Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54881
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Miami

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.

Abstract

פפטיד-מרכזי histocompatibility מורכבת אני בכיתה (pMHC-I) tetramers היה כלים רבים ערך כדי ללמוד CD8 + תגובות תאי T. בגלל ריאגנטים אלה ישירות לאגד קולטני תאי T על פני השטח של CD8 + לימפוציטים מסוג T, שכותרתו fluorochrome tetramers pMHC-לי לאפשר זיהוי מדויק של אנטיגן (Ag) -specific CD8 + T-תאים ללא צורך במבחנה מחדש -גְרִיָה. יתר על כן, בשילוב עם צבע רב cytometry זרימה, pMHC-לי tetramer מכתים יכול לחשוף היבטים מרכזיים של Ag ספציפי CD8 + T-תאים, כולל שלב התמיינות, פנוטיפ זיכרון, מצב ההפעלה. מחקרים מסוג זה כבר שימושי במיוחד בתחום האימונולוגיה HIV שבו CD8 + T-תאים יכולים להשפיע על התפתחות לאיידס. זיהום ניסיוני של קופי רזוס בנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) מספק כלי רב ערך כדי ללמוד חסינות הסלולר נגד נגיף האיידס. כתוצאה מכך, progre ניכרss נעשה בהגדרה ואפיון תגובות T-cell במודל חיה זו. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס ידי מכתים tetramer pMHC-לי. Assay שלנו מאפשר phenotyping כימות וזיכרון סימולטני של שתי אוכלוסיות pMHC-לי tetramer + CD8 + T-cell לכל מבחן, אשר יכול להיות שימושי לצורך מעקב תגובות SIV ספציפי CD8 + T-cell שנוצר על ידי חיסון או זיהום SIV. בהתחשב הרלוונטי של פרימטים לא אנושיים במחקר ביו, מתודולוגיה זו ישימה ללימוד תגובות CD8 + T-cell במסגרות מחלה נפוצה.

Introduction

CD8 + T-תאים מהווים מרכיב חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית כפי שהוא להשתתף מעקב חיסוני גידול ולתרום מיגור פתוגנים תאיים 1. במילות פשוטות, CD8 + T-תאים לבטא קולטנים T-cell (TCRs) כי דווקא מכירים בכיתה מורכבת histocompatibility-מרכזי פפטיד אני (pMHC-I) מולקולות נוכחיות מופעל על הממברנה של תאי מארחים. מאז פפטידים אלה נגזרים proteolysis של חלבונים מסונתזים באופן אנדוגני, pMHC-I פני תא מתחמים פותחים בפנינו צוהר אל הסביבה התאית. עם זיהום בנגיף, למשל, תאים נגועים יציגו מולקולות MHC-I המכילות פפטידים שמקורם וירוס שיכול לשמש ligands עבור TCRs שהביע מסיירי CD8 + T לתאים. במקרה וירוס ספציפי CD8 + T-cell פוגש תא נגוע ההצגה ליגנד pMHC-I שלה, מעורבות TCR תגרום CD8 + T-cell הפעלת ultimately להוביל למקד תמוגה התא. בהתחשב באופי הקריטי של אינטראקציות TCR / pMHC-לי אלה, לקביעת הגודל, הסגוליים פנוטיפ להגיב CD8 + T-תאים לעתים קרובות יכול לחשוף רמזים חשובים על מחלות אנושיות.

עד תחילת 1990, כימות של Ag ספציפי CD8 + T-תאי הסתמכה על assay דילול בדרישה להגביל טכנית (LDA) 2,3. לא זו בלבד LDA לדרוש כמה ימים להסתיים, זה גם לא הצליח לאתר תאים חסרי פוטנציאל שגשוג. כתוצאה מכך, LDA לזלזל בהרבה התדירות בפועל של אנטיגן (Ag) CD8 + T-תאי -specific השתתפות תגובה חיסונית. למרות הפיתוח של ELISPOT מבחני מכתים ציטוקינים תאיים מאוד שיפר את היכולת למדוד חסינות הסלולר, שיטות אלה עדיין יש צורך גירוי במבחנה לכימות Ag ספציפי מתאי T 4. זה לא היה עד 1996 אלטמן, דייויס, ואת הפיצוץeagues פרסם מאמר ציון הדרך שלהם ולדווח על ההתפתחות של טכנולוגית tetramer pMHC-לי 5. קריטי להצלחה של טכניקה זו הייתה multimerization של מולקולות pMHC-I, אשר האריך את זמן מחצית החיים של אינטראקציות TCR / pMHC-I, ובכך להפחית את ההסתברות של tetramers pMHC-לי ליפול במהלך השלבים כביסה של מבחני תזרים cytometric. היתרון העיקרי של tetramers pMHC-לי על מבחני הנ"ל היא היכולת לזהות במדויק Ag ספציפי CD8 + T-תאים ישירות vivo לשעבר ללא צורך גירוי מחדש במבחנה. מעבר לכך, השילוב של מכתים tetramer pMHC-לי עם צבע רב cytometry זרימה אפשר ניתוחים מפורטים של שלב הבידול, פנוטיפ זיכרון, מצב הפעלה של Ag ספציפי CD8 + T-תאי 2-4. לאור התקדמות טכנית האחרונה לאפיון רפרטוארי CD8 + T-cell ידי pMHC-לי multimer מכתים 6, את רוחב היריעה של יישומי FOr מתודולוגיה זו צפויה להימשך מתרחבת.

אזורים מעטים במחקר ביו היה ליהנות יותר מכתים tetramer pMHC-לי מאשר בתחום האימונולוגיה HIV 7. למרות CD8 + T לתאים היו קשורים באופן זמני באמצעות השלט הראשוני של viremia HIV עד מועד הפרסום ידי אלטמן, דייויס, ועמיתיו 8,9, השימוש tetramers pMHC-לי בשנים שלאחר מכן הרחיב את הבנתנו משמעותית של תגובת CD8 + T-cell הספציפית ל- HIV. לדוגמא, מכתים tetramer pMHC-עזר לאשר את הגודל החזק של תגובות וירוס ספציפי CD8 + T-cell ברוב האנשים שנדבקו ב- HIV 10-12. מתודולוגיה זו גם כדי להקל על האפיון של HIV- ו SIV ספציפי תגובות CD8 + T-cell המוגבל על ידי מולקולות MHC-I הקשורות בשליטה ספונטנית של תרבות נגיף בהעדר-טיפול בתופעה תרופתית המכונה "שליטת אליטה" + T-תאי זיהום כרוני בלתי מבוקר 16,17. ככלל, מחקרים אלה מדגישים את התועלת של tetramers pMHC-לי לניטור CD8 + T-cell תגובות נגד נגיף האיידס.

זיהום ניסיוני SIV של קופי רזוס (מולאטית מאכאכה) נשאר מודל החיה הכי הטוב להערכת התערבויות חיסון נגד HIV / איידס 18,19. ב -25 השנים האחרונות, התקדמות משמעותית נעשתה זיהוי ואפיון של SIV ספציפי CD8 + T-תאי במינים זה קוף, לרבות גילוי אללים MHC-I ו- ההגדרה של מוטיבים מחייב פפטיד 13,20-27 . כתוצאה מכך, tetramers pMHC-לי פותח לניתוח SIV הספציפי CD8 + T-cellתגובות במודל החיה הזאת 28. רוב ריאגנטים אלה עשויים המוצרים הגן של ארבעה אללים רזוס מקוק MHC-I: ממו-A1 * 001, ממו-A1 * 002: 01, * ממו-B 008: 01, ו ממו-B * 017: 01. ראוי לציין, קופי רזוס מחווים מוקד MHC-C 29. הרוב המכריע של tetramers pMHC-השתמשתי בניסויים הנוכחי הופקו במתקן Core NIH tetramer באוניברסיטת אמורי. עם זאת, חלק ריאגנטים אלה, כולל ממו-A1 * 001 tetramers מאוגד epitope Gag CM9 immunodominant, ניתן להשיג רק ממקורות מסחריים בשל הסכמי רישוי. Tetramers pMHC-לי שימוש של ארבעה אללים מקוק רזוס המפורטים לעיל, יש לנו המנויים בהצלחה CD8 + T-תאי נגד סך של 21 אפיטופים SIV (טבלה 1), שהיו המושרה על ידי חיסון או זיהום SIV העיקרי 30,31 (et מרטינס al., תצפיות לא פורסם).

כתב היד הנוכחי מספקתpMHC-לי tetramer מכתים מותאם פרוטוקול לקביעת פנוטיפ תדירות וזיכרון של SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס. את assay מתחיל עם הדגירה אלקטיבי 30 דקות עם מעכב קינאז חלבון (PKI; כאן, dasatinib משמש) על מנת להקטין הפנמה TCR ובכך לשפר pMHC-לי tetramer מכתים 32. כפי שנראה בהמשך, הטיפול הזה הוא שימושי במיוחד בעת השימוש ממו-B * 017: 01 tetramers. הוראות כיצד לתייג את התאים עם tetramers fluorochrome מצומדות pMHC-I ו- נוגדנים חד שבטיים (מבז) ניתנים גם. פרוטוקול זה כולל גם צעד התא permeabilization לאיתור התאי של B granzyme המולקולה הקשורים cytolysis (Gzm B). מב נגד CD3 מתווספת בשלב זה, כמו גם כדי לשפר את היכולת לזהות מולקולת איתות TCR זה. כהפניה, כל fluorochromes מועסק לוח מכתים זה מפורט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תא הדם ההיקפי mononuclear (PBMC) הדגימות מנוצלות כתב היד הזה התקבלו קופי רזוס ההודי שוכנו במרכז לחקר הפרימטים הלאומי ויסקונסין. חיות אלה טופלו בהתאם לדוח Weatherall תחת פרוטוקול שאושר על ידי אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים המדרשה ויסקונסין ועדת שימוש 33. נהלי כל החיה בוצעו בהרדמה וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל פוטנציאלי.

1. טיפול PKI

הערה: זה הוא אופציונלי, אבל מומלץ ממו-B * 017: 01 tetramers. ראה תוצאות וסעיפי דיון.

  1. Resuspend PBMC במדיום R10 בריכוז של 1.6 x 10 7 תאים / מ"ל.
  2. הוסף 50 μl של השעית תא זה לזרימה המקבילה cytometry צינורות. הוסף 50 μl של פתרון 100 ננומטר של PKI על צינור אחד.
  3. וורטקס צינור אחד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עד סוף שנת הזהצעד, כל צינור צריך 100 μl של השעיה תא המכיל 8.0 x 10 5 PBMC ו -50 ננומטר של PKI.
  4. המשך לשלב מכתים tetramer pMHC-לי.

2. מכתים עם שכותרתו Fluorochrome pMHC-לי Tetramers

  1. לפני הכנת pMHC-לי tetramer תערובת הורים, צנטריפוגה צינורות tetramer pMHC-I ב -20,000 XG לפחות 15 דקות ב 4 ° C. מטרת צעד זה היא גלולה אגרגטים חלבון בתמיסה tetramer pMHC-לי שעלולים להגביר מכתים רקע. לאחר הצעד צנטריפוגה נעשה, להימנע pipetting מהחלק התחתון של הצינור שבו אגרגטים חלבון צברו.
  2. הכן מספיק לערבב מאסטר tetramer pMHC-לי להכתים את כל הצינורות הניסיונות. כן עודף של 15% מהנפח הכולל של תערובת אמן זה לחשבון pipetting שגיאה.
  3. לדלל tetramers pMHC-לי במאגר כתם (למשל, הצפת כתם מבריקה), כך 25 μl של תמהיל pMHC-לי tetramer האב הוא אדהד כל בדיקה.
    1. לייבל PBMC עם שני tetramers pMHC-לי לכל מבחן; אחד מצומדות כדי allophycocyanin (APC), ואת הקצה השני מבריק ויולט (BV) 421.
  4. להוסיף 8.0 x 10 5 PBMC לזרימה המקבילה cytometry צינור בנפח סופי של 100 μl. אם התאים היו נתונים לטיפול PKI שתואר לעיל, הם צריכים להיות resuspended כבר 100 μl בשלב זה.
  5. הוסף 25 μl של pMHC-לי tetramer תערובת אמן לזרימה המקביל cytometry צינורות. עד סוף שלב זה, הכרך האחרון בצינור אחד צריך להיות 125 μl.
  6. וורטקס צינור אחד כדי homogenize השעית התא.
  7. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 45 דקות. הכן את קוקטייל מב מכתים השטח במהלך הדגירה 45 דקות זה.

מכתים Surface 3.

  1. הכין תערובת מאסטר מב מספיק כדי להכתים את כל הצינורות הניסיונות. כן עודף של 15% מהנפח הכולל של תערובת אמן זה לתת דין וחשבוןpipetting שגיאה.
  2. כוון את עוצמת הקול של מיקס מאסטר עם חיץ כתם כך 50 μl מתווספים לכל מבחן.
  3. לקבלת הדרה ראויה של אי-CD8 + T-תאי תיחום של תת זיכרון, שימוש טיטרציה כמויות של מבז המכוון נגד המולקולות הבאות מיקס מאסטר מכתים פני שטח.
    הערה: fluorochromes מצומדות לכל מבז ניתנים כהפניה: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7, ו CCR7 FITC. ראוי לציין, כי מבז נגד CD14, CD16, CD20 ו הם מצומדות לאותו fluorochrome (כלומר, BV 510) שכן הם ייכללו השער "להיפטר".
  4. כלול לצבוע fixable חדות-הבחנה תאים מתים בתמהיל מאסטר מכתים משטח [כלומר, לצבוע תגובתי אמין (ARD)]. ודא כי מגיב ARD הוא מצומדות כדי fluorochrome עם ספקטרום פליטה דומה כמו אלה המשמשים את השער "להיפטר". במקרה זה, להשתמש ARD אקווה.
  5. הוסף 50 μl שלמיקס מאסטר המכתים מתואר 3.1-3.4 לזרימה המקבילה cytometry צינורות. עד סוף שלב זה, הכרך האחרון בצינור אחד צריך להיות 175 μl.
  6. וורטקס צינור אחד. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 25 דקות.
  7. שטפו תאים עם חיץ לשטוף (פתרון PBS המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור ו 0.45 גר '/ ל NaN 3).
    זהירות: אזיד הנתרן הוא חומר רעיל. חשיפה אפילו כמויות זעירות יכולה לגרום לסימפטומים. ידית חומר זה על פי ההנחיות המפורטות על ידי בריאות הסביבה ובטיחות (EHS) Office במוסד שבו ניסויים אלה מבוצעים.
  8. צינורות צנטריפוגה ב 510 XG במשך 5 דקות. בזהירות למזוג supernatant לתוך מיכל פסולת נפרד. הקפד לא להפריע גלולה.
    זהירות: אין למזוג לשטוף חיץ supernatant לתוך מאגרים המכילים אקונומיקה כפי שהוא יכול להגיב עם ההווה יזיד הנתרן למאגר לשטוף לגרום להיווצרות של גז רעיל 34. Contact משרד EHS במוסד שבו ניסויים אלה מבוצעים על הנחיות כיצד להיפטר יזיד הנתרן.
  9. לאחר decanting, מערבולת התאים בנוזל שאריות שמר בצינור אחד.

קיבוע תא 4.

  1. הוסף 250 μl של פתרון paraformaldehyde 2% (PFA) לכל הצינורות לתקן את התאים.
    זהירות: PFA הוא חומר רעיל. חשיפה אפילו כמויות זעירות יכולה לגרום לסימפטומים. ידית חומר זה על פי ההנחיות המפורטות על ידי משרד EHS במוסד שבו ניסויים אלה מבוצעים.
    1. מאז הפתרון 2% PFA חייב להיות שוה אל התאים, להשתמש PBS להכין פתרון זה. מאה מיליליטר של פתרון 2% PFA מספיק ניסויים מרובים. ביסודיות מערבולת כל הצינורות מיד לאחר תוספת של 2% PFA כדי למנוע היווצרות של אגרגטים התא.
  2. דגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
  3. Wתאי אפר ידי חזרה על שלבי 3.7-3.9. לאחר שלב זה הושלם, התאים ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות. לפני שאתה ממשיך לשלב Permeabilization, מערבולת הצינורות ביסודיות.

5. Permeabilization של תאים

  1. הוסף 500 μl של חיץ permeabilization. וורטקס כל הצינורות.
  2. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 10 דקות.
  3. שטפו תאים על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9.

6. תאיים מכתימים

  1. הכין תערובת מאסטר מב מספיק כדי להכתים את כל הצינורות הניסיונות.
  2. כוון את עוצמת הקול עם PBS או כתם חיץ כך 50 μl של מיקס מאסטר מב התאי מתווספים לכל מבחן.
  3. מכינים את תערובת מאסטר מב המתוארים 6.1 ו -6.2 באמצעות טיטרציה כמויות של מבז המכוונים נגד CD3 ו Gzm B.
    הערה: מעורבות TCR ידי tetramers pMHC-אני יכול לגרום הפנמה CD3, אשר יכול להפריע איתור של tetramer + CD3 + CD8 +תאי T אם מב אנטי CD3 מתווסף מיקס מאסטר משטח מכתים. כדי למנוע זאת, להוסיף את מב אנטי CD3 בשלב זה, כלומר, לאחר התאים permeabilized. Fluorochromes מצומדות לכל מב מפורטים כהפניה: CD3 PerCP Cy5.5 ו Gzm B PE.
  4. הוסף 50 μl של קוקטייל מב אל הצינורות המקבילים. דגירה בחושך בטמפ 'החדר למשך 30 דקות.
  5. שטפו תאים על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9. הצינורות מוכנים להירכש cytometer זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן נעשה שימוש כדי לקבוע את הפנוטיפ הגודל וזיכרון של נגרמת חיסון, Gag CM9 ספציפי תגובות CD8 + T-cell בתוך מקוק ממו-A1 * 001 + רזוס. לניתוח זה, tetramer APC-מצומדות ממו-A1 * 001 / Gag CM9 שימש בהרכב מכתים תזרים cytometric 8 צבעים. איור 1 א - F מציג את האסטרטגיה gating להשתמש כדי לנתח את הנתונים, שאמור להיות מיושם הן tetramers נוכח כל בדיקה. ראוי לציין, כי tetramer pMHC-I + CD8 + אוכלוסיית T-cell מופרד היטב עם (1F הדמוי ו- G) רקע מינימאלי. זיכרון CD8 + T-התאים קופי רזוס ניתן לסווג לשלושה תת מבוסס על ביטוי השטח של CD28 ו CCR7: זיכרון מרכזי (T CM; CD28 + CCR7 +), זיכרון המעבר (T EM1; CD28 + CCR7-), ו מפעיל זיכרון (T EM2; CD28-CCR7-) 35.פרוטוקול זה כולל גם צעד התא permeabilization לגילוי תאי של Gzm B ו- CD3. איור 1G - אני מציג את התיחום של תת זיכרון Gzm B להביע CD8 + T-תאים בתוך tetramer + השער.

רקע מכתים יכול להניב תוצאות לא טובות מבחני תיוג tetramer pMHC-לי. כדי למנוע זאת, כמה אמצעי זהירות הם הציעו. כאמור בסעיף הפרוטוקול, בקבוקונים המכילים חומרים כימיים tetramer pMHC-אני צריך להיות centrifuged תמיד ב -20,000 XG לפחות 15 דקות לפני הכנת תערובות מאסטר. מטרת צעד זה היא גלולה כל אגרגטים חלבון שעשוי להיות הפתרון tetramer pMHC-לי. בנוסף, titrating כל מגיב לפני השימוש מומלץ גם. באופן אידיאלי, MHC-I-מתאים תאים עושים או לא להכיל את אוכלוסיית העניין Ag הספציפית CD8 + T-cell צריכה להיות מסומנת עם tetramer pMHC-לי הרלוונטי. ca זהn להתבצע על ידי צביעת PBMC cryopreserved מן נאיבי SIV (שליטה שלילית) ו SIV נגוע (בקרה חיובית) קופי זה לצד זה עם כמויות שונות של tetramer pMHC-השיג חדש. באיור 2, למשל, 1.0 מיקרוליטר / במבחן נגמ"ש מצומדות ממו-B * 008: אוכלוסיות 01 / הנף RL10 tetramer הניב את ההפרדה הטובה ביותר בין tetramer חיוביות ושליליות CD8 + T-cell. לבסוף הבחירה של fluorochrome גם יכול להשפיע על התוצאות באופן משמעותי המתקבל stainings tetramer pMHC-לי. בהקשר זה, tetramers pMHC-לי מצומדות כדי לעמעם מולקולות (למשל, והעמסת) יש להימנע. מניסיוננו, tetramers pMHC-לי מצומדות כדי fluorochromes הבהיר, כגון PE, APC, ו BV 421, מניב את התוצאות הטובות ביותר.

שמנו לב כי ממו-B * 017: 01 tetramers מניב לרוב מכתים עמום, גם כאשר מצומדות כדי fluorochromes הבהיר שהוזכר לעיל. הסיבות לכךעוצמת קרינה נמוכה אינה ברורה לחלוטין אך עשוי לכלול TCR נמוך זיקה / ממו-B * 017: 01 אינטראקציות והפנמת TCR מהירה על מחייב tetramer 36,37. ברוח דברים אלה, PKIs הוכח לעכב הפנמת TCR על פני השטח של CD8 + T-תאי 32. כתוצאה מכך, PKIs יכול לשפר את היכולת לזהות Ag ספציפי CD8 + T-תאים על ידי מכתים tetramer pMHC-לי. אנו מאשרים תוצאה זו בניסויים שלנו, שבה איכות של ממו-B * 017: 01 tetramer stainings ניתן להשיג שיפור משמעותי על ידי מראש בטיפול PBMC עם PKI (איור 3). מוזר, לפני תחילת טיפול עם PKI זה לא לשפר באופן משמעותי את המכתים של tetramers pMHC-I האחר שנבדק כאן (מידע לא מוצג), טוען כי ממו-B * 017: 01-מוגבל CD8 + T-תאים עשויים להיות ייחודיים רגישותם לטיפול PKI.

איור 1
איור 1: אסטרטגיה gating ותוצאות נציג של מכתים tetramer pMHC-לי מוצלח. הערכנו את הפנוטיפ גודל וזיכרון של Gag הנגרמת חיסון CM9 ספציפי CD8 + T-תאים PBMC מתוך מקוק ממו-A1 * 001 + רזוס. הנה, tetramer APC-מצומדות ממו-A1 * 001 / Gag CM9 שימש בהרכב מכתים תזרים cytometric 8 צבעים. (A - F) האסטרטגיה gating עבור ניתוח תזרים cytometric. ראשית, שער על singlets התקבצו באלכסון נוצר על ידי התוויית גובה פיזור קדימה (FSC-H) לעומת אזור FSC (FSC-A) ולאחר מכן גובה פיזור בצד (SSC-H) לעומת אזור SSC (SSC-A; A ו- B) . לאחר מכן, שער זמן נוצר שכלל רק אותם אירועים נרשמו בתוך העשירונים 5 וה 90 ה. התאים וכתוצאה מכך היו אז מגודרים על "ערוץ dump" שליליים, CD3 + תאים (C ו- D). בשלב זה,אוכלוסיית הלימפוציטים היה התחום המבוסס על מאפייני FSC-A ו SSC-A שלה ניתוחים שלאחר מכן נערכו בתוך CD8 + תאים (E ו- F). אחרי ששטח pMHC-לי tetramer + תאים (G), ניתוח phenotyping הזיכרון בוצע בתוך השער הזה (H). T-תאי זיכרון מקוק רזוס ניתן לסווג לשלוש תת מבוסס על ביטוי של CD28 ו CCR7: זיכרון מרכזי (T CM; CD28 + CCR7 +), זיכרון המעבר (T EM1; CD28 + CCR7-), וזיכרון מפעיל (T EM2 ; CD28-CCR7-). הפרוטוקול הנוכחי כולל גם צעד התא permeabilization להערכת תאיים של Granzyme B (Gzm B) ביטוי בתוך tetramer + CD8 + T-תאי (I). האזור המוצל בהיסטוגרמה תואם tetramer + CD8 + T-תאים מוכתמים מב ביקורת השווה אלוטיפ. למרות tetramer 421 מצומדות BV + האוכלוסייה כי נכח מכתים זהלא שמוצג באיור, האסטרטגיה gating אותו יש להשתמש כדי לנתח את זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תוצאות נציג של טיטרציה של נגמ"ש מצומדות ממו-B * 008: tetramer RL10 01 / הנף. PBMC משני ממו-B * 008: 01+ קופי רזוס שמש לצורך הניסוי הזה: חיה אחת הייתה SIV נאיבי ושמשה בקרה השלילית ואילו השני היה SIV נגוע ושמש השליטה החיובית. כדי לקבוע את סכום ממו-B * 008: 01 / הנף RL10 tetramer מניב ההפרדה הטובה ביותר בין + tetramer ו- CD8 + T-תאי tetramer-, PBMC מכל חית הודגרו עם הכמויות המצוינות של מגיב tetramer pMHC-לי. בהתבסס על תוצאות אלו, 1.0 מיקרוליטר / מבחן ווהים נבחר את הכמות האופטימלית לשמש מבחני העתיד. האסטרטגיה gating מנוצל כדי לנתח את הנתונים מתואר באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: השפעת הטיפול PKI על עוצמת הקרינה של ממו-B * 017: 01 tetramers. המעכב PKI מעכב הפנמה של מתחמי TCR ובכך משפר זיהוי של Ag ספציפי CD8 + T-תאים על ידי fluorochrome שכותרתו pMHC-לי tetramers 32. (א - ב) PBMC משני ממו-B * 017: 01+ קופי רזוס שימשו בניסוי זה: קוף אחד היה SIV נאיבי ושימש שליטה שלילי (א '), ואילו השני היה נגוע ב- SIV ושימשהשליטה החיובית (B). PBMC משני חיות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות PKI בריכוז של 50 ננומטר למשך 30 דקות לפני צביעה עם נגמ"ש מצומדות ממו-B * 017: tetramer IW9 01 / הנף, כמתואר בסעיף פרוטוקול . כהפניה, קבוצה נוספת של צינורות הייתה נתונה באותם תנאי הדגירה מכתימים, חוץ מזה sulfoxide דימתיל (DMSO) נוסף במקום PKI. האסטרטגיה gating מנוצל כדי לנתח את הנתונים מתואר באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

<td> ממו-A1 * 002: 01
חלבון SIV סך חומצת אמינו רצף החומצות האמיניות MHC Class I מולקולה (מינוח) MHC Class I מולקולה (נומנקלטורה ישןה) שם קצר epitope
בְּדִיחָה 181-189 CTPYDINQM ממו-A1 * 001 ממו-A * 01 Gag CM9
בְּדִיחָה 254-262 QNPIPVGNI ממו-A1 * 001 ממו-A * 01 Gag QI9
בְּדִיחָה 72-79 GSENLKSLY ממו-A1 * 001 ממו-A * 01 Gag GY9
מעטפה 830-838 FHEAVQAVW ממו-B * 017: 01 ממו-B * 17 המעטפה FW9
מעטפה 233-241 CAPPGYALL ממו-A1 * 001 ממו-A * 01 המעטפה CL9
מעטפה 620-628 TVPWPNASL ממו-A1 * 001 ממו-A * 01 המעטפה TL9
מעטפה 788-795 RTLLSRVY ממו-A1 * 002: 01 ממו-A * 02 המעטפה RY8
מעטפה 296-304 RTIISLNKY ממו-A1 * 002: 01 ממו-A * 02 המעטפה RY9
Vif 123-131 RRAIRGEQL ממו-B * 008: 01 ממו-B * 08 Vif RL9
Vif 173-181 RRDNRRGL ממו-B * 008: 01 ממו-B * 08 Vif RL8
Vif 66-73 HLEVQGYW ממו-B * 017: 01 ממו-B * 17 Vif HW8
Vif 100-109 VTPNYADILL ממו-A1 * 001 ממו-A * 01 Vif VL10
Vif 97-104 WTDVTPNY ממו-A1 * 002: 01 ממו-A * 02 Vif WY8
לְהַאִיץ 13-22 KRLRLIHLL ממו-B * 008: 01 ממו-B * 08 Rev KL9
לִרְקוֹם 28-35 STPESAML ממו-A1 * 001 ממו-A * 01 טאט SL8
הנף 137-146 RRHRILDIYL ממו-B * 008: 01 ממו-B * 08 הנף RL10
הנף 246-254 RRLTARGLL ממו-B * 008: 01 ממו-B * 08 הנף RL9b
הנף 8-16 RRSRPSGDL ממו-B * 008: 01 ממו-B * 08 הנף RL9a
הנף 165-173 IRYPKTFGW ממו-B * 017: 01 ממו-B * 17 הנף IW9
הנף 195-203 MHPAQTSQW ממו-B * 017: 01 ממו-B * 17 הנף MW9
הנף 159-167 YTSGPGIRY ממו-A * 02 YY9 הנף

טבלה 1: רשימת tetramers pMHC-לי זמין לניטור SIV ספציפי CD8 + T-cell תגובות ב קופי רזוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כמה צעדים שידונו בו הליך זה כיוון שהן חיוניות על כניעתה תוצאות אופטימליות. ראשית, מאז איכות הדגימות הביולוגיות היא מנבא חזק של ההצלחה של כל assay תזרים cytometric 38, כל הטיפול יש לנקוט כדי להבטיח כי התאים הם קיימא וב ההשעיה במהלך ההליך המכתים. זה רלוונטי במיוחד כאשר עובדים עם דגימות cryopreserved שכן הם נוטים יותר בצעדים כבדים בדרך כלל מכילים מספרים גבוהים יותר של תאים מתים. במקרים אלה, להעביר את השעית התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לפני הליך תיוג tetramer pMHC-I עשוי לשפר את התוצאות באופן משמעותי. שנית, לפעול לתגמול הוגן של fluorochromes מועסקי assay הוא קריטי לניתוח נתונים מדויק, במיוחד כאשר מספר רב של פרמטרים, נבחנים באותו הניסוי. בהקשר זה, מומלץ כי בקרות פיצוי חד צבע טרי להיות מוכן לכל s tetramer pMHC-ליtaining assay. אנחנו בעד שימוש חרוזי פיצויים בשל תגובתיות אנטי איג הרחבה והעובדה שהם תשואת הפצות bimodal ברורות של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. מאז חרוזים אלה לא להיקשר למולקולות MHC-I, נוגדנים מצומדות לאותו fluorophores כמו tetramers pMHC-I (למשל, APC ו BV 421) צריך לשמש שולטת פיצוי. כמה חרוזי פיצויים כאלה זמינים מיצרנים מרובים אמורים לשמש על פי הוראות היצרן. שלישית, מאז אסטרטגית phenotyping המתוארת כאן דורשת הסימון של תת CD8 + T-cell מבוסס על הביטוי המדורג של שלוש מולקולות (כלומר, CD28, CCR7, ו Gzm B), שולט gating, כגון קרינה מינוס אחד בדיקות (FMO) או נוגדנים בהתאמה אלוטיפ, יש להשתמש כדי להקל מחקרים מסוג זה. בניסויים שלנו, למשל, צינורות נפרדים המכיל את tetramer pMHC-I + CD8 + T-cell אוכלוסיית ענייןמחדש תמיד מוכתמים מבזים אלוטיפ מצומדות לאותו fluorochromes כמו מהבז נגד CD28, CCR7, ו Gzm B. חשוב לציין כי למרות ההנחיות הנ"ל עשויות לעזור לשפר את האיכות הכוללת של pMHC-לי tetramer stainings, הם אינם משתנים היחידים יכול להשפיע על הביצועים של assay זה. בהתחשב בייחודיות של כל הגדרת מעבדה, את כל העבודה המתוארת כאן צריכה להתבצע לפחות פעם אחת על דגימות מדומה כדי לאפשר תרגול והתאמות רלוונטיות.

מוזר, pMHC-לי tetramer CD8 + T-תאים חיוביים הם נצפו לעתים PBMC מן נאיבי SIV (נגוע ואת חוסנו) קופי רזוס. מקרים אלה אינם מופיעים כדי להיות התוצאה של מכתים רקע מבוסס על בדיקה ויזואלית של הנתונים. במקום זאת, הם עשויים לשקף אינטראקציות בין מולקולות pMHC-I ו- קולטנים אימונוגלובולינים דמוי רוצח (KIRs) הביע על פני השטח של רזוס מקוק NK ו CD8 + T-תאים 39,40. ואכן, ממו-A1 * 002: 01 tetramers מקופל עם פפטידים המתאימים אפיטופים Gag GY9 ו מעטפת RY8 הוכח להיקשר ממו-KIRDL05 39. ברוח דברים אלה, ממו-A1 * 002: 01 / Gag GY9 ו ממו-A1 * 002: 01 / מעטפה RY8 נוטים יותר בו להצגת מכתים tetramer Ag-עצמאית pMHC-שתיארתי לעיל. בהינתן תופעה זו, חשוב לפקח על תגובתיות בסיס הזה בניסויים קוף והכרוכים בהערכות אורכות של תגובות SIV הספציפיות CD8 + T-cell בעקבות זיהום או חיסון. כדי להשיג זאת, רצוי לבצע מכתים tetramer pMHC-לי על דגימות שהתקבלו ביום הראשון של הטיפול. זה יכול גם להיות רלוונטי להקפיא PBMC בכמה aliquots קטן בגודל בנקודות זמן אלה ראשוניים בהשוואות במקרה עם דגימות בסיס נדרשות בניסויים עתידיים.

מגבלה אחת של מכתים tetramer pMHC-לי היא שרק CD8 + T-תאים של סגוליות ידועות ג הגבלת MHC-Iלהיחקר על ידי גישה זו. זה רלוונטי במיוחד ב קופי רזוס בהתחשב הארגון המורכב של לוקוסי MHC שלהם. אכן, haplotype מקוק רזוס אחד יכול להיות עשרות גנים MHC-I, לא כל המקודדים מולקולות אשר מתבטאות ביציבות על פני התא 29. כתוצאה מכך, זה יכול להיות קשה לקבוע את הערכה של מולקולות MHC-I התפקודיות לידי ביטוי על ידי בעלי חיים נתונים. אף על פי כן, זה אזהרה ניתן להתגבר על ידי תכנון ניסויים הכוללים קופים כי הם חיוביים עבור אללים MHC-הכרתי, כגון ממו-A1 * 001, ממו-A1 * 002: 01, ממו-B * 008: 01, ו Mamu- B * 017: 01.

לסיכום, כתב היד הזה מספק פרוטוקול מכתים tetramer אופטימיזציה pMHC-I לקביעת פנוטיפ תדירות וזיכרון של SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס. מאז מכתים tetramer pMHC-לי הוא יותר רגיש IFN-γ ELISPOT מבחני ICS לצורך זיהוי של Ag ספציפי CD8+ T- תאים ואינו דורש במבחנה גירוי Ag, המתודולוגיה המוצגת כאן היא שימושית במיוחד עבור הבוחנים את השפעת CD8 + T-cell התגובות בתוצאה של הידבקות בנגיף הכשל החיסוני. הידע המעשי רכש מאסטרינג טכניקה זו עשויה להיות שימושי גם להעשרת Ag ספציפי CD8 + T-תאי, במסגרת לימודים פונקציונליים לניטור תגובות CD8 + T-cell במסגרות מחלה שונה 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ברצוננו להודות דוד ווטקינס לתמיכה בניסויים שאפשרו אופטימיזציה של המתודולוגיה הנוכחית. מחקר מדווח בפרסום זה מומן בחלקו על ידי מענק טייס שמספק מרכז מיאמי לאיידס מחקר של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת מספר פרסי P30AI073961. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dasatinib Axon medchem Axon 1392 Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C
RPMI w/ Glutamax gibco/ Life Technologies 61870-036 Must be stored at 4 °C 
Heat Inactivated FBS gibco/ Life Technologies 10082-147 Must be stored at 4 °C 
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B Lonza 17-745E Must be stored at 4 °C 
DMSO, Anhydrous Life Technologies D12345 Store at room temperature.
5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes VWR 60819-728
Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers NIH Tetramer Core or MBL, Inc. Must be stored and maintained at  4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.
Fluorochrome-conjugated mAbs Various companies Must be stored and maintained at  4 °C. Do not freeze.
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies l34957 Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use.
Brilliant Stain Buffer BD Biosciences 563794 Must be stored at  4 °C 
Phosphate Buffered Saline VWR 97064-158 Store at room temperature
Albumine Bovine VWR 700011-230 Must be stored at  4 °C 
Sodium Azide VWR 97064-646 Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.
Bleach VWR 89501-620 Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care
Polysorbate 20 (Tween-20) Alfa Aesar L15029 Store at room temperature
Permeabilization Solution 2  BD Biosciences 340973 Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top VWR 72.692.005
2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes Eppendorf 22431048 The use of Sterile microtubes is preffered 
Vortex mixer To discretion of scientist
Biosafety Cabinet  To discretion of scientist
Milli Q Intergral Water Purification system EMD Millipore ZRXQ010WW Molecular Biology grade water from any provider may be used
Microcentrifuge To discretion of scientist
Centrifuge To discretion of scientist
4 °C  refrigerator To discretion of scientist
BD LSR II BD Biosciences Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Deionized water
Aluminum Foil VWR SCIENTIFIC INC. 89068-738
Incubator Must be able to maintain 37 °C  internal temperature
FACS Diva software BD Biosciences
Flowjo software version 9.6 Flowjo Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software
Micropippette tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
  2. Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
  3. Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
  4. Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
  5. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  7. Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  8. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
  9. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
  10. Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
  11. Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
  12. Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
  13. Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
  14. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
  15. Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
  16. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
  17. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
  18. Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
  19. Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
  20. Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
  21. Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
  22. Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
  23. Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
  24. Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
  25. Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
  26. Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
  27. Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
  28. Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
  29. Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
  30. Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
  31. Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
  32. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  33. Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
  34. Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
  35. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  36. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  37. Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  38. Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
  39. Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
  40. Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).

Tags

אימונולוגיה גיליון 118 MHC tetramer חיסון SIV רזוס מקוק
ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup&gt; +</sup&gt; T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez-Nieto, L., Domingues, A.,… More

Gonzalez-Nieto, L., Domingues, A., Ricciardi, M., Gutman, M. J., Maxwell, H. S., Pedreño-Lopez, N., Bailey, V., Magnani, D. M., Martins, M. A. Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining. J. Vis. Exp. (118), e54881, doi:10.3791/54881 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter