Summary
Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.
Abstract
Peptit-büyük doku uygunluk kompleksi sınıf I (pMHC-I) tetramerler CD8 + T hücre yanıtlarını incelemek için paha biçilmez bir araç olmuştur. Bu reaktifler, doğrudan CD8 + T lenfositlerinin yüzeyinde bulunan, T-hücresi reseptörlerine bağlanan için, florokrom etiketli pMHC I tetramerleri antijenin doğru algılama (ag) 'in vitro yeniden gerek kalmadan-spesifik CD8 + T hücreleri etkinleştirmek -uyarım. Akım sitometri çoklu renk ile kombine Dahası, pMHC-I tetramer boyama farklılaşma aşamasında, bellek fenotip ve aktivasyon durumu da dahil olmak Ag-spesifik CD8 + T-hücrelerinin temel yönlerini, ortaya çıkarabilir. CD8 + T hücreleri AIDS'e ilerlemesini etkileyebilir nerede analizler bu tür HIV immünoloji alanında özellikle yararlı olmuştur. maymun bağışıklık yetersizliği virüsü ile rhesus makak (SIV) Deneysel enfeksiyonu AIDS virüsüne karşı hücresel bağışıklığı incelemek için paha biçilmez bir araç sağlar. Bunun bir sonucu olarak, önemli bir PROGREp, bu hayvan modelinde T hücre yanıtlarını tanımlanması ve karakterize yapılmıştır. Burada pMHC I tetramer boyama ile resus makaklarda SIV spesifik CD8 + T hücrelerinin sayımı da optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bizim deney aşılama veya SIV enfeksiyonu ile üretilmiş SIV spesifik CD8 + T-hücresi yanıtları izlemek için yararlı olabilir, test başına iki pMHC I tetramer +, CD8 + T-hücre popülasyonları, eş zamanlı miktar ve bellek fenotiplendirilmesini mümkün kılar. Biyomedikal araştırmalarda insan olmayan primatlarda alaka göz önüne alındığında, bu yöntem, bir çok hastalık ayarları CD8 + T-hücresi yanıtları çalışmak için de geçerlidir.
Introduction
Bunlar tümör immün gözetim katılmak ve hücre içi patojenlere 1 eradikasyonu katkıda bulundukları için, CD8 + T-hücreleri, uyarlayıcı bağışıklık sisteminin önemli bir bileşen ihtiva eder. Basitçe, CD8 + T hücrelerinin konakçı hücrelerin plazma membranı üzerinde mevcut olan T-hücresi spesifik peptid ana histo-uyumluluk kompleksi sınıf I (pMHC-I) tanıyan reseptörleri (TCR'ler) molekülleri ifade eder. Bu peptitler endojen biçimde sentezlenmiş proteinlerin proteolizine türetilir için, hücre yüzeyi pMHC-I kompleksleri hücre içi ortamı bir pencere sağlar. Virüs enfeksiyonu üzerine, örneğin, enfekte olmuş hücreler, CD8 + T hücreleri tarafından ifade edilen devriye TCRler için ligandlar olarak görev yapabilir virüs türevli peptitler içeren MHC-I-molekülleri gösterir. Bir virüs spesifik CD8 + T-hücresi pMHC I ligandını sergileyen bir enfekte olmuş hücre ile karşılaştığında durumunda, TCR etkileşimi CD8 + T-hücresi aktivasyonu ve ulti neden olurkalıntılarından hücre parçalama hedef yol açar. CD8 + T hücrelerinin yanıt büyüklüğü, özgüllük ve fenotip belirlenmesi, bu TCR / pMHC-I etkileşimlerinin kritik doğası göz önüne alındığında genellikle insan hastalıkları ile ilgili önemli ipuçları ortaya çıkarabilir.
1990'ların başına kadar Ag-spesifik CD8 + T hücrelerinin sayılmasına teknik talep sınırlayıcı seyreltme yöntemi (LDA) 2,3 dayanıyordu. LDA birkaç gün gerek yoktu tamamlanması için değil sadece, aynı zamanda proliferatif potansiyeli yoksun hücreleri algılamak için başarısız oldu. Bunun bir sonucu olarak, LDA ölçüde bir bağışıklık tepkisi katılan antijen (Ag) e özgü CD8 + T-hücreleri gerçek sıklığını göz ardı. ELISPOT ve hücre içi sitokin boyama deneyleri geliştirilmesi büyük selüler bağışıklığın ölçülmesi yeteneği geliştirilmiş olmasına rağmen, bu yöntemler de Ag-spesifik T-hücrelerini 4 ölçülmesi için in vitro uyarımı için gerekli. 1996 Altman, Davis ve argo kadar değildieagues pMHC-I tetramer teknolojisinin 5 gelişimini raporlama dönüm noktası makale yayınladı. Bu tekniğin başarısı için kritik böylece akış sitometrik deneylerinin yıkama adımları sırasında düşen pMHC I tetramerleri olasılığını azaltır, TCR / pMHC I etkileşimlerinin yarı ömrü uzatılmış pMHC I moleküllerinin multimerizasyon oldu. Yukarıda belirtilen testlere göre pMHC I tetramerleri en önemli avantajı, doğru in vitro yeniden uyarımı için ihtiyaç olmaksızın doğrudan ex vivo Ag-spesifik CD8 + T-hücreleri tespit yeteneğidir. Ayrıca, çok renkli olan pMHC I tetramer boyama kombinasyonu sitometrisi farklılaşma aşamasında, bellek fenotip ve Ag-spesifik CD8 + T-hücreleri 2-4 aktivasyonu durumunun analizleri sağladı akış. CD8 + T hücre repertuar karakterize etmek için son teknik gelişmeler ışığında pMHC-I, uygulama genişliklerini fo 6 boyama multimerr Bu metodoloji genişleterek devam etmesi muhtemeldir.
Biyomedikal araştırmalarda birkaç alanları HIV immünoloji 7 alanından daha pMHC-ı tetramer boyama daha yararlanmıştır. CD8 + T hücreleri geçici olarak Altman, Davis ve arkadaşları 8,9 ile yayınlandığı zaman HIV viremi ilk kontrolü ile ilişkili olmasına rağmen, takip eden yıllarda pMHC-I tetramers kullanımı önemli ölçüde daha iyi anlamamızı sağlamıştır CD8 + T hücresi tepkisi HIV 'a özel. Örneğin, pMHC I tetramer boyaması çok HIV bulaşmış kişilerin 10-12'de virüse spesifik CD8 + T-hücre yanıtlarının sağlam boyutu teyit etmiştir. Bu yöntem, aynı zamanda "elit kontrol" olarak bilinen antiretroviral tedavi bir fenomendir yokluğunda viral replikasyon kendiliğinden kontrolü ile ilişkili MHC-I-molekülleri ile sınırlı HIV ve SIV spesifik CD8 + T-hücre yanıtlarının karakterizasyonu kolaylaştırmıştır
Rhesus makak (Maçaca mulatta) Deneysel SIV enfeksiyonu HIV / AIDS 18,19 karşı bağışıklık müdahalelerin değerlendirilmesi için en iyi hayvan modeli kalır. Son 25 yıl içinde, önemli bir gelişme MHC-I-allel keşfi ve peptit bağlama motifleri 13,20-27 tanımı da dahil olmak üzere, bu maymun türlerinin SIV spesifik CD8 + T hücrelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlanmıştır . Bunun bir sonucu olarak, pMHC I tetramerleri SIV spesifik CD8 + T hücre analizi için geliştirilmiştirBu hayvan modelinde 28 tepkileri. Mamu-A 1 * 002, Mamu-A 1 * 001: 01, Mamu-B * 008: bu reaktiflerin çoğu dört al yanaklı makak MHC-I-allel gen ürünlerinin yapılan 01 ve Mamu-B * 017: 01. Notun, rhesus makak bir MHC-C lokusu 29 ifade yoktur. Mevcut deneylerde kullanılan pMHC-I tetramers büyük çoğunluğu Emory Üniversitesi'nde NIH Tetramer Core Tesisleri'nde üretilmiştir. Bununla birlikte, immünodominant Gag CM9 epitopa bağlanan Mamu-A 1 * 001 tetramerler dahil olmak üzere bu reaktiflerin bazı, ancak genel lisans anlaşmalar, ticari kaynaklardan elde edilebilir. Dört al yanaklı makak allellerinin kullanılarak pMHC I tetramerleri başarılı aşılama veya primer SIV enfeksiyonu 30,31 (Martins ve arkadaşları tarafından indüklenmiştir 21 SIV epitopların (Tablo 1) 'in bir toplamı karşı CD8 + T hücreleri numaralandırılmış olan, yukarıda listelenen ark., yayınlanmamış gözlemler).
Mevcut el yazması bir sağlarRhesus macaque SIV spesifik CD8 + T hucrelerının frekansı ve bellek fenotip saptanması için optimize pMHC I tetramer boyaması protokolü. TCR içselleştirme azaltmak ve bu sayede pMHC-I 32 boyama tetramer artırmak için, tahlil, bir protein kinaz inhibitörü (burada Dasatinib kullanılan PKI) ile seçmeli 30 dakika kuluçkalama ile başlar. 01 tetramerleri: Aşağıda tarif edildiği gibi Mamu-B * 017 kullanıldığında, bu tedavi, özellikle yararlıdır. florokrom-konjuge pMHC-I tetramers ve monoklonal antikorlar (mAbs) ile hücrelerin etiketlemek için nasıl talimatlar da verilmektedir. Bu protokol, aynı zamanda sitoliz ilişkili bir molekül granzim B (Gzm B), hücre içi saptanması için bir hücre geçirimli hale adımını içerir. CD3'e karşı mAb Bu TCR sinyal molekülünün bulgulanmasını geliştirmek için de bu aşamada eklenir. Bir referans olarak, bu boyama panelinde kullanılan bütün fluorochromes listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yazıda kullanılan periferik kan mononükleer hücre (hücre) numuneleri Wisconsin Ulusal Primat Araştırma Merkezi'nde ev sahipliği Hint rhesus makak elde edilmiştir. Bu hayvanlar Wisconsin Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi 33 Üniversitesi tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde Weatherall Raporu uyarınca bakım için. Tüm hayvan prosedürleri anestezi altında gerçekleştirildi ve tüm çabaları potansiyel acı en aza indirmek için yapılmıştır.
1. PKI Tedavisi
NOT: 01 tetramerler: Bu isteğe bağlıdır, ancak Mamu-B * 017 için önerilir. Sonuçlar ve Tartışma Bölüm bakın.
- 1.6 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda R10 ortam içinde yeniden süspanse PBMC.
- borular sitometrisi gelen akış, bu hücre süspansiyonunun 50 ul ekle. Her tüpe PKI 100 nM çözeltisi 50 ul ekle.
- Her tüp karıştırın. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu sonuna kadaradım her tüp 8.0 X 10 5 PBMC ve PKI 50 nM ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 100 ul olmalıdır.
- pMHC-I tetramer boyama adıma geçin.
Florokrom etiketli pMHC I tetramerleri 2. boyanması
- hazırlamadan önce pMHC I ana karışımı, santrifüj, 4 ° C'de en az 15 dakika boyunca 20,000 xg'de pMHC I tetramer borular tetramer. Bu adımın amacı arka plan boyama artırabilir pMHC I tetramer çözeltisi protein agregatları pelet etmektir. santrifüjleme aşaması tamamlandıktan sonra, protein agregatları birikmiş olacaktır tüpün tabanından pipetleme kaçının.
- Tüm deney tüpleri leke için yeterli pMHC-I tetramer master karışımı hazırlayın. Hata pipetleme için hesaba bu ana karışımı toplam hacminin% 15 fazlalığı hazırlayın.
- PMHC-ı tetramer ana karışımı 25 ul Adde olduğu leke tamponu (örneğin, parlak Leke Tampon) içinde pMHC-I tetramers böylece seyreltinHer bir test, d.
- test başına iki pMHC-I tetramers etiket PBMC; alofikosiyanin konjuge bir (APC) ve Parlak Menekşe (BV) 421 diğer.
- 100 ul'lik bir son hacim içinde tüpler sitometrisi gelen akış 8.0 X 10 5 PBMC ekleyin. Hücreler yukarıda tarif edildiği PKI muameleye tabi tutulur ise, zaten bu aşamada 100 ul içinde yeniden süspanse edilmelidir.
- 25 ul ekleyin pMHC-ı tüpler sitometri gelen akışına ana karışımı tetramer. Bu aşamanın sonunda, her bir tüp içinde son hacim 125 ul olmalıdır.
- hücre süspansiyonu homojen hale getirmek üzere, her bir tüp vorteksleyin.
- 45 dakika boyunca, oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Bu 45 dakika inkübasyon sırasında yüzey boyama mAb kokteyl hazırlayın.
3. Yüzey Boyama
- Tüm deney tüpleri leke için yeterli mAb master karışımı hazırlayın. hesap bu ana karışımı toplam hacminin% 15 fazlalığı hazırlayınHatayı pipet için.
- 50 ul test başına eklenir, böylece leke tamponu ile ana karışımı seviyesini ayarlayın.
- Uygun olmayan CD8 + T-hücrelerinin dışlanma ve bellek alt belirlenmesi için, kullanım yüzeyi boyama ustası karışımı aşağıdaki moleküllere yönelik mAb'lerin miktarda titre.
Not: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 ve CCR7 FITC: Her mAb'ler konjüge fluorochromes bir referans olarak verilmiştir. CD14, CD16 ve CD20 karşı mAb'ler onlar "dökümü" kapısı dahil edilecektir beri aynı florokrom (yani, BV 510) konjuge unutmayın. - Yüzey boyama ustası karışımı ölü hücreleri ayırt edilmesi için bir fixable boya ekleyin [yani, amin reaktif boya (ARD)]. ARD reaktif "dökümü" kapısı kullanılan olanlar gibi benzer bir emisyon spektrumu ile bir florokrom konjuge olduğundan emin olun. Bu durumda, ARD Aqua kullanın.
- 50 ul ekleboyama master miks tüpleri sitometri gelen akışına 3.1-3.4 açıklandığı. Bu aşamanın sonunda, her bir tüp içinde son hacim 175 ul olmalıdır.
- Her tüp karıştırın. 25 dakika boyunca, oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin.
- Yıkama tamponu ile hücreler (sığır serum albümini,% 0.1 ve 0.45 g / L NaN3 içeren PBS çözeltisi) yıkayın.
DİKKAT: Sodyum azid toksik bir maddedir. Hatta küçük miktarlarda maruz kalmak belirtilere neden olabilir. bu deneyler yapılmaktadır kurumunda Çevre Sağlığı ve Güvenliği (ÇSG) Ofisi tarafından belirlenen kurallara göre, bu maddeyi işlemek. - 5 dakika boyunca 510 x g'de santrifüj tüplerine. Dikkatle ayrı bir atık kabına süpernatant süzün. pelet rahatsız etmemek için emin olun.
DİKKAT: yıkama tamponu içinde sodyum azid ile reaksiyona ve zehirli gaz 34 oluşumuna yol gibi ağartıcı ihtiva eden rezervuar halinde yıkama tamponu süpernatant süzün verme. CBu deneyler sodyum azid elden nasıl kılavuzlar için yapılmaktadır kurumda EHS Ofisi ontact. - Dekantasyondan sonra, her bir tüp içinde kalan artık sıvı hücreleri girdap.
4. Hücre Sabitleme
- hücrelerin tespit edilmeleri için tüm tüplere% 2 paraformaldehit (PFA) çözeltisi 250 ul ekle.
DİKKAT: PFA toksik bir maddedir. Hatta küçük miktarlarda maruz kalmak belirtilere neden olabilir. bu deneyler yapılmaktadır kurumda EHS Ofisi tarafından belirlenen kurallara göre, bu maddeyi işlemek.- % 2 PFA çözüm hücrelerine izotonik olması gerektiğinden, bu çözelti hazırlamak için PBS kullanın. % 2 PFA çözeltisi Yüz mililitre birden fazla deneyler için yeterlidir. İyice hemen hücre agrega oluşumu önlemek için% 2 PFA ilavesinden sonra tüm tüpler girdap.
- 20 dakika boyunca 4 ° C'de karanlıkta inkübe edin.
- Wadımlar 3.7-3.9 yineleyerek kül hücreleri. bu adım tamamlandıktan sonra, hücreler 24-48 saat için 4 ° C'de karanlıkta saklanabilir. Permeabilization fazına geçmeden önce, iyice vorteks tüpleri.
Hücrelerin 5. Permeabilization
- permeabilizasyon tampon 500 ul ekle. Vortex bütün tüpler.
- 10 dakika boyunca, oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin.
- adımları 3,7-3,9 tekrarlayarak hücreleri yıkayın.
6. hücre içi boyama
- Tüm deney tüpleri leke için yeterli mAb master karışımı hazırlayın.
- PBS ile hacim veya hücre içi mAb ana karışımı 50 ul test başına eklenir, böylece leke tampon ayarlayın.
- 6.1 ve 6.2 tarif mAb master karışımı hazırlayın CD3 ve Gzm B'ye yönelik mAb'lerin miktarda titre kullanarak
Not: pMHC I tetramerleri TCR etkileşimi tetramer + CD3 + CD8 tespit engelleyebilir CD3 içselleştirme + sonuçlanabilirT-hücreleri anti-CD3 mAb yüzey boyama ana karışıma eklenir. Hücreler permeabilize sonra kaçınmak için, bu aşamada, önceki anti-CD3 mAb ekleyin. CD3 PerCP Cy5.5 ve Gzm B PE: Her mAb konjuge fluorochromes bir referans olarak listelenmiştir. - İlgili tüplere mAb kokteyl 50 ul ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin.
- adımları 3,7-3,9 tekrarlayarak hücreleri yıkayın. Tüpler bir akış sitometresinde elde edilecek hazırız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen protokol Mamu-A 1 * 001 + Rhesus macaque aşı ile uyarılan, Gag CM9 spesifik CD8 + T-hücre yanıtlarının büyüklüğü ve bellek fenotip belirlemek için kullanılmıştır. Bu analiz için, bir APC-konjuge Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer 8 renkli akım sitometri boyama panelinde kullanılmıştır. Şekil 1A - F Her test, bu iki tetramerleri için uygulanması gereken verileri analiz etmek için kullanılan yolluk stratejisini gösterir. PMHC I tetramer + CD8 + T hücre popülasyonu de minimal arka plan (Şekil 1F ve G) ile ayrılır unutmayın. (; CD28 + CCR7 + T CM), ara bellek (t EM1; CD28 + CCR7-) ve efektör merkezi bellek: Rhesus macaque maymunlarının bellek CD8 + T hücrelerinin CD28 ve CCR7 yüzey ekspresyonu göre üç alt-grup olarak sınıflandırılabilir bellek (t EM2; CD28 CCR7-) 35.Bu protokol, aynı zamanda Gzm B ve CD3 hücre içi tespiti için bir hücre geçirimli hale adımını içerir. Şekil 1G - Ben tetramer + kapısının içindeki bellek alt ve Gzm B-ifade CD8 + T-hücrelerinin sınırlandırılmasını gösterir.
Arka plan boyama pMHC-I tetramer etiketleme deneylerinde optimal sonuçlara yol açabilir. Bunu önlemek için, birkaç önlem önerilmektedir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, pMHC I tetramer reaktifleri içeren ufak şişeler, her zaman ana harçlar önce en az 15 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüje tabi olmalıdır. Bu adımın amacı pMHC I tetramer çözelti içinde olan herhangi bir protein agregatları pelet etmektir. Buna ek olarak, kullanımdan önce her reaktif titre da tavsiye edilir. İdeal olarak, veya ilgi Ag-spesifik CD8 + T hücre popülasyonu ilgili pMHC I tetrameri ile etiketlenmelidir içermeyen hücrelerin MHC-I-eşleşti. bu can, yeni elde edilen pMHC I tetramer çeşitli miktarlarda yan SIV saf (negatif kontrol) ve SIV enfeksiyonu (pozitif kontrol) makaklar taraftan dondurulan PBMC lekeleme ile gerçekleştirilebilir. Şekil 2'de, örneğin, 1.0 ml / bir APC-konjuge Mamu-B * 008 testi: 01 / Nef RL10 tetramer tetramer pozitif ve negatif CD8 + T-hücre popülasyonları arasında en iyi aynlma vermiştir. Son florokrom seçimi de önemli ölçüde pMHC-ı tetramer boyamalar elde edilen sonuçları etkileyebilir. Bu bağlamda, pMHC I tetramerleri kaçınılmalıdır moleküller (örneğin, fluoresein) dim konjüge. Bizim tecrübelerimize göre, PE, APC ve BV 421 parlak fluorochromes, konjuge pMHC-I tetramerler, en iyi sonuçlar vermiştir.
Yukarıda belirtilen parlak fluorochromes konjuge 01 tetramerler tipik bile, loş boyama verim: Biz Mamu-B * 017 fark etmişsinizdir. Bunun nedenleriDüşük floresan yoğunluğu tam olarak net değildir ancak düşük afinite TCR / Mamu-B * 017 içerebilir: 01 etkileşimleri ve tetramer 36,37 bağlanma üzerine hızlı TCR içselleştirilmesi. Bu doğrultuda, PKI CD8 + T-hücreleri 32 yüzeyi üzerinde TCR içselleşmesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bunun bir sonucu olarak, PKI pMHC I tetramer boyama ile Ag-spesifik CD8 + T-hücrelerinin tespitini artırır. Bizim deneylerde, bu etkiyi doğruladı nerede Mamu-B kalitesi * 017: renklendirmeler ölçüde ön işlem bir PKI ile PBMC (Şekil 3) iyileştirilebilir 01 tetramer. 01-kısıtlı CD8 + T hücreleri, hassasiyet benzersiz olabilir: İlginçtir ki, bu PKI ile tedavi öncesi önemli ölçüde 017 Mamu-B * düşündüren, (veriler gösterilmemiştir) burada test edilen diğer pMHC-I tetramers lekelenmesine düzelmedi PKI tedavisi ile ilgilidir.
Şekil 1: yolluk strateji ve başarılı pMHC-I tetramer boyama temsilcisi sonuçları. Bu * 001 + Rhesus macaque bir Mamu-A1 PBMC içinde aşıyla indüklenen Gag CM9 spesifik CD8 + T-hücreleri büyüklüğü ve bellek fenotip değerlendirildi. Burada, bir APC-konjuge Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer 8 renkli akım sitometri boyama panelinde kullanılmıştır. (A - F) akım sitometri analizi için Yolluk stratejisi. İlk olarak, çapraz kümelenmiş tekliler bir kapı SSC alanına karşılık daha sonra FSC alanına (FSC A) ve yana saçılım yüksekliği (SSC-H) karşı öne doğru dağılma yüksekliği (FSC lH) işaretlenmesiyle oluşturulmuş (SSC-A, A ve B) . Sonra, bir zaman kapısı 5. ve 90. yüzdelik içinde kaydedildi sadece bu olayları dahil oluşturuldu. Elde edilen hücreler, daha sonra "kaya kanalı" negatif CD3 + hücreleri (C ve D) ile kapı bulundu. Bu aşamada,lenfosit nüfusu FSC-A ve SSC-A özelliklerine göre tarif edilmiş ve sonraki analizler CD8 + hücreler (E ve F) dahilinde yapılmıştır. PMHC I tetramer + hücrelerinin (G) verildikten sonra bellek fenotipleme analizi, bu kapı (H) içinde uygulandı. (; CD28 + CCR7 + T CM), ara bellek (T EM1; CD28 + CCR7-) ve efektör bellek (T EM2 merkezi bellek: Rhesus macaque bellek T-hücreleri, CD28 ve CCR7 ifadesi göre üç alt-grup halinde sınıflandırılabilir , CD28 CCR7-). Bu protokol, Granzim B (Gzm B) tetramer +, CD8 + T-hücreleri (I) 'in içinde ifade hücre içi değerlendirilmesi için bir hücre geçirimli hale adımını içerir. Histogram gölgeli alan bir izotip-uyumlu kontrol mAb ile lekelenmiş tetramer +, CD8 + T-hücreleri karşılık gelir. Bu boyama mevcuttu BV 421-konjuge tetramer + nüfus olmasına rağmenŞekilde gösterilmemiş olan, aynı Ayırıcı stratejisi analiz etmek için kullanılmalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: 01 / Nef RL10 tetramer: bir APC-konjuge Mamu-B * 008 titrasyonu Temsilcisi sonuçları. PBMC iki Mamu-B * 008 den: 01+ rhesus makak bu deney için kullanıldı: bir hayvan SIV naif ve diğer SIV-enfekte oldu ve pozitif kontrol olarak görev ise negatif kontrol olarak görev yaptı. Mamu-B miktarını belirlemek için * 008: tetramer + ve tetramer- CD8 + T-hücreleri arasında en iyi mesafeyi verir 01 / Nef RL10 tetramer, her hayvandan PBMC pMHC I tetramer reajanı belirtilen miktarları ile inkübe edildi. Bu sonuçlara dayanarak, 1.0 ul / test waoptimum miktar seçilen gelecekteki deneylerde kullanılır. Verilerini analiz etmek için kullanılan strateji, yolluk Şekil 1 'de tarif edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: 01 tetramerler: Mamu-B * 017 floresan yoğunluğuna PKI tedavisinin etkileri. PKI önleyicisi TCR komplekslerinin içselleşmesini inhibe eder ve bu şekilde florokrom etiketli pMHC-I 32 tetramerleri aracılığıyla Ag-spesifik CD8 + T-hücrelerinin tespitini artırır. (A - B) iki Mamu-B PBMC * 017: 01+ rhesus makak Bu deneyde kullanıldı: Diğer SIV ile infekte ve olarak görev iken bir maymun, SIV naif ve negatif kontrol (A) olarak görev yaptıpozitif kontrol (B). Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, 01 / Nef IW9 tetramer: Her iki hayvandan PBMC bir APC-konjuge Mamu-B * 017 ile boyanmadan önce 30 dakika için 50 nM bir konsantrasyonda PKI varlığında 37 ° C'de inkübe edildi . Bir referans olarak, tüpler bir grubu olduğu, dimetil sülfoksit dışında aynı kuluçka ve boyama şartlanna tabi tutulmuştur (DMSO) yerine, PKI ilave edildi. Verilerini analiz etmek için kullanılan strateji, yolluk Şekil 1 'de tarif edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| SIV proteini | Amino asit pozisyonu | Amino Asit Dizisi | MHC Sınıf I molekülüne (yeni terminolojisi) | MHC Sınıf I molekülüne (eski nomenklatüre) | Epitop Kısa Adı |
| tıkaç | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A 1 * 001 | Mamu A * 01 | gag CM9 |
| tıkaç | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A 1 * 001 | Mamu A * 01 | gag QI9 |
| tıkaç | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A 1 * 001 | Mamu A * 01 | gag GY9 |
| env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | env FW9 |
| env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A 1 * 001 | Mamu A * 01 | env CL9 |
| env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A 1 * 001 | Mamu A * 01 | env TL9 |
| env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu A * 02 | env RY8 |
| env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu A * 02 | env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif Rl9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A 1 * 001 | Mamu A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu A * 02 | Vif WY8 |
| devir | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| Tat | 28-35 | STPESAML | Mamu-A 1 * 001 | Mamu A * 01 | Tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu A * 02 | Nef YY9 |
Tablo 1: Rhesus macaque SIV spesifik CD8 + T-hücresi yanıtları izlemek için uygun pMHC I tetramerleri listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedür liyakat tartışma birkaç adım onlar iyi sonuçlar veren için çok önemli olduğu gibi. Biyolojik örneklerin kalitesi herhangi bir akış sitometrik tahlil 38 başarı güçlü bir belirleyicisi olduğundan Birincisi, tüm bakım hücreleri boyama işlemi sırasında canlı ve süspansiyonda olmasını sağlamak için alınmalıdır. Onlar topaklanma daha yatkındır ve genellikle ölü hücrelerden daha yüksek sayı içeren bu yana dondurulan örnekleri ile çalışırken bu özellikle önemlidir. Bu gibi durumlarda, önceden pMHC I tetramer etiketleme prosedürü ile 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçen esas itibarıyla sonuçlarını geliştirmek olabilir. İkinci olarak, analizde kullanılan fluorochromes uygun dengeleme birden çok parametre aynı deneyde değerlendirilen, özellikle, doğru veri analizi için çok önemlidir. Bu bağlamda, taze, tek renkli dengeleme kontrol, her pMHC I tetramer s için hazırlanabilir önerilirtahlil taining. Biz nedeniyle geniş bir anti-Ig reaktivitesi ve pozitif ve negatif nüfusun net bimodal dağılımlarını elde gerçeği tazminat boncuk kullanma alışkanlığı. Bu boncuklar MHC-I-molekülleri bağladığı olmadığından, antikorlar, dengeleme kontrol olarak kullanılmalıdır pMHC I tetramerler (örneğin, APC ve BV 421) ile aynı fluorophores konjüge. Bu dengeleme boncuk çeşitli çeşitli satıcılardan temin edilebilir ve üreticinin talimatlarına göre kullanılır. Üçüncü olarak, burada açıklanan fenotiplendirme stratejisi üç moleküllerin (yani, CD28, CCR7 ve Gzm B) gibi floresan eksi biri olarak yolluk kontrolleri, (FMO) testleri kademeli ifade dayalı CD8 + T-hücre alt sınırlarının çizilmesini gerektirir beri veya eş izotipli antikor, analiz bu tür kolaylaştırmak için kullanılır. Deneylerde, faiz a pMHC-I tetramer + CD8 + T hücre popülasyonu içeren, örneğin ayrı tüplerSöz konusu kurallar genel kalitesini artırmaya yardımcı olabilir, ancak yeniden her zaman önemlisi CD28, CCR7 ve Gzm B'ye karşı mAbs aynı fluorochromes konjuge izotip kontrol mAbs ile boyandı pMHC-I lekelenmelerinin tetramer, onlar sadece değişkenler olmadığını Bu testin performansını etkileyebilir. Her laboratuar ortamında tekliği göz önüne alındığında, burada açıklanan tüm iş akışı uygulamaları ve ilgili ayarlamalar için izin vermek için sahte örnekler üzerinde en az bir kez yapılmalıdır.
İlginçtir ki, pMHC-I pozitif CD8 + T hücreleri, zaman zaman SIV saf (enfekte edilmemiş ve aşılanmamış) Rhesus macaque maymunlarının alman PBMC ile gözlenir tetramer. Bu vakalar, verilerin görsel muayene göre arka plan boyama sonucu gibi görünmektedir. Daha ziyade, pMHC-I molekülleri ve katil immünoglobulin benzeri reseptörler (Kirs) arasındaki etkileşimi yansıtan olabilir Rhesus macaque NK ve CD8 + T-hücreleri 3 yüzeyinde eksprese9,40. Gerçekten de, Mamu-A 1 * 002: Gag GY9 Env RY8 epitoplarına karşı gelen peptidler ile sarılır 01 tetramerleri Mamu-KIRDL05 39 bağlandığı gösterilmiştir. Bu doğrultuda, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 ve Mamu-A1 * 002: 01 / Zarf RY8 yukarıda açıklanan Ag bağımsız pMHC-I tetramer boyama gösteren daha yatkındır. Bu olgu göz önüne alındığında, enfeksiyon veya aşılamadan sonra SIV spesifik CD8 + T-hücre yanıtlarının uzunlamasına değerlendirmeler ilgili maymun deneylerde, bu taban reaktiflik için kontrol edilmesi önemlidir. Bu amaca ulaşmak için, tedavinin ilk gününde alınan numuneler üzerinde pMHC I tetramer boyaması gerçekleştirmek tavsiye edilir. Aynı zamanda temel örnekleri, gelecekteki deneylerde ihtiyaç vardır durumda karşılaştırmalarda bu ilk zaman noktalarında birkaç küçük boyutlu alikotları PBMC dondurmak için formüller verilmiştir olabilir.
PMHC I tetramer boyama bir sınırlama olduğu bilinmektedir özgüllük ve MHC-I restriksiyon c sadece CD8 + T hücreleri,Bir bu yaklaşımla incelenecektir. Bu onların MHC loci karmaşık organizasyon verilen rhesus makak özellikle uygundur. Gerçekten de, tek bir resus makak haplotip MHC-I-genlerinin onlarca olabilir, bunların hepsi kararlı biçimde hücre yüzeyi 29 olarak ifade edilen molekülleri kodlayan. Bunun bir sonucu olarak, belirli bir hayvan tarafından ifade edilen fonksiyonel MHC-I-moleküllerinin kümesini belirlemek için zor olabilir. 01, Mamu-B * 008: 01 ve Mamu- Bununla birlikte, bu uyarı 002 gibi Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * olarak bilinen MHC-I-allelleri için pozitif olan maymunlar dahil deney tasarımı ile aşılabilir B * 017: 01.
Sonuç olarak, bu Eser resus makaklarda SIV spesifik CD8 + T hucrelerının frekansı ve bellek fenotip saptanması için optimize edilmiş bir pMHC I tetramer boyaması protokolü sağlar. pMHC I tetramer boyaması Ag-spesifik CD8 tespiti için IFN-γ ELISPOT ve ICS deneylerinin daha duyarlı olduğu için+ T hücreleri ve in vitro olarak, Ag stimülasyon gerektirmez, burada sunulan yöntem bağışıklık eksikliği virüsü enfeksiyonu sonucu CD8 + T-hücre yanıtlarının etkisini incelemek için özellikle yararlıdır. Bu teknik hakim elde uygulama bilgisi de fonksiyonel çalışmalar kapsamında Ag-spesifik CD8 + T hücrelerini zenginleştirmek ve çeşitli hastalık ayarları 6 CD8 + T-hücresi yanıtları izlenmesi için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz mevcut metodoloji optimizasyonu etkin deneyler desteklemek için David Watkins teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası P30AI073961 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri AIDS Araştırma Miami Merkezi tarafından sağlanan bir pilot hibe kısmen desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
