Summary
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 + de afectar a evolução da doença.
Abstract
Péptido-histocompatibilidade principal de classe complexo I (pMHC-I) tetrâmeros têm sido uma ferramenta de valor inestimável para estudar as respostas de células T CD8 +. Porque estes reagentes se ligam directamente aos receptores de células T na superfície das células CD8 + T-linfócitos, tetrâmeros marcado com fluorocromo pMHC-I permitir a detecção exacta do antigénio (Ag) espec�ico CD8 + células-T, sem a necessidade de re in vitro -estimulação. Além disso, quando combinado com multi-color citometria de fluxo, pMHC-I tetrâmero coloração pode revelar aspectos-chave de células T CD8 + Ag específicas, incluindo-estágio de diferenciação, fenótipo de memória e estado de activação. Estes tipos de análises têm sido especialmente úteis no campo da imunologia do HIV, onde células T CD8 + podem afectar a progressão para SIDA. infecção experimental de macacos rhesus com vírus da imunodeficiência símia (SIV) fornece uma ferramenta valiosa para estudar a imunidade celular contra o vírus da AIDS. Como resultado, progre considerávelSS foi feita para definir e caracterizar as respostas de células T neste modelo animal. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para enumerar as células T SIV específicas de CD8 + em macacos rhesus por pMHC-I tetrâmero coloração. Nosso ensaio permite a quantificação e memória fenotipagem simultânea de duas populações de células T pMHC-I tetrâmero + CD8 + por teste, que pode ser útil para rastrear respostas específicas-SIV de células T CD8 + geradas pela vacinação ou infecção pelo SIV. Considerando a relevância dos primatas não humanos na investigação biomédica, esta metodologia é aplicável para estudar as respostas das células T CD8 + em múltiplas configurações de doença.
Introduction
As células T CD8 + compreendem um componente crucial do sistema imune adaptativo que eles participam no tumor vigilância imune e contribuir para a erradicação dos agentes patogénicos intracelulares 1. Em termos simples, as células T CD8 + expressam receptores de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o péptido-classe principal de histocompatibilidade complexo I (pMHC-I) moléculas presentes na membrana plasmática das células hospedeiras. Uma vez que estes péptidos são derivados a partir da proteólise de proteínas sintetizadas endogenamente, pMHC-I da superfície da célula complexos de fornecer uma janela para o meio intracelular. Após a infecção de vírus, por exemplo, as células infectadas irão exibir moléculas de CPH-I que contêm péptidos derivados de vírus que podem servir como ligandos para TCR expressas pelo que patrulha células T CD8 +. No caso de uma célula T CD8 + específicos do vírus encontra uma célula infectada que apresenta o seu ligando pMHC-I, o envolvimento do TCR irá resultar na activação de células T CD8 + e ultimadamente levar a célula alvo de lise. Dada a natureza crítica dessas interações TCR / pMHC-I, a determinação da magnitude, especificidade e fenótipo de responder as células T CD8 + podem muitas vezes revelar pistas importantes sobre doenças humanas.
Até o início de 1990, a quantificação de células T Ag específicos de CD8 + invocado o ensaio tecnicamente exigente diluição limitante (LDA) 2,3. Não só a LDA requerem vários dias para ser concluído, ele também não conseguiu detectar células que não tinham potencial proliferativo. Como resultado, o LDA vastamente subestimado a frequência real do antigénio (Ag) + células-T CD8 espec�icos participantes em uma resposta imune. Embora o desenvolvimento de ELISPOT e ensaios de coloração de citocinas intracelulares melhorou grandemente a capacidade de medir a imunidade celular, estes métodos ainda necessário na estimulação in vitro para quantificar as células T específicas de Ag-4. Não foi até 1996 que Altman, Davis, e colleagues publicaram seu marco artigo relatando o desenvolvimento da tecnologia de tetrâmero pMHC-I 5. Crítica para o sucesso desta técnica foi a multimerização de moléculas pMHC-I, que se estendia a meia-vida de interacções TCR / pMHC-I, reduzindo deste modo a probabilidade de tetrâmeros pMHC-I que caem fora durante os passos de lavagem de ensaios de citometria de fluxo. A principal vantagem de tetrâmeros pMHC-I durante os ensaios acima mencionados é a capacidade de detectar com precisão as células T Ag-CD8 + específica directamente ex vivo, sem a necessidade de in vitro re-estimulação. Além disso, a combinação de pMHC-I tetrâmero coloração com multi-cor citometria de fluxo permitiu uma análise detalhada do andar de diferenciação, fenótipo de memória, e o estado de activação das células T CD8 + específicas de células Ag-2-4. À luz dos recentes avanços técnicos para a caracterização de repertórios de células T CD8 + por pMHC-I multimero coloração 6, a amplitude de aplicações for esta metodologia é provável que continue em expansão.
Poucas áreas da pesquisa biomédica beneficiaram mais do pMHC-I tetrâmero coloração do que o campo da imunologia HIV 7. Embora as células T CD8 + foi temporariamente associado com o controle inicial de viremia HIV no momento da publicação por Altman, Davis, e seus colegas 8,9, o uso de tetrâmeros pMHC-I nos anos seguintes expandiu significativamente a nossa compreensão da o HIV-resposta específica das células T CD8 +. Por exemplo, pMHC-I tetrâmero coloração ajudou a confirmar o tamanho robusta de respostas de células T CD8 + específicas do vírus, na maioria dos indivíduos infectados com HIV 10-12. Esta metodologia também facilitou a caracterização de HIV e respostas de células T específicas de SIV CD8 + restringidos por moléculas de MHC-I associados com um controle espontâneo de replicação virai na ausência de terapia anti-retroviral, um fenómeno conhecido como "controlo de elite"
Infecção experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) continua a ser o melhor modelo animal para avaliação das intervenções imunes contra o HIV / AIDS 18,19. Nos últimos 25 anos, um progresso substancial tem sido feito na identificação e caracterização de células T CD8 específicas SIV-+ nesta espécies de macacos, incluindo a descoberta de alelos de MHC-I e a definição de ligação ao péptido motivos 13,20-27 . Como resultado, I-pMHC tetrâmeros ter sido desenvolvido para a análise de SIV-específica de células T CD8 +respostas neste modelo animal 28. A maioria destes reagentes são feitas dos produtos de gene de quatro macaco rhesus alelos do MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. De nota, macacos rhesus não expressam um locus MHC-C 29. A grande maioria dos tetrâmeros pMHC-I utilizados nas presentes experiências foram produzidas no Centro de NIH tetrâmero Núcleo da Universidade de Emory. No entanto, alguns destes reagentes, incluindo Mamu-A1 * 001 tetrâmeros ligados ao imunodominante epitopo Gag CM9, só pode ser obtido a partir de fontes comerciais devido a acordos de licenciamento. Usando tetrâmeros pMHC-I dos quatro alelos rhesus listados acima, temos enumerado com êxito as células T CD8 + contra um total de 21 epitopos SIV (Tabela 1), que foram induzidos por vacinação ou infecção pelo SIV primário 30,31 (Martins et al., observações não publicadas).
O presente manuscrito fornece umaoptimizado pMHC-I protocolo de coloração do tetrero para a determinação do fenótipo de células T específicas SIV-CD8 + frequência e memória em macacos rhesus. O ensaio começa com um electiva 30 min de incubação com um inibidor de proteína cinase (PKI; aqui, dasatinib é utilizado), a fim de diminuir a internalização de TCR e, assim, melhorar a pMHC-I tetrâmero coloração 32. Como descrito abaixo, o tratamento é especialmente útil quando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Instruções sobre como rotular as células com tetrâmeros pMHC-I fluorocromo conjugado e anticorpos monoclonais (mAbs) também são fornecidos. Este protocolo inclui também um passo para a permeabilização celular para a detecção intracelular da molécula associada à citólise granzima B (GZM B). O anticorpo monoclonal contra CD3 é adicionado neste passo, assim como para melhorar a detecção desta molécula de sinalização de TCR. Como uma referência, todos os fluorocromos utilizados no presente painel de coloração são listados.
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Protocol
As amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) utilizados neste manuscrito foram obtidos a partir de macacos rhesus Indiana alojados no Wisconsin National Primate Research Center. Estes animais foram tratados de acordo com o Relatório de Weatherall sob um protocolo aprovado pela Universidade de Wisconsin Animal Care Graduate School e Use Committee 33. Todos os procedimentos com animais foram realizados sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o potencial sofrimento.
1. Tratamento de PKI
NOTA: Este é opcional, mas recomendado para Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Ver Resultados e Discussão.
- Ressuspender de PBMC em meio de R10 a uma concentração de 1,6 x 10 7 células / ml.
- Adicionar 50 ul desta suspensão de células para o fluxo de citometria de tubos correspondente. Adicionar 50 ul de uma solução 100 nM de PKI para cada tubo.
- Vortex cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 30 min. No final destapasso, cada tubo deve ter 100 ul de uma suspensão de células contendo 8,0 x 10 5 PBMC e 50 nM de PKI.
- Prossiga para a etapa de coloração tetrâmero pMHC-I.
2. A coloração com fluorocromo rotulados pMHC-I tetrâmeros
- Antes de preparar a pMHC-I tetrâmero mistura principal, centrifugar os tubos pMHC-I tetrâmero a 20000 xg durante pelo menos 15 min a 4 ° C. O objectivo deste passo é para sedimentar agregados de proteína na solução de tetrâmero pMHC-I, que pode aumentar a coloração de fundo. Uma vez que o passo de centrifugação é feito, evitar pipetagem a partir do fundo do tubo, onde os agregados de proteína terá acumulado.
- Prepare o suficiente pMHC-I master mix tetrâmero para manchar todos os tubos experimentais. Preparar um excesso de 15% do volume total da mistura principal para esta conta para a pipetagem de erro.
- Diluir tetrâmeros pMHC-I em tampão de coloração (por exemplo, tampão de coloração brilhante), de modo que 25 ul da pMHC-I tetrâmero de mistura principal são added para cada teste.
- Etiqueta de PBMC com dois tetrâmeros pMHC-I por teste; um conjugado com aloficocianina (APC) e o outro para violeta brilhante (BV) 421.
- Adicionar 8,0 x 10 5 PBMC para o fluxo correspondente citometria de tubos em um volume final de 100 ul. Se as células foram submetidas ao tratamento acima descrito de PKI, eles já devem ser ressuspensas em 100 ul neste passo.
- Adicionar 25 ul de I-pMHC tetrâmero mistura principal para o fluxo de citometria de tubos correspondente. No final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 125 uL.
- Vortex cada tubo, a fim de homogeneizar a suspensão de células.
- Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 45 min. Prepara-se o cocktail mAb de coloração da superfície durante este 45 minutos de incubação.
Coloração 3. Superfície
- Prepare o suficiente master mix mAb para corar todos os tubos experimentais. Preparar um excesso de 15% do volume total da mistura principal para esta contapara a pipetagem de erro.
- Ajustar o volume da mistura principal com tampão de coloração de modo que 50 ul são adicionados por teste.
- Para exclusão adequado de células T CD8 + não-e delineação de subconjuntos de memória, usar quantidades de mAbs dirigidos contra as seguintes moléculas na mistura principal a coloração da superfície titulado.
NOTA: Os conjugados com fluorocromos cada mAbs são fornecidas como referência: CD14 BV 510, 510 BV CD16, CD20 BV 510, 785 CD8a BV, CD28 PE Cy7, e CCR7 com FITC. Note-se que os mAbs contra CD14, CD16, CD20 e são conjugados com o mesmo fluorocromo (isto é, BV 510), uma vez que irá ser incluído na porta "dump". - Incluir um corante solucionáveis para discriminar células mortas na mistura principal manchas na superfície [ie, amina corante reativo (ARD)]. Certifique-se de que o reagente de ARD é conjugado com um fluorocromo com um espectro de emissão semelhante como os usados na porta "dump". Neste caso, use ARD Aqua.
- Adicionar 50 ul dea mistura principal de coloração descrito no 3,1-3,4 para o fluxo de citometria de tubos correspondente. No final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 175 uL.
- Vortex cada tubo. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 25 min.
- Lavar as células com tampão de lavagem (solução de PBS contendo 0,1% de albumina de soro de bovino e 0,45 g / L de NaN 3).
CUIDADO: Sodium azide é uma substância tóxica. A exposição a quantidades até mesmo hora podem causar sintomas. Lidar com esta substância de acordo com as diretrizes especificadas pela Saúde Ambiental e Gabinete de Segurança (EHS) na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas. - tubos de centrífuga a 510 xg durante 5 min. Decantar cuidadosamente o sobrenadante para um recipiente de resíduos separado. Certifique-se para não perturbar o sedimento.
CUIDADO: Não decantar lavagem sobrenadante em tampão de reservatórios que contêm lixívia, uma vez que pode reagir com a azida de sódio presente no tampão de lavagem e resultar na formação de um gás tóxico 34. CONTACTO o Escritório EHS na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas para obter orientações sobre como eliminar os azida de sódio. - Após decantação, vortex as células no líquido restante retido em cada tubo.
Fixação 4. celular
- Adicionar 250 ul de uma solução a 2% de paraformaldeído (PFA) a todos os tubos para fixar as células.
CUIDADO: PFA é uma substância tóxica. A exposição a quantidades até mesmo hora podem causar sintomas. Lidar com esta substância de acordo com as orientações especificadas pelo Escritório EHS na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas.- Uma vez que a solução de 2% de PFA deve ser isotónica com as células, utilizar PBS para preparar esta solução. Cem mililitros de uma solução 2% de PFA é suficiente para várias experiências. Agitar bem em vórtice todos os tubos imediatamente após a adição de 2% de PFA, a fim de evitar a formação de agregados de células.
- Incubar no escuro a 4 ° C durante 20 min.
- Wcélulas de cinzas por repetindo os passos 3,7-3,9. Uma vez que este passo está terminado, as células podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C durante 24-48 hr. Antes de prosseguir para a fase de permeabilização, vortex cuidadosamente os tubos.
5. permeabilização de células
- Adicionar 500 ul de tampão de permeabilização. Vortex todos os tubos.
- Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min.
- Lave as células, repetindo os passos 3,7-3,9.
6. intracelular Coloração
- Prepare o suficiente master mix mAb para corar todos os tubos experimentais.
- Ajuste o volume com PBS ou tampão de coloração de modo que 50 ul da mistura principal intracelular mAb são adicionados por teste.
- Preparar a mistura de mestre mAb descrito em 6.1 e 6.2 usando quantidades de mAbs dirigidos contra CD3 e GZM B. titulada
NOTA: envolvimento do TCR pelo tetrâmeros pMHC-I pode resultar em CD3 internalização, o que pode interferir com a detecção do tetrâmero de CD8 + CD3 + +As células T, se o anti-CD3 mAb é adicionada à mistura principal de manchas na superfície. Para evitar isto, adicionar o anti-CD3 mAb, nesta fase, que é, depois as células são permeabilizadas. Os conjugados com fluorocromos cada mAb são listados como referência: CD3 PerCP Cy5.5 e GZM B PE. - Adicionar 50? L de mAb Cocktail aos tubos correspondentes. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
- Lave as células, repetindo os passos 3,7-3,9. Os tubos estão prontos para ser adquirida em um citômetro de fluxo.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito foi usado para determinar a magnitude e a memória de fenótipo, as respostas de células T induzidas por vacina Gag CM9-específicas de CD8 + em uma Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Para esta análise, um tetrâmero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugado foi usado em um painel de coloração de citometria de fluxo de 8 cores. Figura 1A - F mostra a estratégia gating usado para analisar os dados, que devem ser aplicadas para ambos os tetrâmeros presentes em cada teste. Note-se que a pMHC-I tetrâmero de CD8 + da população de células T + é bem separados com o mínimo de fundo (Figuras 1F e G). Memória CD8 + células-T em macacos rhesus pode ser classificada como três subgrupos com base na expressão de superfície de CD28 e CCR7: memória central (T CM; CD28 + CCR7 +), a memória de transição (t EM1; CD28 + CCR7-), e efectora memória (T EM2; CD28-CCR7-) 35.Este protocolo também inclui uma etapa de permeabilização celular para detecção intracelular de GZM B e CD3. Figura 1G - I mostra a delineação dos subconjuntos de memória e células T GZM B que expressam CD8 + na + tetrâmero portão.
coloração de fundo pode produzir resultados sub-óptimos em pMHC-I ensaios de rotulagem tetrâmero. Para evitar isso, algumas precauções são sugeridos. Como foi dito na seção de protocolo, os frascos contendo os reagentes de tetrâmero pMHC-I deve ser sempre centrifugado a 20.000 xg durante pelo menos 15 minutos antes da preparação das misturas principais. O objectivo deste passo é para sedimentar quaisquer agregados proteicos que podem estar em solução tetrâmero pMHC-I. Além disso, titulando cada reagente antes da utilização, também é recomendável. Idealmente, as células que fazem ou não contêm a população de células T CD8 + Ag-specific de interesse deve ser rotulado com o tetrâmero relevante pMHC-I MHC-I-correspondido. esta can ser conseguida por coloração criopreservadas PBMC de SIV ingénuos (controlo negativo) e infectados com SIV lado (controlo positivo) macaques a lado com várias quantidades de um pMHC-I tetrâmero recém-obtido. Na Figura 2, por exemplo, 1,0? L / teste de uma APC conjugada com Mamu-B * 008: 01 / Nef tetrâmero RL-10 obteve-se o melhor separação entre as populações de células T positivas e negativas de tetrâmero de CD8 +. Por fim, a escolha do fluorocromo também pode ter um impacto significativo os resultados obtidos a partir de pMHC-I colorações de tetrâmero. A este respeito, pMHC-I tetrâmeros conjugado com dim moléculas (por exemplo, f luoresceína) devem ser evitados. Em nossa experiência, tetrâmeros pMHC-I conjugados a fluorocromos brilhantes, tais como PE, APC, e BV 421, produziram os melhores resultados.
Notamos que Mamu-B * 017: 01 tetramers normalmente produzem coloração fraca, mesmo quando conjugado com os fluorocromos brilhante acima mencionados. As razões para estebaixa intensidade de fluorescência não são totalmente claras, mas podem incluir baixa afinidade TCR / Mamu-B * 017: 01 interações e rápida interiorização TCR após a ligação tetrâmero 36,37. Ao longo destas linhas, PKI foram mostrados para inibir a internalização de TCR na superfície de células T CD8 + células 32. Como resultado, PKI pode melhorar a detecção de células T CD8 + T-células Ag-específicos por pMHC-I tetrâmero coloração. Confirmámos este efeito nas nossas experiências, onde a qualidade de Mamu-B * 017: 01 tetrâmero colorações pode ser substancialmente melhorada por pré-tratamento de PBMC com uma PKI (Figura 3). Curiosamente, o pré-tratamento com este PKI não melhorou significativamente a coloração de outras tetrâmeros pMHC-I aqui testadas (dados não mostrados), sugerindo que a Mamu-B * 017: As células T CD8 + 01-restritos podem ser únicos na sua sensibilidade para o tratamento de PKI.
Figura 1: estratégia de propagação e resultados representativos de um bem sucedido pMHC-I tetrâmero coloração. Foi avaliada a magnitude e memória fenótipo de células T CD8 + específicas do CM9 Gag induzidos pela vacina em PBMC de um Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Aqui, um tetrâmero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugado foi usado em um painel de coloração de citometria de fluxo de 8 cores. (A - F) Estratégia Gating para análise de citometria de fluxo. Primeiro, um portão em interiores diagonalmente em cluster foi criado por conspirar para frente altura de dispersão (FSC-H) versus área FSC (FSC-A) e, em seguida altura dispersão lateral (SSC-H) versus área SSC (SSC-A; A e B) . Em seguida, uma porta do tempo foi criada, que incluiu apenas os eventos que foram registrados nos dias 5 e 90 percentis. As células resultantes foram então fechado em "canal de descarga", + células negativas CD3 (C e D). Nesta fase, opopulação de linfócitos foi delineada com base na sua FSC-A e propriedades SSC-A e análises posteriores foram realizadas dentro de células T CD8 + (E e F). Depois de delinear pMHC-I tetrâmero + células (G), a análise fenotipagem de memória foi realizado dentro deste gate (H). As células T de memória do macaco rhesus podem ser classificados em três sub-grupos com base na expressão de CD28 e CCR7: memória central (T CM; CD28 + CCR7 +), de memória de transição (t EM1; CD28 + CCR7-), e memória efectora (t EM2 ; CD28-CCR7-). O presente protocolo também inclui um passo de permeabilização celular para a avaliação da expressão intracelular dentro de células T CD8 + (I) tetrâmero + Granzyme B (GZM B). A área sombreada no histograma corresponde a células T CD8 + tetrâmero + coradas com um mAb de controlo de isotipo. Embora o tetrâmero BV-421 conjugado + população que estava presente nesta coloração énão mostrado na figura, a mesma estratégia gating deve ser usada para a analisar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os resultados representativos da titulação de uma APC conjugada com Mamu-B * 008: 01 / Nef RL-10 tetrâmero. PBMC de dois Mamu-B * 008: 01+ macacos rhesus foram utilizados para esta experiência: uma animal era SIV ingénuos e serviu como controlo negativo, enquanto a outra foi infectados com SIV e serviu como o controlo positivo. Para determinar a quantidade de Mamu-B * 008: 01 / Nef RL-10 tetrâmero que produz o melhor separação entre tetrâmero + e células T CD8 + tetramer-, PBMC de cada animal foram incubadas com as quantidades indicadas de o reagente de tetrâmero pMHC-I. Com base nestes resultados, 1,0 ul / WA testes escolhidos como a quantidade óptima a ser utilizada em ensaios futuros. A estratégia gating utilizada para analisar os dados são descritos na Figura 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos do tratamento PKI na intensidade de fluorescência de Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. O inibidor inibe PKI internalização de complexos de TCR e, assim, melhora a detecção de Ag-specific CD8 + T-cells por fluorocromo marcado com Eu-pMHC tetrâmeros 32. (A - B) PBMC de dois Mamu-B * 017: 01+ macacos rhesus foram utilizados nesta experiência: um macaco foi SIV ingénuos e serviu como controlo negativo (A), enquanto o outro foi infectado com SIV e serviuo controlo positivo (B). PBMC de ambos os animais foram incubadas a 37 ° C na presença de PKI a uma concentração de 50 nM durante 30 min antes da coloração com uma APC conjugada com Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 tetrâmero, como descrito na secção Protocolo . Como referência, um outro conjunto de tubos foi submetido às mesmas condições de incubação e de coloração, excepto que a dimetil-sulfóxido (DMSO) foi adicionado em vez de PKI. A estratégia gating utilizada para analisar os dados são descritos na Figura 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| proteína SIV | Posição do aminoácido | Sequência de Aminoácidos | Molécula MHC classe I (nova nomenclatura) | Molécula MHC classe I (antigo nomenclature) | Nome epitopo Curto |
| Mordaça | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag CM9 |
| Mordaça | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag QI9 |
| Mordaça | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag GY9 |
| env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | env FW9 |
| env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env CL9 |
| env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env TL9 |
| env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY8 |
| env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY9 |
| vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | vif RL9 |
| vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | vif RL8 |
| vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | vif HW8 |
| vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | vif Vl10 |
| vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | vif WY8 |
| rotação | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| Tat | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Tat LI8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL-10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | Nef YY9 |
Tabela 1: Lista de pMHC-I tetrâmeros disponíveis para monitorizar respostas de células T CD8 + específicas de SIV em macacos rhesus.
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Discussion
A poucos passos nesta discussão mérito procedimento como eles são cruciais para produzir resultados ideais. Em primeiro lugar, uma vez que a qualidade das amostras biológicas é um forte indicador de sucesso de qualquer ensaio de citometria de fluxo 38, devem ser tomados todos os cuidados para garantir que as células são viáveis e em suspensão durante o processo de coloração. Isto é particularmente relevante quando se trabalha com amostras criopreservadas, uma vez que são mais propensas a aglomeração e normalmente contêm um maior número de células mortas. Nestes casos, passando a suspensão de células através de um coador de células de 70 uM antes do procedimento de marcação tetrâmero pMHC-I pode melhorar substancialmente os resultados. Em segundo lugar, a compensação apropriada dos fluorocromos utilizados no ensaio é crítica para a análise de dados precisos, especialmente quando vários parâmetros estão a ser avaliadas na mesma experiência. Neste sentido, recomenda-se que os controles fresco de compensação de cor única estar preparado para todos os pMHC-I tetrâmero stenção ensaio. Somos a favor do uso de esferas de compensação por causa de sua ampla reactividade anti-Ig e o fato de que eles produzem distribuições bimodais claros de populações positivas e negativas. Uma vez que estes grânulos não se ligam a moléculas do MHC-I, anticorpos conjugados com fluoróforos os mesmos como os tetrâmeros pMHC-I (por exemplo, a APC e BV 421) devem ser utilizadas como controlos de compensação. Vários de tais esferas de compensação estão disponíveis a partir de vários fornecedores e devem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante. Em terceiro lugar, uma vez que a estratégia de fenotipagem aqui descrito requer a definição de subconjuntos de células T CD8 + com base na expressão graduada de três moléculas (ie, CD28, CCR7, e GZM B), controlos de gating, tais como fluorescência menos um (FMO) Testes ou anticorpos do mesmo isotipo, devem ser utilizados para facilitar a estes tipos de análises. Nas nossas experiências, por exemplo, tubos separados contendo a pMHC-I + tetrâmero população de células T CD8 + de um interessere sempre coradas com mAbs de controlo de isotipo conjugados com as mesmas fluorocromos como os mAbs contra CD28, CCR7, e GZM B. É importante ressaltar que, embora as orientações acima mencionadas pode ajudar a melhorar a qualidade geral do pMHC-I tetrâmero colorações, eles não são as únicas variáveis que podem afectar o desempenho do ensaio. Considerando a singularidade de cada ambiente de laboratório, todo o fluxo de trabalho descrito aqui deve ser realizada pelo menos uma vez em amostras de simulação para permitir a prática e os ajustes relevantes.
Curiosamente, pMHC-I tetrâmero células T CD8 + positivas são ocasionalmente observados em PBMC de naïve SIV macacos rhesus (não infectados e não vacinados). Estes casos não parecem ser o resultado da coloração de fundo com base em inspecção visual dos dados. Em vez disso, eles podem reflectir as interacções entre as moléculas pMHC-i e receptores semelhantes a imunoglobulina assassinas (KIR) expresso na superfície de macaco rhesus NK e CD8 + T-cells 39,40. Com efeito, Mamu-A1 * 002: 01 tetrâmeros dobradas com péptidos correspondentes aos epítopos de Gag e Env GY9 RY8 foram mostrados para se ligar a Mamu-KIRDL05 39. Ao longo destas linhas, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 e Mamu-A1 * 002: 01 / Env RY8 são mais propensas a exibir a coloração Ag-independente tetrâmero pMHC-I descrito acima. Dado este fenómeno, é importante para controlar por esta reatividade basal de macaco em experiências que envolvem avaliações longitudinais de respostas de células T específicas de CD8 + SIV após infecção ou vacinação. Para conseguir isso, é aconselhável realizar pMHC-I tetrâmero coloração em amostras obtidas no primeiro dia de tratamento. Ele também pode ser pertinente para congelar PBMC em várias aliquotas de pequeno porte, nestes pontos de tempo iniciais no caso comparações com as amostras de linha de base são necessárias em experiências futuras.
Uma limitação de pMHC-I tetrâmero coloração é que apenas CD8 + células-T de especificidade conhecida e MHC-I c restriçãoum ser estudados por esta abordagem. Isto é particularmente relevante em macacos rhesus, dada a complexa organização do seu loci MHC. Com efeito, um único haplótipo macaco rhesus pode ter dúzias de genes do MHC-I, das quais nem todas codificam moléculas que são expressas de forma estável na superfície da célula 29. Como resultado, pode ser difícil de determinar o conjunto de moléculas de CPH-I funcionais expressas por um determinado animal. No entanto, este pressuposto pode ser superado através da concepção de experiências que incluem macacos que são positivas para os alelos conhecidos do MHC-I, tal como Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu- B * 017: 01.
Em conclusão, este manuscrito fornece um pMHC-I protocolo de coloração tetrâmero optimizado para a determinação do fenótipo de células T específicas do SIV CD8 + frequência e memória em macacos rhesus. Desde pMHC-I tetrâmero coloração é mais sensível do que o IFN-γ ELISPOT e ensaios de ICS para a detecção de células T CD8 específicas do Ag+ Células-T e não necessita de estimulação in vitro Ag, a metodologia aqui apresentada é especialmente útil para estudar o impacto das respostas de células T CD8 + no resultado da infecção por vírus da imunodeficiência. O conhecimento prático adquirido de dominar esta técnica também pode ser útil para enriquecer CD8 + células T Ag específicos, como parte de estudos funcionais e para monitorar as respostas de células T CD8 + em vários cenários de doença 6.
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Acknowledgments
Nós gostaríamos de agradecer a David Watkins para apoiar os experimentos que permitiram a otimização da presente metodologia. Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiado em parte por uma concessão piloto fornecido pelo Centro de Miami para Pesquisa da AIDS dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30AI073961. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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