Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

Abstract

Das National Institute of Health ImageJ ist ein leistungsfähiges, frei verfügbaren Bildverarbeitungs-Software-Suite. ImageJ hat umfassende Partikelanalyse-Algorithmen, die effektiv genutzt werden kann, verschiedene biologische Partikel zu zählen. Wenn eine große Anzahl von Zellproben zu zählen, stellt der Zählkammer einen Engpass in Bezug auf die Zeit. Ebenso Membranen von Migration / Invasion Assays mit dem ImageJ Plug-Zellzähler, obwohl eine genaue Zählung, ist außerordentlich arbeitsintensiv, subjektiv und berüchtigt für verursachen Schmerzen am Handgelenk. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir zwei Plugins innerhalb ImageJ für die einzige Aufgabe der automatisierten Hämozytometer (oder bekannten Volumen) und Migration / invasion Zellzählung. Beide Plugins verlassen sich auf die Fähigkeit, qualitativ hochwertige Mikroaufnahmen mit minimalen Hintergrund zu erfassen. Sie sind einfach für den schnellen Zählen und Analyse großer Probengrößen mit integrierten Analysetools zu verwenden und optimierte Kalibrierung von Zählungen zu helfen. Durch die Kombination der Kernprinzips von Zellzähler mit einem automatisierten Zählalgorithmus und post-counting Analyse Dies erhöht die Leichtigkeit, mit der Migrationsassays kann ohne Verlust an Genauigkeit bearbeitet werden.

Introduction

In - vitro - Zellzählung ist eine wichtige Grundtechnik in einem weiten Bereich von Gewebekulturexperimenten. Exakt die Anzahl der Zellen in einer Kultur , die Bestimmung ist von wesentlicher Bedeutung für die experimentelle Reproduzierbarkeit und Standardisierung ^1,2. Zellzählung kann ein Hämozytometer manuell über als auch unter Verwendung einer Vielzahl von automatisierten Verfahren, jede mit ihren eigenen Vorteilen und Nachteilen ^3,4,5 ausgeführt werden. Die meisten der automatisierten Verfahren zur Zellzählung gehören zu einer von zwei Klassen, diejenigen, die das Coulter-Prinzip verwenden oder Durchflusszytometrie. Coulter Zähler nutzen Sie Zellen elektrische Widerstand der Zellzahl und Größe zu bestimmen. Sie sind schnell, präzise und kostengünstiger als Durchflusszytometer. Jedoch werden sie selten für nur Zellzählung aufgrund ihrer beträchtlichen Kosten im Vergleich zu manuellen Zählung ³ verwendet. Durchflusszytometer, auf der anderen Seite, sind teuer, aber sie haben viele Anwendungen, wie beispielsweise Zellzählung, Analyse der Zellen Form, structure und Mess interne Zellmarker ^4,5. Maschinen, die eine dieser beiden Prinzipien verwenden, sind von vielen Herstellern erhältlich. Manuelle Zählen ist erschwinglich , aber zeitaufwendig und unterliegt Bias , während die automatisierten Verfahren mit einem Bruchteil der Zeit kommen für die manuelle Zählung erforderlich , aber mit teuren Maschinen ^6.

Andere häufige Zellkulturverfahren sind in - vitro - Zellbeweglichkeit Assays, nämlich die Zellmigration und Invasion ^7. Migration und Invasion Assays werden üblicherweise zur Untersuchung der Zellbeweglichkeit und Invasivität in Antwort auf eine chemotaktische Reaktion verwendet. Darüber hinaus sind sie häufig zu studieren Embryonalentwicklung, Differenzierung, Entzündungsreaktion, und die Metastasierung von mehreren Zelltypen ^7-11 verwendet. Zellen, die durch die poröse Membran aus einem Migrationstest migriert oder eingedrungen kann auf zwei verschiedene Weisen quantifiziert werden. Erstens, indem die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff Anfärben Dissoziation from die Membran und Quantifizierung eines Fluoreszenzleser ^12. Eine Einschränkung dieser Methode der Quantifizierung ist , dass keine Aufzeichnung der Membranen zurückgehalten werden kann , und es besteht keine Möglichkeit zur weiteren Analyse ^13. Die zweite Quantifizierungsverfahren wird für Zellen migrierten / eingedrungen mit Fluoreszenzfarbstoff oder häufiger fixiert und gefärbt werden, wobei zytologischen Farbstoffe wie Kristallviolett, Toluidinblau oder Hämatoxylin-Farbstoff; dann werden die Zellen manuell mit invertierten Mikroskopbilder dieser Membranen quantifiziert , die eine sehr zeitraubende Aufgabe ist ^12,13.

Um die Nachteile der manuellen Zellzählung, zwei zuverlässigen und genauen automatischen Zellzähler für Zellkonzentration und für den Migrationstest überwunden wurden entwickelt. Diese automatisierten Zellzähler Algorithmen wurden für ImageJ als Plugin unter Verwendung von Oracle Java-Computer entwickelt. ImageJ ist ein öffentlicher und weit verbreiteten Bildbearbeitungswerkzeug durch das National Institute of Hea entwickeltlth (NIH) ^14,15; Somit erleichtert diese Plugins für ImageJ Schreiben eine einfache Integration in die biologische Gemeinschaft.

Automatisierung der Zellzählung sorgt für einen hohen Durchsatz und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu manuellen Zählung. Obwohl andere verfügbare Software und Plugins verwendet werden kann , die Zellkonzentration durch Bildanalyse ^5,16,17, Zellkonzentration Calculator Plugin ist schnell und kann auch behandeln Verdünnungen von Zellen und Behandlungen zu berechnen. Darüber hinaus können alle Ergebnisse und Berechnungen aus diesen beiden Zähler gespeichert und exportiert werden. Die beiden Plugins in diesem Dokument beschrieben sind, für die Verwendung eines Phasenkontrastmikroskop für Live Cell Imaging und großes Sichtfeld (gesamte Membran capture) Bildgebung für Migration Assay-Membranen durch die Verwendung eines Binokular optimiert. Die Plugins sind frei zum Download zur Verfügung mit Installationsanweisungen aus: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. Verbindung Mikroskop und Kamera-Setup (Zellkonzentration Calculator)

1. Erhöhen Glühbirne Helligkeit voll mit dem Licht Einstellknopf, wechseln Sie auf die 4X Objektivlinse und gewährleisten Phasenkontrastfilter ausgewählt werden.
   HINWEIS: Jede invertierte Phasenkontrastmikroskop für die Gewebekultur mit einem dunklen Hintergrund, zum Beispiel PhP Phasenkontrast, können folgende Standard - Mikroskop und Kamera Verfahren verwendet werden.
2. Innerhalb der Software des Mikroskops eingestellt Bildaufnahmeeinstellungen auf die Standardwerte.
   HINWEIS: Lesen Sie in der Bedienungsanleitung des Mikroskops die Lage dieser Einstellungen zu finden.
   1. Set 'Helligkeit "," Kontrast "und" Sättigung "auf 100% und" Gamma "und" Gain "bis 1,0.
      HINWEIS: Je nach Software, "Helligkeit" und "Kontrast" auf einen Wert von 0% Standard anstelle von 100%.
   2. Set Bilder in schwarz und weiß mit der höchsten Auflösung availabl erfasst werdene (1.600 x 1.200 Pixel (px) oder höher).
      HINWEIS: A 'Sättigung' von 0% reicht aus, wenn ein Schwarz-Weiß-Einstellung nicht verfügbar ist.
3. Legen Sie eine Standard Hemocytometer auf den Mikroskoptisch und erfassen ein Bild wie in (Abbildung 1A) dargestellt; dies ist das "Volume Kalibrierung Bild '. Stellen Sie Belichtungszeit je nach Bedarf.

2. Bildvolumenkalibrierung

1. Offene ImageJ und aus dem Plugins - Menü, starten Sie die Zellkonzentration Rechner (CCC) Plugin, zB Plugins> Analyzer> 'Zellkonzentration Calculator ".
   1. Wenn das Panel 'Bild Volume Kalibrierung "der rechten Seite nicht sichtbar ist, klicken Sie auf" Kalibrieren ", es zu zeigen.
2. In ImageJ, öffnen Sie die "Volume Kalibrierung Bild 'aus Schritt 1.3 (' Datei '>' Open ') und CCC, klicken Sie auf die Schaltfläche" Bild Dimension Get'.
   HINWEIS: Diese sowohl in Bild füllt Breite undHöhe Textfelder mit der Bildauflösung in Pixeln automatisch.
3. In ImageJ, wählen Sie die nächste "Straight Line Tool 'auf die Auswahl - Werkzeuge und eine gerade Linie über die gesamte Länge des Hemocytometer primären (P) zeichnen -square in (Abbildung 1B) gezeigt , durch Klicken und Ziehen Sie den Cursor.
   1. Drücken Sie die Taste "M" das Ergebnisfenster mit den geraden Linie Messungen angezeigt werden soll. Geben Sie den Wert aus der Spalte Länge in die "P-Quadrat Length 'Textbox in CCC (Abbildung 1B).
   2. Klicken Sie auf "Berechnen Bild Volume 'Taste zur Ausgabe des Bildvolumen in das Bildvolumen Textbox. Alternativ, wenn das Volumen des Bildes bereits bekannt ist, geben Sie die Lautstärke in nL in das Bildvolumen Textbox.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern".
   HINWEIS: Das Plugin ist nun kalibriert.

3. Kamera Belichtung Kalibrierung

1. Nach der Zellernte fürZählen über Hemocytometer, Last 10 & mgr; l Zellen in eine Kammer des Hämozytometer und legen Sie es auf den Mikroskoptisch.
2. Mit den gleichen Einstellungen von Schritt 1.2, stellen Sie die Belichtungszeit, so dass die Hintergrundlinien des Hemocytometer verschwinden.
   1. Stellen Sie den Fokus, so dass das Innere der Zellen dunkler als der Zellmembran ist, was anzeigt Fokus innerhalb des zentralen Querschnitts der Zelle und nicht die Pole.
   2. Genauer einstellen , die Belichtung , so dass die Zellen nicht überbelichtet sind , und diejenigen , dargestellt in (1C) ähneln.
      HINWEIS: Ein wenig sichtbar Hemocytometer Linien akzeptabel sind. Es wird empfohlen, diese Einstellungen zu speichern oder aufzeichnen Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhalten.

4. Image Acquisition

1. Für jede Zellprobe, Last 10 & mgr; l in beiden Kammern des Hemocytometer statistische Inferenz Leistung ² zu erhöhen. Legen Sie die Hemocytometer auf dem Mikroskoptischfür die Bildgebung.
   HINWEIS: Die Auflösung und Vergrößerung jedes Bild muss die gleiche wie die "Volume Kalibrierung Bild" sein. Das Plugin zählt alle Bilder von jedem ausgewählten Ordner; halten Bilder im selben Ordner zusammengezählt werden.
   1. Wenn ein Dateiname Autoinkrement Funktion verfügbar ist, schalten Sie ihn ein und stellen Sie sicher, dass jedes Bild nicht nach der Aufnahme den Durchsatz zu erhöhen gezeigt.
      HINWEIS: Manuelles Speichern und jedes Bild Schließen wird der Prozess drastisch verlangsamen. Lesen Sie in der Bedienungsanleitung des Mikroskops für Informationen über die Verfügbarkeit eines Autoinkrement-Funktion.
   2. Erfassen mindestens drei nicht überlappenden Bilder des zentralen Bereichs des Hämozytometer obwohl mehr (5-10) wird empfohlen, die Genauigkeit zu erhöhen.
      HINWEIS: Vermeiden sowohl die oberen und unteren Bereiche der Kammern als Zellen an beiden Stellen in der Dichte zu erhöhen, neigen. Nehmen Sie die gleiche Anzahl von Bildern für jede Kammer. Dies wird bei der Zählung für die ordnungsgemäße Funktion des Plugins erforderlich.

   5. Bild Zählen und Verdünnungen

   1. In CCC, klicken Sie auf "Zellen Count" und beobachten Sie das Verzeichnis Wählen Sie im Dialogfeld. Wählen Sie einen Ordner gezählt werden.
   2. Beachten Sie die Probennummer Eingabefeld nach Auswahl eines Ordners. Geben Sie die Anzahl der Bilder pro Kammer genommen, das heißt, 4.1.2, und klicken Sie auf "OK". Das Plugin wird zählen nun alle JPG, TIFF und PNG-Bilder im ausgewählten Ordner in alphabetischer Reihenfolge.
      Hinweis: Mit einem Klick auf die Schaltfläche "Sample-Viewer", wird der Sample Viewer-Fenster die Anzeige von Informationen über die gezählten Proben bringen. Probenkonzentration ist die durchschnittliche Konzentration aller pro Kammer aufgenommenen Bilder. Proben mit einheitslose Konzentrationen können zu dieser Liste, wie die Zugabe eines Arzneimittels oder kleines Molekül Behandlung zugesetzt werden.
      1. Neuauszählung der Zellproben, wenn die Konzentrationen deutlich innerhalb zählt der gleichen Proben (Abschnitt 4) variieren.
         HINWEIS: Um Verdünnungen für alle berechnen ter zählte-Proben, CCC verwendet automatisch die Formel C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Verwenden Sie das Szenario der Aussaat 15.000 Zellen pro 200 & mgr; l in 30 Wells einer 96-Well-Platte + 1 Extra:
      1. Stellen Sie die Textbox rechts von der C2-Etikett auf 15.000 und die Konzentration Volumen Textbox bis 200, die benachbarte Kombinationsfeld Einheit 'ul' zu ändern.
         HINWEIS: Das Plugin wird letztlich die Konzentration in Zellen / ml berechnen.
      2. Stellen Sie sicher, dass das Volumen Kombinationsfeld hat V2 ausgewählt (endgültige Volumen) und in der Textbox rechts eingeben 6200 (200 & mgr; L x (30 + 1)), "ul" in der Volumeneinheit Kombinationsfeld auswählen.
   4. Klicken Sie auf "berechnen Verwässerung" der aktuell eingegebenen Verdünnung auf die linke untere Listenfeld hinzuzufügen.
      HINWEIS: Für jede Verdünnung hinzugefügt wird für jede Probe und angezeigt in dem Baumdiagramm nach rechts gelöst werden. Klicken Sie doppelt auf jeden Eintrag zu erweitern.
   5. Durch Klicken auf ter Schaltfläche "Speichern" unter dem "Sample-Viewer", um zu schreiben, alle Beispieldaten und Verdünnungen einzureichen.
   6. Hinweis: Diese Daten können die gespeicherte Datei, indem Sie auf "Load" und die Auswahl jederzeit wiederhergestellt werden.

   6. Migration und Invasion (Counter)

   1. Führen Sie die Migration und Invasion Assays , die die Standard - Boyden - Kammer - Methode ^7-9 verwendet wird .
   2. Nachdem die Zellen gewandert sind / eingedrungen, entfernen Sie sorgfältig die Medien innerhalb des Einsatzes durch Umdrehen und leichtes Antippen. Docht entfernt jegliche überschüssige Medien an der Unterseite der Membran verklebt, indem der Rand mit einem Papiertuch zu berühren.
      HINWEIS: Berühren Sie nicht die Membran selbst auf das Handtuch, das adhärierten Zellen lösen kann.
   3. Fix und färben die Zellen wie berichtet ^7-9 in einer 24-Well - Platte mit jeder Zeile mit ~ 500 ul einer anderen Lösung einrichten, zum Beispiel Fixativ, Stain 1, Fleck 2 und doppelt destilliertem Wasser (ddH ₂ O). Füllen Sie eine zweite Platte mit 1x PBS to Stellen Sie die Einsätze in vor dem Schneiden.
   4. Waschen Sie die Einsätze von ihnen in die Vertiefungen gefüllt mit ddH ₂ O und füllen Sie den Einsatz mit ddH ₂ O. Lassen Sie das Wasser vor dem Abtupfen entfernt Zellen durch Umdrehen platzieren.
   5. Verwenden Sie einen sauberen Baumwollapplikator un-migrierten / un-Invasion Zellen von der Oberseite der Membran die Pflege zu entfernen die Membran nicht beschädigt wird. Sein gründliches um die Ränder der Membran.
   6. Schneiden Sie die Membran mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell und sorgfältig übertragen die Membran (Unterseite nach oben) auf einen sauberen Glasobjektträger.
   7. Fügen Sie einen kleinen Tropfen Befestigungslösung unter und auf der Oberseite der Membran und die Abdeckung mit einer dünnen Deckglas.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen innerhalb der Befestigungslösung Trapping Genauigkeit der Zählungen zu erhalten.

   7. Binokular und Kamera-Setup

   1. Schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops und der Kamera.
      HINWEIS: Lesen Sie in der Bedienungsanleitung für detaillierte Anweisungen des Mikroskops.
   2. WitzHin der Software die Bildaufnahmeeinstellungen des Mikroskops auf die Standardwerte.
      HINWEIS: Wenn eine Mittelungsfunktion vorhanden ist, wird ein Wert von vier empfohlen. Dies ist ein guter Kompromiss zwischen dem Grad der Mittelung und Bildaufnahmezeit. Ebenso kann ein kleiner Grad der Schärfbildtreue erhöhen.
      1. Set 'Helligkeit "," Kontrast "und" Sättigung "auf 100% und" Gamma "und" Gain "bis 1,0.
         HINWEIS: Je nach Software, "Helligkeit" und "Kontrast" auf einen Wert von 0% Standard anstelle von 100%.
      2. Set-Display (Echtzeit) und Capture Auflösung bis zu ihrer maximalen Einstellungen (1.600 x 1.200 Pixel und 2.592 x 1.944 Pixel, respectively).
         HINWEIS: Display-Auflösung kann je nach Bedarf angepasst werden, wenn die Refresh-Rate zu langsam ist. Niedrigere Auflösungen werden es schwieriger machen, genau zu konzentrieren, sondern die Aktualisierungsrate zu erhöhen.
   3. Für die Phase des Binokular, verwenden Sie einen festen weißen background; eine schwarze oder Glas Hintergrund ist unzureichend.
   4. Verwenden Sie die oben Bühne Lichtquelle, vorzugsweise aus zwei flexiblen LED-Leuchten auf der rechten Seite und von der Bühne gelassen.
      HINWEIS: Eine unten stufigen Lichtquelle werden die Poren innerhalb der Migrationstest Membran beleuchten, die sich negativ auf die Genauigkeit der Folgezählungen beeinflussen können.
   5. Legen Sie eine abgeschlossene Migration Assaymembran Schieber auf die Bühne. Mit Blick auf das Bild in Echtzeit durch die Software angezeigt, stellen Sie die Vergrößerung mit dem Knopf Zoom-Einstellung, so dass die Kanten einer einzigen Membran nur innerhalb der Kamera Sichtfeld sind.
      HINWEIS: Platzieren Sie die Folie auf einer Glasplatte overtop der weiße Hintergrund der Bühne macht es leichter, die Folie für die Bildgebung zu manövrieren.
   6. Stellen Sie die Lichtquellenpositionen (7.6.1) und Belichtungszeiten so eng wie möglich um das ideale Bild in 2A gezeigt zu reproduzieren. In Abhängigkeit von der Helligkeit, Belichtungszeiten von 5-60 ms ausreichen.
      HINWEIS:Das Ziel ist , ein Bild mit so wenig Hintergrundfarbe wie möglich und eine gleichmäßig beleuchtete Membran ohne Reduktionsbildtreue, das heißt, eine Überbelichtung , die zu einem Verlust von sichtbaren Zellen zu erzeugen.
      1. Positionieren Sie die linke und rechte Lichtquellen in einem niedrigen Winkel relativ zum Schlitten. Dies wird helfen, Hintergrundflecken und Farbfehler entfernen. Versuchen Sie, jede Lichtquelle direkt gegenüber dem anderen zu halten.
         HINWEIS: Während jede Lichtquelle in Position manövriert, drehen Sie den anderen ab. Dies hilft, sich auf den Bereich der Beleuchtung auf die Membran zu zentrieren einfacher und genauer.
   7. Entfernen Sie die Folie und Weißabgleich das Bild einen einzigen Knopfdruck in das Mikroskop-Software.
      HINWEIS: Das Mikroskop ist nun kalibriert. Speichern Sie so viele Einstellungen wie möglich für die zukünftige Verwendung und beachten Sie die Lichtquellenpositionen und Intensität.

   8. Bildaufnahme und Flatfield

   1. Innerhalb der Software dieder Capture-Ordner und Capture ein Bild pro Membran. Nennen Sie die Bilder nach dem allgemeinen Vorlage von: Name - ###, zB Steuerung - 001.tif, Kontrolle - 002.tif, Test Droge - 001.tif, und so weiter.
      HINWEIS: Für die beste Bildergebnisse, die Bilddateityp als TIFF über andere verlustbehaftete Formate wie JPEG speichern.
      HINWEIS: Die Bilder im Anschluss an die allgemeine Vorlage nicht noch gezählt werden, aber nicht auf automatisierte Gruppierung und Flatfield unterliegen.
      1. Wenn Flatfield-Korrektur gewünscht wird, für jede Folie in einen leeren Bereich zu finden und ein leeres Bild im Anschluss an die Namenskonvention nehmen: Name - Blank.
         HINWEIS: Eine leere ein Bereich auf der Folie ist, die keine Membran enthält und stellt die Hintergrundbeleuchtung.
      2. Unmittelbar vor der Bildgebung, glätten jede Membran durch Druck über die Deck Anwendung und so viele gefangen Blasen wie möglich zu entfernen.
   2. In ImageJ, gehen die TC-Plugin, um Plugins und öffnen; zB Plugins> Analysieren> & #39; Transwell-Counter '.
   3. Innerhalb TC, klicken Sie auf die Schaltfläche 'Flatfield' und das Dialogfeld Verzeichnis auswählen beobachten. Wählen Sie den Ordner, in dem die Membran Bilder gespeichert wurden.
      HINWEIS: Es werden nur Bilder mit der allgemeinen Vorlage gespeichert oben wird automatisch korrigiert und in einem neuen Ordner namens Flatfield im ausgewählten Ordner gespeichert Flatfield werden. Siehe 2B ein Beispiel eines Flatfield korrigiertes Bild.

   9. Konfigurationseinstellungen

   1. Öffnen Sie eine Migration Assaymembran Bild in ImageJ ( 'Datei'> 'Open') und wählen Bild> Anpassen> 'Farbschwellwert ...'. Beachten Sie die Farbschwelle Fenster einstellen, welche Farben werden aus dem Bild herausgefiltert werden.
      1. Am unteren Rand des Fensters gesetzt Thresholding Methode 'Shanbhag', Threshold Farbe "Weiß" und Farbraum auf "RGB" (rot, grün, blau); Deaktivieren Sie die Option Dunkler Hintergrund, wenn ausgewählt.
      2. Stellen Sie die obereSchieber durch Klicken und die Markierungen auf 0 und die unteren Schieberegler, um 255 ziehen (die unteren Schieber bei 255 verlassen). Stellen Sie sicher, dass das Bild vollständig weiß ist.
   2. Stellen Sie die grünen und roten oberen Schieber, bis nur noch die Kerne sichtbar sind.
      HINWEIS: Die Einstellungen werden verwendet, vollständig auf die Zelle Fleck ausgewählt variieren. Siehe Abbildung 2C.
   3. Im TC-Plugin, geben Sie die Werte der RGB oberen Schieber in die "RGB Threshold" Konfigurationseinstellungen zugehörigen Textfelder. Klicken Sie auf die "Hinzufügen / Ändern" klicken und die Konfiguration überschreiben.
      1. Lassen Sie die Größenbereich Untere und Obere Werte bei 1 - Infinity.
   4. Im Panel-Konfigurationseinstellungen, klicken Sie auf "Speichern", um die Einstellungen auf die Festplatte zu schreiben.

   10. Zählen Bilder und Kalibrierung

   1. Öffnen Sie das TC-Plugin (8.2) und klicken Sie auf 'Count Ordner' und beobachten Sie das Verzeichnis auswählen Dialogfeld. Wählen Sie den Ordner zu zählen einnd warten, bis es zu beenden.
   2. Jede gezählte-Probe wird auf die Haupttabelle automatisch hinzugefügt. Schlüsselspalten sind 'Count "," Qualität "und" Kalibrieren Sie? ".
      HINWEIS: Die nicht-abgeglichenen Count ist die Anzahl der Partikel pro Membran in dem Bereich in der Spalte 'Area Bereich' angezeigt.
      HINWEIS: Qualität reicht von etwa -0,8 bis 1,7; Q ≥ 0,5 ist akzeptabel.
      1. Beachten Sie ein Häkchen in das "Kalibrieren? ' Spalte, wenn ein Bild markiert ist der ideale Metriken auf seiner Ähnlichkeit zur Kalibrierung basiert.
         HINWEIS: Sowohl Qualität und Kalibrierung könnte darauf hindeuten, dass die aktuellen Einstellungen möglicherweise nicht ausreichen. Wenn nach dem richtigen "Farbe Thresholding" und "Größenbereichen" wurden ausgewählt und Kalibrierung wird noch vorgeschlagen, Inspektion des Originals und gezählt Bilder sollte die endgültige Determinante eines gültigen Zählung sein.
   3. Wählen Sie alle Proben in der Tabelle Markiert für die Kalibrierung.
      1. Rechtsklick in ter Tisch und wählen Recount> 'Empfohlene Größe ". Dies wird erzählen die Bilder mit einem empfohlenen Mindestkornfläche.
      2. Rechts klicken Sie erneut auf und wählen Sie "Show Plot '. Beachten Sie die Frequenz Streudiagramm der Partikelbereiche. Ein ideales Bild wird eine Kurve , die eine lange rechten tailed - Normalverteilung ähnlich, dh der Glockenkurve. Siehe Abbildung 3B.
      3. Stellen Sie den unteren Größenbereich, falls erforderlich, durch die Auswahl der Stichprobe, der rechten Maustaste, und wählen Sie Recount> 'Manuelle Einstellungen ". Beachten Sie die manuellen Einstellungen-Dialog. Geben Sie die gewünschten Einstellungen und klicken Sie auf Count mit den neuen Einstellungen auf das Bild erzählen.
   4. Zum Einstellen der Zählungen manuell wählen Sie die Proben, rechts der Tabelle klicken, und wählen Sie "Bild öffnen mit zählt". Beachten Sie das Originalbild mit roten Markierungen repräsentiert jedes Teilchen durch das Plugin gezählt.
      HINWEIS: Recount> 'Show gezählt Binärbild' nützlich sein kann, wie gut zu überprüfen iNDIVIDUALSTIPENDIEN Zellen werden durch die Farbe Schwellwertbildung gelöst.
      1. Um einen Zähler hinzuzufügen, halten Sie "Strg" und klicken Sie links. Beachten Sie einen Marker an der Cursor-Position, die zu den Proben Gesamtzahl hinzugefügt werden. Um eine Markierung zu entfernen, klicken Sie rechts auf das Bild. Das Plugin wird die Markierung am Cursor zu entfernen.
      2. Um eine Gruppe von Markierungen zu entfernen, ein Auswahlwerkzeug in ImageJ verwenden, um eine Region of Interest (ROI) zu wählen. Digi-Key, rechts klicken Sie auf das Bild Halten und alle Marker innerhalb der ROI werden entfernt. Beachten Sie die Zellzahl in der "Count" Spalte.

   11. Speichern / Öffnen Ergebnisse und Exportieren in CSV

   1. In TC, gehen Sie in der Menüleiste und klicken Sie auf "Datei"> "Ergebnisse speichern". Beachten Sie die Ergebnisse speichern Dialogfeld. Wählen Sie einen Namen und das Ziel und klicken Sie auf "Speichern".
      1. Verwenden Sie 'Datei'> 'Open Ergebnisse' eine Datei zu laden, die alle die in der Haupttabelle angezeigten Daten, including die Handlung.
         HINWEIS: Die Ergebnisdatei speichert die Verzeichnisse die Bilder in gespeichert sind, wenn die Originalbilder bewegt werden nach dem Speichern, die 'Open Originalbild "und" Bild öffnen mit Zählungen' Funktionen fehl..
      2. Um das Bild Verzeichnis zurückzusetzen, um die Proben auszuwählen, klicken Sie rechts in der Tabelle, und wählen Sie "Reset Bildverzeichnis '. Beachten Sie das Verzeichnis auswählen Dialogfeld. Wählen Sie den neuen Ordner, und wenn die Bilder vorhanden sind, werden die Verzeichnisse zurückgesetzt werden. Re-save die Ergebnisdatei.
   2. So speichern Sie gehen, um eine Comma Separated Values ​​(CSV) Datei, in der Menüleiste auf "Datei"> "Export to CSV". Dies erzeugt eine Datei mit Proben in statistischer Gruppen mit der mittleren organisiert zählen und Standardfehler des Mittelwerts; das Layout ist für eine schnelle Grafik gemeinsam Grafikprogramme.
      HINWEIS: Die statistische Gruppen basieren auf den Gruppen innerhalb TC angelegt.
      1. Wenn die Proben der allgemeinen Benennungsvorlage folgen, wählen Sie die Proben gr seinouped rechten Maustaste und wählen Sie "Auto-Gruppierung". Dies fügt Proben mit dem gleichen 'Name' zu der gleichen Gruppe. Am Beispiel Steuerung - 1, Kontrolle - 2, Behandlung - 1, Behandlung - 2: beide Kontrollen der Gruppe "Control" und Behandlungen "Behandlung" hinzugefügt würde.
      2. In Proben manuell Gruppen durch einen Doppelklick auf das die Probe 'Gruppe' Zelle und der Eingabe in die Gruppennamen. Wählen Sie die Proben zu dieser Gruppe hinzugefügt werden soll, klicken Sie rechts und wählen Sie "Zur Gruppe hinzufügen".

Representative Results

Zellkonzentration Rechner

Abbildung 1 zeigt den Gesamtprozess der CCC - Kalibrierung und zählbar Bildaufnahme. 1A und 1B zeigen die P-Quadrat Kalibrierungsbild und Berechnung von P-Quadrat Länge in Pixeln. CCC bestimmt Zellkonzentration in einem bestimmten Volumen nach der Formel:

Einem Hämocytometer des P-square hat ein Volumen von 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm), und diese Konstante gegeben, kann die gesamte Bildvolumen nach der Umwandlung Pixeln mm berechnet werden. 1C ist ein idealer zählbaren Bild mit in-focus - Zellen die charakteristische Phasenbeleuchtungs Anzeige und keine Abstufungen Hintergrund Hämozytometer. Schließlich ist das Streudiagramm von Figure 1D zeigt eine stark korreliert sind , genommen manuellen Vergleich automatisierte Zählung von Zellen , die aus 57 Bildern über verschiedene Experimente und Zelltypen , einschließlich HTR8, ES-2 und Swan71. Bemerkenswert war der obere Bereich der Konzentration ~ 5,6 x 10 ⁶ Zellen / ml mit einem niedrigen Ende ~ 2,3 × 10 ³ Zellen / ml (≈ 5 Zellen pro Bild). Es wird vorgeschlagen, dass, wenn Zahlen unter 10-15 Zellen pro Bild sind, sollte die Probe in einem kleineren Volumen ausgesetzt werden statistische Aussagekraft zu erhöhen.

Erfassung und Verarbeitung von Bildern für Migration Assay Zähler

Hunderte von Migrationsassay-Membranen wurden viele Experimente abgebildet über, von denen alle mit dem menschlichen Trophoblasten-Zelllinie HTR8, Swan71 oder Eierstockkrebs-Zelllinie ES-2 ausgesät. Von diesen Bildern wurden mehrere verschiedene Kategorien von sehr schlecht bis ausgezeichnet Qualität auf Helligkeit, Klarheit und Farbe der Staine Basis darstellen gewähltd-Zellen und der Grad des Hintergrundfärbung und unerwünschte Partikel (noise). Mit diesen Bildern wurden die Standard - RGB - Farbeinstellungen Threshold (≈ 150, 120, 0) bestimmt (Abbildung 2C) und als Grundlage für alle weiteren Entwicklungen des Algorithmus verwendet. Das Ziel war es, die Kernfarbe Gesamtfarb Verhältnis zu maximieren, das heißt, sollte die Mehrheit der farbigen Pixel innerhalb Zellkerne sein. Die obere Platte in Figur 2A veranschaulicht die ideale Bildhelligkeit, Zellkerne Klarheit und Farbe, und vernachlässigbare Hintergrundrauschen. Die Helligkeit des Bildes ist wichtig, um sicherzustellen, dass es eine große genug Kontrast zwischen Zelle und Hintergrund, die eine Schwarz-Weiß-Binär-Bild zu erzeugen.

Wenn diese Differenz nicht erfüllt ist, groß oder unvorhersagbare Bereiche können durch die ImageJ Analysieren Particles Funktion gezählt werden; Im besten Fall ist ein komplett weißen Hintergrund. In der Opposition die untere Platte von FiAbbildung 2A hat extreme Hintergrundfärbung und Zellen , die fast nicht zu unterscheiden sind. Die Membranen mit diesem Grad der Verschmutzung wird wahrscheinlich unzuverlässige Ergebnisse aus dem Migrationstest Zähler erzeugen.

In einigen Fällen kann durch eine Überbelichtung des Bildes beeinflussen Bildtreue Helligkeit auf die ideale Niveau zu erhöhen. In ähnlicher Weise können hohe Belichtung oder Helligkeit erzeugen systemische Farbeffekte mit progressiven oder unregelmäßigen hellen und dunklen Bereichen. Mit Flatfield - Korrektur, können diese Effekte vollständig minimiert oder entfernt werden , wie in 2B (obere vs. unteres Feld) gezeigt. Darüber hinaus ist Flatfield-Korrektur eine gute Möglichkeit, die Helligkeit von mehreren Membran Bilder zu entzerren.

Kalibrierung und Validierung von Migration Assay Zähler

Zur Unterstützung der unser in besser zu bestimmen , ob Migration Assaymembran Bilder , die die erforderlichen Kriterien für eine genaue Zählung treffen, zwei Qualifikations entworfen wurden, die so genannte Bildqualität (Q) und Kalibrierung Empfehlung (CR). Wichtig ist, dass beide Qualifikations, wie der Name CR schon sagt, sind Empfehlungen und fungieren als Führer nicht als absolute Richter des Zählbarkeit jedes Bildes. Sowohl Q und CR werden auf den Metriken der Frequenzstreudiagramm der Partikelbereich basiert (10.3.2). Zur Vereinfachung kann eine Metrik, wie die verschiedenen Formen der Kurve betrachtet werden, die die Häufigkeitsplot bilden. Die gewünschte metric einer ausreichenden Q (≥0.5) wurde durch die beobachtete annähernde Normalverteilung der Zellgröße bestimmt wird . Üblicherweise werden Zellen, die voneinander nicht auflösbaren sind, überfärbt, oder einfach nur besonders groß ist , verschieben die skewedness zu einer Normalverteilung rechts-tailed (3B). Als solches ist dies die ideale metric eines typischen kalibrierten Bildes. Mitdie Zugabe von Hintergrundrauschen, führt dies normalerweise zu einer großen Anzahl von Teilchen in dem 1-5 Pixelbereich - Bereich (3A). Um die Handlung Metriken zu berechnen, werden die Daten mit zehn Savitzky-Golay geglätteten Kurven von Dr. Michael Thomas Flanagan Java Scientific Library produziert unterschiedliche Polynomgrade ausgestattet (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Java/). Im Wesentlichen schafft diese mehrere Punkte in dem ungefähren Bereich jedes Extremum. Durch eine Reihe von Dichte Cluster Karten von lokalen Minima und Maxima, ein allgemeines Bild der Plot - Metriken können als eine geordnete Liste, das heißt, Minimum, Maximum, Minimum / Maximum Überlappung berechnet werden, ..., n - ^ten Extremum. Kurz gesagt, zu denen der Grad die geglätteten Kurven passen die Frequenzdaten bestimmt, wie eng die Extrema gepackt Punkte sind. Je größer die Clusterung von nicht überlappenden Extrema, desto größer Q wird. Theoretisch stellt Q Klarheit Gesamtbild basierend auf ter Verteilung der unterschiedlichen Partikelgrößen.

Ob die Boolsche CR wahr ist oder nicht , hängt von der Folge von Extrema. Aus Figur 3A würde die geordnete Liste Minimum, Maximum, und eine Sequenz von überlappenden Extrema auf der Basis der Eigenschaften des Savitzky-Golay - Kurve. Da 3A stellt einen unkalibrierten Bild, diese allgemeine Folge von Extrema Flaggen CR als wahr, was darauf hindeutet , dem Benutzer , dass die Bildkalibrierung benötigen. In Zukunft ist zu sehen, dass aus Figur 3B, wobei diese Aufzählung identisch sein würden , aber unter Ausschluss des ersten Minimums. So sind die Metriken der idealen unkalibrierten und kalibrierte Bilder wurden bestimmt. Abweichungen von diesen Kennzahlen wird ein Bild für die Kalibrierung im Allgemeinen Flagge und Q ≤ 0, wie der Fall mit der hohen Hintergrundrauschen Membran in 3C reduzieren. Die Anwendung dieser Qualifier auf eine Auswahlvon bescheiden hervorragende Bilder, in Bezug auf Helligkeit und Hintergrundrauschen, ist es klar , dass kalibrierte Bild zählt als unkalibrierten deutlich näher manuelle Zählungen sind (1,9% ± 0,3 vs. 21,7% ± 2,9 sind; Figur 3D, E). die insgesamt hohe Qualität der Bilder für die Analyse (unkalibrierten gewählt Gegeben = 0,71 ± 0,04; Mittelwert ± SE), gab es eine erwartete moderate Erhöhung nur in Q nach der Kalibrierung ( = 0,90 ± 0,04). Zusammengenommen legt nahe , Q die Gesamt Zählbarkeit Potential eines Bildes während CR ist ein starker Indikator dafür , ob die Kalibrierung erfolgreich ist oder nicht.

Timing-Vergleiche beider Zell Konzentration Zähler und Migration Assay Zähler

4A vergleicht CCC Kalibrierungszeit zwischen Benutzer 1 und 2. Wie erwartet, Benutzer 1 war wesentlich schneller als Benutzer 2 zusammen, im Durchschnitt etwa fünf Minuten CCC Kalibrierung nehmen. Um manuelle Hemocytometer Zählen und automatisierte Preise zu vergleichen, die manuelle Rate von Zählen einer Tally Zähler mit verglichen wurde es zur Zeit neun Bilder der Hemocytometer Kammer zu nehmen nahm und CCC (4B) gezählt. Eine typische Zellkonzentration von 1,15 x 10 ⁶ Zellen / ml verwendet wurde Timings zu vergleichen, auf durchschnittlich 1x Durchsatzsteigerung führt. Diese Rate wird in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen variieren in die geladeneHämozytometer als die Gesamtzeit aufgenommenen Bilder zu erfassen und zu verarbeiten, sie ist unabhängig von der Zellzahl.

Schließlich Timings umfasst die Bildaufnahme von Membranen, Quantifizierung innerhalb TC und manuelle Anpassungen dieser Bilder wurde in 4C gemessen. Bemerkenswert ist, 12 Migration Assay Membranen mit niedrigen Zellzahl (Total = 10.571 Zellen) und wesentliche Hintergrundfärbung und Zelltrümmer wurden ausgewählt, ein Worst-Case-Szenario zu erleichtern, die manuelle Anpassungen auf die Zellzahl erfordern würde. Dies ist in Figur 4C Anpassung (Adj) -Säule reflektiert , wo es dauerte durchschnittlich 13 min , um unerwünschte Zählwerte entfernen und fehlende Zellen hinzufügen. Zum Vergleich zu manuellen Zählung wurden optimale Zell Zählraten mit Zellzähler bestimmt; hochwertige Membran Bilder mit hoher Zelldichte verwendet wurden (Ergebnisse nicht gezeigt). Dies ergab eine durchschnittliche maximale Rate zwischen Benutzer 1 und 2 von 9,1 x 10 ³ Zellen / h(~ 2,5 Zellen / s). Mit diesen Zahlen wurden die Membranen aus 4C gezählt 4.4x mit TC schneller als würde bei maximaler manuelle Rate zu erwarten. Die Zeitersparnis sind direkt abhängig von der Zellzahl und Bildqualität, durch Migration Membranen zählen, die wenig oder keine Einstellung und hohe Zelldichte (~ 7.000 Zellen / Membran) erforderlich ist, erzeugt TC Zellzahlen 1,395x schneller als die maximale manuelle Rate.

Abbildung 1: Zellkonzentration Rechner. (A) Phasenkontrastaufnahme des zentralen primären Quadrat der Zählkammer bei 40 - facher Gesamtvergrößerung genommen. Maßstabsbalken entspricht 200 & mgr; m. (B) A geerntete Version des Bildes von (A) darstellt , welche Länge am Hämozytometer gemessen. Das Ergebnisfenster Länge Säule wurde für eine einfache Identifizierung markiert. Yellow Bar= 1 mm. (C) Eine ideale mikroskopische Aufnahme eines Hämocytometer enthält HTR8 Zellen nach Mikroskop und Software - Kalibrierung bei 40 - facher Gesamtvergrößerung mit einer Auflösung von 1.600 x 1.200 Pixel. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. (D) ein Streudiagramm zu vergleichen manuelle Zählungen der ImageJ Plug - Zellzähler mit im Vergleich zu automatisierten Zählungen der gleichen Bilder Zellkonzentration Rechner verwenden. n = 57 Bilder. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Migration Assay Zähler repräsentative Bilder. (A) Die obere Platte ist ein ein Achtel Abschnitt einer Gesamtmembran ein ideales Bild mit minimalem Hintergrund darstellt; Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Dasuntere Platte enthält ein Bild mit einer signifikanten Hintergrundfärbung, die die Genauigkeit der automatischen Zählung stark beeinflusst; Maßstabsbalken = 585 & mgr; m. (B) Die obere Platte stellt ein dunkles Bild von guter Qualität , die ungenau zählt produziert. Die Bodenplatte ist eine zählbare Version des gleichen Bildes nach Korrektur Flatfield. Maßstabsbalken = 593 & mgr; m. (C) Das obere Feld stellt eine gezoomte im Hinblick auf eine typische Membran. Das untere Feld das gleiche Bild ist durch die gewünschte ImageJ Farbe Thresholding gefolgt (RGB Threshold = 150, 120, 0) interzellularen Hintergrund und die Mehrheit der sichtbar gefärbte Zytoplasma zu entfernen. Alle Bilder wurden bei 1,35 x Gesamtvergrößerung mit einem kalibrierten Binokular mit einer Auflösung von 2.592 x 1.944 Pixel von mehreren Migrationstest Invasionen von HTR8 gefärbt mit Hämatoxylin genommen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um die viewa größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Kalibrierung und Validierung von Migrationstest c ounter. (A) Ein typisches Beispiel eines unkalibrierten Bild von hoher Qualität. (B) Die kalibrierte Version von (A) mit Recount Migrationstest Zähler> "Empfohlene Größe". (C) Eine typische Frequenzdarstellung einer niedrigen Bildqualität Membran mit einer signifikanten Hintergrundfärbung oder insgesamt Dunkelheit. (D) ein Streudiagramm zu vergleichen manuelle Zählungen mit dem ImageJ Plug - Zellzähler und Migrationstest Zähler automatisierte zählt. (E) Ein Balkendiagramm die durchschnittliche prozentuale Differenz von kalibrierten gegen unkalibrierten automatisierte Zählungen zeigt. Daten sind Mittelwerte ± SE. P <0,0001, n = 30, ungepaarten t-Test mit Welch correction. Die gleichen Bilder verwendet wurden für D und E. Die Kalibrierung der beiden wurde mit dem Recount getan> "Empfohlene Größe" und Recount> "Manuelle Einstellungen" die Mindestgröße gezählt und Farbschwelle weiter zu verfeinern. Keine manuellen Zählung Anpassungen wurden mit dem 'Open Bild mit Zählungen' Funktion gemacht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Zeitpunkt der Zellkonzentration Zähler und Migrationstest Zähler Nutzung. (A) Vergleich der CCC Kalibrierzeiten (Schritte 1 und 2) zwischen Benutzer 1 (CCC / TC - Experte) und User 2 (CCC / TC Anfänger). (B) die manuelle Zellzählung Zeiten wurden über fünf Studien gemittelt und in Zellen pro Minute gezählt ausgedrückt. automac Zählungen wurden durch Mittelungszeiten berechnet neun Bilder einer Hämozytometer Kammer zu erfassen und mit CCC gezählt. Zellkonzentration verwendet wurde , war ~ 1,15 x 10 ⁶ Zellen / mL. Daten sind Mittelwerte ± SE. n = 5 (C) Transwell Zähler Timings wurden im Vergleich über drei Kategorien: Erwerb (Acq; Schritte 7 und 8), Quantifizierung (Qnt; Schritte 10.1-10.3.3 Standardkonfigurationseinstellungen verwendet wird ), und die manuelle Einstellung (Adj; Schritte 10.4 -1.4.2). Die Membranen quantifiziert hatte einen hohen Grad an Hintergrundfärbung und Schutt, um so erhebliche manuelle Einstellung für genaue Zählungen erforderlich machen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Kritische Schritte, Fehlerbehebung und Einschränkungen

Das Wesen der automatisierten Rechenverfahren, insbesondere die der Partikelanalyse erfordert die mathematische Fähigkeit, diese Partikel zu definieren. Folglich ist die Genauigkeit der beiden Zellkonzentrationsrechner und Migrationsassay Zähler majorly abhängig von Bildwiedergabetreue, das heißt, wie genau das übernommene Bild das Membranzellprobe oder Migrationstest ähnelt. Es ist daher von größter Bedeutung Mikroskop und zugehörige Software Kalibrierprotokollen so gut wie möglich zu folgen. Dazu gehören Hintergrundrauschen zu begrenzen, unerwünschte Partikel zu reduzieren, die Erfassung hell und gleichmäßig im Fokus befindlichen Bilder, und in nicht-verlustbehafteten Dateiformaten wie TIFF speichern. Somit sind beide Plugins wahrscheinlich fehlerhafte Ergebnisse zu produzieren, wenn diese Voraussetzungen nicht erfüllt sind. Es wird daher immer eine gute Praxis zu Doppelzählungen Kontroll-Zelle zu bestimmen, ob sie, wenn sie in doub visuellen Erwartungen entsprechent. Wenn in der Tat die Ergebnisse nicht übereinstimmen, das Originalbild mit dem binären Bild vergleichen kann das Problem (10.4 Anmerkung) helfen aufzuklären. In einigen Fällen dunkler Migrationsassay Bilder können große Bereiche enthalten, die durch Werte Pixel gezählt wurden innerhalb der Farbschwellengrenzen fallen. Im Allgemeinen wird ein Bild unter Verwendung Flatfield entfernen Dunkelheit und Fleckigkeit und verhindern, dass die meisten unerwünschten Zählungen aufgrund der chromatischen Unregelmäßigkeiten.

Da Probleme diese möglichen und relativ häufig, ist es wichtig , Standardbild Integrität Richtlinien , wie sie von der Nature Publishing Group und andere ¹³ vorgeschlagen zu folgen. Um zählt konsistent zu halten, sollte jede Anpassung an ein Bild in gleicher Weise für alle anderen angewendet werden. Dies beinhaltet, ist aber nicht, um den Kontrast, Sättigung, Helligkeit, Verstärkung, Filter wie Mittelung und die Schärfe und die Farbfilter beschränkt. Einstellung der gamma sollte vermieden werden, da es eine nichtlineare Änderung der Pixelfarbe gilt und so jedes Bild beeinflussen können verschiedenely ^14. Wenn eine gemeinsame Belichtungszeit Bilder mit wenigen Zellen Anwendung (<1000), kann dies zu einer Überbelichtung und den Verlust der Bildtreue führen. Umgekehrt kann eine Membran mit Tausenden von Zellen erfordern höhere Belichtungszeiten Unterbelichtung zu verhindern. Dementsprechend ist es am besten Praxis Bilder so wenig wie möglich einzustellen, und nur bei Bedarf, erreichbare höchste Bild Treue zu halten.

Selbst mit einem High-Fidelity-Bild, wahre Partikelzählungen durch unerwünschte Partikel stark verzerrt sein. Wenn die Zellkonzentrationsrechner verwenden, wenn eine Probe signifikante Mengen von Zelltrümmern enthält, und zwar von Bereichen ähnlich denen von suspendierten Zellen, kann dies das Ergebnis verfälschen. In einigen Fällen kann diese automatisierte Analyse zu verhindern, wenn die Bruchstücke nicht minimiert werden kann. Ebenso Membranen Migrationstest, die hohe Hintergrundfärbung von ähnlicher Farbe enthalten Zellen oder nicht entfernten Zellen von der Rückseite der Membran gefärbt wird erzeugen wahrscheinlich inAuf Ergebnisse. Diese unerwünschten Partikel können in der Regel in ein paar Möglichkeiten entfernt werden: die Helligkeit der Lichtquelle oder Belichtungszeit zu erhöhen, ändern die Farbe Thresholding strenger zu sein, oder manuell über "Bild öffnen mit Zählungen '(10.4) entfernt. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll die optimale Bildqualität für CCC und TC zu halten Genauigkeit erforderlich produziert. Allerdings ist TC kann Bilder von deutlich weniger Qualität, unterschiedlichen Vergrößerungen oder unterschiedliche Farbflecken zu zählen, in der Regel nur mehr Zeit erfordern, auf manuelle Einstellungen ausgegeben (10.4).

Während der Kalibrierung jeder Migration Assaymembran Bild ist es wichtig zu berücksichtigen, um die Auflösung des Bildes und die relative Größe der Zellen. Wie zuvor beschrieben, Bildqualität (Q) und Kalibrierung Empfehlung (CR) sind auf Häufigkeitsplot Metriken der Partikelbereich abhängig. Von den analysierten Bilder, nimmt jede Zelle im Durchschnitt bis 1 / 100.000 derGesamtbildfläche. Wenn Bilder von nur Millionen von Pixeln mit einem kleinen Zellgrößenverhältnis verwendet werden, ist die Veränderung in der Zellgröße ebenfalls klein. Das heißt, nur die Varianz 10-60 px reichen. Aber als die Zellenfläche zur Bildflächenverhältnis größer wird, Größen die Verteilung der Zelle erhöht, die Kurtosis der Zellgröße Normalverteilung zu reduzieren, indem die Frequenz von einem bestimmten Bereich zu verringern. Dies wiederum kann die automatisierte Berechnung von Zellenbereich erschweren oder unmöglich machen, weil eine bestimmte Mindestfläche nicht bestimmt werden kann. In ähnlicher Weise gilt dies auch für Bilder mit geringer Anzahl von Zellen, in denen die Häufigkeit der verschiedenen Zellgrößen kann sehr gering sein (<50). Als Ergebnis wird, wenn in dieser Studie oder verschiedene Verteilungen von Zellgröße, manuelle Identifikation von Zellgrößenbereich verwendet, um Bilder mit unterschiedlichen Auflösungen als die Analyse kann (10.3.3) erforderlich sein.

Bedeutung und Perspektiven

Die ImageJ Plug-Zellzähler wurde zunächst Releasierend im Jahr 2001 von Dr. Kurt De Vos und wurde als eine Klammer für die manuelle Zellzählung an diesem Tag serviert. Um den Trend der frei verfügbaren Werkzeugen für die biologische Gemeinschaft, Zellkonzentration Rechner und Migration Assay Zähler bieten, den nächsten Schritt in kostenlose Tools, weiterhin zu helfen, den Durchsatz zu erhöhen und inter experimentelle Reproduzierbarkeit von Migrationsassays. Das Endergebnis Migrationsassays ist stark abhängig von der Anzahl der Zellen beimpft. Ergo eine zuverlässige Zellzahl ist eine Notwendigkeit für die Reproduzierbarkeit. Auf diese Weise bietet CCC Genauigkeit sowohl auf höhere statistische Sicherheit der Zellkonzentration und kürzere Zählzeiten Konservierungszellgesundheit erhöht.

Darüber hinaus ist das Endergebnis der beiden Plugins, um eine Zählung der Zellzahl und nicht ein relativer Index wie Fluoreszenz. Verschiedene andere Protokolle existieren diese Maßnahme Fluoreszenz nach Färbung , aber diese Methoden leiden unter Mangel an Sensibilität ^13. Adobe Photoshop bietet eine eigene Partikelanalyse tool aber das Programm muss für die Verwendung erworben werden und bietet nicht die Post-Zählung von ²⁰ Migrationstest verfügbare Analyse. Beide Plugins setzen auf die Partikelzählung Funktion von ImageJ und kann folglich durch die Makros bearbeitet von ImageJ verwendet vom Endbenutzer geändert werden. Dies bietet mehr Flexibilität für den Benutzer durch die Schaffung neuer Makros den Umfang der Plugins andere Partikel zu erweitern. Die weitere Entwicklung der Breite von zählbaren Partikel zu erhöhen und Endanwender Beiträge integrieren ist der nächste logische Schritt. Durch die Kombination von Analyse, um die Kernprinzipien der Zellzähler mit einem automatisierten Zählalgorithmus und Post-Zählen, dies erhöht die Leichtigkeit, mit der Migration Assays können ohne Verlust an Genauigkeit bearbeitet werden. Die Plugins sind frei zum Download zur Verfügung mit Installationsanweisungen aus: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required