissa fall kan detta hindra automatiserad analys, om skräpet inte kan minimeras. På samma sätt, för att migrering analysmembran som innehåller höga nivåer av bakgrundsfärgning av liknande färg färgade celler eller unremoved celler från baksidan av membranet, sannolikt kommer att producera inExakt resultat. Dessa oönskade partiklar kan normalt tas bort på flera sätt: öka ljuskällan ljusstyrka eller exponeringstid, ändra färgtröskel att vara strängare eller manuellt avlägsnas via "Öppna bild med räknas" (10,4). Det är viktigt att notera att detta protokoll framställer den optimala kvaliteten på bilden som krävs för CCC och TC för att bibehålla noggrannhet. Men är TC kan räkna bilder av betydligt sämre kvalitet, varierande förstoringar, eller olika färgfläckar, i allmänhet bara kräver mer tid på manuella justeringar (10,4).

Under kalibrering av den migration analysmembran bild är det viktigt att ta hänsyn till upplösning av bilden och den relativa storleken av cellerna. Som tidigare beskrivits, bildkvalitet (Q) och kalibrering rekommendation (CR) är beroende av frekvens tomt mått av partikelområdet. Av bilderna analyserats, tar varje cell upp i genomsnitt 1 / 100.000 av dentotala bildområdet. Vid användning av bilder av bara miljontals pixlar med en liten cell storleksförhållandet är också liten variation i cellstorleken. Det vill säga, variansen får endast variera 10-60 px. Men eftersom cellområdet bildareaförhållandet till blir större, fördelningen av cellstorlekar ökar, vilket minskar Kurtosis av cellstorleken normalfördelning genom att minska frekvensen för ett givet område. Detta i sin tur kan göra automatiserad beräkning av cellytan svårare eller omöjligt eftersom en bestämd minimiareal inte kan fastställas. På liknande sätt gäller detta även för bilder med få antal celler där frekvensen hos olika cellstorlekar kan vara mycket låg (<50). Som ett resultat, när man analyserar bilder med olika upplösningar än de som användes i denna studie eller olika fördelningar av cellstorlek, kan behövas manuell identifiering av cellstorleksområde (10.3.3).

Betydelse och framtida inriktningar

ImageJ plugin Cell Counter ursprungligen released 2001 av Dr Kurt De Vos och har fungerat som en stapelvara för manuell cellräkning i dag. Att fortsätta utvecklingen av fritt tillgängliga verktyg för den biologiska, cellkoncentration Calculator och migration analys motverka erbjuda nästa steg i kostnadsfria verktyg för att öka genomströmningen och inter experimentell reproducerbarhet av migrationsanalyser. Slutresultatet av migrationsanalyser är starkt beroende av antalet celler seedade. Ergo en pålitlig celltal är en nödvändighet för reproducerbarhet. På detta sätt, CCC erbjuder både ökad noggrannhet till följd av högre statistisk säkerhet av cellkoncentrationen och kortare count gånger bevara cellhälsa.

Dessutom är slutresultatet av båda plugins en räkning av antalet celler och inte en relativ index såsom fluorescens. Olika andra protokoll finns denna åtgärd fluorescens efter färgning men dessa metoder lider av brist på känslighet ^13. Adobe Photoshop erbjuder sin egen partikelanalys tOOL men programmet måste köpas för användning och erbjuder inte efterräkning analys tillgänglig från migrationsanalys räknaren ^20. Båda plugins förlita sig på partikelräkning funktionen från ImageJ och därför kan ändras av slutanvändaren genom att redigera makron som används av ImageJ. Detta ger större flexibilitet för användaren att utvidga omfattningen av plugins till andra partiklar genom att skapa nya makron. Vidareutveckling för att öka bredden av uppräkneliga partiklar och införliva slutanvändaravgifter är nästa logiska steg. Genom att kombinera de grundläggande principerna i Cell Counter med ett automatiserat räkningsalgoritm och efterräkning analys, ökar detta i hög grad den lätthet med vilken migrationsanalyser kan bearbetas utan någon förlust av noggrannhet. De plugins är fritt tillgängliga för nedladdning med installationsanvisningar från: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required