Summary
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.
Abstract
Peptide-major histocompatibility complex klasse I (pMHC-I) tetrameren heb een waardevol instrument om CD8 + T-cel reacties te bestuderen. Omdat deze reagentia direct binden aan T-cel receptoren op het oppervlak van CD8 + T-lymfocyten, fluorochroom gemerkte pMHC-I tetrameren kan de nauwkeurige detectie van antigeen (Ag) -specifieke CD8 + T-cellen zonder de noodzaak van in vitro re -stimulation. Bovendien, in combinatie met multi-color flowcytometrie kan pMHC-I tetrameer kleuring blijkt sleutelaspecten van Ag-specifieke CD8 + T-cellen, waaronder differentiatiestadium, geheugen fenotype en activeringsstatus. Deze soorten analyses vooral nuttig op het gebied van HIV immunologie is wanneer CD8 + T-cellen progressie beïnvloeden AIDS. Experimentele infectie van rhesus makaken met simian immunodeficiency virus (SIV) biedt een waardevol instrument om cellulaire immuniteit tegen het AIDS-virus te bestuderen. Daardoor aanzienlijke progress is gemaakt bij het bepalen en karakteriseren van T-cel responsen in dit diermodel. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor sommen SIV-specifieke CD8 + T-cellen in rhesus makaken door pMHC-I tetrameer kleuring. De assay maakt de gelijktijdige kwantificering en geheugen fenotypering van twee pMHC-I tetrameer + CD8 + T-celpopulaties per test, die bruikbaar zijn voor het bijhouden van SIV-specifieke CD8 + T-cel responsen opgewekt door vaccinatie of SIV infectie kan zijn. Gezien het belang van niet-menselijke primaten in biomedisch onderzoek, deze methode is toepasbaar voor het bestuderen van CD8 + T-cel responsen in meerdere instellingen ziekte.
Introduction
CD8 + T-cellen een belangrijke component van het adaptieve immuunsysteem voor deelname tumor immune surveillance en dragen bij aan de uitroeiing van intracellulaire pathogenen 1. Eenvoudig gezegd, CD8 + T-cellen brengen T-celreceptoren (TCR's) die specifiek herkennen peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) moleculen aanwezig op het plasmamembraan van gastheercellen. Omdat deze peptiden zijn afgeleid van de proteolyse van endogeen gesynthetiseerde eiwitten, celoppervlak pMHC-I complexen een venster in de intracellulaire omgeving. Na virusinfectie, bijvoorbeeld geïnfecteerde cellen MHC-I moleculen die virus afgeleide peptiden die als liganden voor door TCR patrouilleren CD8 + T-cellen tot expressie kunnen dienen weergeven. Bij een virus-specifieke CD8 + T-cel tegenkomt een geïnfecteerde cel presenteert het pMHC-I ligand, zal TCR betrokkenheid resulteren in CD8 + T-cel activatie en ultiveer leiden tot cellysis richten. Gezien het grote belang van deze TCR / pMHC-I interacties bepalen de grootte, specificiteit en fenotype reageren CD8 + T-cellen vaak kunnen belangrijke aanwijzingen over menselijke ziektes.
Tot begin 1990 kwantificering van Ag-specifieke CD8 + T-cellen gebruikt de technisch veeleisende beperkende verdunningstest (LDA) 2,3. Niet alleen heeft de LDA vereisen een aantal dagen worden afgerond, maar ook nagelaten om cellen die proliferatieve potentiële ontbrak op te sporen. Hierdoor LDA sterk onderschat de werkelijke frequentie van antigeen (Ag) -specifieke CD8 + T-cellen die aan een immuunrespons. Hoewel de ontwikkeling van ELISPOT en intracellulaire cytokine kleuring assays sterk het vermogen om cellulaire immuniteit meten verbeterde Deze methoden verzet in vitro stimulatie te kwantificeren Ag-specifieke T-cellen 4. Het was pas in 1996 dat Altman, Davis, en colleagues publiceerden hun landmark artikel rapporteren van de ontwikkeling van de pMHC-I tetrameer technologie 5. Cruciaal voor het succes van deze techniek was de multimerisatie van pMHC-I moleculen die de halfwaardetijd van TCR / pMHC-I interacties uitgebreid, waardoor de kans op pMHC-I tetrameren vallen tijdens de wasstappen van flowcytometrische assays verminderen. Het belangrijkste voordeel van pMHC-I tetrameren via voornoemde assays is de mogelijkheid om direct ex vivo nauwkeurige opsporing Ag-specifieke CD8 + T-cellen zonder de noodzaak van in vitro her-stimulatie. Bovendien is de combinatie van pMHC-I tetrameer kleuring met multi-color flowcytometrie heeft gedetailleerde analyse van het differentiatiestadium, geheugen fenotype en activeringsstatus van Ag-specifieke CD8 + T-cellen 2-4 toegestaan. In het licht van de recente technische ontwikkelingen voor het karakteriseren van CD8 + T-cel repertoire pMHC-I multimeer kleuring 6, de breedte van de aanvragen for deze methode zal waarschijnlijk blijven uitbreiden.
Er zijn maar weinig gebieden in het biomedisch onderzoek zijn meer geprofiteerd van pMHC-I tetrameer kleuring dan het gebied van HIV immunologie 7. Hoewel CD8 + T-cellen waren tijdelijk geassocieerd met de eerste controle van HIV viremie ten tijde van de publicatie door Altman, Davis en collega 8,9, het gebruik van pMHC-I tetrameren in de daaropvolgende jaren aanzienlijk uitgebreid inzicht in de HIV-specifieke CD8 + T-celrespons. Zo pMHC-I tetrameer kleuring geholpen bevestigen de robuuste afmetingen van virus-specifieke CD8 + T-cel responsen in de meeste HIV-geïnfecteerden 10-12. Deze werkwijze vergemakkelijkt eveneens de karakterisering van HIV en SIV-specifieke CD8 + T-celresponsen beperkt door MHC-I-moleculen geassocieerd met spontane controle van virale replicatie in de afwezigheid van antiretrovirale therapie-depressiviteit en "elite control"
Experimentele SIV infectie van rhesus makaken (Macaca mulatta) blijft de beste diermodel voor het evalueren van immune interventies tegen HIV / AIDS 18,19. In de afgelopen 25 jaar is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de identificatie en karakterisering van SIV-specifieke CD8 + T-cellen in deze apensoorten, waaronder de ontdekking van MHC-I-allelen en de definitie van de peptide binding motieven 13,20-27 . Als gevolg daarvan hebben pMHC-I tetrameren ontwikkeld voor de analyse van SIV-specifieke CD8 + T-cellreacties in dit diermodel 28. De meeste van deze sera worden gemaakt van de genproducten van vier rhesus macaque MHC-I allelen: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, en Mamu-B * 017: 01. Van de nota, doe resusapen geen MHC-C locus 29 te drukken. De overgrote meerderheid van de pMHC-I tetrameren gebruikt in de onderhavige experimenten werden geproduceerd op de NIH tetrameer Core Facility Emory University. Toch heeft een aantal van deze reagentia, met inbegrip van Mamu-A1 * 001 tetrameren gebonden aan de immunodominante Gag CM9 epitoop, kan alleen worden verkregen uit commerciële bronnen te wijten aan licentieovereenkomsten. Gebruik pMHC-I tetrameren van de vier rhesus macaque allelen bovenstaande, hebben we met succes genoemde CD8 + T-cellen tegen een totaal van 21 epitopen SIV (tabel 1), die werden geïnduceerd door vaccinatie of primaire SIV infectie 30,31 (Martins et al., ongepubliceerde waarnemingen).
De huidige manuscript voorziet in eengeoptimaliseerde pMHC-I tetrameer kleuring protocol voor het bepalen van de frequentie en het geheugen fenotype van SIV-specifieke CD8 + T-cellen in rhesus makaken. De bepaling begint met een verkozen 30 min incuberen met een proteïne kinase remmer (PKI, hier Dasatinib wordt gebruikt) om TCR internalisatie verlagen en zo verbeteren pMHC-I tetrameer kleuring 32. Zoals hieronder beschreven, deze behandeling is vooral nuttig bij gebruik Mamu-B * 017: 01 tetrameren. Instructies over hoe de cellen met fluorochroom-geconjugeerde pMHC-I tetrameren en monoklonale antilichamen (mAbs) te labelen zijn ook aanwezig. Dit protocol een cel permeabilisatie stap voor de intracellulaire detectie van de cytolyse-geassocieerde molecule granzyme B (GZM B). Het mAb tegen CD3 toegevoegd in deze stap ook de detectie van deze TCR signaalmolecuul verbeteren. Als referentie zijn alle fluorochromen die in deze kleuring paneel weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruikt in dit handschrift perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werden verkregen van Indiase rhesus makaken ondergebracht bij de Wisconsin National Primate Research Center. Deze dieren werden in overeenstemming met de Weatherall verslag in het kader van een protocol door de Universiteit van Wisconsin Graduate School Animal Care en gebruik Comite 33 goedgekeurd verzorgd. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd onder verdoving en alle inspanningen werden gedaan om potentiële lijden te minimaliseren.
1. PKI Treatment
LET OP: Dit is optioneel, maar aanbevolen voor Mamu-B * 017: 01 tetrameren. Zie Resultaten en discussie secties.
- Resuspendeer in PBMC R10 medium bij een concentratie van 1,6 x 10 7 cellen / ml.
- Voeg 50 ul van de celsuspensie met de corresponderende flowcytometrie buizen. Voeg 50 ul van een 100 nM oplossing van PKI aan elke buis.
- Vortex elke buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Tegen het einde van dezestap moet elke buis 100 ui van een celsuspensie bevattende 8,0 x 10 5 PBMC en 50 nM PKI hebben.
- Ga verder met de pMHC-I tetrameer kleuring stap.
2. Kleuring met fluorochroom gemerkte pMHC-I tetrameren
- Voor de voorbereiding van de pMHC-I tetrameer master mix, centrifuge de pMHC-I tetrameer buizen bij 20.000 g gedurende ten minste 15 min bij 4 ° C. Het doel van deze stap is om proteïneaggregaten pellet in het pMHC-I tetrameer oplossing die achtergrondkleuring kan toenemen. Zodra de centrifugatiestap wordt uitgevoerd, voorkomen pipetteren van de bodem van de buis waarbij het eiwit aggregaten opstapelen.
- Bereid genoeg pMHC-I tetrameer master mix aan alle experimentele buizen vlekken. Bereid een overmaat van 15% van het totale volume van deze master mix te vertegenwoordigen pipetteerfout.
- Verdunnen pMHC-I tetrameren in vlek buffer (bijv Brilliant Stain buffer), zodat 25 ul van de pMHC-I tetrameer master mix zijn Added om elke test.
- Label PBMC met twee pMHC-I tetrameren per test; een geconjugeerd aan allofycocyanine (APC) en de andere Brilliant Violet (BV) 421.
- Voeg 8,0 x 10 5 PBMC in het overeenkomstige stromingscytometrie buizen in een eindvolume van 100 pl. Als de cellen werden onderworpen aan de hierboven beschreven behandeling PKI, moeten ze reeds geresuspendeerd in 100 gl bij deze stap.
- Voeg 25 ul van pMHC-I tetrameer master mix de overeenkomstige flowcytometrie buizen. Tegen het einde van deze stap, moet het eindvolume in elke buis 125 pl.
- Vortex elke buis om de celsuspensie te homogeniseren.
- Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 45 min. Bereid het oppervlak vlekken mAb cocktail tijdens deze 45 minuten incubatie.
3. Surface kleuring
- Bereid genoeg mAb master mix aan alle experimentele buizen vlekken. Bereid een overmaat van 15% van het totale volume van deze master mix verantwoordingvoor pipetteren fout.
- Pas het volume van de master mix met beits buffer, zodat 50 ul worden toegevoegd per test.
- Voor een goede uitsluiting van niet-CD8 + T-cellen en afbakening geheugen subsets gebruik getitreerde hoeveelheden mAb gericht tegen de volgende moleculen op het oppervlak kleuring master mix.
OPMERKING: De fluorochromen geconjugeerd aan elke mAbs als referentie: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7 en CCR7 FITC. Merk op dat de mAbs tegen CD14, CD16 en CD20 geconjugeerd met hetzelfde fluorochroom (bijv BV 510) aangezien zij worden opgenomen in het "dump" poort. - Onder andere een opgelapt kleurstof voor het discrimineren van dode cellen in het oppervlak vlekken master mix [ie, amine reactieve kleurstof (ARD)]. Zorg ervoor dat de ARD reagens is geconjugeerd aan een fluorochroom met een vergelijkbare emissie-spectrum als die wordt gebruikt in het "dumpen" gate. In dit geval gebruikt ARD Aqua.
- Voeg 50 glde kleuring master mix beschreven 3,1-3,4 om de corresponderende flowcytometrie buizen. Tegen het einde van deze stap, moet het eindvolume in elke buis 175 pl.
- Vortex elke buis. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 25 min.
- Was de cellen met wasbuffer (PBS bevattende 0,1% runderserumalbumine en 0,45 g / l NaN3).
LET OP: Natriumazide is een giftige stof. Blootstelling aan zelfs kleine hoeveelheden kan leiden tot symptomen veroorzaken. Behandel deze stof op basis van de door de Environmental Health and Safety (EHS) Kantoor opgegeven bij de instelling waar deze experimenten worden uitgevoerd richtlijnen. - Centrifugebuizen bij 510 xg gedurende 5 minuten. decanteren supernatant voorzichtig in een aparte afvalbak. Zorg ervoor dat de pellet niet te verstoren.
LET OP: niet decanteren wasbuffer supernatant in reservoirs met bleekwater als het kan reageren met de natriumazide aanwezig is in de wasbuffer en resulteren in de vorming van een giftig gas 34. Contact de EHS Office op de instelling waar deze experimenten worden uitgevoerd voor richtlijnen over hoe te ontdoen van natriumazide. - Na decanteren vortex de cellen in de resterende vloeistof in elke buis vastgehouden.
4. Cell Fixatie
- Voeg 250 gl van een 2% paraformaldehyde (PFA) oplossing voor alle buizen aan de cellen vast.
LET OP: PFA is een giftige stof. Blootstelling aan zelfs kleine hoeveelheden kan leiden tot symptomen veroorzaken. Handvat deze stof volgens de EHS Bureau de bij de instelling waar deze experimenten worden uitgevoerd richtlijnen.- Aangezien de 2% PFA oplossing isotoon moeten zijn aan de cellen gebruikt PBS om deze te bereiden. Honderd milliliter van een 2% PFA oplossing is voldoende voor meerdere experimenten. Grondig vortex alle buizen onmiddellijk na de toevoeging van 2% PFA teneinde de vorming van cel aggregaten voorkomen.
- Incubeer in het donker bij 4 ° C gedurende 20 min.
- wash cellen door het herhalen van de stappen 3,7-3,9. Zodra deze stap is voltooid, kunnen de cellen gedurende 24-48 uur worden bewaard in het donker bij 4 ° C. Alvorens over te gaan tot de Permeabilisatie fase vortex grondig uit de buisjes.
5. Permeabilisatie van cellen
- Voeg 500 pl permeabilisatie buffer. Vortex alle buizen.
- Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Was de cellen door het herhalen van de stappen 3,7-3,9.
6. Intracellulaire kleuring
- Bereid genoeg mAb master mix aan alle experimentele buizen vlekken.
- Regel het volume met PBS of beits buffer, zodat 50 ul van de intracellulaire mAb master mix worden toegevoegd per test.
- Bereid de mAb master mix in 6.1 en 6.2 beschreven aan de hand getitreerde hoeveelheden mAb gericht tegen CD3 en GZM B.
OPMERKING: TCR koppeling door pMHC-I tetrameren kan leiden tot CD3 internalisatie, die kunnen interfereren met de detectie van tetrameer + CD3 + CD8 +T-cellen als de anti-CD3 mAb wordt toegevoegd aan het oppervlak vlekken master mix. Om dit te voorkomen, voeg de anti-CD3 mAb in dit stadium, dat wil zeggen na de cellen gepermeabiliseerd. De fluorochromen geconjugeerd aan elk mAb zijn opgenomen als referentie: CD3 PerCP Cy5.5 en GZM B PE. - Voeg 50 ul van mAb cocktail aan de overeenkomstige buizen. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Was de cellen door het herhalen van de stappen 3,7-3,9. De buizen zijn binnen een flow cytometer worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven protocol is gebruikt om de omvang en geheugen fenotype van vaccinatie, Gag CM9-specifieke CD8 + T-celresponsen bepalen een Mamu-A1 * 001 + rhesus macaque. Voor deze analyse werd een APC-geconjugeerd Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetrameer gebruikt in een 8-kleuren flowcytometrische kleuring panel. Figuur 1A - F toont de gating strategie gebruikt om de gegevens, die moeten worden toegepast voor beide in elke test tetrameren analyseren. Merk op dat de pMHC-I tetrameer + CD8 + T-celpopulatie goed gescheiden met minimale achtergrond (figuur 1F en G). Geheugen CD8 + T-cellen in rhesus makaken kunnen worden ingedeeld drie subgroepen op basis van de oppervlakte-expressie van CD28 en CCR7: centrale geheugen (T CM; CD28 + CCR7 +), overgangs- geheugen (T EM1; CD28 + CCR7-) en effector memory (T EM2, CD28-CCR7-) 35.Dit protocol bevat ook een cel permeabilisatie stap voor de intracellulaire detectie van GZM B en CD3. Figuur 1G - I toont de afbakening van het geheugen subsets en GZM B-uiting van CD8 + T-cellen in de tetrameer + gate.
Achtergrondkleuring kan suboptimale resultaten pMHC-I tetrameer labeling assays verkregen. Om dit te voorkomen, zijn een paar voorzorgsmaatregelen voorgesteld. Zoals vermeld in de sectie protocol moet de flacon met pMHC-I tetrameer reagentia altijd gecentrifugeerd bij 20.000 xg gedurende ten minste 15 min voor de bereiding van de mastermengsels. Het doel van deze stap is om elk eiwit aggregaten die kunnen worden in de pMHC-I tetrameer oplossing pellet. Daarnaast titreren elk reagens voorafgaand aan het gebruik wordt ook aanbevolen. Idealiter MHC-I-geëvenaard cellen die wel of niet bevatten Ag-specifieke CD8 + T-cel bevolking van belang moeten worden geëtiketteerd met de betrokken pMHC-I tetrameer. dit can worden bewerkstelligd door kleuring gecryopreserveerde PBMC van SIV naïeve (negatieve controle) en SIV-geïnfecteerde (positieve controle) makaken zij aan zij met verschillende hoeveelheden van een nieuw verkregen pMHC-I tetrameer. In figuur 2 bijvoorbeeld 1,0 gl / test van een APC-geconjugeerd Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetrameer leverde de beste scheiding tussen tetrameer positieve en negatieve CD8 + T-celpopulaties. Ten slotte is de keuze van de fluorochroom kan ook in belangrijke mate invloed hebben op de resultaten van pMHC-I tetrameer kleuringen. In dit opzicht pMHC-I tetrameren geconjugeerd dimmen moleculen (bijvoorbeeld fluoresceïne) te worden vermeden. In onze ervaring, pMHC-I tetrameren geconjugeerd aan heldere fluorochromen, zoals PE, APC, en BV 421, hebben de beste resultaten opgeleverd.
We hebben gemerkt dat Mamu-B * 017: 01 tetrameren levert doorgaans dim kleuring, zelfs wanneer geconjugeerd aan de heldere fluorochromen hierboven vermeld. De redenen hiervoorlage fluorescentie-intensiteit zijn niet helemaal duidelijk, maar kan onder meer low-affiniteit TCR / Mamu-B * 017: 01 interacties en snelle TCR internalisatie op tetrameer binding 36,37. In deze zin zijn PKI aangetoond TCR internalisatie remmen op het oppervlak van CD8 + T-cellen 32. Hierdoor kan PKI detectie van Ag-specifieke CD8 + T-cellen door pMHC-I tetrameer kleuring verbeteren. We hebben dit effect ook in onze experimenten bevestigden waar de kwaliteit van Mamu-B * 017: 01 tetrameer kleuringen kan aanzienlijk worden verbeterd door het voorbehandelen van PBMC met een PKI (figuur 3). Vreemd, voorbehandeling met dit PKI geen significant verbeterde kleuring van andere pMHC-I tetrameren hier getest (gegevens niet getoond), wat suggereert dat Mamu-B * 017: 01-gerestricteerde CD8 + T-cellen uniek in hun gevoeligheid misschien PKI behandeling.
Figuur 1: Gating strategie en representatieve resultaten van een succesvolle pMHC-I tetrameer kleuring. We evalueerden de omvang en het geheugen fenotype van vaccingeïnduceerde Gag CM9-specifieke CD8 + T-cellen in PBMC van een Mamu-A1 * 001 + rhesus makaak. Hier werd een APC-geconjugeerd Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetrameer gebruikt in een 8-kleuren flowcytometrische kleuring panel. (A - F) Gating strategie voor flowcytometrische analyse. Ten eerste, een poort op diagonaal geclusterde singlets is gecreëerd door het plotten voorwaartse verstrooiing hoogte (FSC-H) versus FSC gebied (FSC-A) en zijwaartse verstrooiing hoogte (SSC-H) versus SSC gebied (SSC-A, A en B) . Vervolgens werd een tijd poort werd gemaakt dat alleen de gebeurtenissen die in de 5e en 90e percentiel werden geregistreerd inbegrepen. De resulterende cellen werden vervolgens afgesloten op "dump channel" negatief, CD3 + cellen (C en D). In deze fase, delymfocyt populatie werd afgebakend op basis van de FSC en SSC-A-A en de daaruit voortvloeiende analyses werden uitgevoerd op CD8 + cellen (E en F). Na waarin pMHC-I tetrameer + cellen (G), werd het geheugen fenotypering onderzoek verricht naar deze poort (H). Rhesus macaque memory T-cellen kunnen worden onderverdeeld in drie subgroepen op basis van de expressie van CD28 en CCR7: centrale geheugen (T CM; CD28 + CCR7 +), overgangs- geheugen (T EM1; CD28 + CCR7-) en effector geheugen (T EM2 , CD28-CCR7-). Dit protocol een cel permeabilisatie stap voor de intracellulaire evaluatie van Granzyme B (GZM B) expressie in tetrameer + CD8 + T-cellen (I). Het gearceerde gebied in het histogram overeenkomt met tetrameer + CD8 + T-cellen gekleurd met een isotype-gematched controle mAb. Hoewel de BV-421 geconjugeerd tetrameer + populatie die aanwezig was in deze kleuringniet getoond in de figuur, moet dezelfde gating strategie worden gebruikt om deze te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van de titratie van een APC-geconjugeerde Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetrameer. PBMC van twee Mamu-B * 008: 01+ rhesus makaken werden voor dit experiment: één dier was SIV naïef en diende als de negatieve controle, terwijl de andere was SIV-geïnfecteerde en diende als positieve controle. Om de hoeveelheid Mamu-B bepalen * 008: 01 / Nef RL10 tetrameer dat de beste scheiding tussen tetrameer + en tetramer- CD8 + T-cellen levert, PBMC van elk dier werden met de aangegeven hoeveelheden van de pMHC-I tetrameer reagens. Op basis van deze resultaten, 1,0 gl / test was gekozen als de optimale hoeveelheid te worden gebruikt voor toekomstige analyses. De gating strategie gebruikt om de gegevens te analyseren is beschreven in figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effecten van PKI behandeling op de fluorescentie-intensiteit van Mamu-B * 017: 01 tetrameren. De PKI remt internalisatie van TCR-complexen en verbetert daardoor detectie van Ag-specifieke CD8 + T-cellen door fluorochroom gemerkte pMHC-I tetrameren 32. (A - B) PBMC van twee Mamu-B * 017: 01+ rhesus makaken werden in dit experiment een aap was SIV naïef en diende als de negatieve controle (A), terwijl de andere werd geïnfecteerd met SIV en diende alsde positieve controle (B). PBMC van zowel dieren werden geïncubeerd bij 37 ° C in aanwezigheid van PKI in een concentratie van 50 nM voor 30 min voor kleuren met een APC-geconjugeerd Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 tetrameer, zoals beschreven in het hoofdstuk protocol . Ter referentie, een stel buisjes werd onderworpen aan dezelfde incubatie- en kleuring omstandigheden, behalve dat dimethylsulfoxide (DMSO) werd toegevoegd in plaats van PKI. De gating strategie gebruikt om de gegevens te analyseren is beschreven in figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| SIV eiwit | Aminozuurpositie | Aminozuurvolgorde | MHC klasse I molecuul (nieuwe nomenclatuur) | MHC klasse I molecuul (oude nomenclatuure) | Epitoop korte naam |
| Prop | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag CM9 |
| Prop | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag QI9 |
| Prop | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag GY9 |
| env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | env FW9 |
| env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env CL9 |
| env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env TL9 |
| env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY8 |
| env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Vif WY8 |
| Rev | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| Tat | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | Nef YY9 |
Tabel 1: Lijst van pMHC-I tetrameren die beschikbaar is om SIV-specifieke CD8 + T-cel responsen in rhesus makaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een paar stappen in deze procedure verdienste discussie als ze zijn van cruciaal belang voor een optimaal resultaat opleveren. Ten eerste, omdat de kwaliteit van de biologische monsters is een sterke voorspeller van het succes van elke flowcytometrische bepaling 38, reinigings- moet worden gezorgd dat de cellen levensvatbaar zijn en in suspensie tijdens de kleuringsprocedure. Dit is met name van belang bij het werken met gecryopreserveerde monsters omdat ze meer vatbaar voor klonteren en typisch hogere aantallen dode cellen bevatten. In deze gevallen leiden van de celsuspensie door een 70 um cel zeef voor de tetrameer labelingsprocedure pMHC-I kan aanzienlijk betere resultaten. Ten tweede, goede compensatie van de fluorochromen gebruikt in het assay kritisch is voor nauwkeurige gegevensanalyse, vooral als meerdere parameters worden geëvalueerd in hetzelfde experiment. In dit verband wordt aanbevolen dat de vergoeding in één kleur verse controles worden voorbereid voor elke pMHC-I tetrameer sTaining assay. We geven de voorkeur compensatie parels vanwege hun brede anti-Ig reactiviteit en het feit dat zij op duidelijke bimodale verdeling van positieve en negatieve populaties. Aangezien deze kralen niet binden aan MHC-I moleculen, antilichamen geconjugeerd met fluoroforen hetzelfde als pMHC-I tetrameren (bijvoorbeeld APC en BV 421) worden gebruikt als compensatie controles. Verscheidene van dergelijke compensatie kralen zijn verkrijgbaar van meerdere leveranciers en worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Ten derde, aangezien de fenotypering strategie beschreven vereist de afbakening van CD8 + T-cel subsets op basis van de gesorteerde expressie van drie moleculen (bijvoorbeeld CD28, CCR7, en GZM B), gating organen zoals fluorescentie min één (FMO) testen of-isotype antilichamen worden gebruikt om dit soort analyses vergemakkelijken. In onze experimenten, bijvoorbeeld afzonderlijke buizen met het pMHC-I tetrameer + CD8 + T-celpopulatie eenre altijd gekleurd met isotype controle mAb geconjugeerd aan dezelfde fluorochromen de mAbs tegen CD28, CCR7 en GZM B. Belangrijk hoewel de bovengenoemde richtlijnen kan bijdragen aan de algehele kwaliteit van pMHC-I tetrameer kleuringen, ze zijn niet de enige variabelen die kan het gebruik van deze test. Gezien de uniciteit van elk laboratorium setting, moet de gehele workflow hier beschreven minstens één keer worden uitgevoerd op mock monsters mogelijk te maken voor de praktijk en relevante aanpassingen.
Vreemd genoeg pMHC-I tetrameer positieve CD8 + T-cellen worden soms waargenomen in PBMC van SIV naïeve (niet-geïnfecteerde en gevaccineerde) rhesus makaken. Deze zaken lijken het resultaat van achtergrondkleuring basis van visuele inspectie van de gegevens. Veeleer kunnen zij tijdens interacties tussen pMHC-I moleculen en killer immunoglobuline-achtige receptoren (KIR) op het oppervlak van rhesus macaque NK en CD8 + T-cellen 39,40. Inderdaad, Mamu-A1 * 002: hebben 01 tetrameren gevouwen met peptiden die overeenkomen met de Gag GY9 en Env RY8 epitopen aangetoond te binden aan Mamu-KIRDL05 39. Langs deze lijnen, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 en Mamu-A1 * 002: 01 / Env RY8 zijn meer vatbaar voor de tentoonstelling van de Ag-onafhankelijke pMHC-I tetrameer kleuring hierboven beschreven. Aangezien dit fenomeen is het belangrijk om te controleren voor deze basislijn reactiviteit in experimenten met apen longitudinale beoordeling van SIV-specifieke CD8 + T-cel responsen na infectie of vaccinatie. Om dit te bereiken is het raadzaam om pMHC-I tetrameer kleuring uitgevoerd op monsters die op de eerste dag van de behandeling. Het kan ook relevant zijn voor PBMC bevriezen in meerdere kleine formaat porties bij deze eerste tijdstippen bij vergelijkingen met basislijn monsters zijn nodig in toekomstige experimenten.
Een beperking van pMHC-I tetrameer kleuring is dat alleen CD8 + T-cellen van bekende specificiteit en MHC-restrictie CEen bestudeerd worden door deze aanpak. Dit is met name relevant in rhesus makaken gezien de complexe organisatie van hun MHC loci. Inderdaad kan één rhesus macaque haplotype tientallen MHC-I genen, die niet allemaal coderen voor moleculen die stabiel tot expressie worden gebracht op het celoppervlak 29. Hierdoor kan het moeilijk zijn om het geheel van functionele MHC-I-moleculen door een bepaald dier tot expressie te bepalen. Toch kan dit voorbehoud worden overwonnen door het ontwerpen van experimenten die apen die positief voor bekende MHC-I-allelen zijn, zoals Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * onder 002: 01, Mamu-B * 008: 01, en Mamu- B * 017: 01.
Samenvattend, dit manuscript geeft een geoptimaliseerde pMHC-I tetrameer kleuring protocol voor het bepalen van de frequentie en het geheugen fenotype van SIV-specifieke CD8 + T-cellen in rhesus makaken. Aangezien pMHC-I tetrameer kleuring is gevoeliger dan IFN-γ ELISPOT ICS en assays voor de detectie van Ag-specifieke CD8+ T-cellen en vereist geen in vitro stimulatie Ag, de hier gepresenteerde methode is bijzonder nuttig voor het bestuderen van het effect van CD8 + T-celresponsen bij de uitkomst van immunodeficiëntie virusinfectie. De praktische kennis verworven van beheersen deze techniek kan ook nuttig voor het verrijken Ag-specifieke CD8 + T-cellen als onderdeel van functionele studies en voor het toezicht CD8 + T-cel responsen in verschillende ziektetoestanden instellingen 6 zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij willen graag David Watkins bedanken voor de ondersteuning van de experimenten die de optimalisatie van de huidige methodiek ingeschakeld. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd mede ondersteund door een pilot subsidie verstrekt door de Miami Center for AIDS Research van de National Institutes of Health onder award nummer P30AI073961. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
