Summary
ويرد بروتوكول للقياس المباشر لتوزيع حجم الجسيمات في الحلول المركزة باستخدام ديناميكية المجهر تشتت الضوء.
Protocol
التحضير 1. عينة
- تنقية أحادية استجابة درجات الحرارة
- حل 20 غراما من N -isopropylacrylamide (NIPA) في 100 مل من التولوين.
- تصفية حل تحت الشفط لإزالة الغبار.
- خلط الراشح مع 500 مل من الأثير البترول.
- وضع وعاء التفاعل في حمام الماء المثلج.
- تحريك الحل حتى يتم ترسيب أحادية (عادة 30 دقيقة).
- تصفية حل تحت شفط للحصول على أحادية المترسبة.
- تجفيف أحادية تحت ضغط منخفض (100 باسكال) بين عشية وضحاها.
- تحضير محلول البوليمر استجابة درجات الحرارة
- ديغا 20 مل من الماء منزوع الأيونات ل 1.0 دقيقة باستخدام مضخة الحجاب الحاجز.
- حل 780.8 ملغ من NIPA تنقيته في 9.5 مل من الماء نزع الغاز ومنزوع الأيونات.
- وضع وعاء التفاعل في حمام الماء المثلج.
- درع رد فعل منضوء من خلال تغطية الجهاز مع رقائق الألومنيوم.
- تحريك الحل بلطف لمدة 10 دقيقة في حين قدم تدفق معتدلة من الغاز هارون بلطف عن طريق طرف ماصة تعلق على اسطوانة غاز مع أنبوب.
- إضافة 11.9 ميكرولتر من N، N، N '، N' -tetramethylethylenediamine إلى حل عن طريق micropipette.
- تحريك حل ل1.0 دقيقة في حين قدم غاز هارون، كما ذكر في الخطوة 1.2.5.
- مع التحريك العينة، ويحل 4.0 ملغ من فوق كبريتات الأمونيوم في 0.5 مل من الماء نزع الغاز ومنزوع الأيونات.
- مزيج من محلول العينة (من الخطوة 1.2.7) والحل فوق كبريتات الأمونيوم (من الخطوة 1.2.8).
- تحريك الحل لمدة 30 ثانية في حين قدم غاز AR، كما ذكر في الخطوة 1.2.5.
- تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في الثلاجة (4 درجة مئوية) بين عشية وضحاها.
- إعداد يتصاعد عينة
- ضع 60 ميكرولتر من محلول العينة (منخطوة 1.2.11) في شريحة تجويف.
- تغطية الحل مع غطاء زجاجي دائري. يجب الحرص على عدم فقاعات فخ الهواء.
- الحل إزالة الزائدة باستخدام micropipette ومختبر مناديل.
- ختم العينة مع الغراء. اسمحوا الجافة الغراء في درجة حرارة الغرفة (عادة 6 ساعات).
- إعداد شريحة أخرى مليئة اتكس 0.1٪ بالوزن البوليسترين (100 نانومتر الجسيمات القطر) تعليق باتباع الخطوات 1.3.1-1.3.4. يستخدم هذه الشريحة كمعيار.
2. حجم الجسيمات قياس مع الإنارة الديناميكي التشتت مجهر
- تعظيم الاستفادة من أداة
- ضع الشريحة تعليق البوليسترين اللاتكس (من الخطوة 1.3.5) على مسرح المجهر المقلوب. الجانب غطاء زجاجي يجب ان يواجه الهبوط.
- وضع المثبط شعاع أمام كاشف (وهو الضوئي الانهيار وautocorrelator).
- تطبيق شعاع الليزر (ليزر الحالة الصلبة، λ = 488 نانومتر، 30 ميغاواط، مستمرةموجة) لعينة من خلال العدسة الشيئية (10 ×). جزء من الضوء المنعكس يمر عبر مرآة إطلاق المجهر ولوحظ بواسطة كاميرا CCD التي شنت في ميناء جانب المجهر (الشكل 1).
- ضبط ارتفاع عدسة موضوعية لتحديد نقطة محورية في تعليق عينة عن طريق تحويل ارتفاع عدسة الهدف من موقع منخفض إلى مرتفع. خلال هذا الإجراء، يتم تركيز الصورة ينعكس ثلاث مرات: في سطح الزجاج غطاء، في واجهة بين الزجاج غطاء والعينة، وعلى واجهة بين العينة والزجاج ثقب الشرائح. تعيين نقطة الوصل بين النقاط الثانية والثالثة.
- تخفيف شدة الضوء المتناثرة من خلال تغيير قوة الليزر.
- إدخال الضوء المتناثرة في كاشف عن طريق إزالة المثبط شعاع أمام كاشف. هذه الوحدة يقيس العلاقة وقت شدة الضوء.
- تعيين الثقب (φ = 50 ميكرون) betwالتابعين المجهر وكاشف لتحقيق التأثير متحد البؤر. ضبط الموقف من الثقب إلى تحقيق أقصى قدر من شدة الضوء في كاشف.
- قياس وظيفة ارتباط وقت شدة الضوء المتناثرة لمدة 30 ثانية قبل بدء تشغيل خاسسرح عن طريق الكمبيوتر. وكثيرا ما أعرب عن وظيفة ارتباط يقاس ز (2) (ر) - 1، حيث t هي المرة ارتباط 4 و
. هنا، الأول (ر) هو شدة الضوء المتناثرة في الوقت t و (•••) T حان الوقت المتوسط. الوقت تسوس سيكون ما يقرب من 0.1 مللي ثانية. - ضبط نقطة محورية للحصول على مجموعة واسعة من أجل السعة الأولية وظيفة الوقت الارتباط (ز (2) (ر = 0) - 1).
ملاحظة: إن السعة الأولية تتأثر بشدة من كمية الضوء المنعكسة. عن طريق تحريك سحب نقطة البؤريايه ار دى واجهة بين الزجاج غطاء والعينة، وكمية ضوء الزيادات ينعكس. لعدسات ضوء قوي، مثل اللاتكس البوليسترين، واتساع الأولية يمكن تغييرها من 0 إلى 1. ومع ذلك، فإنه من الصعب تحديد السعة الأولية وثيقة إلى 1 لحلول البوليمر أكثر شيوعا بسبب شدة الضوء المنعكس هو أعلى بكثير من أن من الضوء المتناثرة. - تطبيق معكوس لابلاس تحول (باستخدام برنامج تنظيم مقيدة CONTIN 13،14) إلى وظيفة الوقت الارتباط التي تم الحصول عليها للحصول على وظيفة حجم التوزيع. في الحالات التي يتم فيها تعيين السعة الأولية إلى أقل من 0.2، فإن وظيفة توزيع نصف قطرها الهيدروديناميكية تظهر ذروة حادة نحو 100 نانومتر، وهو ضعف نصف قطر الفعلي (انظر مناقشة للحصول على التفاصيل).
- قياس عينة
- ضبط درجة الحرارة مرحلة إلى 25 درجة مئوية.
- ضع شريحة أعدت مع بولي NIPA (PNIPA) solutأيون (الخطوة 1.3.4) على مسرح المجهر.
- قياس وظيفة الوقت علاقة لشدة الضوء المتناثرة باتباع الخطوات 2.1.4-2.1.8. إذا كانت السعة الأولية أكبر من 0.2، وضبط نقطة محورية لجعل السعة الأولية وظيفة الوقت ارتباط أقل من 0.2 باتباع الخطوة 2.1.9. والسعة الأولية صغيرة يبسط تحليل.
- ضبط درجة الحرارة مرحلة إلى 35 درجة مئوية، والانتظار حتى يتحول الحل العكرة. درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST) من حل PNIPA 32 درجة مئوية (15).
- قياس وظيفة ارتباط الوقت عن طريق الخطوات التالية 2.1.4-2.1.8. إذا كان ذلك ممكنا، وضبط الموقف من النقطة المحورية لجعل السعة الأولية وظيفة الوقت ارتباط أقل من 0.2. عن حلول العكرة، تميل سعة الأولية إلى زيادة، لأن شدة الزيادات الضوء المتناثرة في حين أن الضوء الذي ينعكس يزال مستمرا.
- تطبيق معكوس لابلاس transformatiإلى وظائف ارتباط وقت الحصول عليها للحصول على وظائف حجم التوزيع. لاحظ أن الحجم الفعلي هو نصف قيمة تم الحصول عليها في الحالات التي يكون فيها السعة الأولية هي أقل من 0.2.
. هنا، الأول (ر) هو شدة الضوء المتناثرة في الوقت t و (•••) T حان الوقت المتوسط. الوقت تسوس سيكون ما يقرب من 0.1 مللي ثانية. Representative Results
تم قياس في نقاط الاتصال المختلفة، كما هو مبين في الشكل 2 (أ): وظائف وقت الارتباط من شدة الضوء المتناثرة لتعليق البوليسترين اللاتكس (50 نانومتر الجسيمات دائرة نصف قطرها). تم تحويل هذه الوظائف ارتباط في وظائف توزيع نصف قطرها الهيدروديناميكية بواسطة معكوس تحويل لابلاس (انظر الشكل 2 (ب) و (ج)). باستخدام نفس الإجراء، تم الحصول على وظائف علاقة الوقت وظائف توزيع نصف قطرها الهيدروديناميكية من الحل PNIPA عند 25 درجة مئوية و 35 درجة مئوية، على التوالي. الأرقام 3 (أ) و (ب) تظهر وظائف الساعة ارتباط من شدة الضوء المتناثرة وظائف توزيع حجم المقابلة من الحل PNIPA أدناه (25 درجة مئوية) وفوق (35 درجة مئوية) وLCST. تم الحصول على وظائف توزيع حجم من قبل معكوس لابلاس تحول تليهاتصحيح مغايرة جزئي. متوسط نصف قطر الهيدروديناميكية تحت LCST هو عدة عشرات من نانومتر، وهو الأمر المعهود عن حلول البوليمر. في المقابل، فإن نصف قطر الهيدروديناميكية فوق LCST حوالي 1.0 ميكرون. هذه النتيجة تتفق مع حقيقة أن الحل هو عكر فوق LCST. الخطوط الحمراء والزرقاء في الشكل (3) تمثل توزيع حجم حلول PNIPA التي تم الحصول عليها مباشرة بعد و20 دقيقة بعد الحل أصبح العكرة، على التوالي. الشكل (3) (ب) يشير بوضوح الى نمو التجميع.
الشكل 1. مخططات من الحيوي المجهر تشتت الضوء. الثقب (PH)، شعاع الخائن (BS)، المستقطب (بولندا)، والثنائي الضوئي سيل (الهادئ). الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ممثل النتائج لتعليق البوليسترين اللاتكس. (أ) وظائف ارتباط وقت شدة الضوء المتناثرة لتعليق البوليسترين اللاتكس. في دائرة نصف قطرها الاسمي هو 50 نانومتر، وتركيز 0.1٪ بالوزن. تم الحصول على مجموعتين من البيانات من نقاط نثر مختلفة. (ب) و (ج) المقابلة وظائف توزيع حجم لتعليق البوليسترين اللاتكس التي حصل عليها معكوس لابلاس تحول من (أ). الخط الأحمر يتوافق مع وظيفة الارتباط الوقت الذي ما يقرب من 1.0 السعة الأولي، والخط الأزرق يقابل ذلك مع اتساع الأولية أن ما يقرب من 0.2. تم حساب المحور الأفقي دون (ب) و مع (ج) النظر في تأثير heterodyning جزئية (PHD) عندما و<< . 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ممثل النتائج عن حل PNIPA. (أ) وظائف ارتباط وقت شدة الضوء المتناثرة من أجل حل PNIPA. (ب) المقابلة وظائف توزيع حجم من أجل حل PNIPA التي حصل عليها معكوس لابلاس تحول من (أ). تم حساب المحور الأفقي النظر في تأثير heterodyning جزئية لكل مجموعة البيانات. يمثل خط أسود على البيانات التي تم الحصول عليها عند 25 درجة مئوية. يمثل خطا أحمر البيانات التي تم الحصول عليها بعد تحول حل عكر (35 درجة مئوية). يمثل الخط الأزرق البيانات التي تم الحصول عليها بعد قياس 20 دقيقة من الخط الأحمر./54885/54885fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
السعة الأولية للدالة الارتباط الوقت يعتمد بشكل كبير على نقطة محورية، كما هو مبين في الشكل 2 (أ). هذا على ما يبدو يتناقض مع حقيقة أن الحل هو متجانس (باستثناء طبقة رقيقة على واجهة) 8. ويعزى هذا الاختلاف في السعة الأولية إلى التباين في كمية الضوء المنعكسة. جزئية نظرية مغايرة 16 تتنبأ بأن السعة الأولية، A، شدة الضوء المتناثرة، والصورة، وشدة الضوء المنعكس، وص، تلبية المعادلة التالية 1
وتظهر هذه المعادلة أن أكبر I ص يصبح، يصبح أصغر حجما. لذلك، ويتم تقليل من خلال تحديد موقف البؤري على مقربة من واجهة. نشر الواضح D المستمر وكاليفورنيان الحصول عليها عن طريق تركيب دالة الارتباط الوقت في حالة حلول monodisperse:
أين 
. هنا، n هو معامل الانكسار من المذيب (الماء، 1.33)، θ هي الزاوية متفرقة (180 درجة)، وλ هو الطول الموجي للضوء (514.5 نانومتر). منذ طبقنا الهندسة ارتداد مبعثر، ويحدد قيمة ف. ومع ذلك، يتم حل هذه النقطة باستخدام موجات مختلفة من الضوء. يرجى ملاحظة أن أي نوع من مصدر ليزر الموجة المستمرة متاح لبناء المجهر DLS. بفضل حجم المشع صغير، ويقدر عامل تماسك 17 أن يكون أكثر من 0.99 ولا يكاد يذكر. عن حلول polydisperse، يتم الحصول على وظيفة توزيع D A عن طريق معكوس تحويل لابلاس. عشر مغايرة جزئيةيتوقع eory أيضا أن D وليس هو نفسه كما نشر الفعلي D المستمر. هذه الثوابت نشر اثنين من تلبية المعادلة التالية:
يتم تحويل D ثابت نشر في الهيدروديناميكية دائرة نصف قطرها R ح باستخدام معادلة اينشتاين ستوكس 4. عندما أ = 1، تصبح هذه العلاقة D A = D. في هذه الحالة، فإن عملية تحويل البيانات هي نفسها التي لتشتت الضوء الديناميكي المشترك. الخط الأحمر هو مبين في الشكل 2 (ب) يتوافق مع هذه الحالة. في المقابل، تصبح هذه العلاقة D A = 0.5 D في الحد من A → 0. لذلك، ويقدر حجم ليكون ضعفي حجم الفعلي عندما وصغيرة (أي عمليا وأقل من 0.2)، كما هو موضح من قبل الخط الأزرق في الشكل 2 (ب) (أ) هو صغير إلى حد كبير، والمحور الأفقي يمكن تحويل، كما هو مبين في الشكل 2 (ج). من حيث المبدأ، يمكننا تحويل D وإلى D لأي قيمة A. في الممارسة العملية، ومع ذلك، فمن الأفضل لتعيين السعة الأولية أصغر من 0.2، منذ بسيط تقريب D A ~ 0.5 D يصدق.
وقد أظهرت السمات البارزة للتقنية نثر المجهر دينامية الخفيفة باستخدام محلول PNIPA. وقد تمت دراسة التشكل من PNIPA أسفل وأعلى LCST على نطاق واسع باستخدام النيوترونات زاوية صغيرة نثر 15،18. في المقابل، لم تستغل تشتت الضوء الحيوي لتحليل PNIPA فوق LCST بسبب تعكر 19 منه. يتم حل هذه المشكلة عن طريق الحيوي المجهر تشتت الضوء، كما هو مبين في الشكلين 3 (أ) و (ب). حجم هذه المجاميع هو عدة و# 181؛ م، والتي لا يمكن الحصول عليها إما صغيرة زاوية الأشعة السينية / تشتت النيوترونات أو تقنيات تشتت الضوء التقليدية. قياسات وقت حل باستخدام هذا النظام يعطي معلومات عن عملية التجميع خلال التغير في درجة الحرارة.
ويتضح العيب من الحيوي المجهر تشتت الضوء أيضا في الشكل (3). للنتيجة دون LCST، وظيفة ارتباط الوقت يتأثر بشدة كمية صغيرة جدا من الغبار الحاضر (الخطوط السوداء في الشكل 3). على سبيل المثال، فإن وظيفة ارتباط الوقت لا يتحلل تماما، حتى في زمن ارتباط في ترتيب 1.0 ثانية. وذلك لأن حجم المشع مع هذا الجهاز (ما يقرب من 1.0 ميكرون) هو أصغر بكثير من أن المشع مع جهاز تشتت الضوء الحيوي المعتاد (حوالي 100 ميكرون). في الحالات التي يكون فيها شدة الضوء المتناثرة ضعيفة، تحجب إشارة من الضوضاء، مثل تلك التي تسببها الصورةكميات مول الغبار في الحل. ولذلك، فإن القمم الثلاث هو مبين في الشكل (3) (ب) لا يجوز أن يكون الأهمية الكمية على الرغم من أن النظام العام للحجم هو مفيد. لاحظ أن هذا المشتت الضعيف يمكن أن يقاس جهاز تشتت الضوء الحيوي التقليدي.
لقد أثبتنا أن دينامية المجهر تشتت الضوء تمكننا من قياس العينات سواء شفافة وعكر مع نفس الإعداد. ومنذ مدة مسار بصري في العينات غير قصيرة، ويمكن تطبيق هذه التقنية لعينات امتصاص الضوء القوية، مثل تعليق أنابيب الكربون 20. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لدقة مكانية عالية، ويمكن تطبيق هذه التقنية على الخلايا البيولوجية. لتطبيقه على الأحياء، ويمكن أيضا هذه الطريقة تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير الأخرى، مثل مضان والتصوير رامان. وبالتالي، فإننا نعتقد أن دينامية المجهر تشتت الضوء هو أداة قوية لمجموعة واسعة من المجالات البحثية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide, 98% | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | I0401 | |
| toluene, 99% | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 201-01876 | |
| petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-22565 | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99% | Sigma | T9281 | |
| ammonium persulfate, 98% | Sigma | 248614 | |
| polystyrene latex suspension, 1 wt% | Duke Scientific Corporation | 3500A | |
| argon | Koike Sanso Kogyo Co., Ltd. | purity > 99.999 vol.% | |
| cavity slide | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | 83-0336 | |
| inverted microscope | Nikon Instech Co., Ltd. | ECLIPSE Ti-U | |
| Thermo Plate | Tokai Hit CO.,Ltd | TP-108R-C | |
| Solid-state laser | Coherent | OBIS 488LX | |
| avalanche photodiode | ALV-GmbH | ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode | |
| correlator | ALV-GmbH | ALV-5000/EPP |
References
- Hiroi, T., Shibayama, M. Dynamic Light Scattering Microscope: Accessing Opaque Samples with High Spatial Resolution. Opt. Express. 21, 20260-20267 (2013).
- Barth, H. G., Flippen, R. B.
- Liu, Y., Wang, Z., Zhang, X.
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics. , Dover Publications, Inc. (2000).
- Phillies, G. D. J. Experimental demonstration of ruultiple-scattering suppression in quasielastic-light-scattering spectroscopy by homodyne coincidence techniques. Phys. Rev. A. 24, 1939-1943 (1981).
- Phillies, G. D. J. Suppression of multiple scattering effects in quasielastic light scattering by homodyne crosscorrelation techniques. J. Chem. Phys. 74, 260-262 (1981).
- Ishii, K., Yoshida, R., Iwai, T. Single-scattering spectroscopy for extremely dense colloidal suspensions by use of a low-coherence interferometer. Opt. Lett. 30, 555-557 (2005).
- Xia, H., Ishi, K., Iwai, T. Hydrodynamic Radius Sizing of Nanoparticles in Dense Polydisperse Media by Low-Coherence Dynamic Light Scattering. Jpn. J. Appl. Phys. 44, 6261-6264 (2005).
- Maret, G., Wolf, P. E. Multiple light scattering from disordered media. The effect of brownian motion of scatterers. Z. Phys. B. 65, 409-413 (1987).
- Pine, D. J., Weitz, D. A., Chaikin, P. M., Herbolzheimer, E.
- Cerbino, R., Trappe, V. Differential Dynamic Microscopy: ProbingWave Vector Dependent Dynamics with a Microscope. Phys. Rev. Lett. 108, 188102 (2012).
- Lu, P. J., et al. Characterizing Concentrated, Multiply Scattering, and Actively Driven Fluorescent Systems with Confocal Differential Dynamic Microscopy. Phys. Rev. Lett. 108, 218103 (2012).
- Provencher, S. W. A constrained regularization method for investing data represented by linear algebraic or integral equations. Comp. Phys. Comm. 27, 213-227 (1982).
- Provencher, S. W., Stepanek, P. Global analysis of dynamic light scattering autocorrelation functions. Part. Part. Syst. Charact. 13, 291 (1996).
- Takata, S., Norisuye, T., Shibayama, M. Small-angle Neutron Scattering Study on Preparation Temperature Dependence of Thermosensitive Gels. Macromolecules. 35, 4779-4784 (2002).
- Pusey, P. N., van Megen, W. Dynamic Light Scattering by Non-Ergodic Media. Physica A. 157, 705-741 (1989).
- Chu, B. Laser Light Scattering. 2nd Ed. , Academic Press. (1991).
- Shibayama, M., Tanaka, T., Han, C. C. Small-Angle Neutron-Scattering Study on Poly(N-Isopropyl Acrylamide) Gels near Their Volume-Phase Transition-Temperature. J. Chem. Phys. 97, 6829-6841 (1992).
- Tanaka, T., Sato, E., Hirokawa, Y., Hirotsu, S., Peetermans, J. Critical Kinetics of Volume Phase Transition of Gels. Phys. Rev. Lett. 55, 2455-2458 (1985).
- Hiroi, T., Ata, S., Shibayama, M. Transitions of Aggregation States for Concentrated Carbon Nanotube Dispersion. J. Phys. Chem. C. 120, 5776-5782 (2016).
