Summary
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour le dénombrement et la caractérisation des cellules macaques rhésus T CD8 + contre le virus du sida. Cet article est utile non seulement dans le domaine de l' immunologie du VIH, mais aussi à d' autres domaines de la recherche biomédicale où les réponses des lymphocytes T CD8 + sont connus pour affecter les résultats de la maladie.
Abstract
Peptide-majeur d' histocompatibilité de classe I (pMHC-I) tétramères ont été un outil précieux pour étudier CD8 + réponses des lymphocytes T. Du fait que ces réactifs se lient directement aux récepteurs des cellules T à la surface des lymphocytes T CD8 + des lymphocytes, des tétramères fluorochrome marqué pMHC-I permettent la détection précise de l' antigène (Ag) spécifique de cellules CD8 + des cellules T sans le besoin de re in vitro -stimulation. En outre, lorsqu'il est combiné avec multi-couleurs cytométrie en flux, pMHC-I coloration de tétramère peut révéler des aspects clés de cellules T Ag-spécifiques CD8 +, y compris l' étape de différenciation, phénotype mémoire, et l' état d'activation. Ces types d'analyses ont été particulièrement utiles dans le domaine de l' immunologie du VIH où les lymphocytes T CD8 + peuvent affecter la progression du sida. L'infection expérimentale de macaques rhésus avec le virus de l'immunodéficience simienne (SIV) fournit un outil précieux pour étudier l'immunité cellulaire contre le virus du sida. Par conséquent, PROGRE considérabless a été faite dans la définition et la caractérisation des réponses des lymphocytes T dans ce modèle animal. Nous présentons ici un protocole optimisé pour dénombrer les cellules T SIV spécifiques CD8 + dans macaques rhésus par pMHC-I coloration tétramère. Notre test permet la quantification et la mémoire simultanée phénotypage de deux populations pMHC-I tétramère + CD8 + T-cellules par test, qui pourraient être utiles pour le suivi des réponses des lymphocytes T CD8 + spécifique du SIV générés par la vaccination ou infection SIV. Compte tenu de l'importance des primates non humains dans la recherche biomédicale, cette méthode est applicable pour l' étude des réponses des CD8 + des cellules T dans de multiples contextes pathologiques.
Introduction
Les lymphocytes T CD8 + comprennent une composante essentielle du système immunitaire adaptatif car ils participent à la surveillance immunitaire de la tumeur et contribuent à l'élimination des agents pathogènes intracellulaires 1. En termes simples, les lymphocytes T CD8 + expriment des récepteurs de cellules T (TCR) qui reconnaissent spécifiquement le peptide majeur d' histocompatibilité de classe I (I) pMHC-molécules présentes sur la membrane plasmique des cellules hôtes. Étant donné que ces peptides sont dérivés de la protéolyse des protéines synthétisées de manière endogène, les complexes pMHC-I de surface cellulaire fournissent une fenêtre dans l'environnement intracellulaire. Lors de l' infection par le virus, par exemple, les cellules infectées présenteront des molécules du CMH-I , contenant des peptides dérivés de virus qui peuvent servir de ligands pour les TCR exprimés par les patrouilles des lymphocytes T CD8 +. Dans le cas d' une CD8 + des cellules T spécifiques du virus rencontre une cellule infectée présentant son ligand pMHC-I, l' engagement du TCR entraînera l' activation CD8 + et des lymphocytes T ultiron conduire à cibler la lyse cellulaire. Étant donné la nature critique de ces interactions TCR / pMHC-I, la détermination de l'ampleur, la spécificité et le phénotype de répondre lymphocytes T CD8 + peuvent souvent révéler des indices importants sur les maladies humaines.
Jusqu'au début des années 1990, la quantification des cellules T Ag spécifiques CD8 + appuyé sur la limitation de dosage de dilution exigeant techniquement (LDA) 2,3. Non seulement la LDA ne nécessite plusieurs jours pour être achevé, il a également échoué à détecter des cellules qui ne disposaient pas de potentiel prolifératif. Par conséquent, le LDA largement sous - estimer la fréquence réelle de l' antigène (Ag) , les cellules T CD8 + spécifique de participant à une réponse immunitaire. Bien que le développement de dosages ELISPOT et intracellulaire des cytokines de coloration a grandement amélioré la capacité à mesurer l' immunité cellulaire, ces procédés restent nécessaires stimulation in vitro pour la quantification des lymphocytes T spécifiques d' Ag-4. Ce ne fut pas avant 1996 que Altman, Davis et colleagues publié leur article historique des rapports du développement de la technologie de tétramère pMHC-I 5. Cruciale pour le succès de cette technique était la multimérisation des molécules pMHC-I, qui étendent la demi-vie des interactions TCR / pMHC-I, ce qui réduit la probabilité de tétramères pMHC I tombant au cours des étapes de lavage des tests de cytométrie de flux. Le principal avantage de tétramères pMHC-I au cours des essais mentionnés ci - dessus est la possibilité de détecter avec précision les cellules T spécifiques d' Ag CD8 + ex vivo directement sans la nécessité d' une stimulation in vitro nouveau dans. En outre, la combinaison de pMHC-I coloration tétramère avec multi-couleurs cytométrie en flux a permis des analyses détaillées du stade de différenciation, phénotype mémoire, et l' état d'activation de + cellules T CD8 Ag spécifiques 2-4. À la lumière des récents progrès techniques pour la caractérisation des répertoires CD8 + T-cell par pMHC-I multimère coloration 6, l'étendue des applications for cette méthodologie est susceptible de continuer à développer.
Peu de domaines de la recherche biomédicale ont plus bénéficié de pMHC-I coloration tétramère que le domaine de l' immunologie du VIH 7. Bien que les lymphocytes T CD8 + ont été temporellement associée au contrôle initial de la virémie VIH au moment de la publication par Altman, Davis et ses collègues 8,9, l'utilisation de tétramères pMHC-I dans les années qui ont suivi considérablement élargi notre compréhension de la réponse spécifique au VIH des cellules T CD8 +. Par exemple, pMHC-I coloration tétramère permis de confirmer la taille robuste de CD8 + réponses de cellules T spécifiques du virus dans la plupart des individus infectés par le VIH 10-12. Cette méthodologie a également facilité la caractérisation des VIH- et CD8 + réponses SIV spécifiques de lymphocytes T restreinte par les molécules du CMH-I associés au contrôle de la réplication virale spontanée en l'absence de thérapie antirétrovirale, un phénomène connu sous le nom "contrôle de l' élite"
Infection SIV expérimentale de macaques rhésus (Macaca mulatta) reste le meilleur modèle animal pour évaluer les interventions immunitaires contre le VIH / SIDA 18,19. Au cours des 25 dernières années, des progrès substantiels ont été réalisés dans l'identification et la caractérisation des cellules T SIV-CD8 + spécifiques de cette espèce de singe, y compris la découverte d'allèles du CMH-I et la définition de liaison peptidiques motifs 13,20-27 . Par conséquent, les tétramères pMHC-I ont été mis au point pour l'analyse de SIV CD8 + spécifiques des lymphocytes Tles réponses dans ce modèle animal 28. La plupart de ces réactifs sont constitués des produits géniques de quatre macaques rhésus alleles du CMH-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, et Mamu-B * 017: 01. Fait à noter, les macaques rhésus n'expriment un locus MHC-C 29. La grande majorité des tétramères pMHC-I utilisés dans les présentes expériences ont été produites à l'installation NIH tétramère de base à l'Université Emory. Néanmoins, certains de ces réactifs, y compris Mamu-A1 * 001 tétramères liés à l'épitope immunodominant Gag CM9, ne peut être obtenu auprès de sources commerciales en raison d'accords de licence. Utilisation de tétramères pMHC-I des quatre allèles de macaques rhésus énumérés ci - dessus, nous avons énuméré avec succès des cellules T CD8 + contre un total de 21 épitopes SIV (tableau 1), qui ont été induites par la vaccination ou une infection SIV primaire 30,31 (Martins et al., observations non publiées).
Le présent manuscrit fournit uneoptimisé pMHC-I tétramère protocole de coloration pour déterminer la fréquence et de la mémoire phénotype des cellules T spécifiques du SIV CD8 + chez les macaques rhésus. L'essai commence par un stage de 30 minutes d' incubation avec un inhibiteur de la protéine kinase (PKI, ici, dasatinib est utilisé) afin de diminuer TCR intériorisation et ainsi améliorer pMHC-I tétramère coloration 32. Comme cela est décrit ci-après, ce traitement est particulièrement utile lors de l'utilisation Mamu-B * 017: 01 tétramères. Instructions sur la façon d'étiqueter les cellules avec tétramères pMHC-I fluorochrome conjugué et les anticorps monoclonaux (mAb) sont également fournis. Ce protocole comprend en outre une étape de perméabilisation cellulaire pour la détection intracellulaire de la molécule associée à la cytolyse granzyme B (MGZ B). Le mAb contre CD3 est ajouté à cette étape aussi bien pour améliorer la détection de cette molécule de signalisation TCR. À titre de référence, tous les fluorochromes utilisés dans ce panneau de coloration sont répertoriés.
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Protocol
Les échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) utilisés dans ce manuscrit ont été obtenus à partir de macaques rhésus indiens logés au National Primate Research Center Wisconsin. Ces animaux ont été pris en charge en conformité avec le rapport Weatherall en vertu d' un protocole approuvé par l'Université du Wisconsin Graduate School Animal Care et utilisation Comité 33. Toutes les procédures animales ont été réalisées sous anesthésie et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance potentielle.
1. Traitement PKI
NOTE: Cette option est facultative, mais recommandée pour Mamu-B * 017: 01 tétramères. Résultats et discussion Sections.
- Remettre en suspension les PBMC dans du milieu R10 à une concentration de 1,6 x 10 7 cellules / ml.
- Ajouter 50 ul de cette suspension cellulaire à l'écoulement correspondant cytométrie tubes. Ajouter 50 ul d'une solution 100 nM de l'ICP à chaque tube.
- Vortex chaque tube. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. À la fin de cettel' étape, chaque tube doit avoir 100 ul d'une suspension de cellules contenant 8,0 x 10 5 PBMC et 50 nM de PKI.
- Passez à l'étape tétramère coloration pMHC-I.
2. La coloration avec un fluorochrome marqués pMHC-I tétramères
- Avant de préparer le pMHC-I tétramère mélange maître, centrifuger les tubes tétramère pMHC-I à 20 000 xg pendant au moins 15 min à 4 ° C. Le but de cette étape est de sédimenter des agrégats de protéines dans la solution de tétramère pMHC-I qui peut augmenter la coloration de fond. Une fois que l'étape de centrifugation est effectuée, d'éviter un pipetage à partir du fond du tube, où les agrégats de protéines se sont accumulés.
- Préparer assez maître tétramère mélange pMHC-I pour colorer tous les tubes expérimentaux. Préparer un excès de 15% du volume total de ce mélange maître pour tenir compte de pipetage erreur.
- Diluer tétramères pMHC-I dans la tache tampon (par exemple, le tampon Stain Brilliant) de telle sorte que 25 pi de la pMHC-I tétramère master mix sont added à chaque test.
- Étiquette PBMC avec deux tétramères pMHC-I par test; un conjugué à l'allophycocyanine (APC), et l'autre au violet brillant (BV) 421.
- Ajouter 8,0 x 10 5 PBMC à l'écoulement correspondant cytométrie tubes dans un volume final de 100 ul. Si les cellules ont été soumises au traitement de l'ICP décrit ci-dessus, ils devraient déjà être remises en suspension dans 100 pi à cette étape.
- Ajouter 25 pi de pMHC-I tétramère mélange maître à l'écoulement correspondant cytométrie tubes. À la fin de cette étape, le volume final dans chaque tube doit être de 125 ul.
- Vortexer chaque tube afin d'homogénéiser la suspension cellulaire.
- Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 45 min. Préparer le cocktail de surface de coloration de mAb pendant cette 45 minutes d'incubation.
La coloration de la surface 3.
- Préparer suffisamment mélange maître mAb pour colorer tous les tubes expérimentaux. Préparer un excès de 15% du volume total de ce mélange maître pour tenir comptepour le pipetage d'erreurs.
- Réglez le volume du mélange maître avec un tampon de tache de telle sorte que 50 ul sont ajoutés par test.
- Pour une bonne exclusion des lymphocytes T CD8 + non et la délimitation des sous - ensembles de mémoire, on utilise des quantités de mAb dirigés contre les molécules suivantes dans le mélange maître de coloration de la surface titrée.
NOTE: Les fluorochromes conjugués à chaque mAb sont fournis à titre de référence: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7 et CCR7 FITC. Notez que les mAb contre CD14, CD16 et CD20 sont conjugués à la même fluorochrome (ie, BV 510) , car ils seront inclus dans la porte "dump". - Inclure un colorant pouvant être fixé pour distinguer les cellules mortes dans le mélange maître de coloration de la surface [ie, colorant réactif amine (ARD)]. Assurez-vous que le réactif d'ARD est conjugué à un fluorochrome avec un spectre d'émission similaire à ceux utilisés dans la porte "dump". Dans ce cas, utilisez ARD Aqua.
- Ajouter 50 pi dele maître de coloration mélange décrit dans 3,1-3,4 à l'écoulement correspondant cytométrie tubes. À la fin de cette étape, le volume final dans chaque tube doit être de 175 ul.
- Vortex chaque tube. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 25 min.
- Laver les cellules avec du tampon de lavage (solution de PBS contenant 0,1% de sérum - albumine bovine et 0,45 g / L NaN3).
ATTENTION: L'azoture de sodium est une substance toxique. L'exposition à des quantités infimes peut provoquer des symptômes. Manipuler cette substance selon les directives spécifiées par la santé environnementale et de bureau (EHS) de sécurité de l'établissement où ces expériences sont effectuées. - Tubes à centrifuger à 510 g pendant 5 min. Décanter avec soin le surnageant dans un conteneur à déchets séparé. Veillez à ne pas perturber le culot.
ATTENTION: Ne pas transvaser lavage surnageant tampon dans des réservoirs contenant l' eau de Javel car il peut réagir avec l'azoture de sodium présent dans le tampon de lavage et entraîner la formation d'un gaz toxique 34. Contactez l'Office EHS dans l'établissement où ces expériences sont effectuées pour les lignes directrices sur la façon de disposer de l'azoture de sodium. - Après décantation, les cellules vortex dans le liquide retenu dans les restes de chaque tube.
4. Cellule de fixation
- Ajouter 250 ul de 2% de paraformaldehyde (PFA), une solution à tous les tubes pour fixer les cellules.
ATTENTION: PFA est une substance toxique. L'exposition à des quantités infimes peut provoquer des symptômes. Manipuler cette substance selon les directives spécifiées par le Bureau EHS dans l'établissement où ces expériences sont effectuées.- Etant donné que la solution de PFA 2% doit être isotonique aux cellules, en utilisant du PBS pour préparer cette solution. Cent millilitres d'une solution PFA 2% est suffisant pour des expériences multiples. vortex à fond tous les tubes immédiatement après l'addition de 2% de PFA, afin d'éviter la formation d'agrégats cellulaires.
- Incuber dans l'obscurité à 4 ° C pendant 20 min.
- Wcellules de cendres en répétant les étapes 3,7-3,9. Une fois cette étape terminée, les cellules peuvent être stockés dans l'obscurité à 4 ° C pendant 24-48 h. Avant de passer à la phase de perméabilisation, vortex à fond les tubes.
5. La perméabilisation de cellules
- Ajouter 500 pi de tampon de perméabilisation. Tourbillonnaire tous les tubes.
- Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 10 min.
- Laver les cellules en répétant les étapes 3,7-3,9.
6. intracellulaires Coloration
- Préparer suffisamment mélange maître mAb pour colorer tous les tubes expérimentaux.
- Réglez le volume avec du PBS ou le tampon de tache de telle sorte que 50 ul du mélange intracellulaire maître mAb sont ajoutés par test.
- Préparer le mélange maître mAb décrit dans 6.1 et 6.2 en utilisant des quantités de mAb dirigés contre CD3 et GZM B. titrée
NOTE: TCR engagement par tétramères pMHC-I peut se traduire par CD3 intériorisation, qui peut interférer avec la détection de tétramère + CD3 + CD8 +Les cellules T si le mAb anti-CD3 est ajouté au mélange maître de coloration de la surface. Pour éviter cela, ajouter le mAb anti-CD3 à ce stade, qui est, après que les cellules sont perméabilisées. Les fluorochromes conjugués à chaque mAb sont répertoriés comme une référence: CD3 PerCP Cy5.5 et GZM B PE. - Ajouter 50 ul de mAb cocktail aux tubes correspondants. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min.
- Laver les cellules en répétant les étapes 3,7-3,9. Les tubes sont prêts à être acquis dans un cytomètre de flux.
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Representative Results
Le protocole décrit ici a été utilisé pour déterminer l'amplitude et de la mémoire de phénotype CD8 +, les réponses des lymphocytes T spécifiques de Gag-CM9 induits par le vaccin dans une Mamu-A1 * 001 + macaque rhésus. Pour cette analyse, un tétramère Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugué a été utilisé dans un panneau de coloration cytométrie de flux 8 couleurs. Figure 1A - F montre la stratégie de déclenchement utilisé pour analyser les données, qui devraient être appliquées pour les deux tétramères présents dans chaque test. A noter que le tétramère pMHC-I + CD8 + population de lymphocytes T est bien séparée avec un fond minimum (figures 1F et G). La mémoire CD8 + des cellules T chez les macaques rhésus peuvent être classés en trois sous - ensembles en fonction de l'expression de surface de CD28 et CCR7: la mémoire centrale (T CM, CD28 + CCR7 +), la mémoire de transition (T EM1, CD28 + CCR7-) et effecteur mémoire (T EM2; CD28-CCR7-) 35.Ce protocole comprend en outre une étape de perméabilisation cellulaire pour la détection intracellulaire de MGZ B et CD3. Figure 1G - I montre la délimitation des sous - ensembles de mémoire et les cellules T GZM B exprimant CD8 + dans le tétramère + porte.
La coloration de fond peut donner des résultats optimaux dans pMHC-I des essais de marquage tétramère. Pour éviter cela, quelques précautions sont suggérées. Comme indiqué dans la section de protocole, les flacons contenant les réactifs tétramère pMHC-I doivent toujours être centrifugés à 20.000 xg pendant au moins 15 min avant la préparation des mélanges maîtres. Le but de cette étape est de culot d'agrégats de protéines qui peuvent se trouver dans la solution de tétramère pMHC-I. En outre, titration chaque réactif avant l'utilisation est également recommandée. Idéalement, les cellules qui font ou ne contiennent pas la population CD8 + T-cellules Ag-spécifique d'intérêt doit être étiqueté avec le tétramère pertinent pMHC-I MHC-I-appariés. Cette can être accompli par coloration cryoconservés PBMC de SIV naïve (contrôle négatif) et SIV-infectés (contrôle positif) macaques côte à côte avec différentes quantités d'un nouveau obtenu pMHC-I tétramère. Sur la figure 2, par exemple, 1,0 pl / test d'un Mamu-B * APC conjugué à 008: 01 / Nef RL10 tétramère a donné la meilleure séparation entre les populations de cellules T tétramère positives et négatives CD8 +. Enfin, le choix des fluorochromes peuvent également avoir un impact significatif sur les résultats obtenus à partir pMHC I colorations tétramère. A cet égard, les tétramères pMHC I conjugués à tamiser des molécules (par exemple, la fluorescéine) doit être évitée. Dans notre expérience, tétramères pMHC-I conjugués à des fluorochromes lumineux, tels que PE, APC, et BV 421, ont donné les meilleurs résultats.
Nous avons remarqué que Mamu-B * 017: 01 tétramères donnent généralement une coloration faible, même lorsqu'ils sont conjugués aux fluorochromes lumineuses mentionnées ci-dessus. Les raisons de cettefaible intensité de fluorescence ne sont pas tout à fait claire , mais pourrait inclure faible affinité TCR / Mamu-B * 017: 01 interactions et intériorisation TCR rapide lors de la liaison tétramère 36,37. Le long de ces lignes, IPK se sont révélés inhiber l' internalisation du TCR à la surface de T CD8 + 32 cellules. En conséquence, IPK peut améliorer la détection des CD8 + T-cellules Ag-spécifiques par pMHC-I coloration tétramère. Nous avons confirmé cet effet dans nos expériences, où la qualité de Mamu-B * 017: 01 tétramère colorations peuvent être sensiblement améliorées par le pré-traitement des PBMC avec une PKI (Figure 3). Curieusement, pré-traitement avec ce PKI n'a pas amélioré de manière significative la coloration des autres tétramères pMHC-I testés ici (données non présentées), ce qui suggère que Mamu-B * 017: les lymphocytes T CD8 + 01 restriction pourraient être uniques dans leur sensibilité au traitement PKI.
Figure 1: stratégie Gating et des résultats représentatifs d'un succès pMHC-I coloration tétramère. Nous avons évalué l'amplitude et de la mémoire phénotype des lymphocytes T CD8 + spécifiques de Gag-CM9 induits par le vaccin dans les PBMC à partir d' un Mamu-A1 * 001 + macaque rhésus. Ici, un tétramère Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugué a été utilisé dans un panneau de coloration cytométrie de flux 8 couleurs. (A - F) stratégie gating pour l' analyse cytométrique de flux. Tout d' abord, une porte sur singulets diagonale en cluster a été créé en traçant l' avant hauteur de dispersion (FSC-H) par rapport à la zone FSC (FSC-A), puis la hauteur de diffusion latérale (SSC-H) par rapport à la zone SSC (SSC-A; A et B) . Ensuite, une porte de temps a été créé qui comprenait uniquement les événements qui ont été enregistrés dans les 5 e et 90 e percentiles. Les cellules résultantes ont ensuite été déclenchés sur "décharge canal", cellules CD3 négatives + (C et D). A ce stade, lapopulation de lymphocytes a été tracée en fonction de son FSC-A et les propriétés du SSC-A et les analyses ultérieures ont été effectuées à l'intérieur de cellules CD8 + (E et F). Après avoir exposé pMHC-I tétramère + cellules (G), la mémoire d' analyse de phénotypage a été réalisée au sein de cette porte (H). Les cellules T rhésus mémoire macaque peuvent être classés en trois sous - ensembles en fonction de l'expression de CD28 et CCR7: une mémoire centrale (T CM, CD28 + CCR7 +), une mémoire de transition (T EM1, CD28 + CCR7-) et mémoire effecteurs (T ME2 ; CD28 CCR7-). Le présent protocole comprend également une étape de perméabilisation cellulaire pour l'évaluation intracellulaire de granzyme B (GZM B) expression au sein de tétramère + lymphocytes T CD8 + (I). La zone ombrée dans l'histogramme correspond à tétramère + lymphocytes T CD8 + colorées avec un contrôle mAb isotype. Bien que le tétramère BV 421 conjugué + population qui était présente dans cette coloration estnon représenté sur la figure, la même stratégie de déclenchement doit être utilisé pour l'analyser. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les résultats représentatifs du titrage d'un Mamu-B APC conjugué * 008: 01 / RL10 Nef tétramère. PBMC de deux Mamu-B * 008: 01+ macaques rhésus ont été utilisés pour cette expérience: un animal était SIV naïve et a servi de contrôle négatif tandis que l'autre a été infecté par le SIV et a servi de contrôle positif. Pour déterminer la quantité de Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tétramère qui donne la meilleure séparation entre tétramère + et T-cellules tetramer- CD8 +, PBMC de chaque animal ont été incubées avec les quantités de réactif de tétramère pMHC-I indiqués. Sur la base de ces résultats, 1,0 pl / wa tests choisie comme la quantité optimale à utiliser dans des analyses futures. La stratégie de portillonnage utilisée pour analyser les données est décrit à la figure 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Effets d' un traitement ICP sur l'intensité de fluorescence de Mamu-B * 017: 01 tétramères. L'inhibiteur de l' ICP inhibe l' internalisation des complexes de TCR et améliore la détection des CD8 + Ag-spécifique des cellules T par fluorochrome marqué pMHC-I tétramères 32 ainsi. (A - B) PBMC de deux Mamu-B * 017: 01+ macaques rhésus ont été utilisés dans cette expérience: un singe était SIV naïve et a servi de contrôle négatif (A), tandis que l'autre a été infecté par le SIV et servile contrôle positif (B). PBMC de deux animaux ont été mis à incuber à 37 ° C en présence de l'ICP à une concentration de 50 nM pendant 30 minutes avant la coloration avec un Mamu-B APC conjugué * 017: 01 / Nef IW9 tétramère, comme décrit dans la section Protocole . A titre de référence, une autre série de tubes a été soumis aux mêmes conditions d'incubation et de coloration, sauf que le diméthylsulfoxyde (DMSO) a été ajouté à la place de l'ICP. La stratégie de portillonnage utilisée pour analyser les données est décrit à la figure 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| protéines SIV | La position d' acide aminé | Séquence d' acides aminés | CMH de classe I Molecule (nouvelle nomenclature) | CMH de classe I Molecule (ancienne nomenclaturee) | Nom court Epitope |
| Gag | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Gag CM9 |
| Gag | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Gag QI9 |
| Gag | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Gag GY9 |
| Env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Env FW9 |
| Env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Env CL9 |
| Env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Env TL9 |
| Env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Env RY8 |
| Env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Vif WY8 |
| Tour | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| camelote | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | Nef YY9 |
Tableau 1: Liste des tétramères pMHC-I est disponible pour surveiller les réponses CD8 + spécifiques du SIV de lymphocytes T chez le macaque rhésus.
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Discussion
Quelques étapes de cette procédure mérite discussion car ils sont essentiels pour produire des résultats optimaux. Premièrement, étant donné la qualité des échantillons biologiques est un puissant prédicteur de la réussite de toute cytométrie de flux dosage 38, tous les soins doivent être prises pour veiller à ce que les cellules sont viables et en suspension au cours de la procédure de coloration. Ceci est particulièrement vrai lorsque l'on travaille avec des échantillons cryoconservés car elles sont plus sujettes à l'agglutination et contiennent généralement un plus grand nombre de cellules mortes. Dans ce cas, le passage de la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 pm avant l'opération de marquage tétramère pMHC-I pourrait améliorer considérablement les résultats. En second lieu, une compensation adéquate des fluorochromes utilisés dans l'analyse est critique pour une analyse précise des données, en particulier lorsque plusieurs paramètres sont évalués dans la même expérience. À cet égard, il est recommandé que les contrôles frais de compensation unique couleur être préparés pour chaque pMHC-I tétramère scontenant dosage. Nous sommes favorables à l'utilisation de billes de compensation en raison de leur large réactivité anti-Ig et le fait qu'ils donnent des distributions bimodales claires des populations positives et négatives. Étant donné que ces perles ne se lient pas à des molécules du CMH-I, les anticorps conjugués aux mêmes fluorophores que les tétramères pMHC-I (par exemple, APC et BV 421) doivent être utilisés en tant que témoins de compensation. Plusieurs de ces perles de compensation sont disponibles auprès de fournisseurs multiples et doivent être utilisés selon les instructions du fabricant. Troisièmement, étant donné que la stratégie de phénotypage décrite ici nécessite la délimitation des CD8 + sous - ensembles de cellules T basé sur l'expression graduée de trois molécules (c. -à- CD28, CCR7 et GZM B), des contrôles de déclenchement, tels que la fluorescence moins un des tests (FMO) ou des anticorps isotypiques appariés, devraient être utilisés pour faciliter ce type d'analyse. Dans nos expériences, par exemple, des tubes séparés contenant le tétramère pMHC-I + population CD8 + T-cellule d'intérêt d' unre toujours colorées avec mAb de contrôle isotype conjugués aux mêmes fluorochromes que les mAb contre CD28, CCR7 et GZM B. Il est important, bien que les directives susmentionnées pourraient aider à améliorer la qualité globale de pMHC-I tétramère Colorations, ils ne sont pas les seules variables peut affecter les performances de ce dosage. Compte tenu du caractère unique de chaque environnement de laboratoire, l'ensemble du workflow décrit ici doit être effectuée au moins une fois sur des échantillons simulés pour permettre la pratique et les ajustements pertinents.
Curieusement, pMHC-I tétramère cellules T CD8 + positives sont parfois observées dans les PBMC de naïfs SIV des macaques rhésus (non infectées et non vaccinés). Ces cas ne semblent pas être le résultat de la coloration de fond sur la base de l'inspection visuelle des données. Au contraire, ils pourraient refléter les interactions entre les molécules pMHC-I et tueuses récepteurs de type immunoglobuline (KIR) exprimées à la surface des macaques rhésus T-cellules NK et CD8 + 39,40. En effet, Mamu-A1 * 002: 01 tétramères pliée avec des peptides correspondant aux épitopes Gag et Env GY9 RY8 ont été montrés se lier à Mamu-KIRDL05 39. Le long de ces lignes, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 et Mamu-A1 * 002: 01 / Env RY8 sont plus enclins à exposer le pMHC-I coloration tétramère Ag indépendant décrit ci-dessus. Compte tenu de ce phénomène, il est important de contrôler la réactivité de cette référence dans les expériences impliquant des évaluations de singe longitudinales des réponses des CD8 + spécifiques du SIV de lymphocytes T après l' infection ou la vaccination. Pour ce faire, il est conseillé d'effectuer pMHC-I coloration tétramère sur des échantillons obtenus sur le premier jour du traitement. Il pourrait également être pertinent de geler PBMC dans plusieurs aliquotes de petite taille à ces points de temps initiaux en cas de comparaisons avec des échantillons de référence sont nécessaires dans des expériences futures.
Une limitation de pMHC-I coloration de tétramère est que seuls les lymphocytes T CD8 + des cellules de spécificité connue et la restriction du CMH-I cun être étudié par cette approche. Ceci est particulièrement pertinent dans les macaques rhésus compte tenu de l'organisation complexe de leur loci du CMH. En effet, un macaque rhésus haplotypes peuvent avoir des douzaines de gènes du CMH-I, dont toutes ne codent des molécules qui sont exprimés de manière stable sur la surface cellulaire 29. En conséquence, il peut être difficile de déterminer l'ensemble des molécules fonctionnelles du CMH-I exprimées par un animal donné. Néanmoins, cette mise en garde peut être surmontée par la conception des expériences qui incluent les singes qui sont positifs pour les allèles connus du CMH-I, tels que Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, et Mamu- B * 017: 01.
En conclusion, ce manuscrit fournit un pMHC-I protocole de coloration tétramère optimisé pour déterminer la fréquence et de la mémoire phénotype des cellules T spécifiques du SIV CD8 + chez les macaques rhésus. Etant donné que pMHC-I coloration de tétramère est plus sensible que l'IFN-γ et des tests ELISPOT de l'ICS pour la détection de l'Ag-CD8 spécifiques+ T-cellules et ne nécessite pas in vitro Ag stimulation, la méthodologie présentée ici est particulièrement utile pour étudier l'impact des CD8 + réponses des lymphocytes T dans l'issue de l' infection par le virus de l' immunodéficience. Les connaissances pratiques acquises de la maîtrise de cette technique pourrait également être utile pour enrichir les cellules T CD8 + Ag-spécifiques dans le cadre des études fonctionnelles et pour la surveillance de CD8 + réponses des lymphocytes T dans divers milieux de la maladie 6.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier David Watkins pour soutenir les expériences qui ont permis l'optimisation de la méthodologie actuelle. La recherche rapportée dans la présente publication a été financée en partie par une subvention pilote fourni par le Centre de Miami for AIDS Research des National Institutes of Health sous le numéro d'attribution P30AI073961. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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