Summary
هنا، نقدم بروتوكول الأمثل للتعداد وتميز المكاك ريسوس خلايا CD8 + T ضد فيروس الإيدز. هذه المقالة هي مفيدة ليس فقط في مجال علم المناعة فيروس نقص المناعة البشرية، ولكن أيضا في مناطق أخرى من البحوث الطبية الحيوية حيث من المعروف أن استجابة خلايا CD8 + T للتأثير على نتائج المرض.
Abstract
وقد الببتيد كبيرا التوافق النسيجي الطبقة معقدة الأول (PMHC-I) tetramers أداة لا تقدر بثمن لدراسة CD8 + استجابات الخلايا التائية. لأن هذه الكواشف ربط مباشرة إلى مستقبلات الخلايا التائية على سطح CD8 + الخلايا اللمفاوية التائية، tetramers PMHC-I-وصفت تألقي تمكين كشف دقيق للمستضد (حج) -specific CD8 + T-الخلايا دون الحاجة إلى إعادة في المختبر -stimulation. وعلاوة على ذلك، وعندما يقترن متعددة الألوان التدفق الخلوي، ويمكن PMHC-I tetramer تلطيخ تكشف عن جوانب رئيسية من CD8 + T-خلايا حج محددة، بما في ذلك مرحلة التمايز، النمط الظاهري الذاكرة، وحالة التنشيط. وكانت هذه الأنواع من التحليلات مفيدة بشكل خاص في مجال علم المناعة HIV حيث CD8 + T الخلايا يمكن أن تؤثر على تطور مرض الإيدز. العدوى التجريبية من قرود المكاك ريسوس مع فيروس نقص المناعة القردي (SIV) يوفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة المناعة الخلوية ضد فيروس الإيدز. ونتيجة لذلك، PROGRE كبيرأحرز SS في تحديد وتوصيف استجابات الخلايا التائية في هذا النموذج الحيواني. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لتعداد SIV محددة CD8 + الخلايا التائية في قرود المكاك ريسوس التي كتبها PMHC-I tetramer تلطيخ. يسمح لنا مقايسة في وقت واحد الكمي والذاكرة phenotyping من اثنين من السكان PMHC-I tetramer + CD8 + T-خلية في الاختبار، والتي قد تكون مفيدة لتتبع CD8 + استجابات الخلايا التائية SIV محددة الناتجة عن التطعيم أو العدوى SIV. وبالنظر إلى أهمية الرئيسيات غير البشرية في مجال البحوث الطبية الحيوية، وهذه المنهجية هي قابلة للتطبيق لدراسة CD8 + استجابات الخلايا التائية في إعدادات أمراض متعددة.
Introduction
تشمل CD8 + T الخلايا عنصرا حاسما في الجهاز المناعي التكيفي كما أنها تشارك في الورم المراقبة المناعة والمساهمة في القضاء على مسببات الأمراض داخل الخلايا 1. بعبارات بسيطة، CD8 + T-خلايا تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) التي تعترف على وجه التحديد الببتيد كبيرا التوافق النسيجي الطبقة معقدة الأول (PMHC-I) جزيئات موجودة على الغشاء البلازمي للخلايا المضيفة. منذ يتم الحصول على هذه الببتيدات من التحلل البروتيني من البروتينات توليفها التطور الطبيعي، وتوفر المجمعات PMHC-I سطح الخلية نافذة على البيئة داخل الخلايا. على عدوى فيروس، على سبيل المثال، فإن الخلايا المصابة عرض جزيئات MHC-I تحتوي على الببتيدات المستمدة من الفيروسات التي يمكن أن تكون بمثابة بروابط لTCRs أعرب عن طريق القيام بدوريات CD8 + الخلايا التائية. في الحدث CD8 + T-خلية الفيروس محددة اجه الخلية المصابة تقديم يجند PMHC-I، فسوف المشاركة TCR يؤدي في CD8 + تنشيط خلايا T وأولتييؤدي المطاف إلى استهداف تحلل الخلية. ونظرا للطبيعة الحساسة لهذه التفاعلات TCR / PMHC-I، وتحديد حجم ونوعية، والنمط الظاهري من الاستجابة CD8 + T الخلايا وغالبا ما تكشف عن خيوط مهمة حول الأمراض التي تصيب الإنسان.
حتى 1990s في وقت مبكر، وتحديد حجم CD8 + T-خلايا حج محددة تعتمد على مطالبة من الناحية الفنية فحص تخفيف الحد (LDA) 2،3. لم يكتف LDA تتطلب عدة أيام إلى أن تكتمل، إلا أنها أخفقت أيضا للكشف عن الخلايا التي تفتقر إلى إمكانية التكاثري. ونتيجة لذلك، LDA التقليل إلى حد كبير من وتيرة الفعلي للمستضد (حج) -specific CD8 + الخلايا التائية المشاركة في الاستجابة المناعية. على الرغم من أن تطوير ELISPOT والخلايا المقايسات خلوى تلطيخ تحسن كبير في القدرة على قياس المناعة الخلوية، وهذه الأساليب لا تزال هناك حاجة إلى تحفيز المختبر لقياس حج محددة خلايا تي 4. لم يكن حتى عام 1996 أن ألتمان، ديفيس، وكولeagues نشرت مقالة بارزة على الإبلاغ عن تطوير تكنولوجيا tetramer PMHC-I 5. حاسمة لنجاح هذا الأسلوب كان multimerization من جزيئات PMHC-I، الذي مدد نصف عمر التفاعلات TCR / PMHC-I، مما يقلل من احتمال tetramers PMHC-I تسقط خلال خطوات الغسيل من المقايسات تدفق cytometric. والميزة الرئيسية لtetramers PMHC-I على المقايسات المذكورة أعلاه هي القدرة على كشف بدقة حج محددة CD8 + T-الخلايا مباشرة خارج الجسم الحي دون الحاجة لفي المختبر إعادة التحفيز. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين PMHC-I tetramer تلطيخ مع متعدد الألوان تدفق سمحت الخلوي تحليلات مفصلة للمرحلة التمايز، النمط الظاهري الذاكرة، وحالة تفعيل CD8 + T-خلايا حج محددة 2-4. في ضوء التطورات التقنية الأخيرة لوصف ذخيرة CD8 + T-الخلية PMHC-I متعدد القسيمات تلطيخ 6، واتساع نطاق التطبيقات FOص هذه المنهجية من المرجح أن تستمر في التوسع.
وقد استفادت المناطق القليلة في البحوث الطبية الحيوية أكثر من PMHC-I tetramer تلطيخ من مجال علم المناعة فيروس نقص المناعة البشرية (7). على الرغم من CD8 + T الخلايا قد ارتبط زمنيا مع الرقابة الأولية فيروسية الدم فيروس نقص المناعة البشرية بحلول موعد نشر من قبل التمان، ديفيس، والزملاء 8،9، واستخدام tetramers PMHC-I في السنوات التي تلت ذلك توسعت بشكل كبير من فهمنا لل فيروس نقص المناعة البشرية محددة CD8 + استجابة خلايا T. على سبيل المثال، ساعدت PMHC-I tetramer تلطيخ التأكد من حجم قوة من CD8 + الاستجابات تي خلية الفيروس محددة في معظم الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية 10-12. كما سهلت هذه المنهجية توصيف بفيروس نقص المناعة البشرية و+ استجابات الخلايا التائية SIV محددة CD8 مقيدة جزيئات MHC-I المرتبطة تحكم عفوية من تكاثر الفيروس في غياب العلاج المضاد للفيروسات الرجعية لظاهرة تعرف باسم "سيطرة النخبة"
عدوى SIV التجريبية من قرود المكاك ريسوس (المكاك الخلاسي) يبقى أفضل نموذج حيواني لتقييم التدخلات المناعية ضد فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز 18،19. في السنوات ال 25 الماضية، تم إحراز تقدم كبير في تحديد وتوصيف SIV محددة CD8 + الخلايا التائية في هذا أنواع القرود، بما في ذلك اكتشاف الأليلات MHC-I وتعريف الببتيد ملزم الزخارف 13،20-27 . ونتيجة لذلك، وضعت tetramers PMHC-I لتحليل SIV محددة CD8 + T-خليةالردود في هذا النموذج الحيواني 28. تتم معظم هذه الكواشف من المنتجات الجينات من أربعة المكاك ريسوس الأليلات MHC-I: مامو-A1 * 001، مامو-A1 * 002: 01، مامو-B * 008: 01، ومامو-B * 017: 01. وتجدر الإشارة، قرود المكاك ريسوس لا يعبر عن MHC-C مكان 29. تم إنتاج الغالبية العظمى من tetramers PMHC-I المستخدمة في التجارب الحالية في مرفق المعاهد الوطنية للصحة Tetramer الأساسية في جامعة إيموري. ومع ذلك، فإن بعض هذه الكواشف، بما في ذلك مامو-A1 * 001 tetramers منضمة إلى سائد مناعيا حاتمة الكمامة CM9، ويمكن الحصول عليها إلا من مصادر تجارية بسبب اتفاقات الترخيص. باستخدام tetramers PMHC-I من أربعة الأليلات المكاك ريسوس المذكورة أعلاه، قمنا المذكورة بنجاح CD8 + الخلايا التائية ضد ما مجموعه 21 الحواتم سيف (الجدول 1)، التي يسببها التطعيم أو العدوى SIV الابتدائي 30،31 (مارتينز وآخرون آل. والملاحظات غير منشورة).
يوفر هذا المخطوط لبروتوكول tetramer تلطيخ PMHC-I الأمثل لتحديد تردد الذاكرة والنمط الظاهري من CD8 + T-خلايا SIV محددة في قرود المكاك ريسوس. يبدأ الفحص مع الاختيارية حضانة 30 دقيقة مع مثبط بروتين كيناز (PKI، وهنا، ويستخدم Dasatinib) من أجل تقليل TCR الداخلي، وبالتالي تحسين PMHC-I tetramer تلطيخ 32. كما هو موضح أدناه، وهذا العلاج مفيد خصوصا عند استخدام مامو-B * 017: 01 tetramers. كما تقدم إرشادات حول كيفية تسمية الخلايا مع tetramers PMHC-I-تألقي مترافق والاجسام المضادة (MABS). ويشمل هذا البروتوكول أيضا خطوة خلية permeabilization للكشف عن الخلايا للالمرتبطة انحلال خلوي جزيء باء granzyme (Gzm B). وأضاف ماب ضد CD3 في هذه الخطوة، وكذلك لتحسين الكشف عن هذه إشارات الجزيء TCR. كمرجع، يتم سرد كافة fluorochromes العاملين في هذا الفريق تلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الطرفية خلية الدم وحيدات النوى (PBMC) العينات المستخدمة في هذه المخطوطة من قرود المكاك ريسوس الهندية يضم في مركز ويسكونسن الوطنية الرئيسيات البحوث. وتتم رعاية هذه الحيوانات لوفقا لتقرير Weatherall بموجب بروتوكول المعتمد من جامعة ويسكونسن كلية الدراسات العليا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة 33. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية تحت التخدير وقدمت كل الجهود للحد من المعاناة المحتملة.
1. PKI العلاج
ملاحظة: هذا هو اختياري، ولكن يوصى مامو-B * 017: 01 tetramers. نرى نتائج وأقسام مناقشة.
- و resuspend PBMC في المتوسط R10 بتركيز 1.6 × 10 7 خلية / مل.
- إضافة 50 ميكرولتر من هذا التعليق الخلية إلى تدفق المقابلة الخلوي الأنابيب. إضافة 50 ميكرولتر من حل نانومتر 100 من PKI إلى كل أنبوب.
- دوامة كل أنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وبحلول نهاية هذاخطوة، يجب أن يكون كل أنبوب 100 ميكرولتر من تعليق خلية تحتوي على 8.0 × 10 5 PBMC و 50 نانومتر من PKI.
- انتقل إلى الخطوة tetramer تلطيخ PMHC-I.
2. تلطيخ مع المسمى تألقي-Tetramers PMHC-I
- قبل إعداد PMHC-I tetramer مزيج الرئيسي، أنابيب الطرد المركزي tetramer PMHC-I في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية. والهدف من هذه الخطوة هو بيليه المجاميع البروتين في حل tetramer PMHC-I التي قد تزيد تلوين الخلفية. وبمجرد الانتهاء من خطوة الطرد المركزي، وتجنب pipetting لمن أسفل الأنبوب حيث تراكمت المجاميع البروتين.
- إعداد ما يكفي من PMHC-I مزيج tetramer الماجستير وصمة عار جميع الأنابيب التجريبية. إعداد يزيد على 15٪ من إجمالي حجم هذا المزيج رئيسية لحساب pipetting لخطأ.
- تمييع tetramers PMHC-I في المخزن وصمة عار (على سبيل المثال، بريليانت صمة عار الواق) بحيث أن 25 ميكرولتر من-I PMHC tetramer مزيج الرئيسي هي اضافتهاد لكل اختبار.
- التسمية PBMC مع اثنين من tetramers PMHC-I في الاختبار؛ واحد مترافق إلى allophycocyanin (APC) والآخر لالبنفسج الرائعة (BV) 421.
- إضافة 8.0 × 10 5 PBMC إلى تدفق المقابلة الخلوي الأنابيب في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر. إذا تعرض الخلايا لعلاج PKI المذكورة أعلاه، ينبغي أن يكون بالفعل معلق في 100 ميكرولتر في هذه الخطوة.
- إضافة 25 ميكرولتر من PMHC-I tetramer مزيج الرئيسي لتدفق المقابلة الخلوي الأنابيب. وبحلول نهاية هذه الخطوة، يجب أن يكون الحجم النهائي في كل أنبوب 125 ميكروليتر.
- دوامة كل أنبوب من أجل التجانس تعليق الخلية.
- احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. تحضير كوكتيل سطح تلطيخ ماب خلال هذه الحضانة 45 دقيقة.
تلطيخ 3. السطح
- إعداد ما يكفي من مزيج الرئيسي ماب لصبغ جميع الأنابيب التجريبية. إعداد يزيد على 15٪ من إجمالي حجم هذا مزيج الرئيسي لحسابلpipetting لخطأ.
- ضبط مستوى الصوت من مزيج الرئيسي مع العازلة وصمة عار بحيث يتم إضافة 50 ميكرولتر لكل اختبار.
- لاستبعاد السليم عدم CD8 +-T-الخلايا وترسيم مجموعات فرعية الذاكرة، استخدام معاير كميات من MABS الموجهة ضد الجزيئات التالية في مزيج الرئيسي تلطيخ السطح.
ملاحظة: يتم توفير fluorochromes مترافق إلى كل MABS كمرجع: CD14 BV 510، CD16 BV 510، CD20 BV 510، CD8α BV 785، CD28 PE Cy7، وCCR7 FITC. لاحظ أن MABS ضد CD14، CD16، CD20 وومترافق إلى نفس تألقي (أي بي 510) لأنها سوف تدرج في باب "تفريغ". - تشمل صبغة قابل للتثبيت للتمييز الخلايا الميتة في مزيج الرئيسي تلطيخ السطح [أي، الأمين صبغ رد الفعل (ARD)]. تأكد من أن كاشف ARD ومترافق إلى تألقي مع طيف الانبعاث مماثلة لتلك التي استخدمت في باب "تفريغ". في هذه الحالة، استخدم ARD أكوا.
- إضافة 50 ميكرولتر منمزيج تلطيخ الماجستير وصفها في 3،1-3،4 لتدفق المقابلة الخلوي الأنابيب. وبحلول نهاية هذه الخطوة، يجب أن يكون الحجم النهائي في كل أنبوب 175 ميكروليتر.
- دوامة كل أنبوب. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
- غسل الخلايا مع غسل العازلة (حل PBS تحتوي على 0.1٪ من ألبومين المصل البقري و 0.45 جم / لتر نان 3).
تنبيه: أزيد الصوديوم هو مادة سامة. التعرض لكميات حتى الدقيقة يمكن أن تسبب الأعراض. التعامل مع هذه المادة وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة من قبل صحة البيئة ومكتب (الصحة والسلامة) السلامة في المؤسسة حيث يتم تنفيذ هذه التجارب. - أنابيب الطرد المركزي في 510 x ج لمدة 5 دقائق. بعناية صب طاف في حاوية النفايات منفصلة. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
تنبيه: لا صب غسل العازلة طاف في الخزانات التي تحتوي على مواد التبييض لأنها يمكن أن تتفاعل مع أزيد الصوديوم موجودة في غسل العازلة ويؤدي إلى تشكيل الغازات السامة 34. Contact مكتب الصحة والسلامة في المؤسسة حيث يتم تنفيذ هذه التجارب للحصول على إرشادات حول كيفية التخلص من أزيد الصوديوم. - بعد الصب، دوامة الخلايا في السائل المتبقي المحتفظ بها في كل أنبوب.
التثبيت 4. خلية
- إضافة 250 ميكرولتر من محلول 2٪ امتصاص العرق (PFA) لجميع أنابيب لإصلاح الخلايا.
تنبيه: PFA هو عبارة عن مادة سامة. التعرض لكميات حتى الدقيقة يمكن أن تسبب الأعراض. التعامل مع هذه المادة وفقا للمبادئ التوجيهية التي يحددها مكتب الصحة والسلامة في المؤسسة حيث يتم تنفيذ هذه التجارب.- منذ PFA حل 2٪ يجب أن يكون متساوي التوتر على الخلايا، استخدم برنامج تلفزيوني لإعداد هذا الحل. مائة ملليلتر من محلول PFA 2٪ تكفي لتجارب متعددة. تماما دوامة جميع أنابيب على الفور بعد إضافة 2٪ PFA من أجل منع تشكيل المجاميع الخلية.
- احتضان في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- Wخلايا الرماد بتكرار الخطوات 3،7-3،9. بمجرد الانتهاء من هذه الخطوة، والخلايا يمكن تخزينها في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة. قبل الانتقال إلى المرحلة Permeabilization، دوامة الأنابيب بدقة.
5. Permeabilization من الخلايا
- إضافة 500 ميكرولتر من العازلة permeabilization. دوامة جميع أنابيب.
- احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- غسل الخلايا عن طريق تكرار الخطوات 3،7-3،9.
6. بين الخلايا تلطيخ
- إعداد ما يكفي من مزيج الرئيسي ماب لصبغ جميع الأنابيب التجريبية.
- ضبط مستوى الصوت مع برنامج تلفزيوني أو عازلة وصمة عار بحيث يتم إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الرئيسي ماب داخل الخلايا في الاختبار.
- تحضير مزيج الرئيسي ماب هو موضح في 6.1 و 6.2 باستخدام كميات من MABS الموجهة ضد CD3 وGzm ب معاير
ملاحظة: المشاركة TCR بواسطة tetramers PMHC-I يمكن أن يؤدي إلى CD3 الداخلي، والتي يمكن أن تتداخل مع الكشف عن tetramer + CD3 + CD8 +تي الخلايا إذا تم إضافة مكافحة CD3 ماب لمزيج الرئيسي تلطيخ السطح. لتجنب هذا، إضافة لمكافحة CD3 ماب في هذه المرحلة، وهذا هو، بعد permeabilized الخلايا. يتم سرد fluorochromes مترافق إلى كل ماب كمرجع: CD3 PerCP Cy5.5 وGzm ب PE. - إضافة 50 ميكرولتر من ماب كوكتيل للأنابيب المقابلة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- غسل الخلايا عن طريق تكرار الخطوات 3،7-3،9. أنابيب جاهزة للالحصول عليها في قياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم استخدام بروتوكول صفها هنا لتحديد حجم الذاكرة والنمط الظاهري لل، استجابات الخلايا التائية التي يسببها اللقاح الكمامة CM9 محددة CD8 + في مامو-A1 * 001 + المكاك ريسوس. لهذا التحليل، تم استخدام مامو-A1 * 001 / الكمامة CM9 tetramer مترافق APC-في 8 لون تدفق cytometric لوحة تلطيخ. الشكل 1A - F يظهر استراتيجية النابضة المستخدمة لتحليل البيانات، التي ينبغي تطبيقها لكلا tetramers موجودة في كل اختبار. لاحظ أن tetramer PMHC-I + CD8 + السكان تي الخلية يتم فصل جيدا مع الحد الأدنى من الخلفية (أرقام 1F وG). ذاكرة CD8 + T-الخلايا في قرود المكاك ريسوس يمكن تصنيفها إلى ثلاثة مجموعات فرعية على أساس التعبير سطح CD28 وCCR7: الذاكرة المركزية (T سم، CD28 + CCR7 +)، ذاكرة الانتقالية (T EM1، CD28 + CCR7-)، والمستجيب ذاكرة (T EM2، CD28-CCR7-) 35.ويشمل هذا البروتوكول أيضا خطوة خلية permeabilization للكشف عن الخلايا من Gzm B و CD3. الشكل 1G - ويبين ترسيم مجموعات فرعية الذاكرة وGzm B-التعبير عن CD8 + T-الخلايا داخل tetramer + البوابة.
تلوين الخلفية يمكن أن تسفر عن نتائج دون المستوى الأمثل في PMHC-I المقايسات tetramer وضع العلامات. لتجنب هذا الأمر، واقترح بعض الاحتياطات. كما جاء في قسم البروتوكول، قارورة تحتوي على الكواشف tetramer PMHC-I وينبغي دائما أن طرد في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إعداد يمزج الرئيسي. والهدف من هذه الخطوة هو بيليه أي مجاميع البروتين الذي قد يكون في حل tetramer PMHC-I. بالإضافة إلى ذلك، المعايرة كل كاشف قبل استخدامها ويوصى أيضا. من الناحية المثالية، الخلايا التي تفعل أو لا تحتوي على السكان CD8 + T-خلية حج محددة من الفائدة يجب أن يكون المسمى مع tetramer PMHC-I ذات الصلة MHC-I-مطابقة. هذا كاليفورنيان أن يتحقق عن طريق تلطيخ cryopreserved PBMC من SIV ساذجة (المراقبة السلبية) وSIV المصابين الجانب (مراقبة إيجابية) قرود المكاك إلى جنب مع كميات مختلفة من الحصول عليها حديثا PMHC-I tetramer. في الشكل 2، على سبيل المثال، 1.0 ميكرولتر / اختبار من APC مترافق مامو-B * 008: 01 / نيف RL10 tetramer حققت أفضل فصل بين tetramer CD8 + السكان الإيجابية والسلبية تي خلية. وأخيرا خيار تألقي يمكن أيضا أن يؤثر بشكل كبير على النتائج التي تم الحصول عليها من PMHC-I stainings tetramer. وفي هذا الصدد، tetramers PMHC-I مترافق قاتمة جزيئات (على سبيل المثال، فلوريسئين) ينبغي تجنبها. في تجربتنا، tetramers PMHC-I مترافق إلى fluorochromes مشرق، مثل البولي ايثيلين، APC، وBV 421، وقد أسفرت نتائج أفضل.
وقد لاحظنا أن مامو-B * 017: 01 tetramers عادة تسفر عن تلطيخ خافت، حتى عندما يضاف إلى fluorochromes مشرق المذكورة أعلاه. وأسباب ذلكانخفاض كثافة مضان ليست واضحة تماما، ولكنها قد تشمل تقارب منخفضة TCR / مامو-B * 017: 01 التفاعلات واستيعاب TCR السريع على tetramer ملزمة 36،37. على طول هذه الخطوط، وقد ثبت أن ال PKI لمنع TCR الداخلي على سطح CD8 + الخلايا التائية 32. ونتيجة لذلك، يمكن ال PKI تحسين الكشف عن حج محددة CD8 + T-الخلايا عن طريق PMHC-I tetramer تلطيخ. لقد أكد هذا التأثير في تجاربنا، حيث جودة مامو-B * 017: 01 tetramer stainings يمكن تحسينها بشكل كبير عن طريق ما قبل المعالجة PBMC مع PKI (الشكل 3). الغريب، لم المعالجة المسبقة مع هذا PKI لم تتحسن بشكل كبير من تلطيخ tetramers PMHC-I أخرى اختبارها هنا (لا تظهر البيانات)، مما يوحي بأن مامو-B * 017: 01 مقيدة CD8 + T الخلايا قد تكون فريدة من نوعها في حساسيتها للعلاج PKI.
الشكل 1: استراتيجية المحاصرة ونتائج ممثل ناجح PMHC-I tetramer تلطيخ. قمنا بتقييم حجم الذاكرة والنمط الظاهري من CD8 + T-خلايا الكمامة CM9 الخاصة التي يسببها اللقاح في PBMC من مامو-A1 * 001 + المكاك ريسوس. هنا، تم استخدام مامو-A1 * 001 / الكمامة CM9 tetramer مترافق APC-في 8 لون تدفق cytometric لوحة تلطيخ. (A - F) استراتيجية المحاصرة لتحليل تدفق cytometric. أولا، تم إنشاء بوابة على singlets لتتجمع قطريا بالتآمر الأمام ارتفاع مبعثر (FSC-H) مقابل منطقة FSC (FSC-A) ومن ثم ارتفاع الجانب مبعثر (SSC-H) مقابل منطقة SSC (SSC-A، A و B) . بعد ذلك، تم إنشاء البوابة الزمنية التي شملت فقط تلك الأحداث التي سجلت خلال ال 5 و ال 90 عشر المئوية. ثم تم بوابات الخلايا الناتجة عن "قناة تفريغ" السلبية، CD3 + الخلايا (C و D). في هذه المرحلة،كان يرسم السكان الخلايا اللمفاوية على أساس لها FSC-A وخصائص SSC-A وأجريت التحليلات اللاحقة ضمن CD8 خلايا + (E و F). وبعد عرض PMHC-I tetramer + الخلايا (G)، تم إجراء تحليل phenotyping الذاكرة ضمن هذه البوابة (H). الريسوس الذاكرة المكاك (خلايا تي) يمكن تصنيفها إلى ثلاث مجموعات فرعية على أساس التعبير عن CD28 وCCR7: الذاكرة المركزية (T سم، CD28 + CCR7 +)، ذاكرة الانتقالية (T EM1، CD28 + CCR7-)، وذاكرة المستجيب (T EM2 ، CD28-CCR7-). ويشمل هذا البروتوكول أيضا خطوة خلية permeabilization لتقييم الخلايا من جرانزيم ب (Gzm ب) التعبير في tetramer + CD8 + الخلايا التائية (I). المنطقة المظللة في الرسم البياني يناظر tetramer + CD8 + T-الخلايا الملون مع ماب ضبط مطابقة نمط إسوي. على الرغم من أن tetramer BV 421 مترافق + السكانية التي كانت موجودة في هذا تلطيخلا هو مبين في الشكل، ينبغي أن تستخدم استراتيجية النابضة نفس لتحليلها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ممثل نتائج المعايرة من APC مترافق مامو-B * 008: 01 / نيف RL10 tetramer. PBMC من اثنين مامو-B * 008: 01+ استخدمت قرود المكاك ريسوس لهذه التجربة: كان حيوان واحد SIV ساذجة وكان بمثابة سيطرة سلبية في حين كان البعض SIV المصابين وشغل منصب مراقبة إيجابية. لتحديد مقدار مامو-B * 008: 01 / نيف RL10 tetramer أن تعطي أفضل فصل بين tetramer + وtetramer- CD8 + الخلايا التائية، PBMC من كل حيوان وحضنت مع المبالغ المشار إليها من tetramer كاشف PMHC-I. وبناء على هذه النتائج، 1.0 ميكرولتر / اختبار واالصورة التي اختيرت لتكون كمية الأمثل لاستخدامها في المقايسات في المستقبل. يوصف استراتيجية النابضة استخدامها لتحليل البيانات في الشكل 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: آثار العلاج PKI على كثافة مضان من مامو-B * 017: 01 tetramers. المانع PKI يمنع استيعاب المجمعات TCR، وبالتالي يحسن الكشف عن حج محددة CD8 + T-الخلايا عن طريق تألقي المسمى PMHC-I tetramers 32. (A - B) PBMC من اثنين مامو-B * 017: 01+ استخدمت قرود المكاك ريسوس في هذه التجربة: كان قرد واحد SIV السذاجة وكان بمثابة سيطرة سلبية (A)، بينما يصاب البعض مع SIV وشغل منصبمراقبة إيجابية (B). حضنت PBMC من كل من الحيوانات عند 37 درجة مئوية في وجود PKI بتركيز 50 نانومتر لمدة 30 دقيقة قبل تلطيخ مع APC مترافق مامو-B * 017: 01 / نيف IW9 tetramer، كما هو موضح في قسم البروتوكول . كمرجع، تعرضت مجموعة أخرى من الأنابيب لنفس الحضانة وتلطيخ الظروف، إلا أن سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) وأضيف بدلا من PKI. يوصف استراتيجية النابضة استخدامها لتحليل البيانات في الشكل 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البروتين SIV | موقف حمض أميني | تسلسل الأحماض الأمينية | MHC من الدرجة الأولى جزيء (التسمية الجديدة) | MHC من الدرجة الأولى جزيء (nomenclatur القديمةه) | اسم حاتمة قصيرة |
| أسكت | 181-189 | CTPYDINQM | مامو-A1 * 001 | مامو-A * 01 | هفوة CM9 |
| أسكت | 254-262 | QNPIPVGNI | مامو-A1 * 001 | مامو-A * 01 | هفوة QI9 |
| أسكت | 72-79 | GSENLKSLY | مامو-A1 * 001 | مامو-A * 01 | هفوة GY9 |
| الحياة الفطرية | 830-838 | FHEAVQAVW | مامو-B * 017: 01 | مامو-B * 17 | الحياة الفطرية FW9 |
| الحياة الفطرية | 233-241 | CAPPGYALL | مامو-A1 * 001 | مامو-A * 01 | الحياة الفطرية CL9 |
| الحياة الفطرية | 620-628 | TVPWPNASL | مامو-A1 * 001 | مامو-A * 01 | الحياة الفطرية TL9 |
| الحياة الفطرية | 788-795 | RTLLSRVY | مامو-A1 * 002: 01 | مامو-A * 02 | الحياة الفطرية RY8 |
| الحياة الفطرية | 296-304 | RTIISLNKY | مامو-A1 * 002: 01 | مامو-A * 02 | الحياة الفطرية RY9 |
| VIF | 123-131 | RRAIRGEQL | مامو-B * 008: 01 | مامو-B * 08 | VIF RL9 |
| VIF | 173-181 | RRDNRRGL | مامو-B * 008: 01 | مامو-B * 08 | VIF RL8 |
| VIF | 66-73 | HLEVQGYW | مامو-B * 017: 01 | مامو-B * 17 | VIF HW8 |
| VIF | 100-109 | VTPNYADILL | مامو-A1 * 001 | مامو-A * 01 | VIF VL10 |
| VIF | 97-104 | WTDVTPNY | مامو-A1 * 002: 01 | مامو-A * 02 | VIF WY8 |
| تزيد السرعة | 13-22 | KRLRLIHLL | مامو-B * 008: 01 | مامو-B * 08 | القس KL9 |
| ملابس رثة | 28-35 | STPESAML | مامو-A1 * 001 | مامو-A * 01 | تات SL8 |
| نيف | 137-146 | RRHRILDIYL | مامو-B * 008: 01 | مامو-B * 08 | نيف RL10 |
| نيف | 246-254 | RRLTARGLL | مامو-B * 008: 01 | مامو-B * 08 | نيف RL9b |
| نيف | 8-16 | RRSRPSGDL | مامو-B * 008: 01 | مامو-B * 08 | نيف RL9a |
| نيف | 165-173 | IRYPKTFGW | مامو-B * 017: 01 | مامو-B * 17 | نيف IW9 |
| نيف | 195-203 | MHPAQTSQW | مامو-B * 017: 01 | مامو-B * 17 | نيف MW9 |
| نيف | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> مامو-A1 * 002: 01مامو-A * 02 | نيف YY9 |
الجدول 1: قائمة tetramers PMHC-I المتاحة لرصد CD8 + استجابات الخلايا التائية SIV محددة في قرود المكاك ريسوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على بعد خطوات قليلة في هذا الإجراء تستحق المناقشة لأنها حاسمة لتحقيق نتائج أفضل. أولا، لأن نوعية العينات البيولوجية هي مؤشرا قويا لنجاح أي تدفق cytometric فحص 38، يجب أن تؤخذ كل الحرص على التأكد من أن الخلايا هي قابلة للحياة وفي تعليق أثناء إجراء تلطيخ. وينطبق ذلك بشكل خاص عند العمل مع العينات cryopreserved لأنها أكثر عرضة للتكتل وعادة ما تحتوي على أرقام أعلى من الخلايا الميتة. في هذه الحالات، تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر قبل PMHC-I الإجراء tetramer وضع العلامات قد يحسن كثيرا من النتائج. الثانية، والتعويض المناسب للfluorochromes المستخدمة في الفحص هو أمر حاسم لتحليل بيانات دقيقة، وخصوصا عندما يتم تقييم معلمات متعددة في نفس التجربة. وفي هذا الصدد، فمن المستحسن أن يتم إعداد الضوابط واحد لون جديد التعويض عن كل PMHC-I tetramer الصورةtaining الفحص. ونحن نحبذ استخدام الخرز تعويضات بسبب تفاعل واسع النطاق على مكافحة IG وحقيقة أنها تسفر عن التوزيعات ذات النسقين واضحة من السكان الإيجابية والسلبية. وبما أن هذه الخرز لا ربط جزيئات MHC-I، مترافق الأضداد لنفس fluorophores كما tetramers PMHC-I (على سبيل المثال، APC وBV 421) يجب أن تستخدم ضوابط التعويض. هي العديد من هذه الخرز التعويض متاح من بائعين متعددين، ويجب استخدامها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ثالثا، لأن استراتيجية phenotyping الموصوفة هنا يتطلب ترسيم CD8 + مجموعات فرعية الخلايا التائية على أساس التعبير متدرجة من ثلاثة جزيئات (أي، CD28، CCR7، وGzm B)، النابضة الضوابط، مثل مضان ناقص واحد اختبارات (FMO) أو الأجسام المضادة مطابقة نمط إسوي، ينبغي أن تستخدم لتسهيل هذه الأنواع من التحليلات. في تجاربنا، على سبيل المثال، أنابيب منفصلة تحتوي على tetramer PMHC-I + السكان CD8 + T-خلية من الفائدةإعادة الملون دائما مع MABS isotype السيطرة مترافق إلى نفس fluorochromes مثل MABS ضد CD28، CCR7، وGzm B. الأهم من ذلك، على الرغم من أن المبادئ التوجيهية المذكورة آنفا قد يساعد على تحسين الجودة الشاملة للPMHC-I tetramer stainings، فهي ليست المتغيرات الوحيدة التي يمكن أن تؤثر على أداء هذا الاختبار. ونظرا لتفرد كل مخبريا، يجب أن يتم تنفيذ العمل كله هو موضح هنا مرة واحدة على الأقل على عينات وهمية للسماح لممارسة والتعديلات ذات الصلة.
الغريب، PMHC-I tetramer ولاحظت CD8 + T-خلايا إيجابية في بعض الأحيان في PBMC من السذاجة سيف (غير المصابة وغير المحصنة) قرود المكاك ريسوس. لا تظهر هذه الحالات أن تكون نتيجة لتلوين الخلفية على أساس الفحص البصري للبيانات. وبدلا من ذلك، لأنها قد تعكس التفاعلات بين الجزيئات PMHC-I والقاتل تشبه المناعي مستقبلات (كيرس) أعرب على سطح المكاك ريسوس NK و CD8 + T الخلايا 39،40. في الواقع، مامو-A1 * 002: وقد ثبت أن 01 tetramers مطوية مع الببتيدات المقابلة لالحواتم الكمامة GY9 وأظرف RY8 ربط مامو-KIRDL05 39. على طول هذه الخطوط، مامو-A1 * 002: 01 / الكمامة GY9 ومامو-A1 * 002: 01 / أظرف RY8 هي أكثر عرضة لاظهار حج مستقل PMHC-I تلطيخ tetramer المذكورة أعلاه. ونظرا لهذه الظاهرة، فمن المهم للسيطرة على هذا التفاعل الأساسي في التجارب التي تنطوي على قرد تقييم طولية من + استجابات الخلايا التائية SIV محددة CD8 بعد الإصابة أو التطعيم. ولتحقيق ذلك، فإنه من المستحسن لأداء PMHC-I tetramer تلطيخ على عينات تم الحصول عليها في اليوم الأول من العلاج. ويمكن أيضا أن تكون ذات صلة لتجميد PBMC في عدة قسامات صغيرة الحجم في هذه النقاط مرة الأولى في مقارنات مع حالة هناك حاجة إلى عينات أساسية في التجارب المستقبلية.
واحد الحد من PMHC-I tetramer تلطيخ هو أن فقط CD8 + T-خلايا خصوصية معروفة وMHC-I تقييد جعلى أن تدرس هذا النهج. وينطبق ذلك بشكل خاص في قرود المكاك ريسوس نظرا لمنظمة معقدة من مواضع MHC بهم. في الواقع، يمكن لاحد القرد المكاك النمط الفرداني يكون العشرات من الجينات MHC-I، ليست كلها ترميز الجزيئات التي يتم التعبير عنها بشكل مستقر على سطح الخلية 29. ونتيجة لذلك، يمكن أن يكون من الصعب تحديد مجموعة من جزيئات MHC-I الوظيفية التي أعرب عنها حيوان معين. ومع ذلك، هذا التحذير يمكن التغلب عليها من خلال تصميم التجارب التي تشمل القرود التي هي ايجابية للالأليلات MHC-I المعروفة، مثل مامو-A1 * 001، مامو-A1 * 002: 01، مامو-B * 008: 01، وMamu- B * 017: 01.
وفي الختام، تقدم هذه المخطوطة بروتوكول tetramer تلطيخ PMHC-I الأمثل لتحديد تردد الذاكرة والنمط الظاهري من CD8 + T-خلايا SIV محددة في قرود المكاك ريسوس. منذ PMHC-I tetramer تلطيخ هو أكثر حساسية من الإنترفيرون γ ELISPOT والمقايسات ICS للكشف عن CD8 حج محددة+ الخلايا التائية ولا يتطلب في المختبر حج التحفيز، والمنهجية المقدمة هنا هي مفيدة بشكل خاص لدراسة تأثير CD8 + استجابات الخلايا التائية في نتائج عدوى فيروس نقص المناعة. المعرفة العملية المكتسبة من اتقان هذه التقنية قد تكون مفيدة أيضا لإثراء CD8 + T-خلايا حج محددة كجزء من الدراسات الفنية ولرصد CD8 + استجابات الخلايا التائية في مختلف البيئات المرض 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ونود أن نشكر ديفيد واتكينز لدعم التجارب التي مكنت من تحسين المنهجية الحالية. وأيد البحث عنها في هذا المطبوع جزئيا من خلال منحة التجريبية التي يقدمها المركز ميامي لأبحاث الإيدز من المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة P30AI073961. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
