Summary
Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für das Aufzählen und Rhesusaffe CD8 + T - Zellen gegen das AIDS - Virus zu charakterisieren. Dieser Artikel ist nützlich , nicht nur auf dem Gebiet der HIV Immunologie, sondern auch auf anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung , wo CD8 + T - Zell - Reaktionen bekannt sind , Krankheitsverlauf zu beeinflussen.
Abstract
Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC--I) Tetramere haben ein unschätzbares Werkzeug gewesen CD8 + T-Zell - Reaktionen zu untersuchen. Da diese Reagenzien binden direkt an T-Zell - Rezeptoren auf der Oberfläche von CD8 + T-Lymphozyten, Fluorochrom-markiertem pMHC-I Tetramere ermöglichen , die genaue Erfassung von Antigen (Ag) -spezifische CD8 + T-Zellen ohne die Notwendigkeit einer in vitro Re -Stimulation. Wenn darüber hinaus mit Mehrfarben kombiniert Durchflusszytometrie kann pMHC-I Tetramerfärbung Schlüsselaspekte der Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen zeigen, einschließlich Differenzierungsstadium, Gedächtnis Phänotyp und Aktivierungsstatus. Diese Arten von Analysen wurden besonders nützlich auf dem Gebiet der HIV Immunology wo CD8 + T-Zellen , das Fortschreiten zu AIDS beeinflussen können. Experimentelle Infektion von Rhesus-Makaken mit Simian Immunodeficiency Virus (SIV) stellt ein unschätzbares Werkzeug zelluläre Immunität gegen das AIDS-Virus zu untersuchen. Als Ergebnis erhebliche progress wurde bei der Definition und Charakterisierung T-Zell-Antworten in diesem Tiermodell hergestellt. Wir stellen hier ein optimiertes Protokoll für Aufzählen SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in rhesus macaques durch pMHC-I Tetramer-Färbung. Unser Assay erlaubt die gleichzeitige Quantifizierung und Speicher Phänotypisierung von zwei pMHC-I Tetramer + CD8 + T-Zell - Populationen pro Test, der für die Verfolgung von SIV-spezifischen CD8 + T-Zell - Antworten , die durch Impfung oder SIV - Infektion nützlich sein könnten. CD8 + T-Zellantworten in mehreren Krankheitseinstellungen unter Berücksichtigung der Relevanz von nicht - menschlichen Primaten in der biomedizinischen Forschung, ist diese Methode anwendbar für die Untersuchung.
Introduction
CD8 + T-Zellen umfassen eine entscheidende Komponente des adaptiven Immunsystems , wie sie in Tumor - Immunüberwachung und tragen zur Eradikation intrazellulärer Pathogene 1 teilnehmen. In einfachen Worten auszudrücken CD8 + T-Zellen T-Zell - Rezeptoren (TCR) , die spezifisch Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC--I) Moleküle auf der Plasmamembran der Wirtszellen erkennen. Da diese Peptide aus der Proteolyse von endogen synthetisierten Proteinen, Zelloberflächen pMHC-I-Komplexe liefern ein Fenster in die intrazelluläre Umgebung abgeleitet werden. Nach der Virusinfektion, zum Beispiel, werden infizierte Zellen zeigen MHC-I - Moleküle Virus abgeleitete Peptide enthält , die als Liganden für TCRs ausgedrückt durch patrouillieren CD8 + T-Zellen dienen kann. Im Falle einer infizierten Zelle präsentiert ein Virus-spezifischen CD8 + T-Zelle ihre pMHC-I - Liganden trifft, wird TCR Eingriff resultieren in CD8 + T-Zell - Aktivierung und ultifähr führen Zell-Lyse zu zielen. In Anbetracht der kritischen Natur dieser TCR / pMHC--I - Wechselwirkungen, die Bestimmung der Größe, Spezifität und Phänotyp reagieren CD8 + T-Zellen können offenbaren oft wichtige Hinweise auf Krankheiten beim Menschen.
Bis in die frühen 1990er Jahre, die Quantifizierung von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen auf der technisch anspruchsvollen Grenzverdünnung Assays herangezogen (LDA) 2,3. Nicht nur, dass mehrere Tage die LDA erfordern abgeschlossen werden, ist es auch nicht, Zellen zu erkennen, die proliferative Potential fehlte. Als Ergebnis unterschätzt die LDA in beträchtlichem Ausmaß die tatsächliche Häufigkeit von Antigen (Ag) -spezifische CD8 + T-Zellen in einer Immunantwort beteiligt. Obwohl die Entwicklung von ELISPOT und intrazellulären Zytokin - Färbung Assays die Fähigkeit stark verbesserte zelluläre Immunität zu messen, benötigt diese Methoden noch in - vitro - Stimulation zur Quantifizierung von Ag-spezifischen T-Zellen 4. Erst 1996, dass Altman, Davis, und colleagues ihre Wahrzeichen Artikel veröffentlicht , die Entwicklung der 5 - Technologie pMHC--I Tetramer berichten. Entscheidend für den Erfolg dieser Technik war die Multimerisierung von pMHC-I-Moleküle, die die Halbwertszeit von TCR / pMHC-I-Wechselwirkungen erweitert, wodurch die Wahrscheinlichkeit pMHC-I Tetramere während der Waschschritte von durchflusszytometrischen Assays Abfallen reduzieren. Der Hauptvorteil der pMHC-I - Tetramere in den vorgenannten Tests ist die Fähigkeit, genau Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen direkt ex vivo , ohne die Notwendigkeit für in vitro Restimulation detektieren. Darüber hinaus hat die Kombination von pMHC-I Tetramer - Färbung mit Mehrfarben - Zytometrie detaillierte Analysen der Differenzierungsstufe, Speicher Phänotyps erlaubt fließen und Aktivierungsstatus von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen 2-4. In Anbetracht der jüngsten technischen Fortschritte für die Charakterisierung von CD8 + T-Zell - Repertoires durch pMHC--I - Multimer Färbung 6, die Breite der Anwendungen for diese Methode ist wahrscheinlich, weiter zu wachsen.
Nur wenige Gebiete in der biomedizinischen Forschung haben mehr profitierte von pMHC--I Tetramerfärbung als dem Gebiet der HIV Immunologie 7. Obwohl CD8 + T-Zellen zeitlich mit der anfänglichen Kontrolle der HIV - Virämie durch den Zeitpunkt der Veröffentlichung von Altman, Davis und Kollegen 8,9 in Verbindung gebracht worden war, unser Verständnis für die Verwendung von pMHC--I Tetrameren in den folgenden Jahren deutlich ausgebaut die HIV-spezifischen CD8 + T-Zell - Antwort. Zum Beispiel half pMHC-I Tetramerfärbung die robust Größe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zell - Reaktionen in den meisten HIV-infizierten Personen 10-12 bestätigen. Diese Methode erleichtert auch die Charakterisierung von HIV- und SIV-spezifischen CD8 + T-Zell - Antworten beschränkt durch MHC-I - Moleküle mit spontaner Kontrolle der viralen Replikation in Abwesenheit von antiretroviralen Therapie-Phänomen als "Elite - control" bekannt assoziiert
Experimentelle SIV - Infektion von Rhesusaffen (Macaca mulatta) bleibt das beste Tiermodell für 18,19 Immun Interventionen gegen HIV / AIDS zu bewerten. In den letzten 25 Jahren erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in dieser Affenarten, einschließlich der Entdeckung von MHC-I - Allele und die Definition von Peptid - Bindungsmotive hergestellt 13,20-27 . Als Ergebnis wurden für die Analyse von SIV-spezifischen CD8 + T-Zell - pMHC-I Tetramere entwickelteAntworten in diesem Tiermodell 28. Die meisten dieser Reagenzien werden der Genprodukte von vier Rhesusaffe MHC-I - Allele hergestellt: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01 und Mamu-B * 017: 01. Zu beachten ist , Rhesusmakaken exprimieren keine MHC-C - Locus 29. Die überwiegende Mehrheit der pMHC--I-Tetramere in den vorliegenden Experimenten verwendet wurden bei der NIH Tetramer Core Facility an der Emory University produziert. Dennoch können einige dieser Reagenzien, einschließlich Mamu-A1 * 001 Tetrameren die immuno-Gag CM9 Epitop gebunden ist, nur aus kommerziellen Quellen aufgrund von Lizenzverträgen erworben werden. Verwendung pMHC-I Tetramere der vier Rhesusaffe Allele oben aufgeführten haben wir erfolgreich aufgezählt CD8 + T-Zellen gegen insgesamt 21 Epitope SIV (Tabelle 1), die durch Impfung oder primäre SIV - Infektion 30,31 (Martins et induziert wurden al., nicht veröffentlichte Beobachtungen).
Die vorliegende Manuskript stellt einoptimiert pMHC-I Tetramer Färbeprotokoll die Frequenz und die Speicher Phänotyp von SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in rhesus macaques zu bestimmen. Der Test beginnt mit einer elektiven 30 min Inkubation mit einem Proteinkinase - Inhibitor (PKI, hier Dasatinib verwendet wird), um TCR - Internalisierung zu verringern und dadurch verbessern pMHC-I Tetramer 32 Anfärbung. Wie unten beschrieben, ist diese Behandlung besonders nützlich, wenn Mamu-B * 017 unter Verwendung von: 01-Tetramere. Die Anleitung, wie die Zellen mit fluorochromkonjugierten pMHC--I Tetrameren und monoklonale Antikörper (mAb) zu beschriften sind ebenfalls vorhanden. Dieses Protokoll umfasst auch eine Zellpermeabilisierung Schritt für die intrazellulären Nachweis des Zytolyse-assoziierten Moleküls Granzym B (GZM B). Der mAb gegen CD3 wird bei diesem Schritt hinzugefügt, und Nachweis dieses TCR Signalmoleküls zu verbessern. Als Referenz, die alle in dieser Färbung Platte eingesetzt Fluorochrome werden aufgelistet.
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Protocol
Die Pbmc (PBMC) Proben in diesem Manuskript verwendet wurden, aus der indischen Rhesusmakaken am Wisconsin-National Primate Research Center untergebracht erhalten. Diese Tiere wurden betreut in Übereinstimmung mit dem Weatherall Bericht unter einem Protokoll , das von der University of Wisconsin Graduate School Animal Care und Use Committee 33 genehmigt. Alle Tier Verfahren wurden unter Anästhesie und alle Bemühungen durchgeführt wurden gemacht, potentielle Leiden zu minimieren.
1. PKI-Behandlung
Hinweis: Dies ist optional, aber für Mamu-B * 017 empfohlen: 01 Tetrameren. Siehe Ergebnisse und Diskussion Abschnitte.
- Resuspendieren PBMC in R10 - Medium bei einer Konzentration von 1,6 x 10 7 Zellen / ml.
- Je 50 ul dieser Zellsuspension zu dem entsprechenden Durchflusscytometrie Rohre. Werden 50 ul einer 100 nM Lösung von PKI zu jedem Röhrchen.
- Vortex jedes Röhrchen. für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Bis Ende diesesSchritt sollte jedes Röhrchen wurden 100 ul einer Zellsuspension haben die 8,0 x 10 5 PBMC und 50 nM von PKI.
- Fahren Sie mit dem pMHC--I Tetramerfärbung Schritt.
2. Die Färbung mit Fluorochrom-markierten pMHC--I Tetramere
- Vor der Herstellung des pMHC--I Tetramer Master-Mix, Zentrifuge die pMHC--I Tetramer Röhrchen bei 20.000 g für mindestens 15 min bei 4 ° C. Das Ziel dieses Schrittes ist es Proteinaggregate in dem pMHC-I Tetramer Lösung zu pelletieren, die Hintergrundfärbung erhöhen. Sobald der Zentrifugationsschritt durchgeführt wird, zu vermeiden Pipettieren von dem Boden des Röhrchens, wo die Proteinaggregate angesammelt haben.
- Bereiten Sie genügend pMHC--I Tetramer Master-Mix alle experimentellen Röhren zu färben. Bereiten Sie einen Überschuss von 15% des Gesamtvolumens dieses Mastermixes zu Konto für Fehler Pipettieren.
- Verdünnte pMHC--I Tetrameren in Flecken Puffer (zB Brilliant Stain Buffer) , so dass 25 ul des pMHC--I Tetramer Master - Mix adde sindd jedem Test.
- Label-PBMC mit zwei pMHC--I Tetrameren pro Test; ein bis Allophycocyanin (APC) und das andere an Brilliant Violet (BV) 421 konjugiert.
- Hinzufügen 8,0 x 10 5 PBMC mit dem entsprechenden Durchflusscytometrie Röhrchen in einem Endvolumen von 100 & mgr; l. Wenn die Zellen an der PKI oben beschriebenen Behandlung unterzogen wurden, sollten sie bereits in 100 & mgr; l bei diesem Schritt wieder suspendiert werden.
- In 25 ul pMHC--I Tetramer Master-Mix auf den entsprechenden Durchflusszytometrie Röhren. Bis zum Ende dieses Schritts sollte das Endvolumen in jedem Röhrchen 125 & mgr; l sein.
- Vortexen jedes Rohr, um die Zellsuspension zu homogenisieren.
- Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 45 min. Bereiten Sie die Oberflächenfärbung mAb Cocktail während dieser 45 Minuten Inkubation.
3. Oberflächenfärbung
- Bereiten Sie genügend mAb Master-Mix alle experimentellen Röhren zu färben. Bereiten eines Überschusses von 15% des Gesamtvolumens dieses Mastermix zu entfallenzum Pipettieren Fehler.
- Stellen Sie die Lautstärke des Master-Mix mit Flecken Puffer, so dass 50 & mgr; l pro Test hinzugefügt werden.
- Für eine korrekte Ausschluss nicht CD8 + T-Zellen und Abgrenzung der Speicheruntergruppen, Einsatzmengen an gegen die folgenden Moleküle in der Oberflächenfärbung Mastermix gerichtet mAbs titriert.
HINWEIS: Die Fluorochrome zu jedem mAbs konjugiert sind als Referenz angegeben: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510 CD8a BV 785, CD28 PE Cy7 und CCR7 FITC. Beachten Sie, dass die mAbs gegen CD14, CD16 und CD20 auf den gleichen Fluorochrom konjugiert sind (dh, BV 510) , da sie in der "dump" Tor aufgenommen werden. - Fügen Sie einen fixierbaren Farbstoff zur Unterscheidung toten Zellen in der Oberflächenfärbung Mastermix [dh Amin Reaktivfarbstoff (ARD)]. Stellen Sie sicher, dass die ARD-Reagenz an ein Fluorochrom mit einem ähnlichen Emissionsspektrum wie die, die in der "dump" Gate verwendet konjugiert ist. In diesem Fall verwenden Sie ARD Aqua.
- In 50 uldie Färbung Master-Mix in 3,1-3,4 auf den entsprechenden Durchflusszytometrie Röhren beschrieben. Bis zum Ende dieses Schritts sollte das Endvolumen in jedem Röhrchen 175 & mgr; l sein.
- Vortex jedes Röhrchen. Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 25 min.
- Wasche die Zellen mit Waschpuffer (PBS - Lösung , 0,1% Rinderserumalbumin und 0,45 g / l NaN 3 enthält).
ACHTUNG: Natriumazid ist eine toxische Substanz. Die Exposition gegenüber selbst geringste Mengen können Symptome verursachen. Gehen Sie mit diesem Stoff nach den vorgegebenen Richtlinien der Environmental Health and Safety (EHS) Büro in der Einrichtung, wo diese Experimente durchgeführt werden. - Zentrifugenröhrchen bei 510 xg für 5 min. Überstand vorsichtig in einen separaten Abfallbehälter umfüllen. Achten Sie darauf, nicht das Pellet zu stören.
ACHTUNG: Nicht Waschpuffer Überstand in Stauseen mit Bleichlauge dekantieren , wie es mit dem Natriumazid in der Waschpuffer und führen zur Bildung eines giftigen Gases 34 reagieren kann. Contact das EHS Amt in der Einrichtung, in der diese Experimente für Richtlinien durchgeführt werden, wie Natriumazid zu entsorgen. - Nach dem Abgießen, Vortex, um die Zellen in der übriggebliebenen Flüssigkeit in jedem Röhrchen aufbewahrt.
4. Zellfixierung
- In 250 ul einer 2% Paraformaldehyd (PFA) Lösung für alle Rohre, die die Zellen zu fixieren.
ACHTUNG: PFA ist eine giftige Substanz. Die Exposition gegenüber selbst geringste Mengen können Symptome verursachen. Gehen Sie mit diesem Stoff nach den von der EHS Amt festgelegten Richtlinien in der Einrichtung, wo diese Experimente durchgeführt werden.- Da die 2% PFA-Lösung zu den Zellen isotonisch sein müssen, verwenden diese PBS-Lösung herzustellen. Einhundert Milliliter einer 2% PFA-Lösung ist für mehrere Experimente genug. Gründlich vortexen alle Rohre unmittelbar nach der Zugabe von 2% PFA, um die Bildung von Zellaggregaten zu verhindern.
- im Dunkeln inkubieren 20 min bei 4 ° C.
- WAsche-Zellen durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen. Sobald dieser Schritt abgeschlossen ist, können die Zellen im Dunkeln bei 4 ° C für 24-48 Stunden gelagert werden. Bevor ich auf die Permeabilisierungs Phase verläuft, Strudel, die durch und durch Rohre.
5. Die Permeabilisierung der Zellen
- In 500 ul Permeabilisierung Puffer. Vortex alle Röhrchen.
- Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min.
- Wash-Zellen durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen.
6. intrazelluläre Färbung
- Bereiten Sie genügend mAb Master-Mix alle experimentellen Röhren zu färben.
- Stellen Sie die Lautstärke mit PBS oder Flecken Puffer, so dass 50 ul des intrazellulären mAb Master-Mix pro Test hinzugefügt werden.
- Bereiten Sie den mAb Master-Mix in 6.1 und 6.2 unter Verwendung von Mengen von mAb gegen CD3 und GZM B. titriert
HINWEIS: TCR Eingriff mit pMHC-I Tetrameren kann in CD3 Internalisierung führen, die mit der Detektion von Tetramer + CD3 + CD8 + störenT-Zellen, wenn die anti-CD3-mAb auf die Oberfläche Anfärbung Mastermix zugesetzt. Um dies zu vermeiden, fügen Sie den Anti-CD3-mAb in diesem Stadium, das heißt, nachdem die Zellen permeabilisiert werden. CD3 PerCP Cy5.5 und GZM B PE: die Fluorochrome zu jedem mAb, konjugiert sind als Referenz aufgeführt. - In 50 ul mAb Cocktail zu den entsprechenden Rohren. Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min.
- Wash-Zellen durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen. Die Rohre sind bereit Zytometer in einem Strömungs erworben werden.
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Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll verwendet worden ist, die Größe und die Speicher Phänotyp von Impfstoff-induzierten, CM9 Gag-spezifischen CD8 + T-Zell - Antworten in einem Mamu-A1 * 001 + Rhesusaffe zu bestimmen. Für diese Analyse wird ein APC-konjugiertem Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 Tetramer wurde in einem 8-Farb durchflusszytometrischen Anfärbung Tafel verwendet. 1A - F zeigt die Strategie Gating verwendet , um die Daten zu analysieren, die für beide Tetramere angewendet werden sollte , die in jedem Test. Beachten Sie, dass die pMHC-I Tetramer + CD8 + T-Zellpopulation auch mit minimalem Hintergrund (Figuren 1F und G) getrennt ist. (; CD28 + CCR7 + T CM), die Übergangsspeicher Zentralspeicher (T EM1; CD28 + CCR7-) und Effektor: Speicher CD8 + T-Zellen in rhesus macaques kann als drei Untergruppen auf der Basis der Oberflächenexpression von CD28 und CCR7 klassifizieren Speicher (T EM2; CD28-CCR7-) 35.Dieses Protokoll umfasst auch eine Zellpermeabilisierung Schritt zur intrazellulären Nachweis von GZM B und CD3. Figur 1G - I zeigt die Abgrenzung von Speicheruntergruppen und GZM B-exprimierenden CD8 + T-Zellen innerhalb der Tetramer + gate.
Die Hintergrundfärbung kann suboptimalen Ergebnissen in pMHC--I Tetramer Kennzeichnung Assays ergeben. Um dies zu vermeiden, sind einige Vorsichtsmaßnahmen vorgeschlagen. Wie in dem Protokollabschnitt angegeben, sollten die Fläschchen, die pMHC--I Tetramer Reagenzien enthält immer mindestens 15 min vor der Herstellung der Mastermixes bei 20.000 · g zentrifugiert werden. Das Ziel dieses Schrittes ist es, alle Protein-Aggregate zu pelletieren, die in dem pMHC-I Tetramer Lösung sein kann. Zusätzlich jedes Reagenz titriert vor der Verwendung wird auch empfohlen. Idealerweise Zellen MHC-I-abgestimmt , das tun oder nicht enthalten sollte , die Ag-spezifischen CD8 + T-Zellpopulation von Interesse mit dem entsprechenden pMHC--I Tetramer markiert werden. Diese can durch Anfärben kryokonservierten PBMC aus SIV naiven erreicht werden (negative Kontrolle) und SIV-infizierten (positive Kontrolle) macaques nebeneinander mit verschiedenen Mengen eines neu pMHC-I Tetramer erhalten. In Figur 2 beispielsweise 1,0 & mgr; l / Test eines APC-konjugiertem Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 Tetramer ergab die beste Trennung zwischen Tetramer positive und negative CD8 + T-Zellpopulationen. Schließlich kann die Wahl von Fluorochrom auch deutlich die Ergebnisse aus pMHC--I Tetramer Färbungen erhalten auswirken. In dieser Hinsicht konjugiert pMHC-I Tetramere Moleküle (zB Fluorescein) zu dimmen vermieden werden sollte. Nach unserer Erfahrung konjugiert pMHC--I Tetrameren helle Fluorochromen wie PE, APC, und BV 421, haben die besten Ergebnisse erzielt.
Wir haben bemerkt, dass Mamu-B * 017: 01 Tetramere typischerweise dim Färbung ergeben, auch wenn zu den hellen Fluorochrome oben genannten konjugiert. Die Gründe hierfürniedrige Fluoreszenzintensität sind nicht ganz klar , aber möglicherweise niedriger Affinität TCR / Mamu-B * 017 umfassen: 01 - Wechselwirkungen und schnelle TCR Internalisierung auf Tetramer Bindung 36,37. In dieser Richtung haben, PKIs gezeigt worden TCR Internalisierung auf der Oberfläche von CD8 + T-Zellen 32 zu hemmen. Als Ergebnis kann PKIs Nachweis von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen durch pMHC-I Tetramer - Färbung verbessern. Wir haben diesen Effekt in unseren Experimenten bestätigt, wo die Qualität der Mamu-B * 017: 01 Tetramer Anfärbungen können im wesentlichen durch Vorbehandeln PBMC mit einer PKI (Abbildung 3) verbessert werden. Erstaunlicherweise hat die Vorbehandlung mit diesem PKI nicht signifikant die Färbung von anderen hier getesteten pMHC-I Tetramere verbessern (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet , dass Mamu-B * 017: 01-restringierte CD8 + T-Zellen in ihrer Empfindlichkeit eindeutig sein könnten zu PKI Behandlung.
Abbildung 1: Gating - Strategie und repräsentative Ergebnisse eines erfolgreichen pMHC--I Tetramerfärbung. Wir untersuchten die Größe und die Speicher Phänotyp von Impfstoff-induzierten Gag CM9-spezifischen CD8 + T-Zellen in PBMC von einem Mamu-A1 * 001 + Rhesusaffe. Hier wird ein APC-konjugiertem Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 Tetramer wurde in einem 8-Farb durchflusszytometrischen Anfärbung Tafel verwendet. (A - F) Gating - Strategie für die durchflusszytometrische Analyse. Zunächst wurde durch Auftragen Vorwärtsstreuung Höhe (FSC-H) im Vergleich zu FSC - Bereich (FSC-A) und dann Seitenstreuhöhe (SSC-H) im Vergleich zu SSC - Bereich ein Tor auf diagonal gruppierten singlets erstellt (SSC-A; A und B) . Als nächstes wurde ein Zeittor erzeugt , die nur die Ereignisse enthalten , die innerhalb der 5. und 90. Perzentile aufgenommen wurden. Die resultierenden Zellen wurden dann gated on "dump Kanal" negative, CD3 + Zellen (C und D). In diesem Stadium derLymphozytenpopulation wurde auf der Grundlage ihrer FSC-A abgegrenzt und SSC-A Eigenschaften und nachfolgenden Analysen wurden innerhalb von CD8 + Zellen (E und F) durchgeführt. Nach der Darstellung pMHC-I Tetramer + -Zellen (G), wobei der Speicher Phänotypisierung Analyse wurde innerhalb dieses Gate (H) durchgeführt. Rhesusaffe Gedächtnis - T-Zellen kann in drei Untergruppen basierend auf der Expression von CD28 und CCR7 eingeteilt werden: (; CD28 + CCR7 + T CM), die Übergangsspeicher Zentralspeicher (T EM1; CD28 + CCR7-) und Effektor - Speicher (T EM2 ; CD28-CCR7-). Dieses Protokoll umfasst auch eine Zellpermeabilisierung Schritt für die Auswertung von intrazellulärem Granzyme B (GZM B) Expression in Tetramer + CD8 + T-Zellen (I). Der schattierte Bereich in dem Histogramm entspricht Tetramer + CD8 + T-Zellen , die mit einem Isotyp-Kontroll - mAb gefärbt. Obwohl die BV 421-konjugierten Tetramer + Population, die in dieser Färbung vorhanden war, istnicht in der Figur gezeigt, sollte die gleiche Gating-Strategie zu analysieren verwendet werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der Titration einer APC-konjugierten Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 Tetramer. PBMC von zwei Mamu-B * 008: 01+ Rhesusmakaken wurden für dieses Experiment verwendet: ein Tier war SIV naiv und diente als negative Kontrolle , während der andere war SIV-infizierten und diente als Positivkontrolle. Zur Bestimmung der Menge an Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 Tetramer, die die beste Trennung zwischen Tetramer + und tetramer- CD8 + T-Zellen PBMC von jedem Tier liefert wurden mit den angegebenen Mengen des pMHC-I Tetramer Reagenz inkubiert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden 1,0 ul / Test was als die optimale Menge gewählt, um in zukünftigen Tests verwendet werden. Die Gating - Strategie , um die Daten zu analysieren , verwendet wird , in Figur 1 beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Wirkungen von PKI - Behandlung auf die Fluoreszenzintensität von Mamu-B * 017: 01 Tetrameren. Die PKI - Inhibitor hemmt die Internalisierung von TCR - Komplexe und verbessert dadurch Nachweis von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen durch Fluorochrom-markiertem pMHC-I Tetramere 32. (A - B) PBMC von zwei Mamu-B * 017: 01+ Rhesusmakaken in diesem Experiment verwendet wurden: ein Affe war SIV naiv und diente als negative Kontrolle (A), während die andere mit SIV infiziert war und diente alsDie positive Kontrolle (B). PBMC von beiden Tiere wurden bei 37 ° C in Gegenwart von PKI in einer Konzentration von 50 nM für 30 min vor dem Färben mit einer APC-konjugiertem Mamu-B * 017 inkubiert: 01 / Nef IW9 Tetramer, wie in dem Protokoll beschrieben . Als Referenz wurde ein weiterer Satz von Rohren auf die gleichen Inkubations- und Färbungsbedingungen unterworfen, außer dass Dimethylsulfoxid (DMSO) anstelle von PKI hinzugefügt. Die Gating - Strategie , um die Daten zu analysieren , verwendet wird , in Figur 1 beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| SIV - Protein | Aminosäure-Position | Aminosäuresequenz | MHC - Klasse - I - Molekül (neue Nomenklatur) | MHC - Klasse - I - Molekül (alte Nomenclature) | Epitops Kurzname |
| Gag | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag CM9 |
| Gag | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag QI9 |
| Gag | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag GY9 |
| env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | env FW9 |
| env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env CL9 |
| env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env TL9 |
| env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY8 |
| env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Vif WY8 |
| Umdrehung | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| Tat | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 16.08 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | Nef YY9 |
Tabelle 1: Liste der pMHC--I Tetrameren für die Überwachung SIV-spezifischen CD8 + T-Zellantworten in Rhesusmakaken.
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Discussion
Ein paar Schritte in diesem Verfahren Verdienst Diskussion, wie sie sind entscheidend für optimale Ergebnisse liefert. Erstens, weil die Qualität der biologischen Proben ein starker Prädiktor für den Erfolg eines Durchflusszytometrie - Assay 38 ist, müssen alle darauf zu achten, dass die Zellen lebensfähig und in Suspension während der Färbung sind. Dies ist besonders relevant, wenn sie mit kryokonservierten Proben arbeiten, da sie anfälliger für Verklumpung und enthalten typischerweise eine höhere Anzahl von toten Zellen. In diesen Fällen könnten die Ergebnisse wesentlich zu verbessern einer 70 & mgr; m Zelle Sieb vor dem pMHC--I Tetramer Markierungsverfahren der Zellsuspension der Durchreise. Zweitens richtige Kompensation der Fluorochrome in dem Assay verwendet wird, ist kritisch für eine genaue Datenanalyse, insbesondere dann, wenn mehrere Parameter in dem gleichen Experiment evaluiert. In diesem Zusammenhang empfiehlt es sich, frische einfarbige Kompensationssteuerungen für jeden pMHC--I Tetramer s hergestellt werdenTaining Test. Wir bevorzugen die Verwendung der Entschädigung Perlen wegen ihrer breiten anti-Ig-Reaktivität und die Tatsache, dass sie klar bimodale Verteilungen von positiven und negativen Populationen ergeben. Da diese Perlen an MHC-I - Moleküle binden nicht, konjugierte Antikörper gegen die gleiche Fluorophore wie die pMHC--I Tetrameren (zB APC und BV 421) als Kompensationssteuerungen verwendet werden. Mehrere solcher Kompensations Perlen sind von verschiedenen Anbietern zur Verfügung und sollten gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Drittens beschrieben , da die Phänotypisierung Strategie hier erfordert die Abgrenzung von CD8 + T-Zell - Untergruppen auf der abgestuften Expression von drei Molekülen basiert (dh CD28, CCR7 und GZM B), Gating Kontrollen, wie Fluoreszenz minus eins (FMO) Tests oder Isotyp-Antikörper, sollte diese Art von Analysen zu erleichtern, verwendet werden. In unseren Experimenten zum Beispiel getrennte Röhren die pMHC--I Tetramer + CD8 + T-Zellpopulation von Interesse ein enthält ,re immer mit Isotyp-Kontrolle mAb, konjugiert an den gleichen Fluorochrome wie die mAbs gegen CD28, CCR7 und GZM B. Wichtig ist gefärbt, obwohl die oben genannten Richtlinien helfen könnte, die Gesamtqualität der Verbesserung pMHC--I Anfärbungen Tetramer, sind sie nicht die einzigen Variablen, die die Leistung dieses Assays beeinträchtigen kann. In Anbetracht der Einzigartigkeit jedes Laborbedingungen, beschrieben der gesamte Workflow hier sollte mindestens einmal auf Mock-Proben durchgeführt werden, für die Praxis und entsprechenden Anpassungen zu ermöglichen.
Seltsamerweise , Tetramer pMHC--I positive CD8 + T-Zellen werden gelegentlich in PBMC von SIV naiven (nicht - infizierten und nicht geimpften) Rhesusmakaken beobachtet. Diese Fälle scheinen nicht das Ergebnis von Hintergrundfärbung zu sein, basierend auf Sichtprüfung der Daten. Vielmehr sie Wechselwirkungen zwischen pMHC--I - Molekülen und Killer - Immunoglobulin-like Rezeptoren (KIR) , ausgedrückt auf der Oberfläche der Rhesusaffe NK und CD8 + T-Zellen , beeinträchtigen könnten 39,40. Tatsächlich Mamu-A1 * 002: 01 Tetramere gefaltet mit Peptiden zu den Gag GY9 und Env RY8 Epitope wurden entsprechende zu Mamu-KIRDL05 39 zu binden , gezeigt. Entlang dieser Linien, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 und Mamu-A1 * 002: 01 / Env RY8 sind anfälliger für Aussteller der Ag-unabhängige pMHC--I Tetramerfärbung oben beschrieben. Angesichts dieses Phänomens ist es wichtig , für diese Basis Reaktivität in monkey Experimenten zur Steuerung beteiligt Längsabschätzungen von SIV-spezifischen CD8 + T-Zell - Reaktionen nach einer Infektion oder Impfung. Um dies zu erreichen, ist es ratsam pMHC-I Tetramer-Färbung an Proben die am ersten Tag der Behandlung durchzuführen. Es könnte sich auch bei diesen ersten Zeitpunkten für den Fall, Vergleiche zu frieren PBMC in mehreren kleinformatigen Aliquots relevant werden mit Baseline-Proben, die in zukünftigen Experimenten benötigt werden.
Eine Einschränkung pMHC-I Tetramer - Färbung ist , dass nur CD8 + T-Zellen bekannter Spezifität und MHC-I - Restriktions cein durch diesen Ansatz untersucht werden. Dies ist besonders relevant in Rhesusmakaken die komplexe Organisation ihrer MHC-Loci gegeben. In der Tat eine einzige Rhesusaffe Haplotyp Dutzende von MHC-I - Gene haben kann, von denen nicht alle kodieren Moleküle , die auf der Zelloberfläche 29 stabil exprimiert werden. Als Ergebnis kann es schwierig sein, die Menge der funktionellen MHC-I-Moleküle von einem gegebenen Tier exprimiert zu bestimmen. Dennoch kann diese Einschränkung durch die Gestaltung Experimente überwunden werden , die Affen sind , die für die bekannten MHC-I - Allele positiv sind, wie Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01 und Mamu- B * 017: 01.
Zusammenfassend stellt dieses Manuskript eine optimierte pMHC-I Tetramer Färbeprotokoll die Frequenz und die Speicher Phänotyp von SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in rhesus macaques zu bestimmen. Da pMHC-I Tetramer-Färbung ist empfindlicher als IFN-γ ELISPOT und ICS-Assays zum Nachweis von Ag-spezifischen CD8+ T-Zellen und erfordert keine in vitro Stimulation Ag, präsentiert die Methodik hier ist besonders nützlich , um die Auswirkungen von CD8 + T-Zell - Antworten in dem Ergebnis der immunodeficiency Virus - Infektion zu studieren. Das praktische Wissen von Beherrschung dieser Technik erworben könnte auch zur Anreicherung von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen als Teil der funktionellen Studien und zur Überwachung von CD8 + T-Zellantworten in verschiedenen Krankheitseinstellungen 6 nützlich sein.
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Acknowledgments
Wir möchten, dass David Watkins für die Unterstützung der Experimente zu danken, die die Optimierung der vorliegenden Methodik ermöglicht. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde teilweise durch einen Piloten Zuschuss zur Verfügung gestellt von der Miami-Zentrum für AIDS-Forschung der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer P30AI073961 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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