Summary
गतिशील प्रकाश बिखरने माइक्रोस्कोपी का उपयोग केंद्रित समाधान में कण आकार के वितरण के प्रत्यक्ष माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है।
Protocol
1. नमूना तैयार
- तापमान उत्तरदायी monomers के शुद्धीकरण
- टोल्यूनि की 100 मिलीलीटर में एन -isopropylacrylamide के 20 ग्राम (NIPA) भंग।
- सक्शन के तहत समाधान फ़िल्टर धूल को खत्म करने के लिए।
- पेट्रोलियम ईथर के 500 एमएल के साथ छानना मिक्स।
- एक बर्फ नहाने के पानी में प्रतिक्रिया पोत रखें।
- समाधान हलचल जब तक monomers उपजी हैं (आमतौर पर 30 मिनट)।
- उपजी monomers प्राप्त करने के लिए सक्शन के तहत समाधान फ़िल्टर।
- कम दबाव (100 Pa) रातोंरात तहत monomers सूखी।
- तापमान संवेदनशील बहुलक समाधान की तैयारी
- देगास 20 1.0 एक डायाफ्राम पंप का उपयोग मिनट के लिए विआयनीकृत पानी की एमएल।
- degassed और विआयनीकृत पानी की 9.5 एमएल में शुद्ध NIPA के 780.8 मिलीग्राम भंग।
- एक बर्फ नहाने के पानी में प्रतिक्रिया पोत रखें।
- से प्रतिक्रिया शील्डएल्यूमीनियम पन्नी के साथ तंत्र को कवर द्वारा प्रकाश।
- जबकि धीरे एक पिपेट एक ट्यूब के साथ गैस सिलेंडर से जुड़ी टिप के माध्यम से गैस एर के एक मध्यम प्रवाह शुरू 10 मिनट के लिए धीरे समाधान हलचल।
- एन, एन, एन के 11.9 μL ',' एन एक micropipette के माध्यम से समाधान करने के लिए -tetramethylethylenediamine जोड़ें।
- समाधान के रूप में कदम 1.2.5 में उल्लेख किया है, जबकि गैस एर शुरू 1.0 मिनट के लिए हलचल।
- नमूना सरगर्मी जबकि, degassed और विआयनीकृत पानी की 0.5 एमएल में अमोनियम persulfate की 4.0 मिलीग्राम भंग।
- और अमोनियम persulfate समाधान (कदम 1.2.8 से) (कदम 1.2.7 से) नमूना समाधान मिश्रण।
- समाधान के रूप में कदम 1.2.5 में उल्लेख किया है, जबकि गैस एर शुरू 30 एस के लिए हिलाओ।
- एल्यूमीनियम पन्नी के साथ समाधान कवर और एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) रात भर में इसे रख लो।
- नमूना mounts की तैयारी
- नमूना समाधान के 60 μL प्लेस (सेएक गुहा स्लाइड में कदम 1.2.11)।
- एक परिपत्र कांच कवर के साथ समाधान को कवर किया। जाल हवा के बुलबुले के लिए सावधान नहीं रहें।
- अतिरिक्त समाधान एक micropipette और प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग निकालें।
- गोंद के साथ नमूना सील। कमरे के तापमान (आमतौर पर 6 ज) पर गोंद सूखी।
- निम्नलिखित कदम 1.3.1-1.3.4 से 0.1% wt polystyrene लेटेक्स (100 एनएम कण व्यास) निलंबन के साथ भरा एक और स्लाइड तैयार करें। इस स्लाइड एक मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है।
एक गतिशील लाइट छितराया माइक्रोस्कोप के साथ 2. कण आकार माप
- साधन के अनुकूलन
- उल्टे खुर्दबीन के मंच पर (कदम 1.3.5 से) polystyrene लेटेक्स निलंबन स्लाइड रखें। कांच कवर पक्ष नीचे का सामना करना चाहिए।
- डिटेक्टर के सामने एक किरण स्पंज (एक हिमस्खलन photodiode और एक autocorrelator) रखें।
- एक लेजर बीम (ठोस राज्य लेजर, λ = 488 एनएम, 30 मेगावाट लागू करें, निरंतरतरंग) नमूने के लिए एक उद्देश्य लेंस के माध्यम से (10 ×)। परिलक्षित प्रकाश के एक हिस्से को माइक्रोस्कोप के एक प्रक्षेपण दर्पण के माध्यम से चला जाता है और एक सीसीडी कैमरा द्वारा मनाया जाता है माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के पक्ष में बंदरगाह पर मुहिम शुरू की।
- कम से उच्च पद से उद्देश्य लेंस की ऊंचाई स्थानांतरण द्वारा नमूना निलंबन पर केंद्र बिन्दु निर्धारित करने के लिए उद्देश्य लेंस की ऊंचाई को समायोजित करें। , कवर कांच की सतह पर कांच कवर और नमूना के बीच इंटरफेस में, और नमूना और छेद स्लाइड कांच के बीच इंटरफेस में: इस प्रक्रिया के दौरान, परिलक्षित छवि तीन बार ध्यान केंद्रित किया है। दूसरे और तीसरे अंक के बीच केन्द्र बिन्दु निर्धारित करें।
- लेजर शक्ति बदलकर बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता को कम करना।
- डिटेक्टर के सामने किरण स्पंज को हटाने के द्वारा डिटेक्टर में बिखरे हुए प्रकाश का परिचय। इस इकाई के प्रकाश की तीव्रता का समय सह-संबंध के उपाय।
- एक पिनहोल (φ = 50 माइक्रोन) सेट betwमाइक्रोस्कोप और डिटेक्टर een confocal प्रभाव को प्राप्त करने के लिए। डिटेक्टर पर प्रकाश की तीव्रता अधिकतम करने के लिए पिनहोल की स्थिति को समायोजित करें।
- एक कंप्यूटर के माध्यम से correlator के संचालन की शुरुआत से 30 एस के लिए बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता का समय सहसंबंध समारोह को मापने। 1, जहां टी सहसंबंध के समय 4 और है - मापा सहसंबंध समारोह अक्सर जी (2) (टी) के रूप में व्यक्त किया जाता है
। यहाँ, मैं (टी) समय टी और (•••) टी समय औसत है पर बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता है। क्षय समय लगभग 0.1 एमएस होगा। - समय सहसंबंध समारोह के प्रारंभिक आयाम के लिए एक विस्तृत श्रृंखला प्राप्त करने के लिए केन्द्र बिन्दु समायोजित (जी (2) (टी = 0) - 1)।
ध्यान दें: प्रारंभिक आयाम दृढ़ता से परावर्तित प्रकाश की राशि से प्रभावित है। केन्द्र बिन्दु टो ले जाकरकांच कवर और नमूना, परिलक्षित प्रकाश बढ़ जाती है की राशि के बीच इंटरफेस अर्द। ऐसे polystyrene लेटेक्स के रूप में मजबूत प्रकाश scatterers, के लिए, प्रारंभिक आयाम 1. हालांकि 0 से बदला जा सकता है, इसे और अधिक आम बहुलक समाधान के लिए 1 के करीब प्रारंभिक आयाम स्थापित करने के लिए है क्योंकि परावर्तित प्रकाश की तीव्रता के मुकाबले कहीं ज्यादा मुश्किल है बिखरे हुए प्रकाश की। - उलटा लाप्लास परिवर्तन प्राप्त समय सहसंबंध समारोह के लिए (विवश नियमितीकरण कार्यक्रम Contin 13,14 का उपयोग) आकार के वितरण समारोह के अधिग्रहण के लिए लागू करें। मामलों में जहां प्रारंभिक आयाम कम से कम 0.2 के लिए सेट कर दिया जाता है, hydrodynamic त्रिज्या के वितरण समारोह में 100 एनएम, दो बार वास्तविक त्रिज्या (विवरण के लिए चर्चा देखें) है, जो चारों ओर एक तेज चोटी दिखाएगा।
- नमूना माप
- 25 डिग्री सेल्सियस तक तापमान चरण निर्धारित करें।
- एक स्लाइड के साथ पाली NIPA (PNIPA) solut तैयार रखेंआयन (कदम 1.3.4) खुर्दबीन के मंच पर।
- निम्नलिखित कदम 2.1.4-2.1.8 से बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता का समय सहसंबंध समारोह को मापने। प्रारंभिक आयाम 0.2 से बड़ा है, तो केन्द्र बिन्दु समय सहसंबंध समारोह के प्रारंभिक आयाम बनाने के लिए कदम 2.1.9 का पालन करके कम से कम 0.2 समायोजित करें। एक छोटी सी प्रारंभिक आयाम विश्लेषण सरल करता है।
- 35 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट चरण के लिए और इंतजार जब तक समाधान परेशान हो जाता है। PNIPA समाधान के निचले महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) 32 डिग्री सेल्सियस है 15।
- निम्नलिखित कदम से समय सहसंबंध समारोह उपाय 2.1.4-2.1.8। यदि संभव, केन्द्र बिन्दु की स्थिति समय सहसंबंध समारोह कम से कम 0.2 की प्रारंभिक आयाम बनाने के लिए समायोजित करें। पंकिल समाधान के लिए, अपने शुरुआती आयाम बढ़ाने के लिए, बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता बढ़ जाती है क्योंकि जबकि परावर्तित प्रकाश की कि निरंतर बनी हुई हैं।
- उलटा लाप्लास transformati लागू करेंप्राप्त समय सहसंबंध के कार्य करने के लिए पर आकार वितरण कार्य प्राप्त करने के लिए। ध्यान दें कि वास्तविक आकार मामलों में आधे से प्राप्त मूल्य जहां प्रारंभिक आयाम 0.2 की तुलना में कम है।
। यहाँ, मैं (टी) समय टी और (•••) टी समय औसत है पर बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता है। क्षय समय लगभग 0.1 एमएस होगा। Representative Results
एक polystyrene लेटेक्स निलंबन के लिए बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता का समय सह-संबंध कार्यों (कण त्रिज्या: 50 एनएम) के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है, विभिन्न फोकल प्वाइंट पर मापा गया (क)। ये सह-संबंध कार्यों उलटा लाप्लास परिवर्तन से hydrodynamic त्रिज्या का वितरण कार्य में परिवर्तित किया गया (संदर्भ लें चित्र 2 (ख) और (ग))। उसी प्रक्रिया का उपयोग करना, समय सह-संबंध कार्यों और PNIPA समाधान hydrodynamic त्रिज्या का वितरण कार्य में क्रमश: 35 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त की और थे। आंकड़े 3 (क) और (ख) बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता का समय सह-संबंध कार्यों और नीचे PNIPA समाधान (25 डिग्री सेल्सियस) और ऊपर (35 डिग्री सेल्सियस) LCST की इसी आकार के वितरण कार्यों दिखा। आकार के वितरण कार्यों उलटा लाप्लास परिवर्तन के द्वारा पीछा द्वारा प्राप्त किया गयाआंशिक Heterodyne के सुधार। LCST नीचे औसत hydrodynamic त्रिज्या नैनोमीटर के कई दसियों, जो बहुलक समाधान के लिए विशिष्ट है। इसके विपरीत, LCST ऊपर hydrodynamic त्रिज्या के बारे में 1.0 माइक्रोन है। यह नतीजा है कि इस तथ्य के समाधान LCST ऊपर परेशान है साथ संगत है। चित्रा 3 में लाल और नीले रंग की लाइनों के तुरंत बाद प्राप्त की और समाधान के बाद 20 मिनट के पंकिल, क्रमशः बन PNIPA समाधान के आकार के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 3 (ख) स्पष्ट रूप से एकत्रीकरण के विकास को इंगित करता है।
चित्रा 1. गतिशील प्रकाश बिखरने माइक्रोस्कोप के Schematics। पिनहोल (पीएच), बीम फाड़नेवाला (बी एस), polarizer (पोल), और हिमस्खलन photodiode (APD)। कृपया देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।
चित्रा 2 एक polystyrene लेटेक्स निलंबन के लिए प्रतिनिधि परिणाम है। (क) polystyrene लेटेक्स निलंबन के लिए बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता का समय सह-संबंध कार्य करता है। नाममात्र त्रिज्या 50 एनएम है और एकाग्रता 0.1 wt% है। दो डेटासेट अलग बिखरने अंक से प्राप्त किया गया। (ख), (ग) polystyrene लेटेक्स निलंबन के लिए इसी आकार के वितरण के कार्यों का उलटा लाप्लास परिवर्तन द्वारा प्राप्त (क)। लाल रेखा समय सहसंबंध समारोह जिसका प्रारंभिक आयाम लगभग 1.0 से मेल खाती है, और ब्लू लाइन एक प्रारंभिक आयाम यह है कि लगभग 0.2 के साथ उस से मेल खाती है। क्षैतिज अक्ष (ख) के बिना और (ग) के साथ आंशिक heterodyning (पीएचडी) के प्रभाव पर विचार गणना की गई जब एक << ; 1. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. एक PNIPA समाधान के लिए प्रतिनिधि परिणाम है। (क) PNIPA समाधान के लिए बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता का समय सह-संबंध कार्य करता है। (ख) PNIPA समाधान (क) के उलटा लाप्लास परिवर्तन से प्राप्त करने के लिए इसी आकार के वितरण कार्य करता है। क्षैतिज अक्ष प्रत्येक डेटा सेट के लिए आंशिक heterodyning के प्रभाव पर विचार गणना की गई। काला लाइन डेटा 25 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा डेटा प्राप्त बस के बाद समाधान परेशान कर दिया (35 डिग्री सेल्सियस) का प्रतिनिधित्व करता है। ब्लू लाइन डेटा लाल रेखा की एक 20 मिनट की माप के बाद प्राप्त प्रतिनिधित्व करता है।/54885/54885fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
समय सहसंबंध समारोह के प्रारंभिक आयाम भारी, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया केन्द्र बिन्दु पर निर्भर करता है (क)। यह प्रतीत होता है कि इस तथ्य के समाधान सजातीय है (इंटरफेस में पतली परत के लिए छोड़कर) 8 के विपरीत है। प्रारंभिक आयाम में यह बदलाव परिलक्षित प्रकाश की राशि में एक बदलाव के लिए जिम्मेदार ठहराया है। आंशिक Heterodyne सिद्धांत 16 भविष्यवाणी की है कि प्रारंभिक आयाम, ए, बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता, मैं, और परावर्तित प्रकाश की तीव्रता, मैं r, निम्न समीकरण को संतुष्ट 1
इस समीकरण से पता चलता है कि बड़े मैं r हो जाता है, छोटे एक हो जाता है। इसलिए, एक अंतरफलक के करीब फोकल स्थिति की स्थापना से कम है। स्पष्ट प्रसार निरंतर विकास के एक सीएn monodisperse समाधान के मामले में समय सहसंबंध समारोह फिटिंग द्वारा प्राप्त किया जा:
कहा पे 
। इधर, n विलायक (पानी, 1.33) का अपवर्तनांक है, θ बिखरे कोण (180), और λ प्रकाश (514.5 एनएम) की तरंग दैर्ध्य है। चूंकि हम backscattering ज्यामिति का प्रयोग किया, क्यू के मूल्य तय हो गई है। हालांकि, इस बात प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके हल किया है। कृपया ध्यान दें कि निरंतर तरंग लेजर स्रोत के किसी भी प्रकार डीएलएस माइक्रोस्कोप के निर्माण के लिए उपलब्ध है। छोटे विकिरणित मात्रा के लिए धन्यवाद, जुटना कारक 17 से ज्यादा होने का अनुमान 0.99 और नगण्य है। Polydisperse समाधान के लिए, डी ए के वितरण समारोह उलटा लाप्लास परिवर्तन द्वारा प्राप्त की है। आंशिक Heterodyne वेंeory भी भविष्यवाणी की है कि डी एक वास्तविक प्रसार निरंतर विकास के रूप में ही नहीं है। इन दो प्रसार स्थिरांक संतुष्ट निम्न समीकरण:
प्रसार निरंतर डी hydrodynamic त्रिज्या आर आइंस्टीन-स्टोक्स समीकरण 4 का उपयोग ज में बदल जाती है। एक = 1, इस रिश्ते डी ए = डी हो जाता है। इस मामले में, डेटा रूपांतरण की प्रक्रिया है कि आम गतिशील प्रकाश बिखरने के समान ही है। लाल रंग में चित्रा 2 (ख) से पता चला लाइन इस मामले से मेल खाती है। इसके विपरीत, इस संबंध में एक की सीमा पर डी एक = 0.5 डी हो जाता है → 0. इसलिए, आकार दो बार के रूप में वास्तविक आकार के रूप में बड़े हो सकता है जब एक छोटी सी (व्यावहारिक रूप से, कम से कम 0.2) है अनुमान लगाया गया है, के रूप में द्वारा दिखाए चित्रा 2 (ख) की ब्लू लाइन एक काफी छोटा है, क्षैतिज अक्ष, स्थानांतरित किया जा सकता है के रूप में चित्रा 2 (ग) में दिखाया गया है। सिद्धांत रूप में, हम एक के किसी भी मूल्य के लिए विकास में डी ए में बदल सकते हैं। व्यवहार में, हालांकि, यह बेहतर 0.2 से प्रारंभिक आयाम छोटे स्थापित करने के लिए है, क्योंकि साधारण सन्निकटन डी एक ~ 0.5 डी सच है।
गतिशील प्रकाश बिखरने माइक्रोस्कोप तकनीक की प्रमुख विशेषताएं एक PNIPA समाधान का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। नीचे और ऊपर LCST PNIPA की रचना बड़े पैमाने पर छोटे कोण न्यूट्रॉन 15,18 बिखरने का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। इसके विपरीत, गतिशील प्रकाश बिखरने अपनी मैलापन 19 की वजह से LCST ऊपर PNIPA के विश्लेषण के लिए उपयोग नहीं किया गया है। यह समस्या है, गतिशील प्रकाश बिखरने माइक्रोस्कोप के द्वारा हल के रूप में 3 आंकड़े में दिखाया गया है (क) और (ख)। इन समुच्चय के आकार के कई है और# 181; मीटर है, जो या तो छोटे कोण एक्स-रे / न्यूट्रॉन बिखरने या पारंपरिक प्रकाश बिखरने तकनीक द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है। समय हल माप इस प्रणाली का उपयोग तापमान परिवर्तन के दौरान एकत्रीकरण की प्रक्रिया के बारे में जानकारी दे।
गतिशील प्रकाश बिखरने माइक्रोस्कोप का दोष भी चित्रा 3 में सचित्र है। LCST नीचे परिणाम के लिए, समय सहसंबंध समारोह दृढ़ता से धूल वर्तमान की बहुत छोटी राशि (चित्रा 3 में काले लाइनों) से प्रभावित है। उदाहरण के लिए, समय सहसंबंध समारोह भी 1.0 एस के क्रम में सह-संबंध समय के साथ पूरी तरह से क्षय नहीं होता। इसका कारण यह मात्रा इस तंत्र (लगभग 1.0 माइक्रोन) के साथ विकिरणित हमेशा की तरह गतिशील प्रकाश बिखरने तंत्र (लगभग 100 माइक्रोन) के साथ कि विकिरणित की तुलना में काफी छोटा होता है। मामलों में जहां बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता कमजोर है, संकेत ऐसे रों की वजह से है कि के रूप में, शोर से छिप जाता हैसमाधान में धूल की मात्रा में मॉल। इसलिए, तीन चोटियों में चित्रा 3 (ख) में दिखाया गया मात्रात्मक महत्व हालांकि आकार का सामान्य क्रम सार्थक है नहीं हो सकता है। ध्यान दें कि इस तरह के एक कमजोर scatterer एक पारंपरिक गतिशील प्रकाश बिखरने तंत्र से मापा जा सकता है।
हमने दिखा दिया है कि गतिशील प्रकाश बिखरने माइक्रोस्कोप हमें ही स्थापना के साथ दोनों पारदर्शी और परेशान नमूनों को मापने के लिए सक्षम बनाता है। चूंकि नमूनों में ऑप्टिकल पथ की लंबाई कम है, इस तकनीक जैसे कार्बन नैनोट्यूब निलंबन 20 के रूप में, मजबूत प्रकाश को अवशोषित नमूने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, अपने उच्च स्थानिक संकल्प के कारण, इस तकनीक को जैविक कोशिकाओं के लिए आवेदन किया जा सकता है। जीव विज्ञान के लिए अपने आवेदन के लिए, इस विधि को भी अन्य इमेजिंग तकनीक, ऐसे प्रतिदीप्ति और रमन इमेजिंग के रूप में के साथ जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, हम मानते हैं कि गतिशील प्रकाश बिखरने माइक्रोस्कोप अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide, 98% | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | I0401 | |
| toluene, 99% | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 201-01876 | |
| petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-22565 | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99% | Sigma | T9281 | |
| ammonium persulfate, 98% | Sigma | 248614 | |
| polystyrene latex suspension, 1 wt% | Duke Scientific Corporation | 3500A | |
| argon | Koike Sanso Kogyo Co., Ltd. | purity > 99.999 vol.% | |
| cavity slide | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | 83-0336 | |
| inverted microscope | Nikon Instech Co., Ltd. | ECLIPSE Ti-U | |
| Thermo Plate | Tokai Hit CO.,Ltd | TP-108R-C | |
| Solid-state laser | Coherent | OBIS 488LX | |
| avalanche photodiode | ALV-GmbH | ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode | |
| correlator | ALV-GmbH | ALV-5000/EPP |
References
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