ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

Abstract

Sağlık ImageJ National Institute güçlü, serbestçe kullanılabilir görüntü işleme yazılımı paketidir. ImageJ çeşitli biyolojik partiküller saymak için etkili bir şekilde kullanılabilir kapsamlı parçacık analizi algoritmaları. hücre örneklerinin çok sayıda sayım yaparken, hemositometre zaman açısından bir darboğaz sunar. Aynı şekilde, ImageJ eklentisi Cell Counter ile göç / işgali deneyleri gelen zarları sayma doğru olsa da, bilek ağrılarına sebep için son derece emek yoğun sübjektif ve rezil. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz otomatik hemasitometre (ya da bilinen hacim) ve göç / işgali hücre sayımı tek görev için ImageJ içinde iki eklentileri geliştirmiştir. Her iki eklentileri minimum arka plan ile yüksek kalitede mikrograflar elde etmek yeteneğine güveniyor. Bunlar, kullanımı kolay ve sayıları kalibrasyonunu yardımcı olmak için yerleşik analiz araçları ile geniş örneklem boyutları hızlı sayım ve analiz için optimize edilmiş. Çekirdek prensibini birleştirerekotomatik sayım algoritması ve sonrası sayma analizi ile Cell Counter s, bu büyük ölçüde göç deneyleri doğruluk kaybı olmaksızın işlenebilir kolaylığını artırır.

Introduction

In vitro hücre sayımı olarak doku kültürü deneyleri, geniş bir aralık içinde bir önemli temel bir tekniktir. Doğru bir kültürde hücre sayısının belirlenmesi deney tekrarlanabilirlik ve standardizasyon ^1,2 için gereklidir. Hücre sayımı bir hemasitometre kullanarak yanı sıra otomatik çeşitli yöntemler, kendi avantajları ve dezavantajları ^3,4,5 her kullanılarak elle yapılabilir. hücre sayımı için otomatik yöntemlerin çoğu iki sınıfa Coulter prensibini kullanın veya akım sitometri olanların birine ait. Coulter sayaçlar hücre sayısını ve boyutunu belirlemek için hücreler elektriksel direnç yararlanmak. Onlar akış sitometrelerinde daha hızlı, doğru ve ucuzdur. Ancak, nadiren manuel sayım ³ ile karşılaştırıldığında nedeniyle önemli ölçüde eksiksiz tek hücre sayımı için kullanılır. Öte yandan, sitometre akış pahalıdır fakat, hücre sayımı, hücreler şekil, st analizi maddesi olarakkezlerinin ve ölçüm dahili hücre ^4,5 işaretleme kalemler. Bu iki ilke birini kullanın makineler birçok üretici edinilebilir. Otomatik yöntemler elle sayım için gerekli zamanın bir kısmı ile geliyor ama pahalı makineler ⁶ kullanırken manuel sayım uygun fiyatlı ama zaman alıcı ve önyargı tabidir.

Diğer yaygın hücre kültür işlemleri in vitro hücre motilite deneyleri, yani, hücre göçü ve yayılması ⁷ bulunmaktadır. Yer değiştirmesine ve istilasma deneyler genellikle bir kemotaktik yanıtı yanıt olarak, hücre motilitesinin ve invazyon araştırmak için kullanılır. Buna ek olarak, yaygın olarak birden fazla hücre tipleri ^7-11 embriyonik gelişimi, farklılaşma, enflamatuvar yanıtı ve metastazı çalışma için kullanılır. Bir göç testinin gözenekli zarından göç veya işgal Hücreler iki farklı şekilde belirlenebilir. İlk olarak, bir floresan boya ile boyanması, ayrışma ile sağa solaBir floresan okuyucu ¹² kullanılarak membran ve miktarının m. Miktar, bu yöntemin bir sınırlaması bir kayıt membran muhafaza edilebilir ve daha fazla analiz ¹³ imkanı olmasıdır. Taşınan ikinci ölçümü yöntemi / sabit ve kristal viyole, toluidin mavisi veya hematoksilen olarak sitolojik boyalar ile daha sık floresan boya veya, ile boyanmış hücrelerin işgal edildi; Daha sonra hücreler elle çok zaman alan bir görev ^12,13 olan bu membranların ters mikroskopik görüntüleri kullanılarak ölçülür.

kılavuzu hücre sayımı dezavantajlarını aşmak için, hücre konsantrasyonu ve göç deneyi için iki güvenilir ve doğru otomatik hücre sayaçları geliştirilmiştir. Bunlar otomatik hücre sayıcı algoritmaları Oracle'ın Java bilgisayar dili kullanarak bir eklenti olarak ImageJ için geliştirilmiştir. ImageJ Hea Ulusal Enstitüsü tarafından geliştirilen bir kamu ve yaygın kullanılan görüntü işleme aracıdırinci (NIH) ^14,15; böylece, ImageJ için bu eklentileri yazma biyolojik topluluk içine kolay entegrasyon kolaylaştırır.

hücre sayımı otomasyonu elle sayım kıyasla yüksek üretim ve tekrarlanabilirlik sağlar. Diğer uygun yazılım ve eklentiler görüntü analizi ^5,16,17, hücre konsantrasyonu Hesap eklenti aracılığıyla hücre konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilir, ancak hızlı ve aynı zamanda hücre ve tedavi dilüsyonları işleyebilir. Ayrıca, bu iki sayaçları tüm sonuçlar ve hesaplamalar kaydedilir ve ihraç edilebilir. Bu yazıda anlatılan iki eklentileri diseksiyon kapsamı kullanımı yoluyla canlı hücre görüntüleme ve göç tahlil membranların için büyük görüş alanı (tüm membran yakalama) görüntüleme için bir faz kontrast mikroskop kullanımı için optimize edilmiştir. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: eklentileri yükleme talimatları indirmek için serbestçe kullanılabilir.

Protocol

1. Bileşik Mikroskop ve Kamera Ayarı (Hücre Konsantrasyon Hesaplama)

1. Işık ayar düğmesi ile tam ampul parlaklığını artırmak 4X objektif lens geçmek ve faz kontrast filtreleri seçilmiş olduğundan emin olun.
   NOT: koyu arka plan ile doku kültürü için herhangi bir ters faz kontrast mikroskop, örneğin, PhP faz kontrast, standart mikroskop ve kamera prosedürleri takip kullanılabilir.
2. mikroskop yazılım içinde, varsayılan değerlere görüntü yakalama ayarlarını.
   NOT: Bu ayarların yerini bulmak için mikroskop kullanım kılavuzuna başvurun.
   1. 'Parlaklık', 'kontrast' ve% 100 'doygunluğu' ve 'gama' ve 1.0 'kazanç' olarak ayarlayın.
      NOT: yazılıma bağlı olarak, 'parlaklık' ve 'kontrast' bir% 0 değeri yerine% 100 varsayılan.
   2. Set görüntüler siyah ve beyaz yüksek çözünürlüklü availabl kullanarak çekileceke (1600 x 1200 piksel (px) veya daha fazla).
      NOT: Siyah ve beyaz ayar kullanılamaz ise% 0 'doyma' yeterlidir.
3. Mikroskop sahneye bir standart hemasitometre yerleştirin ve (Şekil 1A) 'de gösterildiği gibi bir görüntü yakalamak; Bu 'Ses Kalibrasyon görüntü "dir. gerektiği gibi poz zamanlamasını ayarlayın.

2. Görüntü Ses Kalibrasyon

1. Açık ImageJ ve Eklentiler menüsünden, Hücre Konsantrasyon Hesaplama (CCC) eklentisi, örneğin, Eklentiler> Analiz> 'Hücre Konsantrasyon Hesaplama' başlar.
   1. Sağ tarafının 'Görüntü Ses Kalibrasyonu' paneli görünür değilse, bunu göstermek için 'kalibre' üzerine tıklayın.
2. ImageJ, 'Get Görüntü Dimension' düğmesine adım 1.3 ( 'Dosya'> 'Aç') dan ve CCC tıklama 'Cilt Kalibrasyon görüntüsünü' açın.
   NOT: Bu, hem Görüntü dolduracaktır Genişlik veotomatik piksel görüntü çözünürlüğü ile Yükseklik metin kutuları.
3. ImageJ, seçim araçları 'Düz Hat Aracı' sonraki seçin ve tıklayıp imleci sürükleyerek (Şekil 1B) gösterilmiştir -Kare hemositometre birincil (P) tüm uzunluğu boyunca düz bir çizgi çizin.
   1. Düz çizgi ölçümleri içeren Sonuçları penceresini görüntülemek için 'M' tuşuna basın. CCC 'P-kare Uzunluk' metin (Şekil 1B) içine Süre sütunundaki değeri yazın.
   2. çıkışına 'Resim Volume hesaplayın' düğmesine Görüntü Ses metin içine resim hacmini tıklayın. Görüntünün hacmi zaten bilinen Alternatif olarak, Görüntü Ses metin içine nL hacim yazın.
4. 'Kaydet' butonuna tıklayın.
   NOT: Eklenti şimdi kalibre edilir.

3. Kamera Pozlama Kalibrasyon

1. için aşağıdaki hücre hasathemasitometre bir odasına hemasitometre, yük hücreleri 10 mcL yoluyla sayma ve mikroskop sahneye yerleştirin.
2. hemasitometre arka plan çizgileri kaybolur, böylece adım 1.2 den aynı ayarları kullanarak, pozlama süresini ayarlayın.
   1. Hücrelerin iç merkez enine hücre bölümüne değil, kutuplar içinde odağı belirten hücre zarı daha koyu olacak şekilde odağı ayarlayın.
   2. Dahası hücreler aşırı pozlanmış olmayacak şekilde pozlamayı ayarlayın ve (Şekil 1C) tasvir benzemektedir.
      NOT: Biraz görünür hemositometre hatları kabul edilebilir. Doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlamak için bu ayarları kaydetmek veya kayıt tavsiye edilir.

4. Görüntü Alma

1. Her hücre örneği için, hemasitometre her iki kanadında içine yük 10 uL istatistiksel çıkarsama gücünü ² artırmak. Mikroskop sahnede hemasitometre yerleştiringörüntüleme için.
   NOT: Her resmin çözünürlük ve büyütme 'Ses Kalibrasyon görüntü' aynı olmalıdır. eklenti seçilen herhangi bir klasörün tüm görüntüleri sayar; tutmak görüntüler aynı klasörde birlikte sayılacak.
   1. Bir dosya adı otomatik artış işlevi varsa, açın ve her resim yeteneğini artırmak için ele geçirdikten sonra gösterilen olmadığından emin olun.
      NOT: El tasarruf ve büyük ölçüde süreci yavaşlatacak her görüntüyü kapatarak. otomatik artışlı fonksiyonunun kullanılabilirliği hakkında bilgi almak için mikroskop kullanım kılavuzuna başvurun.
   2. daha fazla (5-10) doğruluğunu artırmak için tavsiye edilir, ancak hemasitometre merkez bölgenin en az üç örtüşmeyen görüntüler çekin.
      NOT: Hücreler her iki noktada yoğunluğunda artış eğilimi olarak üst ve odaların alt alanlarını hem kaçının. Her bölme için görüntülerin aynı sayıda alır. Bu sayım sırasında eklenti düzgün işlemesi için gereklidir.

   5. Görüntü Sayım ve çözeltiler

   1. CCC, 'Hücreler Kont' tıklayın ve Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. Bir klasör seçin sayılacak.
   2. Bir klasörü seçtikten sonra örneklem sayısı giriş kutusuna dikkat edin. Odasının başına alınan görüntülerde, yani 4.1.2 numarasını girin ve 'Tamam' düğmesine tıklayın. eklenti artık alfabetik sıraya göre seçilen klasördeki tüm jpg, tiff ve png görüntüleri sayacaktır.
      NOT: 'Örnek Görüntüleyici' düğmesine tıklamak sayılan örnekleri hakkında bilgi görüntüleyen örnek Görüntüleyicisi penceresini getirecektir. Örnek konsantrasyon odasının başına alınan tüm görüntülerin ortalama konsantrasyonu. birimsiz konsantrasyonlu örnekleri, örneğin bir ilaç veya küçük molekül tedavi ek olarak, bu listeye eklenebilir.
      1. konsantrasyonları aynı örneklerin (bölüm 4) sayar içinde önemli ölçüde değişebilir, eğer hücre örnekleri anlatmak.
         NOT: Tüm için dilüsyonları hesaplamak için to sayılır-örnekleri, CCC otomatik formül _C1 V ₁ = C ₂ V ₂ kullanır.
   3. İlave bir 96-yuvalı plakanın + 1, 30 kuyu içine tohum 200 uL başına 15,000 hücre senaryoyu kullanın:
      1. 'Ul' bitişik açılan kutu birimi değiştirme, 15.000 C2 etiketin sağında ve 200 konsantrasyon hacmi metin için metin kutusunu ayarlayın.
         NOT: eklenti sonuçta hücre / ml konsantrasyonu hesaplar.
      2. Emin hacim açılan kutu V2 seçti (son hacim) yapmak ve sağa metin hacim birimi birleşik giriş kutusunda 'uL' seçerek, 6200 (200 uL x (30 + 1)) girin.
   4. sol alt liste kutusuna şu anda girilen seyreltme eklemek için 'Hesapla Seyreltme tıklayın.
      Not: eklenen her seyreltme için her bir örnek için çözülecek ve sağa üç diyagram gösterilir. Her giriş çift tıklayın genişletmek için.
   5. tıklanması to Örnek Görüntüleyici 'düğmesinin altındaki' Kaydet 'düğmesine tüm örnek veriler ve dilüsyonları dosyaya yazmak için.
   6. NOT: Bu veriler 'Load' tıklayıp kaydettiğiniz dosyayı seçerek herhangi bir zamanda telafi edilebilir.

   6. Göç ve işgali (Sayaç)

   1. Standart Boyden çemberinin yöntemi ^7-9 ile göç ve istila testlerini gerçekleştirmek.
   2. Hücreler göç etmiş sonra / işgal dikkatle tersini hafifçe dokunarak insert içinde ortamı çıkarın. Fitil uzakta herhangi bir aşırı medya bir kağıt havlu kenarı dokunarak zarın altına yapıştırılır.
      NOT: Bu yapışmış hücreleri çıkarmak olabilir, havlu membran kendisi dokunmayın.
   3. Fix ve farklı çözümün ~ içeren her satırında kurmak 24 plaka 500 ul bildirilen ^7-9 olarak hücreleri leke, örneğin, sabitleyici, Leke 1, Leke 2 ve çift distile su (GKD ₂ O). 1x PBS t ikinci bir tabak dolduruno kesmeden önce de ekler yerleştirin.
   4. Inversiyon hücreleri uzak sürüntü önce suyu boşaltın GKD ₂ O ile dolu kuyulara içine yerleştirerek ekler yıkayın ve GKD ₂ O. ile elemanını doldurun.
   5. zara zarar verilmemesine zar özen göstererek üst un-göç / un-işgal hücreleri çıkarmak için temiz bir pamuk aplikatör kullanın. membran kenarlarında eksiksiz olması.
   6. temiz bir cam slayt üzerine membran (alt tarafı yukarıya) aktarmak dikkatli bir şekilde jilet veya neşter kullanılarak membran kesin ve.
   7. altında ve membran üzerine monte çözeltinin küçük bir damla ekleme ve ince kapak kayma ile kaplayın.
      NOT: sayım doğruluğunu korumak için montaj çözümü içinde kabarcığı kaçının.

   7. Kapsam ve Kamera Kurulumu Kesme

   1. mikroskop ışık kaynağı ve kamera açın.
      NOT: Ayrıntılı yönergeler için mikroskop kullanım kılavuzuna başvurun.
   2. Zekâmikroskop yazılım, set görüntü yakalama ayarlarını hin varsayılan değerlere.
      NOT: Bir ortalama fonksiyonu varsa, dört kişilik bir değer tavsiye edilir. Bu ortalama ve görüntü elde etme zamanı derecesi arasında iyi bir uzlaşma olduğunu. Aynı şekilde, keskinleştirme küçük bir derece görüntü vefa artabilir.
      1. 'Parlaklık', 'kontrast' ve% 100 'doygunluğu' ve 'gama' ve 1.0 'kazanç' olarak ayarlayın.
         NOT: yazılıma bağlı olarak, 'parlaklık' ve 'kontrast' bir% 0 değeri yerine% 100 varsayılan.
      2. maksimum ayarlarına ekran (gerçek zamanlı) ve çekim çözünürlüğü (1600 x 1200 px ve 2592 x 1944 px, sırasıyla).
         NOT: Ekran çözünürlüğü yenileme hızı çok yavaş ise gerektiği gibi ayarlanabilir. Alt kararlar daha zor doğru odaklanmak için yapmak, ancak yenileme hızını artıracaktır.
   3. Diseksiyon kapsamı aşaması için, beyaz bir katı backgro kullanımıund; siyah veya cam arka yetersizdir.
   4. sağa iki esnek LED ışıklar, tercihen yukarıda sahne ışık kaynağı kullanın ve sahnenin sol.
      NOT: ışık kaynağı olumsuz sonraki sayımların doğruluğunu etkileyebilir göç tahlil zarı içinde gözenekleri yanacaktır aşağıda sahnede A.
   5. sahneye tamamlanmış göç deneyi membran slayt yerleştirin. Tek bir membran kenarları sadece kameranın görüş alanı içinde olması için yazılım tarafından görüntülenen gerçek zamanlı görüntü baktığımızda, yakınlaştırma ayar düğmesi ile büyütmeyi ayarlayabilirsiniz.
      NOT: Bir cam levha üzerine slayt yerleştirilmesi üstünlük beyaz arka sahne daha kolay görüntüleme için slayt manevra yapar.
   6. Mümkün olduğunca yakından Şekil 2A tasvir ideal bir görüntü üretmek için ışık kaynağı pozisyonları (7.6.1) ve pozlama süreleri ayarlayın. parlaklığına bağlı olarak, 5-60 ms maruz kalma süreleri yeterli olmalıdır.
      NOT:Amaç görünür hücre kaybına yol açan mümkün olduğunca az arka plan rengi ve yani görüntü vefa, düşürmeden bir homojen aydınlatmalı membran aşırı maruz bir görüntü elde etmektir.
      1. slayt düşük açıda sol ve sağ ışık kaynağı yerleştirin. Bu arka plan leke ve kromatik sapmaları kaldırmak yardımcı olacaktır. diğer tam karşısında her ışık kaynağı tutmaya çalışın.
         NOT: pozisyona her ışık kaynağı manevra yaparken, diğer kapatın. Bu kendini daha kolay ve doğru zar üzerine aydınlatma alanını ortalamak için yardımcı olur.
   7. slayt ve beyaz dengesini mikroskop yazılımı tek bir düğmeye tıklama kullanarak görüntü çıkarın.
      NOT: Mikroskop şimdi kalibre edilir. ileride kullanmak üzere mümkün olduğunca çok sayıda ayarları kaydedin ve ışık kaynağı pozisyonları ve yoğunluğu dikkat ediniz.

   8. Görüntü Alma ve Flatfield

   1. yazılım içinde, setyakalama klasör konumu ve yakalama membranı başına bir resim. Genel şablona aşağıdaki görüntüleri Adı: Ad - böylece 001.tif ve - örneğin ###, Denetim - 001.tif, Denetim - 002.tif Test ilaç.
      NOT: En iyi görüntü sonuçları elde etmek için, örneğin jpeg gibi diğer kayıplı formatlar üzerinde tiff gibi görüntü dosya türü kaydedin.
      NOT: Görüntüler hala sayılacaktır genel şablonu takip etmiyor ama otomatik gruplama ve düz Fielding tabi olmayacaktır.
      1. flatfield düzeltme isteniyorsa, her slayt için boş bir alan bulmak ve adlandırma kuralı aşağıdaki Boş görüntü çekmek: İsim - Boş.
         NOT: Boş bir hayır membran içerir ve arka plan aydınlatma temsil slaytta bir alandır.
      2. Hemen görüntüleme önce, lamel üzerinde baskı uygulayarak her membran düzleştirmek ve mümkün olduğunca çok sayıda tuzak kabarcıklarını çıkarmak.
   2. ImageJ, plugin gidin ve TC eklentisi açmak; Örneğin, Eklentiler>> & # Analiz39; Transwell Sayaç '.
   3. TC içinde, 'Flatfield' butonuna tıklayın ve Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. Membran görüntüleri kaydedildi klasörü seçin.
      Not: Yukarıdaki genel şablonu ile kaydedilmiş Sadece görüntüleri otomatik olarak düzeltilir ve seçilen klasör içinde Flatfield adında yeni bir klasöre kaydedilir flatfield edilecektir. Bir flatfield düzeltilmiş görüntünün bir örnek için Şekil 2B bakın.

   9. Yapılandırma Ayarları

   1. Bir göç deneyi membran ImageJ görüntü ( 'Dosya'> 'Aç') seçin ve Image> Adjust> 'Renk Eşiği ...' açın. Görüntünün filtre edilecek hangi renklerin ayarlamak için Renk Eşiği penceresini gözlemleyin.
      1. Pencerenin alt, 'RGB' (kırmızı, yeşil, mavi) olarak ayarlanmış Eşik yöntemi 'Shanbhag' için, 'Beyaz' Eşik renk ve renk uzayı at; seçtiyseniz işaretini kaldırın Koyu arka plan.
      2. üst ayarlayıntıklayıp 255 0 belirteçleri ve alt kaydırıcıları sürükleyerek sürgü (255 dip kaydırıcıları bırakın). Görüntü tamamen beyaz olduğundan emin olun.
   2. Sadece çekirdekler görünene kadar yeşil ve kırmızı üst sürgü ayarlayın.
      NOT: Kullanılan hücre leke üzerine tamamen değişecektir seçilen ayarlar. Şekil 2c 'ye bakınız.
   3. TC eklenti, giriş ilişkili Yapılandırma Ayarları 'RGB Eşik' metin kutularının içine RGB üst sürgü değerleri. 'Ekle / Değiştir' düğmesine tıklayın ve yapılandırmayı üzerine.
      1. 1 ile Çap Aralığı Alt ve Üst değerlerini bırakın - Infinity.
   4. Yapılandırma Ayarları panelinde, sabit sürücüye ayarları yazmak için 'Kaydet'i tıklayın.

   10. Sayma Görüntüleri ve Kalibrasyon

   1. TC eklentisi (8.2) açın ve 'Klasör Kont' tıklayın ve Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. klasörü seçin sayılacak birbitirmek için nd bekleyin.
   2. Her sayılan-numune otomatik olarak ana tabloya eklenir. Anahtar sütunlar 'Kont', 'Kalite' ve 'kalibre?' Vardır.
      NOT: un kalibre Sayısı sütunundaki 'Alan aralığı' görüntülenen alanda membranın başına parçacıkların sayısıdır.
      NOT: Kalite yaklaşık -0.8 1.7 arasında değişmektedir; Q ≥ 0.5 kabul edilebilir.
      1. bir onay işareti gözlemlemek 'kalibre?' bir görüntü kalibrasyonu için işaretlenir sütun halinde ideal bir ölçümlere kendi benzerliği dayalı.
         NOT: Kalite ve Kalibrasyon Hem geçerli ayarları muhtemelen yetersiz olduğu önerebilir. uygun 'Renk Eşik' ve 'Boyut Aralıkları' sonra seçilmiştir ve kalibrasyon hala orijinal denetlenmesine önerilen ve görüntüler geçerli saymak son belirleyici olmalıdır sayılır edin.
   3. Kalibrasyon için işaretlendi Tablo tüm Örnekleri seçin.
      1. t sağ tıklayınmasa basıp Recount o> 'boyutu Önerilen'. Bu önerilen asgari parçacık alanı ile görüntüleri anlatmak olacaktır.
      2. Tekrar sağ tıklayın ve 'Show Plot' seçeneğini seçin. parçacık alanlarının frekans dağılım grafiği gözlemleyin. İdeal görüntü yani uzun sağ kuyruklu normal dağılım, çan eğrisi benzeyen bir grafik olacak. Şekil 3B bakın.
      3. örnek, sağ tıklayarak seçerek ve anlatmak> 'Manuel ayarları seçerek, gerekirse alt Boyut aralığı ayarlayın. manuel ayarlar iletişim gözlemleyin. İstediğiniz ayarları girin ve yeni ayarlarla görüntüyü anlatmak için sayın tıklatın.
   4. Elle sayımı ayarlamak sağ tablo tıklayarak, örnekleri seçin ve 'sayımları ile Açık görüntü' seçin. eklenti tarafından sayılan her parçacık temsil kırmızı işaretleri ile orijinal görüntü gözlemleyin.
      NOT: Recount> ne kadar iyi kontrol etmek yararlı olabilir 'Show ikili görüntü sayılır' individual hücreler renk eşikleme ile çözümlenir ediliyor.
      1. bir sayı eklemek için, 'Ctrl' ve sol tıklama tutun. numunelerin toplam sayısı eklenecek imleç konumda bir işaret gözlemleyin. bir işaretçi kaldırmak için, sağ görüntüyü tıklatın. eklenti imleç yakın işaretleyici kaldıracaktır.
      2. belirteçlerin bir grubu kaldırmak için, faiz (ROI) bir bölge seçmek için ImageJ bir seçim aracını kullanın. 'Ctrl' tutarken, resmi sağ tıklayıp ROI içindeki tüm belirteçler silinecektir. 'Kont' sütunundaki hücre sayısını dikkate alınız.

   11. Tasarruf / Sonuçlar açma ve CSV İhracat

   1. > 'Kaydet sonuçları' TC, menü çubuğuna gidin ve 'Dosya' üzerine tıklayın. Sonuçları Kaydet iletişim kutusunu gözlemleyin. bir ad ve hedef seçin ve 'Kaydet'i tıklayın.
      1. 'Aç Sonuçları', ana tabloda görüntülenen tüm verileri içeren bir dosya yüklemek includin için> 'Dosya' kullanıng arsa.
         NOT: Sonuçlar dosya görüntüleri kaydedilir dizinleri kaydeder orijinal görüntüleri başarısız olur fonksiyonları 'sayıları ile Açık görüntü', 'Aç orijinal görüntü' ve kaydettikten sonra taşınır ise..
      2. Görüntü dizini sıfırlamak örnekleri seçmek için, sağ tablosunu tıklatın ve 'görüntü dizini Reset' seçeneğini seçin. Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. Yeni klasörü seçin ve görüntüler varsa, dizinleri sıfırlanır. Sonuçlar dosyasını yeniden kaydedin.
   2. menü çubuğunda bir Virgülle Ayrılmış Değerler (CSV) dosyasına kaydetmek için '.csv Export' 'Dosya'> gidin. Bu ortalama ile istatistiksel gruplar halinde organize örneklerin sayısı ve ortalamanın standart hatası ile bir dosya oluşturur; onun düzeni ortak grafik programlarında hızlı grafik için tasarlanmıştır.
      NOT: İstatistiksel gruplar TC içinde oluşturulan gruplara dayanmaktadır.
      1. Numuneler genel adlandırma şablonu izlerseniz, gr olmak örnekleri seçmekouped, sağ tıklayın ve 'Otomatik gruplama' seçeneğini seçin. Bu aynı gruba aynı 'Adı' ile örnekleri ekler. Her iki kontrolleri 'Tedavi' grubun 'Denetim' ve tedaviler eklenebilir: 1, Kontrolü - - 2, Tedavi - - 1, Tedavi 2 örnek Kumandanın Kullanılması.
      2. grup adına çift tıklayarak gruplara elle numunenin 'Grup' hücre ve yazmaya örnekleri ekleyin. Seçin örnekleri sağ tıklayın ve 'Gruba ekle', bu gruba eklenecek.

Representative Results

Hücre Konsantrasyon Hesaplama

Şekil 1 CCC kalibrasyon ve sayılabilir görüntü alımı genel sürecini sunmaktadır. Şekil 1A ve 1B piksel P-kare uzunluğu P-kare kalibrasyon görüntü ve hesaplama betimliyor. CCC, aşağıdaki formül kullanılarak, belirli bir hacim içinde hücre konsantrasyonunu belirler:

Hemasitometre P-kare 100 nL hacmini (1 mm x 1 mm x 0.1 mm) ve toplam görüntü hacmi mm piksel dönüştürdükten sonra bu sabit hesaplanabilir vermiştir. Şekil 1C içinde odak hücreleri karakteristik faz aydınlatma ve arka plan hemositometre mezuniyet görüntüleme ile ideal sayılabilir görüntüdür. Son olarak, Figür scatter plote 1D HTR8, ES-2 ve Swan71 dahil olmak üzere çeşitli deneyler ve hücre tipleri ele 57 görüntüleri hücreleri otomatik sayım karşısında yüksek korelasyon, kılavuzu gösterir. Notun, konsantrasyonun üst aralığı ~ 5.6 x 10 ⁶ hücre / ml ~ 2.3 x 10 ³ hücre / mL (görüntü başına ≈ 5 hücre) bir düşük sonunda oldu. Sayımlar görüntü başına 10-15 hücreleri altında ise, örnek istatistiksel gücünü artırabilmek için daha küçük bir hacimde askıya alınması önerilmektedir.

Göç Testi Sayaç için Toplama ve Görüntüler İşleme

göçü deneyi membran yüzlerce insan trofoblastik hücre çizgisi HTR8, Swan71 veya yumurtalık kanseri hücre çizgisi ES-2 ekilmiştir her biri çok sayıda deney üzerinde görüntülenmiştir. Bu görüntülerin, çoklu parlaklık, netlik ve Staine rengine göre mükemmel kalitede çok kötü gelen kategorilerin bir dizi temsil etmek seçildid hücreleri ve arka plan boyama ve istenmeyen parçacıkların (gürültü) derecesi. Bu görüntülerin kullanılması, varsayılan RGB Eşik renk ayarları (≈ 150, 120, 0) (Şekil 2C) tespit edilmiş ve algoritmanın sonraki tüm gelişmeler temel olarak kullanılır. Amaç, yani toplam renk oranı, nükleer renk maksimize etmek olduğunu, renkli piksellerin çoğunluğu hücre çekirdeğinde içinde olmalıdır. Şekil 2A üst panel ideal bir görüntü parlaklığını, hücre çekirdekleri netlik ve renk, ve önemsiz arka plan gürültüsünü göstermektedir. görüntünün parlaklığı siyah ve beyaz ikili görüntü elde etmek için hücre ve arka plan arasında büyük bir kontrast yetersiz olduğundan emin olmak için önemlidir.

Bu fark bir araya geldi değilse, büyük ya da öngörülemeyen alanlar Parçacıklar fonksiyonunu analiz ImageJ tarafından sayılabilir; En iyi senaryo tamamen beyaz arka plan. Muhalefet ise, Fi alt panelşekil 2A aşırı arka plan boyama ve neredeyse ayırt edilemez hücreleri vardır. boyanma bu derecesi ile Membranlar büyük olasılıkla göç tahlil sayaç güvenilmez sonuçlar üretecektir.

Bazı durumlarda, ideal bir düzeye parlaklığı artırarak görüntü overexposing görüntü vefa etkileyebilir. Benzer şekilde, yüksek maruz kalma ya da parlaklık ilerici ya da düzensiz aydınlık ve karanlık bölgeler ile sistemik renk etkilere neden olabilir. Flatfield düzeltme ile, bu etkiler minimize ya da Şekil 2B'de (üst genel alt panel) 'de gösterildiği gibi tamamen kaldırılabilir. Ayrıca, flatfield düzeltme çoklu membran görüntü parlaklığını eşitlemek için iyi bir yoldur.

Kalibrasyon ve Göç Testi Counter Doğrulama

bize yardımcı olmak içiner göç deneyi membran görüntüleri doğru sayma için gerekli kriterleri yerine daha iyi belirlenmesinde, iki elemeleri tasarlanmıştır denilen görüntü kalitesi (Q) ve kalibrasyon tavsiye (CR). Daha önemlisi, her iki elemeleri adı CR anlaşılacağı gibi, daha doğrusu her resmin Sayılabilirliğin mutlak hakimler daha kılavuzları olarak sadece tavsiye ve hareket vardır. Hem Q ve CR parçacık alanı (10.3.2) frekans dağılım grafiği metriklerine dayanmaktadır. basitleştirme, bir metrik frekans arsa oluşturan eğrinin çeşitli şekiller olarak kabul edilebilir. Yeterli bir Q (≥0.5) istenen mt hücre boyutu gözlenen yaklaşık normal dağılım ile tespit edilmiştir. Genel olarak, birbirinden çözümlenemeyen olan hücreler ya da sadece özellikle büyük lekeli aşırı bir dik kuyruklu normal dağılım (Şekil 3B) için skewedness kaydırır. Bu nedenle, bu tipik bir kalibre edilmiş bir görüntü doğru bir ölçümdür. İlearka plan gürültüsünün yanı sıra, bu normal olarak 1-5 piksel alanı aralığı (Şekil 3A) partiküllerin büyük bir artışına yol açmaktadır. arsa ölçümleri hesaplamak için, veri Dr. Michael Thomas Flanagan Java Bilimsel Kütüphanesi (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga tarafından üretilen polinom derece farklı on Savitzky-Golay düzeltilmiş eğrileri ile donatılmıştır / java /). Esasen, bu her ekstremum yaklaşık bölgesinde birden fazla puan oluşturur. Yerel asgari ve azami yoğunluk küme haritalarının bir dizi sayesinde, arsa metrik genel resim sıralı yani listede, minimum, maksimum, minimum / maksimum örtüşme, ..., n ekstremum ^inci gibi hesaplanabilir. Kısaca, derecesi olan düzeltti eğriler frekans veri noktaları uç değerlerini ne kadar dolu sıkı belirler uyacak şekilde. Örtüşmeyen exremum daha kümeleme, büyük Q olur. Teoride, Q t dayalı genel görüntü netliği temsiltat parçacık boyutu O dağılımı.

Boolean CR doğru olup olmadığı exremum dizisi bağlıdır. Şekil 3A itibaren, sıralı liste minimum, maksimum ve Savitzky-Golay eğrisinin özelliklerine göre uç değerlerini örtüşen bir dizi olacaktır. Şekil 3A görüntü kalibrasyonu gerekebilir kullanıcıya düşündüren bir kalibre edilmemiş bir görüntü olarak gerçek ekstrema bayrakları CR bu genel dizisini temsil ettiğinden dolayı. İleride, o Şekil 3B den, bu liste aynı ancak ilk minimum dışlanması ile olacağını görülebilir. Böylece ideal bir kalibre edilmemiş ve kalibre görüntülerin ölçümlerini belirlendi. Bu metrikler sapmalar kalibrasyon için bir görüntü bayrak ve Şekil 3C yüksek arka plan gürültü membran ile durum olarak, Q ≤ 0 azaltmak genellikle olacak. Seçime bu eleme uygulamakparlaklık ve arka plan gürültü açısından mükemmel görüntüler, mütevazı nedeniyle, kalibre görüntü sayıları (Şekil 3D, E sırasıyla 2.9 ± 0.3% 21,7 vs ± 1.9%) kalibre edilmemiş göre manuel sayıları önemli ölçüde daha yakın olduğu açıktır. kalibre edilmemiş analiz için seçilen görüntülerin genel olarak yüksek kalitede (Verilen = 0.71 ± 0.04; ) ortalama ± SE vardı kalibrasyon aşağıdaki sadece Q beklenen ılımlı bir artış ( = 0.90 ± 0.04). Birlikte ele alındığında, Q CR ise bir görüntünün genel sayılabilirlik potansiyeli kalibrasyon başarılı olup olmadığına güçlü bir göstergesi olduğunu göstermektedir.

Hem Hücre Konsantrasyon Sayacı ve Göç Testi Counter Karşılaştırmalar Zamanlama

Şekil 4A Kullanıcı 1 CCC kalibrasyonu için ortalama yaklaşık beş dakika alarak, birlikte, önemli ölçüde daha hızlı Kullanıcı 2'den oldu Kullanıcı 1 ve 2 arasında CCC kalibrasyon süresi karşılaştırır. Manuel hemositometre sayma ve otomatik oranlarını karşılaştırmak amacıyla, bir çetelesini sayılmadan manuel oranı hemositometre odasının dokuz fotoğraf çekmek için geçen süre karşılaştırıldı ve CCC (Şekil 4B) sayılmıştır. 1.15 x 10 ⁶ hücre tipik / mL hücre konsantrasyonuna throughput 1x artış ortalama yol zamanlamalarını karşılaştırmak için kullanıldı. Bu oran, yüklenen hücrelerin sayısına bağlı olarak değişecektirgörüntü yakalamak ve bunları işlemek için alınan toplam süre olarak hemositometre hücre sayısının bağımsızdır.

Son olarak, membranlar, TC içinde ölçümü ve bu görüntülerin manuel ayarlamaları görüntü elde etme kapsayan zamanlamaları Şekil 4C ölçüldü. Özellikle, düşük hücre sayısı (= Toplam 10571 hücreleri) ve önemli arka plan boyama ve hücresel enkaz ile 12 göç tahlil membranlar hücre sayısı manuel ayarlamalar gerektirecek bir en kötü durum senaryosu kolaylaştırmak için seçildi. Bu istenmeyen sayımları kaldırmak ve cevapsız hücreleri eklemek için 13 dakika ortalama aldı Şekil 4C ayarı (Adj) sütununda yansıtılır. elle sayım ile karşılaştırma yapmak için, en uygun hücre sayımı oranları Cell Counter ile tespit edilmiştir; Yüksek hücre yoğunluğuna sahip, yüksek kaliteli membran görüntüler (sonuçlar gösterilmemiştir) kullanılmıştır. Bu 9.1 x 10 ³ hücre / h Kullanıcı 1 ve 2 arasında bir ortalama maksimum oranı sağladı(~ 2.5 hücre / s). Bu numaraları kullanılarak, Şekil 4C'de gelen zarlar daha hızlı TC ile maksimal el oranda beklenenden daha 4.4x sayılmıştır. zaman tasarrufu az veya hiç uyum ve yüksek hücre yoğunluğu (~ 7.000 hücre / membran) gerekli göç zarlarını sayarak, hücre sayısı ve görüntü kalitesi üzerinde doğrudan bağlıdır, TC hücre sayımları daha hızlı maksimum manuel oranı daha 1,395x üretti.

Şekil 1: Hücre Konsantrasyon Hesaplama. 40X toplam büyütmede alınan hemasitometre merkezi birincil kare (A) Faz kontrast mikrografı. Ölçek çubuğu 200 uM temsil eder. (B) A hemasitometre ölçmek için ne uzunluk gösteren (A) görüntünün kırpılmış versiyonu. Sonuçları penceresi uzunluğu sütun kolay tanımlama için vurgulandı. sarı çubuk= 1 mm. (C) 1600 x 1200 px çözünürlüğe sahip 40X toplam büyütme mikroskop ve yazılım kalibrasyon sonrasında HTR8 hücreleri içeren bir hemasitometre ideal mikrografı. Ölçek çubuğu = 200 mikron. (D) Hücre Konsantrasyon Hesaplama kullanarak aynı görüntülerin otomatik sayım kıyasla ImageJ eklentisi Hücre Sayacı kullanılarak manuel sayıları karşılaştıran bir dağılım arsa. n = 57 ve görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Göç tahlil temsilcisi görüntüleri karşı. (A) üst panel asgari arka plan ile ideal bir görüntü tasvir toplam membran bir sekizde birine kısmıdır; Ölçek çubuğu = 200 mikron.alt panel ciddi otomatik sayım doğruluğunu etkiler önemli arka plan boyama ile bir görüntü içerir; Ölçek çubuğu = 585 mikron. (B) üst panel yanlış sayıları üretilen kaliteli bir karanlık görüntüsünü temsil eder. alt panel flatfield düzeltmesinden sonra aynı görüntünün bir sayılabilir sürümüdür. Ölçek çubukları 593 mikron =. (C) üst panel temsil eden bir uzaklaştırdınız-tipik bir membran görünümü. alt panel istenilen ImageJ renk eşikleme ardından aynı görüntü (RGB Eşiği = 150, 120, 0) arası arka plan ve gözle görülür lekeli sitoplazmanın çoğunluğu kaldırmak için. Tüm görüntüler hematoksilen ile boyanmış HTR8 birden fazla göç tahlil istilasına 2592 x 1944 px çözünürlükte bir kalibre diseksiyon kapsamı ile 1.35X toplam büyütmede alındı. Ölçek çubukları 100 mikron =. Vie için lütfen buraya tıklayınızBu rakamın wa daha büyük bir versiyonu.

Şekil 3: Kalibrasyon ve göç tahlil c Sayaç doğrulama. (A) yüksek kalitede bir kalibre edilmemiş görüntünün tipik örneği. Göç tahlil sayacın yeniden sayılması> 'Önerilen boyutu' kullanarak (B) (A) kalibre versiyonu. (C) önemli arka plan leke ya da genel karanlık ile düşük görüntü kalitesi zarının tipik bir frekans arsa. (D) ImageJ eklentisi Hücre Sayaç ve göç tahlil sayacı otomatik sayıları kullanarak manuel sayıları karşılaştıran bir dağılım arsa. (E) kalibre edilmemiş otomatik sayım karşı kalibre ortalama yüzde farkını gösteren bir çubuk grafiği. Veri ± SE Ortalama vardır. P <0.0001, n = 30, Welch Corre ile eşleşmemiş t-testiction. Aynı görüntüler D için kullanılan ve her ikisi E. Kalibrasyon yeniden sayılması> 'Önerilen boyut "ve Recount> ile yapıldı' Manuel ayarlar 'daha az boyutu sayılır ve renk eşiği rafine. Hiçbir manuel sayım ayarlamaları fonksiyonu 'sayıları ile Açık görüntü' kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Hücre Konsantrasyon Sayacı ve göç tahlil karşı kullanımının zamanlaması. CCC kalibrasyon kez (A) Karşılaştırma (1 ve 2 numaralı adımları) Kullanıcı 1 (CCC / TC uzmanı) ve Kullanıcı 2 (CCC / TC acemi) arasında. (B) El hücre sayımı beş kat çalışmalarda üzerinde ortalama ve bir dakika başına sayılan hücrelerinde eksprese edildi. Automatic sayımları bir hemositometre odasının dokuz görüntüleri yakalamak için ortalama süreleri hesaplanır ve CCC ile sayıldı. Kullanılan hücre konsantrasyonu ~ 1.15 x 10 ⁶ hücre / mL idi. Veri ± SE Ortalama vardır. 10.4 adımlar (QNT; varsayılan yapılandırma ayarlarını kullanarak 10.1-10.3.3 adımlar), ölçme, satın alma (7. ve 8. adımları Edi) ve manuel ayar (Adj: n = 5. (C) Transwell Sayaç zamanlamaları üzerinde üç kategori karşılaştırıldı -1.4.2). nicel membranlar doğru sayımları için önemli manuel ayar gerektiren amacıyla arka plan boyama ve enkaz yüksek derecede vardı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Kritik Adımlar, sorun giderme ve Sınırlamalar

Otomatik hesaplama yöntemleri doğası, parçacık analizi, özellikle bu, bu parçacıkları tanımlamak için matematiksel yetenek gerektirir. Sonuç olarak, Hücre Konsantrasyon Hesaplama ve göç tahlil sayacı hem doğruluğu yakalanan görüntü hücresi örnek veya göç tahlil zarı benzer ne kadar yakından, yani resim netliği üzerinde majorly bağlıdır. Bu nedenle mümkün olduğunca en iyi olarak mikroskop ve ilgili yazılım kalibrasyon protokollerini takip etmek geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu, arka plan gürültüsünü sınırlayan istenmeyen parçacıkları azaltarak, parlak ve düzgün bir şekilde odak görüntüleri yakalayan ve bu tiff olmayan kayıplı dosya biçimlerinde kaydetme dahildir. Böylece, her iki eklentileri bu gereksinimleri yerine getirilmediği takdirde hatalı sonuçlar üretmek için muhtemeldir. Çift kontrol hücre sayımları bu nedenle her zaman iyi bir uygulama ne zaman DOUB onlar görsel beklentilerinize uygun olup olmadığını belirlemek için birt. Eğer gerçekten sonuçlar sorunu (10.4 not) aydınlatmak yardımcı olabilir ikili görüntü ile orijinal görüntüyü karşılaştırarak, eşleşmiyor. Bazı durumlarda, koyu göçü deneyi görüntü ve renk eşik sınırları içinde kalan piksel değerleri nedeniyle sayılmış geniş alanları içerebilir. Genel olarak, bir flatfield görüntü kullanılarak karanlık ve lekelenmelere kaldırmak ve kromatik düzensizlikler nedeniyle en istenmeyen sayımları engelleyecektir.

Bu olası ve nispeten sık karşılaşılan sorunları göz önüne alındığında, Nature Publishing Group ve diğerleri ¹³ tarafından önerilen olduğu gibi standart resim bütünlüğü yönergeleri takip etmek önemlidir. Tutarlı sayıları tutmak için, bir resim için herhangi bir ayar tüm diğerlerine eşit uygulanmalıdır. Bu içerir, ancak, doygunluk, parlaklık, kontrast kazanç ile sınırlı değildir, böyle bir ortalama alma ve keskinlik ve renk filtreleri gibi filtreler. gama ayarlaması o piksel renk doğrusal olmayan bir değişiklik geçerlidir kaçınılmalıdır ve çok farklı her görüntüyü etkileyebilirly ^14. Birkaç hücreleri ile görüntüleri ortak bir pozlama süresi uygularken (<1.000), bu aşırı maruz kalma ve görüntü aslına kaybına yol açabilir. Tersine, binlerce hücreleri içeren bir zar az pozlama önlemek için yüksek pozlama süreleri gerektirebilir. Buna göre, ulaşılabilir en yüksek görüntü sadakat korumak için, mümkün olduğunca az ve sadece gerekli görüntüleri ayarlamak için en iyi uygulamadır.

Hatta yüksek sadakat görüntü ile gerçek parçacık sayımı istenmeyen parçacıklar tarafından ciddi çarpık olabilir. Örnek hücre kalıntılarının önemli miktarda içeriyorsa özellikle süspansiyon hücreleri benzer alanlarında, Celi konsantrasyonu hesap kullanıldığında, bu sonucu çarpık olabilir. enkaz minimize edilemez Bazı durumlarda, bu otomatik analizi engelleyebilir. Aynı şekilde, benzer renk arka plan boyama yüksek düzeyde içeren göç tahlil membranlar membran arkasından hücreleri ya da Çıkarılmayan hücreleri lekeli, muhtemelen i üreteceknDoğruluk sonuçlanır. Bu istenmeyen parçacıklar normalde birkaç yolla kaldırılabilir: ışık kaynağı parlaklık veya pozlama süresini arttırmak, daha sıkı, ya da manuel olarak 'sayıları ile Açık görüntü' (10.4) üzerinden kaldırıldı olmak için renk eşikleme değiştirerek. Protokol doğruluğunu sağlamak için CCC ve TC için gerekli görüntünün optimal kaliteyi üreten dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, TC, genel olarak, sadece elle ayarlama (10.4) harcanan daha fazla zaman gerektiren önemli ölçüde daha az kaliteli, farklı büyütmelerde, veya farklı renk lekeleri görüntü sayma yeteneğine sahiptir.

Herhangi bir göç tahlil membran resmin kalibrasyonu sırasında dikkate görüntünün çözünürlüğünü ve hücrelerin göreli boyutunu almak önemlidir. Daha önce açıklandığı gibi, Görüntü Kalitesi (Q) ve Kalibrasyon önerisi (CR) parçacık alanının frekans arsa metrikleri bağlıdır. analiz görüntülerin, her bir hücre ortalama 1 / 100.000 kadar sürerToplam görüntü alanı. Küçük hücre boyutu oranı piksel sadece milyonlarca görüntüleri kullanarak, hücre boyutunda farklılıklar da küçüktür. Bu varyans sadece 10-60 px değişebilir vardır. Görüntü alanı oranı hücre alanı büyüdükçe Ancak, hücrenin dağılımı herhangi bir alanda sıklığını azaltarak hücre boyutu normal dağılımın Çarpıklık azaltarak, artar boyutları. Kesin bir minimum alan tespit edilemediği için sırayla Bu hücre alanının otomatik hesaplama daha zor ya da imkansız hale getirebilir. Benzer şekilde, bu da (<50), farklı hücre boyutlarına sahip sıklığı çok düşük olabilir burada hücre az sayıda olan görüntülere uygulanır. Bu çalışmada, veya hücre boyutunun farklı dağılım kullanılanlardan farklı çözünürlüklerde görüntüleri analiz Sonuç olarak, hücre boyutu aralığının el tanımlama (10.3.3) gerekli olabilir.

Önemi ve Gelecekteki Yol

ImageJ eklentisi Hücre Sayım Cihazı ilk rele olduDr Kurt De Vos tarafından 2001 yılında ased ve bu güne kadar manuel hücre sayımı için bir elyaf olarak görev yapmıştır. Biyolojik toplum için serbestçe kullanılabilir araçlar trendi devam etmek için, Hücre Konsantrasyon Hesaplama ve göç tahlil karşı çıkışı ve göç deneyleri arası deneysel tekrarlanabilirlik artırmaya yardımcı olmak için ücretsiz araçlarımızdan sonraki adımı sunuyoruz. Taşıma deneyleri sonucudur tohumlanmış hücrelerin sayısı oldukça bağımlıdır. Ergo güvenilir bir hücre sayısı tekrarlanabilir için bir zorunluluktur. Bu şekilde, CCC hem nedeniyle hücre konsantrasyonu ve hücre sağlığını korumak daha kısa sayım kez daha istatistiksel kesinlikle doğruluk arttı sunuyor.

Ayrıca, her iki eklentileri sonuçta hücre sayısının sayımı olup bu floresan gibi göreli indeksidir. Çeşitli diğer protokoller boyanarak ölçen floresan var ama bu yöntemler duyarlılık ¹³ eksikliğinden muzdarip. Adobe'nin Photoshop kendi parçacık analizi t sunuyorool ancak program kullanımı için satın alınmalıdır ve göç tahlil sayacı ²⁰ edinilebilir sonrası sayma analizi sunmaz. Her iki eklentileri ImageJ gelen partikül sayma özelliğe dayanan ve dolayısıyla ImageJ tarafından kullanılan makrolar düzenleyerek son kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Bu kullanıcı yeni makrolar oluşturarak diğer parçacıklara eklentileri kapsamını genişletmek için daha fazla esneklik sunuyor. son kullanıcı katkıları sayılabilir parçacıkların genişliği artırmak ve birleştirmek için daha da geliştirilmesi bir sonraki mantıklı adımdır. otomatik sayım algoritması ve sonrası sayma analizi ile Cell Counter temel ilkelerini birleştirerek, bu büyük ölçüde göç deneyleri doğruluk kaybı olmaksızın işlenebilir kolaylığını artırır. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: eklentileri yükleme talimatları indirmek için serbestçe kullanılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required