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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

सिमीयन इम्यूनो वायरस-विशिष्ट CD8 का विश्लेषण Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54881
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Miami

Summary

यहाँ, हम एड्स के वायरस के खिलाफ की गणना और रीसस मकाक सीडी 8 + टी कोशिकाओं निस्र्पक के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस लेख उपयोगी न केवल एचआईवी प्रतिरक्षा विज्ञान के क्षेत्र में, लेकिन यह भी जहां सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया रोग परिणाम को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है जैव चिकित्सा अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों के लिए है।

Abstract

पेप्टाइड प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग मैं (pMHC I) tetramers सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण किया गया है। क्योंकि इन अभिकर्मकों सीधे सीडी 8 + टी lymphocytes की सतह पर टी सेल रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य, fluorochrome लेबल pMHC-मैं tetramers प्रतिजन का सही पता लगाने (एजी) में इन विट्रो पुनः के लिए आवश्यकता के बिना विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को सक्षम -stimulation। इसके अलावा, जब बहु रंग के साथ संयुक्त प्रवाह cytometry, pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला भेदभाव मंच, स्मृति phenotype, और सक्रियण स्थिति सहित एजी-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रमुख पहलुओं, प्रकट कर सकते हैं। विश्लेषण के इन प्रकार के एचआईवी प्रतिरक्षा विज्ञान के क्षेत्र में विशेष रूप से उपयोगी गया है, जहां सीडी 8 + टी कोशिकाओं को एड्स प्रगति को प्रभावित कर सकते हैं। बंदर इम्यूनो वायरस से रीसस मकाक (SIV) की प्रायोगिक संक्रमण एड्स वायरस के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा में अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करता है। नतीजतन, काफी progreएसएस इस पशु मॉडल में परिभाषित करने और टी सेल प्रतिक्रिया निस्र्पक में किया गया है। यहाँ हम pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला द्वारा रीसस मकाक में SIV विशेष सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गणना के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे। हमारे परख परीक्षण प्रति दो pMHC-मैं tetramer + सीडी 8 + टी सेल आबादी है, जो ट्रैकिंग SIV विशेष सीडी 8 + टी सेल टीकाकरण या SIV संक्रमण से उत्पन्न प्रतिक्रिया के लिए उपयोगी हो सकता है के एक साथ मात्रा का ठहराव और स्मृति phenotyping परमिट। जैव चिकित्सा अनुसंधान में nonhuman प्राइमेट की प्रासंगिकता को देखते हुए, इस पद्धति कई रोग सेटिंग्स में सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए लागू है।

Introduction

के रूप में वे ट्यूमर प्रतिरक्षा निगरानी में भाग लेने और intracellular रोगजनकों 1 के उन्मूलन के लिए योगदान सीडी 8 + टी कोशिकाओं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के एक महत्वपूर्ण घटक शामिल हैं। सरल शब्दों में, सीडी 8 + टी कोशिकाओं टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) है कि विशेष रूप से पेप्टाइड प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग मैं (pMHC-आई) को पहचान अणुओं मेजबान कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर उपस्थित व्यक्त करते हैं। चूंकि इन पेप्टाइड्स endogenously संश्लेषित प्रोटीन के प्रोटियोलिसिस से निकाली गई है, कोशिका की सतह pMHC-मैं परिसरों intracellular माहौल में एक खिड़की प्रदान करते हैं। वायरस के संक्रमण पर, उदाहरण के लिए, संक्रमित कोशिकाओं MHC-मैं वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड्स कि सीडी 8 + टी कोशिकाओं गश्त द्वारा व्यक्त TCRs के लिए ligands के रूप में सेवा कर सकते हैं युक्त अणुओं को प्रदर्शित करेगा। घटना एक वायरस-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल एक संक्रमित कोशिका अपने pMHC-मैं ligand पेश मुठभेड़ों में, TCR सगाई सीडी 8 + टी सेल सक्रियण और ulti में परिणाम होगाmately सेल को लक्षित करने के लिए नेतृत्व। इन TCR / pMHC-मैं बातचीत की गंभीर प्रकृति को देखते हुए, का निर्धारण करने के परिमाण, विशिष्टता, और सीडी 8 + टी कोशिकाओं जवाब के phenotype अक्सर मानव रोगों के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रकट कर सकते हैं।

1990 के दशक तक, एजी-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव तकनीकी रूप से मांग सीमित कमजोर पड़ने परख (झील प्राधिकरण) 2,3 पर भरोसा किया। इतना ही नहीं कई दिनों झील प्राधिकरण की आवश्यकता थी पूरा किया जाना है, यह भी कोशिकाओं है कि proliferative संभावित कमी रह गई थी पता लगाने में नाकाम रहे। नतीजतन, झील प्राधिकरण बेहद प्रतिजन (एजी) विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भाग लेने के वास्तविक आवृत्ति कम करके आंका। हालांकि ELISPOT और intracellular साइटोकाइन धुंधला assays के विकास के बहुत सेलुलर प्रतिरोधक क्षमता को मापने के लिए क्षमता में सुधार, इन तरीकों अभी भी एजी विशेष टी-कोशिकाओं 4 बढ़ाता के लिए इन विट्रो में उत्तेजना की आवश्यकता है। यह 1996 है कि Altman, डेविस, और coll तक नहीं थाeagues प्रकाशित उनकी ऐतिहासिक लेख pMHC-मैं टेट्रामर प्रौद्योगिकी 5 के विकास रिपोर्टिंग। इस तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण pMHC-मैं अणु है, जो TCR / pMHC-मैं बातचीत के आधे-जीवन बढ़ाया है, जिससे प्रवाह cytometric assays के कदम धोने के दौरान गिरने pMHC-मैं tetramers की संभावना को कम करने के multimerization था। ऊपर उल्लिखित assays के ऊपर pMHC-मैं tetramers का मुख्य लाभ यह सही इन विट्रो फिर से उत्तेजना के लिए आवश्यकता के बिना सीधे पूर्व vivo एजी-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का पता लगाने की क्षमता है। इसके अलावा, बहु रंग के साथ pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला के संयोजन cytometry भेदभाव मंच, स्मृति phenotype, और एजी- विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं 2-4 के सक्रियण की स्थिति का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति दी गई प्रवाह। द्वारा सीडी 8 + टी सेल repertoires निस्र्पक के लिए हाल ही में तकनीकी प्रगति के प्रकाश में pMHC-पास 6 धुंधला हो multimer, के लिए आवेदनों की चौड़ाईआर इस पद्धति का विस्तार जारी होने की संभावना है।

जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में कुछ क्षेत्रों में एचआईवी इम्यूनोलॉजी 7 के क्षेत्र से pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला से अधिक लाभ हुआ है। सीडी 8 + टी कोशिकाओं अस्थायी Altman, डेविस, और उनके सहयोगियों द्वारा 8,9 प्रकाशन के समय से एचआईवी viremia की प्रारंभिक नियंत्रण के साथ संबद्ध किया गया था, हालांकि, आगामी वर्षों में pMHC-मैं tetramers का उपयोग काफी की हमारी समझ का विस्तार एचआईवी विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया। उदाहरण के लिए, pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला सबसे एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों 10-12 में वायरस-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया के मजबूत आकार की पुष्टि की मदद की। इस पद्धति भी MHC-मैं एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी-एक "कुलीन नियंत्रण" के रूप में जाना जाता घटना के अभाव में वायरल प्रतिकृति की सहज नियंत्रण के साथ जुड़े अणुओं द्वारा प्रतिबंधित एचआईवी और SIV विशेष सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया के लक्षण वर्णन में मदद की + टी कोशिकाओं की बेकार phenotype के लिए एक प्रतिवर्ती मार्ग के रूप में क्रमादेशित मौत 1 (पीडी -1) / पीडी ligand 1 (पीडी-एल 1) अक्ष स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी 16,17। सामूहिक रूप से, इन अध्ययनों एड्स वायरस के खिलाफ सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए pMHC-मैं tetramers की उपयोगिता को रेखांकित।

रीसस मकाक (macaca mulatta) की प्रायोगिक SIV संक्रमण एचआईवी / एड्स के खिलाफ 18,19 प्रतिरक्षा हस्तक्षेप के मूल्यांकन के लिए सबसे अच्छा पशु मॉडल बनी हुई है। पिछले 25 वर्षों में, पर्याप्त प्रगति इस बंदर प्रजाति में पहचान और SIV विशेष सीडी 8 + टी कोशिकाओं के लक्षण वर्णन में किया गया है, MHC-मैं alleles की खोज और पेप्टाइड बाध्यकारी रूपांकनों 13,20-27 की परिभाषा सहित । नतीजतन, pMHC-मैं tetramers SIV विशेष सीडी 8 + टी सेल के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया हैइस पशु मॉडल 28 में हिमायती हैं। मामू-A1 * 002 मामू-A1 * 001,: 01: इन अभिकर्मकों के अधिकांश चार रीसस मकाक MHC-मैं alleles के जीन उत्पादों से बना रहे हैं 01, मामू-बी * 008: मामू-बी * 017 01, और। ध्यान से, रीसस मकाक एक MHC-सी लोकस 29 व्यक्त नहीं करते। वर्तमान प्रयोगों में इस्तेमाल pMHC-मैं tetramers के विशाल बहुमत के इमोरी विश्वविद्यालय में एनआईएच tetramer कोर सुविधा पर तैयार किए गए। फिर भी, इन अभिकर्मकों कुछ, मामू-A1 * 001 tetramers immunodominant चुप CM9 मिलान के लिए बाध्य सहित, केवल लाइसेंस समझौतों के कारण वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है। चार रीसस मकाक alleles का उपयोग करना pMHC-मैं tetramers ऊपर सूचीबद्ध है, हम सफलतापूर्वक 21 SIV epitopes (तालिका 1) के एक कुल, जो टीकाकरण या प्राथमिक SIV संक्रमण 30,31 (मार्टिंस एट द्वारा प्रेरित किया गया खिलाफ सीडी 8 + टी कोशिकाओं प्रगणित है अल।, अप्रकाशित टिप्पणियों)।

वर्तमान पांडुलिपि एक प्रदान करता हैरीसस मकाक में SIV विशेष सीडी 8 + टी कोशिकाओं की आवृत्ति और स्मृति phenotype का निर्धारण करने के लिए अनुकूलित pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला प्रोटोकॉल। आदेश TCR internalization कम होती है और जिससे में सुधार pMHC-मैं 32 धुंधला हो tetramer करने के लिए, परख एक प्रोटीन kinase अवरोध (यहाँ, Dasatinib प्रयोग किया जाता है PKI) के साथ एक वैकल्पिक 30 मिनट ऊष्मायन के साथ शुरू होता है। 01 tetramers: जैसा कि नीचे वर्णित है, इस उपचार में विशेष रूप से उपयोगी है जब का उपयोग कर मामू-बी * 017 है। कैसे fluorochrome संयुग्मित pMHC-मैं tetramers और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS) के साथ कोशिकाओं लेबल करने के निर्देश भी प्रदान की जाती हैं। इस प्रोटोकॉल भी cytolysis जुड़े अणु granzyme बी (GZM बी) के intracellular का पता लगाने के लिए एक सेल permeabilization कदम भी शामिल है। CD3 के खिलाफ एमएबी इस कदम पर जोड़ा जाता है के रूप में अच्छी तरह से इस TCR संकेत अणु का पता लगाने में सुधार होगा। एक संदर्भ के रूप में, यह धुंधला पैनल में कार्यरत सभी fluorochromes सूचीबद्ध हैं।

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Protocol

परिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMC) इस पांडुलिपि में उपयोग के नमूने विस्कॉन्सिन नेशनल प्राइमेट रिसर्च सेंटर में रखे भारतीय रीसस मकाक से प्राप्त किया गया। इन जानवरों को एक प्रोटोकॉल विस्कॉन्सिन ग्रेजुएट स्कूल पशु की देखभाल और उपयोग समिति 33 के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित के तहत Weatherall रिपोर्ट के अनुसार देखभाल कर रहे थे। सभी पशु प्रक्रियाओं संज्ञाहरण के तहत किया गया था और सभी प्रयासों संभावित पीड़ा को कम करने के लिए किए गए थे।

1. PKI उपचार

नोट: 01 tetramers: यह वैकल्पिक है, लेकिन के लिए मामू-बी * 017 की सिफारिश की है। परिणाम और चर्चा अनुभाग देखें।

  1. 1.6 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में R10 मध्यम में Resuspend PBMC।
  2. नलियों cytometry इसी प्रवाह करने के लिए इस सेल निलंबन के 50 μl जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब PKI की एक 100 एनएम समाधान के 50 μl जोड़ें।
  3. प्रत्येक ट्यूब भंवर। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इस के अंत तककदम, प्रत्येक ट्यूब युक्त 8.0 x 10 5 PBMC और PKI के 50 एनएम एक सेल निलंबन के 100 μl होना चाहिए।
  4. pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला कदम के लिए आगे बढ़ें।

2. Fluorochrome लेबल pMHC-मैं tetramers साथ धुंधला

  1. तैयारी से पहले pMHC-मैं मास्टर मिश्रण, अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर pMHC-मैं टेट्रामर नलियों tetramer। इस कदम का लक्ष्य pMHC-मैं टेट्रामर समाधान है कि पृष्ठभूमि धुंधला वृद्धि हो सकती है में प्रोटीन समुच्चय गोली है। एक बार centrifugation कदम से किया जाता है, ट्यूब जहां प्रोटीन समुच्चय जमा है जाएगा के नीचे से pipetting से बचें।
  2. सभी प्रयोगात्मक ट्यूबों के दाग के लिए पर्याप्त pMHC-मैं टेट्रामर मास्टर मिश्रण तैयार करें। त्रुटि pipetting के लिए खाते में इस मास्टर मिश्रण की कुल मात्रा का 15% की एक अतिरिक्त तैयार करें।
  3. इतने दाग पतला बफर (जैसे, बहुत खूब दाग बफर) में pMHC-मैं tetramers कि pMHC-मैं tetramer मास्टर मिश्रण के 25 μl Adde हैंप्रत्येक परीक्षा के लिए डी।
    1. परीक्षण प्रति दो pMHC-मैं tetramers के साथ लेबल PBMC; एक allophycocyanin संयुग्मित (एपीसी) और खूब वायलेट (बीवी) 421 करने के लिए अन्य।
  4. 100 μl के अंतिम मात्रा में ट्यूबों cytometry इसी प्रवाह के लिए 8.0 x 10 5 PBMC जोड़ें। यदि कोशिकाओं ऊपर वर्णित PKI इलाज के लिए किए गए थे, वे पहले से ही इस कदम पर 100 μl में resuspended किया जाना चाहिए।
  5. 25 μl जोड़े pMHC-मैं नलियों cytometry इसी प्रवाह करने के लिए मास्टर मिश्रण tetramer। इस कदम के अंत तक, प्रत्येक ट्यूब में अंतिम मात्रा 125 μl होना चाहिए।
  6. क्रम में सेल निलंबन homogenize करने के लिए प्रत्येक ट्यूब भंवर।
  7. 45 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर अंधेरे में सेते हैं। इस 45 मिनट ऊष्मायन के दौरान सतह धुंधला एमएबी कॉकटेल तैयार करें।

3. सतह धुंधला

  1. सभी प्रयोगात्मक ट्यूबों के दाग के लिए पर्याप्त एमएबी मास्टर मिश्रण तैयार करें। खाते में इस मास्टर मिश्रण की कुल मात्रा का 15% की एक अतिरिक्त तैयारत्रुटि pipetting के लिए।
  2. दाग बफर के साथ मास्टर मिश्रण की मात्रा इतनी है कि 50 μl परीक्षण प्रति जोड़ रहे हैं समायोजित करें।
  3. गैर-सीडी 8 + टी कोशिकाओं के समुचित बहिष्कार और स्मृति कैंपेन्स के चित्रण के लिए, उपयोग titrated सतह धुंधला मास्टर मिश्रण में निम्नलिखित अणुओं के खिलाफ निर्देशित Mabs की मात्रा।
    नोट: CD14 बी.वी. 510, CD16 बी.वी. 510, CD20 बी.वी. 510, CD8α बी.वी. 785, CD28 पीई Cy7, और CCR7 FITC: प्रत्येक MABS संयुग्मित fluorochromes एक संदर्भ के रूप में प्रदान की जाती हैं। ध्यान दें कि CD14, CD16, और CD20 के खिलाफ MABS ही fluorochrome (यानी, बी.वी. 510) के बाद से वे 'डंप' गेट में शामिल किया जाएगा संयुग्मित हैं।
  4. सतह धुंधला मास्टर मिश्रण में मृत कोशिकाओं भेदभाव के लिए एक फिक्स रंग शामिल है [यानी, एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई (एआरडी)]। सुनिश्चित करें कि एआरडी अभिकर्मक 'डंप' गेट में इस्तेमाल लोगों के रूप में एक समान उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ एक fluorochrome संयुग्मित है सुनिश्चित करें। इस मामले में, एआरडी एक्वा का उपयोग करें।
  5. के 50 μl जोड़ेधुंधला मास्टर मिश्रण नलियों cytometry इसी प्रवाह के लिए 3.1-3.4 में वर्णित है। इस कदम के अंत तक, प्रत्येक ट्यूब में अंतिम मात्रा 175 μl होना चाहिए।
  6. प्रत्येक ट्यूब भंवर। 25 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर अंधेरे में सेते हैं।
  7. धोने बफर के साथ कोशिकाओं (पीबीएस गोजातीय सीरम albumin के 0.1% और 0.45 छ / एल NaN 3 युक्त समाधान) धो लें।
    चेतावनी: सोडियम azide एक जहरीले पदार्थ है। यहां तक ​​कि मिनट मात्रा के संपर्क में लक्षण पैदा कर सकता है। दिशा निर्देशों संस्था जहां इन प्रयोगों का प्रदर्शन किया जा रहा है पर पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा (EHS) कार्यालय द्वारा निर्दिष्ट के अनुसार इस पदार्थ संभाल लेना।
  8. 5 मिनट के लिए 510 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। ध्यान से एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला छानना। गोली परेशान नहीं सुनिश्चित करें।
    चेतावनी: ब्लीच युक्त जलाशयों में धो बफर सतह पर तैरनेवाला छानना के रूप में यह धोने बफर में सोडियम azide वर्तमान के साथ प्रतिक्रिया और एक जहरीले गैस 34 के गठन में परिणाम कर सकते हैं मत करो। सीसंस्था जहां इन प्रयोगों कैसे सोडियम azide के निपटान के लिए दिशा-निर्देशों के लिए किया जा रहा है पर EHS कार्यालय ontact।
  9. decanting के बाद बचे हुए तरल प्रत्येक ट्यूब में बनाए रखा कोशिकाओं में भंवर।

4. सेल फिक्सेशन

  1. सभी ट्यूबों के लिए एक 2% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान के 250 μl जोड़े कोशिकाओं को ठीक करने के लिए।
    चेतावनी: पीएफए ​​एक जहरीले पदार्थ है। यहां तक ​​कि मिनट मात्रा के संपर्क में लक्षण पैदा कर सकता है। दिशा निर्देशों संस्था जहां इन प्रयोगों का प्रदर्शन किया जा रहा है पर EHS कार्यालय द्वारा निर्दिष्ट के अनुसार इस पदार्थ संभाल लेना।
    1. के बाद से 2% पीएफए ​​समाधान कोशिकाओं को isotonic होना चाहिए, पीबीएस का उपयोग इस समाधान तैयार करने के लिए। एक 2% पीएफए ​​समाधान की एक सौ मिलीलीटर कई प्रयोगों के लिए पर्याप्त है। अच्छी तरह से तुरंत क्रम में सेल समुच्चय के गठन को रोकने के लिए 2% पीएफए ​​के अलावा के बाद सभी ट्यूबों भंवर।
  2. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं।
  3. डब्ल्यूकदम 3.7-3.9 दोहरा द्वारा राख कोशिकाओं। एक बार यह कदम पूरा हो गया है, कोशिकाओं 24-48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखा जा सकता है। Permeabilization चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले, अच्छी तरह से ट्यूबों के भंवर।

5. प्रकोष्ठों के Permeabilization

  1. permeabilization बफर के 500 μl जोड़ें। भंवर सभी ट्यूबों।
  2. 10 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर अंधेरे में सेते हैं।
  3. कदम 3.7-3.9 दोहरा द्वारा कोशिकाओं को धो लें।

6. Intracellular धुंधला

  1. सभी प्रयोगात्मक ट्यूबों के दाग के लिए पर्याप्त एमएबी मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  2. पीबीएस के साथ मात्रा या दाग बफर इतना है कि intracellular एमएबी मास्टर मिश्रण के 50 μl परीक्षण प्रति जोड़ रहे हैं समायोजित करें।
  3. एमएबी मास्टर मिश्रण 6.1 और 6.2 में वर्णित तैयार का उपयोग कर titrated CD3 और GZM बी के खिलाफ निर्देशित Mabs की मात्रा
    नोट: pMHC-मैं tetramers द्वारा TCR सगाई CD3 internalization, जो tetramer + CD3 + सीडी 8 का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं + में परिणाम कर सकते हैंटी-कोशिकाओं विरोधी CD3 एमएबी सतह धुंधला मास्टर मिश्रण में जोड़ा जाता है। इससे बचने के लिए, इस स्तर है, उस पर विरोधी CD3 एमएबी जोड़ने के बाद कोशिकाओं permeabilized रहे हैं। CD3 PerCP Cy5.5 और GZM बी पीई: प्रत्येक एमएबी संयुग्मित fluorochromes एक संदर्भ के रूप में सूचीबद्ध हैं।
  4. इसी ट्यूबों के लिए एमएबी कॉकटेल के 50 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे में अस्थायी पर अंधेरे में सेते हैं।
  5. कदम 3.7-3.9 दोहरा द्वारा कोशिकाओं को धो लें। नलियों कोशिकामापी एक प्रवाह में प्राप्त किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक मामू-A1 * 001 + रीसस मकाक में टीका-प्रेरित, चुप CM9 विशेष सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया की भयावहता और स्मृति phenotype निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस विश्लेषण के लिए, एक एपीसी संयुग्मित मामू-A1 * 001 / चुप CM9 टेट्रामर एक 8 रंग प्रवाह cytometric धुंधला पैनल में इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 1 ए - एफ gating डेटा है, जो प्रत्येक परीक्षा में मौजूद दोनों tetramers के लिए लागू किया जाना चाहिए विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया रणनीति से पता चलता। ध्यान दें कि pMHC-मैं tetramer + सीडी 8 + टी सेल की आबादी में अच्छी तरह से कम से कम पृष्ठभूमि (आंकड़े 1F और जी) के साथ अलग किया जाता है। (; CD28 + CCR7 + टी मुख्यमंत्री), संक्रमणकालीन स्मृति (टी EM1; CD28 + CCR7-), और प्रेरक केंद्रीय स्मृति: रीसस मकाक में स्मृति सीडी 8 + टी कोशिकाओं CD28 और CCR7 की सतह अभिव्यक्ति के आधार पर तीन सबसेट के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता स्मृति (टी EM2; CD28-CCR7-) 35।इस प्रोटोकॉल भी GZM बी और CD3 के intracellular का पता लगाने के लिए एक सेल permeabilization कदम भी शामिल है। चित्रा 1G - मैं tetramer + फाटक के भीतर स्मृति सबसेट और GZM बी व्यक्त सीडी 8 + टी कोशिकाओं के चित्रण से पता चलता है।

पृष्ठभूमि धुंधला pMHC-मैं टेट्रामर लेबलिंग assays में सबऑप्टिमल परिणाम निकल सकते हैं। इससे बचने के लिए, कुछ सावधानियों का सुझाव दिया है। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में कहा गया है, pMHC-मैं टेट्रामर अभिकर्मकों युक्त शीशियों हमेशा कम से कम 15 मिनट के मास्टर घोला जा सकता है की तैयारी के लिए पहले के लिए 20,000 XG पर centrifuged किया जाना चाहिए। इस कदम का लक्ष्य किसी भी प्रोटीन समुच्चय है कि pMHC-मैं टेट्रामर समाधान में हो सकता गोली है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक अभिकर्मक का उपयोग करने से पहले titrating भी सिफारिश की है। आदर्श रूप में, MHC-मैं से मिलान कोशिकाओं है कि क्या करना है या शामिल नहीं है ब्याज की एजी-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल की आबादी प्रासंगिक pMHC-मैं टेट्रामर के साथ लेबल किया जाना चाहिए। इस CAn एक नव प्राप्त pMHC-मैं टेट्रामर के विभिन्न मात्रा के साथ कंधे से SIV भोले (नकारात्मक नियंत्रण) और SIV संक्रमित (सकारात्मक नियंत्रण) मकाक तरफ से cryopreserved PBMC धुंधला द्वारा पूरा किया जा सकता है। चित्रा 2 में, उदाहरण के लिए, 1.0 μl / एक एपीसी संयुग्मित मामू-बी * 008 का परीक्षण: 01 / Nef RL10 टेट्रामर टेट्रामर सकारात्मक और नकारात्मक सीडी 8 + टी सेल आबादी के बीच सबसे अच्छा जुदाई झुकेंगे। अन्त में fluorochrome का चुनाव भी काफी pMHC-मैं टेट्रामर stainings से प्राप्त परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। इस संबंध में pMHC-मैं tetramers अणु (जैसे, fluorescein) मंद करने के लिए बचा जाना चाहिए संयुग्मित। हमारे अनुभव में, pMHC-मैं इस तरह के पीई, एपीसी, और बी.वी. 421 के रूप में उज्ज्वल fluorochromes, संयुग्मित tetramers, सबसे अच्छा परिणाम सामने आए हैं।

हमने देखा है कि मामू-बी * 017: 01 tetramers आम तौर पर मंद धुंधला निकलेगा, तब भी जब उज्ज्वल ऊपर उल्लेख किया fluorochromes संयुग्मित। इस के लिए कारणोंकम प्रतिदीप्ति तीव्रता पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हैं, लेकिन कम आत्मीयता TCR / मामू-बी * 017 में शामिल हो: 01 बातचीत और टेट्रामर बाध्यकारी 36,37 पर तेजी से TCR internalization। इन पंक्तियों के साथ, PKIs सीडी 8 + टी कोशिकाओं 32 की सतह पर TCR internalization को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। नतीजतन, PKIs pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला द्वारा एजी-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का पता लगाने में सुधार कर सकते हैं। हम अपने प्रयोगों में इस आशय की पुष्टि की है, जहां मामू-बी की गुणवत्ता * 017: 01 टेट्रामर stainings काफी हद तक पूर्व के इलाज के लिए एक PKI के साथ PBMC (चित्रा 3) द्वारा सुधार किया जा सकता है। मजे की बात है, इस PKI के साथ पूर्व उपचार काफी यहाँ परीक्षण (डेटा) नहीं दिखाया अन्य pMHC-मैं tetramers का धुंधला सुधार नहीं किया, सुझाव है कि मामू-बी * 017: 01-प्रतिबंधित सीडी 8 + टी कोशिकाओं को अपनी संवेदनशीलता में अद्वितीय हो सकता है PKI उपचार करने के लिए।

आकृति 1
चित्रा 1: gating रणनीति और एक सफल pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला के प्रतिनिधि परिणाम है। हम एक मामू-A1 * 001 + रीसस मकाक से PBMC में टीका प्रेरित चुप CM9 विशेष सीडी 8 + टी कोशिकाओं की भयावहता और स्मृति phenotype मूल्यांकन किया है। इधर, एक एपीसी संयुग्मित मामू-A1 * 001 / चुप CM9 टेट्रामर एक 8 रंग प्रवाह cytometric धुंधला पैनल में इस्तेमाल किया गया था। (ए - एफ) प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए gating रणनीति। सबसे पहले, तिरछे क्लस्टर singlets पर एक गेट एफएससी क्षेत्र (एफएससी-ए) और फिर ओर तितर बितर ऊंचाई (एसएससी-एच) एसएससी क्षेत्र बनाम बनाम आगे तितर बितर ऊंचाई (एफएससी-एच) साजिश रचने के द्वारा बनाया गया था (एसएससी-ए, ए और बी) । अगले, एक समय गेट बनाया गया था कि केवल उन घटनाओं है कि 5 वें और 90 वें शतमक के भीतर दर्ज किया गया शामिल थे। जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं फिर "डंप चैनल" नकारात्मक, CD3 + कोशिकाओं (सी और डी) gated थे। इस स्तर पर,लिम्फोसाइट आबादी अपनी एफएससी-ए और एसएससी-ए गुणों के आधार पर चित्रित किया गया था और बाद के विश्लेषण सीडी 8 + कोशिकाओं (ई और एफ) के भीतर आयोजित की गई। PMHC-मैं tetramer + कोशिकाओं (G) की रूपरेखा तैयार करने के बाद, स्मृति phenotyping विश्लेषण इस गेट (एच) के भीतर प्रदर्शन किया गया था। (; CD28 + CCR7 + टी मुख्यमंत्री), संक्रमणकालीन स्मृति (टी EM1; CD28 + CCR7-), और प्रेरक स्मृति (टी EM2 केंद्रीय स्मृति: रीसस मकाक स्मृति टी कोशिकाओं CD28 और CCR7 की अभिव्यक्ति के आधार पर तीन सबसेट में वर्गीकृत किया जा सकता है ; CD28-CCR7-)। वर्तमान प्रोटोकॉल भी granzyme बी (GZM बी) tetramer + सीडी 8 + टी कोशिकाओं (मैं) के भीतर अभिव्यक्ति के intracellular मूल्यांकन के लिए एक सेल permeabilization कदम भी शामिल है। हिस्टोग्राम में छायांकित क्षेत्र tetramer + सीडी 8 + टी कोशिकाओं एक निर्धारण मिलान नियंत्रण एमएबी के साथ दाग से मेल खाती है। हालांकि बी.वी. 421 संयुग्मित tetramer + आबादी है कि इस धुंधला में उपस्थित किया गया हैचित्र में दिखाया गया है, एक ही gating रणनीति यह विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: 01 / Nef RL10 टेट्रामर: एक एपीसी संयुग्मित मामू-बी * 008 का अनुमापन के प्रतिनिधि परिणाम है। PBMC से दो मामू-बी * 008: 01+ रीसस मकाक इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया: एक जानवर SIV भोले था और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की अन्य SIV-संक्रमित किया गया था और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया है, जबकि। मामू-बी की राशि का निर्धारण करने के लिए * 008: 01 / Nef RL10 टेट्रामर कि tetramer + और tetramer- सीडी 8 + टी कोशिकाओं के बीच सबसे अच्छा जुदाई पैदावार, प्रत्येक जानवर से PBMC pMHC-मैं टेट्रामर अभिकर्मक की मात्रा के साथ संकेत दिया incubated रहे थे। इन परिणामों के आधार पर, 1.0 μl / परीक्षण वाअधिकतम राशि के रूप में चुना भविष्य assays में इस्तेमाल किया जाएगा। Gating डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग रणनीति चित्रा 1 में वर्णित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: 01 tetramers: मामू-बी * 017 के प्रतिदीप्ति तीव्रता पर PKI उपचार के प्रभाव। PKI अवरोध TCR परिसरों के internalization को रोकता है और इस तरह fluorochrome लेबल pMHC-मैं tetramers 32 से एजी-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का पता लगाने में सुधार। (ए - बी) के दो मामू-बी से PBMC * 017: 01+ रीसस मकाक इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया: एक बंदर SIV भोले था और नकारात्मक नियंत्रण (ए) के रूप में कार्य किया है, जबकि अन्य SIV से संक्रमित किया गया था और के रूप में सेवासकारात्मक नियंत्रण (बी)। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में, 01 / Nef IW9 टेट्रामर: दोनों जानवरों से PBMC 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के एक एपीसी संयुग्मित मामू-बी * 017 साथ धुंधला करने से पहले के लिए 50 एनएम की एकाग्रता में PKI की उपस्थिति में incubated रहे थे । एक संदर्भ के रूप में, ट्यूब की एक और सेट है कि डाइमिथाइल sulfoxide को छोड़कर, एक ही ऊष्मायन और धुंधला शर्तों के अधीन था (DMSO) PKI के बजाय जोड़ा गया है। Gating डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग रणनीति चित्रा 1 में वर्णित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> मामू-A1 * 002: 01
SIV प्रोटीन एमिनो एसिड की स्थिति अमीनो एसिड अनुक्रम MHC वर्ग मैं अणु (नया नामकरण) MHC वर्ग मैं अणु (पुराने नामकरणई) मिलान शॉर्ट नाम
झूठ 181-189 CTPYDINQM मामू-A1 * 001 मामू-ए * 01 चुप CM9
झूठ 254-262 QNPIPVGNI मामू-A1 * 001 मामू-ए * 01 चुप QI9
झूठ 72-79 GSENLKSLY मामू-A1 * 001 मामू-ए * 01 चुप GY9
पर्यावरण 830-838 FHEAVQAVW मामू-बी * 017: 01 मामू-बी * 17 पर्यावरण FW9
पर्यावरण 233-241 CAPPGYALL मामू-A1 * 001 मामू-ए * 01 पर्यावरण Cl9
पर्यावरण 620-628 TVPWPNASL मामू-A1 * 001 मामू-ए * 01 पर्यावरण TL9
पर्यावरण 788-795 RTLLSRVY मामू-A1 * 002: 01 मामू-ए * 02 पर्यावरण RY8
पर्यावरण 296-304 RTIISLNKY मामू-A1 * 002: 01 मामू-ए * 02 पर्यावरण RY9
Vif 123-131 RRAIRGEQL मामू-बी * 008: 01 मामू-बी * 08 Vif RL9
Vif 173-181 RRDNRRGL मामू-बी * 008: 01 मामू-बी * 08 Vif RL8
Vif 66-73 HLEVQGYW मामू-बी * 017: 01 मामू-बी * 17 Vif HW8
Vif 100-109 VTPNYADILL मामू-A1 * 001 मामू-ए * 01 Vif VL10
Vif 97-104 WTDVTPNY मामू-A1 * 002: 01 मामू-ए * 02 Vif WY8
फिरना 13-22 KRLRLIHLL मामू-बी * 008: 01 मामू-बी * 08 रेव KL9
गूंथना 28-35 STPESAML मामू-A1 * 001 मामू-ए * 01 गूंथना SL8
एनईएफ 137-146 RRHRILDIYL मामू-बी * 008: 01 मामू-बी * 08 एनईएफ RL10
एनईएफ 246-254 RRLTARGLL मामू-बी * 008: 01 मामू-बी * 08 एनईएफ RL9b
एनईएफ 8-16 RRSRPSGDL मामू-बी * 008: 01 मामू-बी * 08 एनईएफ RL9a
एनईएफ 165-173 IRYPKTFGW मामू-बी * 017: 01 मामू-बी * 17 एनईएफ IW9
एनईएफ 195-203 MHPAQTSQW मामू-बी * 017: 01 मामू-बी * 17 एनईएफ MW9
एनईएफ 159-167 YTSGPGIRY मामू-ए * 02 एनईएफ YY9

तालिका 1: pMHC-मैं रीसस मकाक में SIV विशेष सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए उपलब्ध tetramers की सूची।

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Discussion

इस प्रक्रिया योग्यता चर्चा में कुछ कदम वे इष्टतम परिणाम उपज के लिए महत्वपूर्ण हैं के रूप में। सबसे पहले, के बाद से जैविक नमूनों की गुणवत्ता में किसी भी प्रवाह cytometric परख 38 की सफलता का एक मजबूत कारक है, सभी देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को धुंधला प्रक्रिया के दौरान व्यवहार्य और निलंबन में हैं लिया जाना चाहिए। यह विशेष रूप से प्रासंगिक है जब cryopreserved नमूनों के साथ काम करने के बाद से वे और अधिक clumping से ग्रस्त हैं और आम तौर पर मृत कोशिकाओं की अधिक संख्या में होते है। इन मामलों में, pMHC-मैं टेट्रामर लेबलिंग प्रक्रिया से पहले एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन गुजर काफी परिणामों में सुधार हो सकता है। दूसरा, परख में कार्यरत fluorochromes का उचित मुआवजा खासकर जब कई मापदंडों को ही प्रयोग में मूल्यांकन किया जा रहा है सटीक डाटा के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। इस संबंध में यह सिफारिश की है कि ताजा एकल रंग मुआवजा नियंत्रण हर pMHC-मैं टेट्रामर एस के लिए तैयार रहनापरख taining। हम उनके व्यापक विरोधी पुलिस महानिरीक्षक जेट और तथ्य यह है कि वे सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के स्पष्ट bimodal वितरण उपज की वजह से मुआवजा मोतियों के उपयोग के पक्ष में। चूंकि इन मोतियों MHC-मैं अणुओं के लिए बाध्य नहीं है, एंटीबॉडी pMHC-मैं tetramers (जैसे, एपीसी और बी.वी. 421) के रूप में एक ही fluorophores मुआवजा नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए संयुग्मित। इस तरह के मुआवजे मोतियों की कई कई विक्रेताओं से उपलब्ध हैं और निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए। तीसरा, phenotyping रणनीति यहाँ वर्णित सीडी 8 + टी सेल तीन अणुओं (यानी, CD28, CCR7, और GZM बी), इस तरह के प्रतिदीप्ति शून्य से एक के रूप में gating नियंत्रण, (FMO) परीक्षणों के वर्गीकृत अभिव्यक्ति पर आधारित कैंपेन्स के चित्रण की आवश्यकता के बाद से या निर्धारण मिलान एंटीबॉडी, विश्लेषण के इन प्रकार की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हमारे प्रयोगों में, उदाहरण के लिए, अलग नलियों pMHC-मैं tetramer + ब्याज की सीडी 8 + टी सेल की आबादी वालेफिर हमेशा की तरह, CD28, CCR7, और GZM बी महत्वपूर्ण बात खिलाफ MABS के रूप में ही fluorochromes संयुग्मित निर्धारण नियंत्रण MABS के साथ दाग हालांकि ऊपर उल्लिखित दिशा निर्देशों के समग्र गुणवत्ता में सुधार लाने में मदद कर सकता pMHC-मैं stainings tetramer, वे न केवल चर रहे हैं कि इस परख के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं। हर प्रयोगशाला की स्थापना की विशिष्टता को देखते हुए पूरे यहाँ वर्णित कार्यप्रवाह अभ्यास और प्रासंगिक समायोजन के लिए अनुमति देने के लिए नकली नमूने पर कम से कम एक बार किया जाना चाहिए।

मजे की बात है, pMHC-मैं tetramer सकारात्मक सीडी 8 + टी कोशिकाओं कभी कभी SIV भोले (असंक्रमित और unvaccinated) रीसस मकाक से PBMC में मनाया जाता है। इन मामलों में डेटा के दृश्य निरीक्षण के आधार पर पृष्ठभूमि धुंधला का परिणाम होना प्रकट नहीं करते। बल्कि, वे pMHC-मैं अणुओं और हत्यारा इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर्स (Kirs) के बीच बातचीत को प्रतिबिंबित हो सकता रीसस मकाक एन.के. और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की सतह पर 3 व्यक्त9,40। दरअसल, मामू-A1 * 002: 01 tetramers चुप GY9 और पर्यावरण RY8 epitopes के लिए इसी पेप्टाइड्स के साथ जोड़कर मामू-KIRDL05 39 करने के लिए बाध्य करने के लिए दिखाया गया है। इन पंक्तियों के साथ, मामू-A1 * 002: 01 / चुप GY9 और मामू-A1 * 002: 01 / पर्यावरण RY8 अधिक एजी स्वतंत्र pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला ऊपर वर्णित प्रदर्शन से ग्रस्त हैं। इस घटना को देखते हुए यह बंदर संक्रमण या टीकाकरण के बाद SIV विशेष सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य आकलन से जुड़े प्रयोगों में इस आधारभूत जेट के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, यह उपचार के पहले दिन प्राप्त नमूनों पर pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला प्रदर्शन करने की सलाह दी जाती है। यह भी मामला तुलना में इन प्रारंभिक समय बिंदुओं पर कई छोटे आकार aliquots में PBMC फ्रीज करने के साथ आधारभूत नमूने भविष्य प्रयोगों में जरूरत है उचित हो सकता है।

PMHC-मैं टेट्रामर धुंधला की एक सीमा है कि ज्ञात विशिष्टता और MHC-मैं प्रतिबंध सी की ही सीडी 8 + टी कोशिकाओंएक इस दृष्टिकोण से अध्ययन किया जा सकता है। यह उनकी एमएचसी लोकी के जटिल संगठन दिया रीसस मकाक में विशेष रूप से प्रासंगिक है। दरअसल, एक एकल रीसस मकाक haplotype MHC-मैं जीनों के दर्जनों हो सकता है, बिल्कुल भी नहीं है जो की अणुओं है कि स्थिरतापूर्वक कोशिका की सतह पर 29 सांकेतिक शब्दों में व्यक्त कर रहे हैं। नतीजतन, यह कार्यात्मक MHC-मैं किसी जानवर द्वारा व्यक्त अणुओं के सेट निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। 01, मामू-बी * 008: 01, और Mamu- फिर भी, इस चेतावनी के प्रयोगों है कि इस तरह के मामू-A1 * 001, मामू-A1 * के रूप में जाना जाता है कि बंदरों MHC-मैं alleles के लिए सकारात्मक रहे हैं, शामिल 002 डिजाइन द्वारा दूर किया जा सकता बी * 017: 01।

अंत में, इस पांडुलिपि रीसस मकाक में SIV विशेष सीडी 8 + टी कोशिकाओं की आवृत्ति और स्मृति phenotype का निर्धारण करने के लिए एक अनुकूलित pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला प्रोटोकॉल प्रदान करता है। चूंकि pMHC-मैं टेट्रामर धुंधला एजी-विशिष्ट सीडी 8 का पता लगाने के लिए IFN-γ ELISPOT और आईसीएस assays की तुलना में अधिक संवेदनशील है+ टी कोशिकाओं और इन विट्रो एजी उत्तेजना की आवश्यकता नहीं है, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रणाली इम्यूनो वायरस के संक्रमण के परिणाम में सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया के प्रभाव के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। व्यावहारिक ज्ञान इस तकनीक के माहिर से अर्जित भी कार्यात्मक अध्ययन के हिस्से के रूप में एजी-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को समृद्ध बनाने के लिए और विभिन्न रोग सेटिंग्स 6 में सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Acknowledgments

हम प्रयोगों कि वर्तमान कार्यप्रणाली के अनुकूलन सक्षम समर्थन करने के लिए डेविड वाटकिंस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। अनुसंधान इस प्रकाशन में सूचना के तहत पुरस्कार नंबर P30AI073961 राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के एड्स अनुसंधान के लिए मियामी में केंद्र द्वारा उपलब्ध कराई गई एक पायलट अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dasatinib Axon medchem Axon 1392 Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C
RPMI w/ Glutamax gibco/ Life Technologies 61870-036 Must be stored at 4 °C 
Heat Inactivated FBS gibco/ Life Technologies 10082-147 Must be stored at 4 °C 
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B Lonza 17-745E Must be stored at 4 °C 
DMSO, Anhydrous Life Technologies D12345 Store at room temperature.
5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes VWR 60819-728
Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers NIH Tetramer Core or MBL, Inc. Must be stored and maintained at  4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.
Fluorochrome-conjugated mAbs Various companies Must be stored and maintained at  4 °C. Do not freeze.
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies l34957 Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use.
Brilliant Stain Buffer BD Biosciences 563794 Must be stored at  4 °C 
Phosphate Buffered Saline VWR 97064-158 Store at room temperature
Albumine Bovine VWR 700011-230 Must be stored at  4 °C 
Sodium Azide VWR 97064-646 Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.
Bleach VWR 89501-620 Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care
Polysorbate 20 (Tween-20) Alfa Aesar L15029 Store at room temperature
Permeabilization Solution 2  BD Biosciences 340973 Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top VWR 72.692.005
2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes Eppendorf 22431048 The use of Sterile microtubes is preffered 
Vortex mixer To discretion of scientist
Biosafety Cabinet  To discretion of scientist
Milli Q Intergral Water Purification system EMD Millipore ZRXQ010WW Molecular Biology grade water from any provider may be used
Microcentrifuge To discretion of scientist
Centrifuge To discretion of scientist
4 °C  refrigerator To discretion of scientist
BD LSR II BD Biosciences Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Deionized water
Aluminum Foil VWR SCIENTIFIC INC. 89068-738
Incubator Must be able to maintain 37 °C  internal temperature
FACS Diva software BD Biosciences
Flowjo software version 9.6 Flowjo Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software
Micropippette tips

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 118 एमएचसी टेट्रामर टीका SIV रीसस मकाक
सिमीयन इम्यूनो वायरस-विशिष्ट CD8 का विश्लेषण<sup&gt; +</sup&gt; रीसस मकाक में टी-कोशिकाओं पेप्टाइड MHC-मैं tetramer धुंधला द्वारा
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Gonzalez-Nieto, L., Domingues, A.,… More

Gonzalez-Nieto, L., Domingues, A., Ricciardi, M., Gutman, M. J., Maxwell, H. S., Pedreño-Lopez, N., Bailey, V., Magnani, D. M., Martins, M. A. Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining. J. Vis. Exp. (118), e54881, doi:10.3791/54881 (2016).

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