Summary
我们提出了如何妥善保存，并准备测试断裂和定量计算机断层成像尸体股骨一个强大的协议。该方法提供了对用于确定骨矿物密度，断裂强度之间的关系，并限定有限元模型的几何形状和性能的目的输入条件的精确控制。
Abstract
尸体断裂测试通常用来了解影响股骨近端强度的因素。由于体外生物组织很容易随着时间的推移失去其机械性能，样品必须仔细进行实验测试的准备，以获得在体内条件代表可靠的结果。出于这个原因，我们设计了一个协议和一套夹具以制备股骨标本，使得它们的机械性能经历最小的变化。在准备步骤和机械测试除股骨保持在冷冻状态。有临床双能X线骨密度仪（DXA）骨密度仪获得了全髋关节和股骨颈骨密度（BMD）的相关临床措施，并利用CT与校准幻影，获得三维几何和骨矿物质的分布基于所述灰度值的定量估计。任何可能的骨骼疾病，骨折，或植入物或影响骨结构的工件的情况下，被排除用X射线扫描。对于制备，所有的骨头被仔细清洗过量的软组织，并切断与盆栽在感兴趣的内部旋转角度。切割夹具允许骨的远端被切断而使股骨近端在所希望的长度。以允许以后的CT扫描和机械测试期间在规定的角度股骨颈定位，股骨近端的轴是在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），使用专为所需的方向而设计的夹具盆栽。然后从我们的实验中收集的数据被用于定量计算机断层扫描（QCT）的验证为基础的有限元分析（FEA），如在不同的协议描述。在这个手稿中，我们提出了力学性能试验和随后的QCT / FEA建模精确的骨骼制备的协议。目前的协议已成功应用于准备约200 CADaveric股骨超过6年的时间。
Protocol
注：本协议提出的所有研究是由梅奥诊所的机构审查委员会（IRB）的批准。尸骨了来自不同组织的一个为期6年获得。所有标本72小时死亡的内收集的，包裹在盐水饱和毛巾，并储存于-20℃，直至准备。
1.使用DXA测量骨密度
- 除去保持在-20℃下冷冻样品在室温下解冻约24小时标本并不需要从原始包装中删除，如果最软组织已被删除。
- 大米使用两个5磅袋占了软组织。封面上DXA表两种大米袋用塑料袋，以防止污染。的米袋将模拟周边扫描期间的软组织（体内 ）， 如图1。
- 保护DXA扫描器表面衬塑纸，并放置2个塑料包装里CE袋放在扫描仪表（ 图1A）。
- 莱在的大米包装袋顶部2股骨（左，右），使得近端（包括股骨头）集中在包包和后侧下跌（ 图1B）。这模仿患者仰卧在他们的后面。
- 覆盖前/暴露股骨近端年底与另外两个5磅的大米包装袋（ 图1C）。
- 机头跟在股骨近端，并根据病人的骨密度测量（ 图1C）的标准机构的程序扫描股骨。按照具体DXA制造商的说明。
- 从DXA机软件界面执行正常股骨扫描。选择股骨考试，通过相应地按压向左或向右箭头上DXA手臂上的尸体股骨顶部的DXA手臂的位置，并通过点击“开始”按钮，开始考试。通过点击“分析”执行BMD分析。
不E：从扫描得到的自动T分数分类骨为正常，骨质减少或骨质疏松性（ 图1D）。按照具体DXA制造商的说明。
- 从DXA机软件界面执行正常股骨扫描。选择股骨考试，通过相应地按压向左或向右箭头上DXA手臂上的尸体股骨顶部的DXA手臂的位置，并通过点击“开始”按钮，开始考试。通过点击“分析”执行BMD分析。
2.清洗，切割和钻孔骨的骨远端
- 通过仔细地除去从骨的任何剩余的软组织清洁股骨的最基端为300 mm。此步骤是必须允许PMMA期间在机械测试准备制陶过程联系骨头。骨头不需要解冻到室温这个过程。
- 消毒用70％异丙醇的工作区，并覆盖在一侧（ 图2A）与塑料薄膜吸收纸垫的表。设置在桌子上（ 图2B）的开始清洗，切割（ 图2A至2H）的整个过程全股骨。穿戴个人防护装备（PPE），包括手套和保护眼睛。
- 刮去多余的骨膜和用刮刀和手术刀（ 图2C，2H）切去多余的组织。
- 放置骨中的定制切割夹具如图2D与抗夹具的丙烯酸板股骨的头部。
- 对准并靠住上切割夹具（ 图2D）的两个插针的骨干。
- 固定骨头拧紧向下骨干开槽板的夹具;如果骨不平躺在夹具上，挂前端关闭桌面并且还根据需要握住标本就位（ 图2D）任选拉链扎股骨颈。
- 切割通过开槽板作为引导用铸件切割器（ 图2E）的股骨的远端轴;持有用干抹布/毛巾骨头更好的抓地力。
- 除去从夹具的骨;后切正常骨长度为255毫米（ 图2F）。
- 用刮匙约25毫米深清洁骨髓的骨髓腔。然后，将纱布海绵吸干的内表面。取出纱布刚刚之前放置在模具中的股骨的远端。把手用干毛巾/抹布骨和钻10毫米的孔，通过所述远端在从试样的近端切割端约25毫米。注：这是使PMMA穿透运河和牢固地固定骨头。
3.灌封骨
- 设计和制造封装容器。灌封容器形成5毫米厚的丙烯酸系片材，并具有以下外部尺寸50毫米乘50毫米的方形横截面和100毫米高（ 图3A）。
- 适当的骨骼识别标签封装容器（ 图3A和3B -看到亚克力盒标签）。
- 调整嵌入夹具适当取向（左腿或右腿; 例如 15°或30°内旋转）。
- 放置灌封容器在灌封容器（ 图3B）中嵌入夹具，代替骨的基部和与指针在夹具（ 图3C）对齐颈部到骨的内部的旋转角度调整到所需的值。
- 测量60克PMMA粉，并在通风橱用30克液体树脂混合，直到粉末溶解。该混合物应该是可流动的。使用一次性纸杯这一进程。
- 将混合物倒入带有通风橱（ 图3D）下骨灌封容器，允许以固化约10 - 15分钟，直到PMMA是透明和硬的。这应该只填写〜PMMA的灌封容器的1/2。小心包装在盐水饱和毛巾骨，以防止由于聚甲基丙烯酸甲酯聚合（ 图3E）中的发热组织干。
- 定期检查股骨，以确保它保持在对齐在固化过程中的容器。
- 从灌封夹具除去股骨并用盐水浸泡纸巾（ 图3E）包裹。
- 在通风橱下制备90克PMMA的如在步骤3.5解释和完全填充灌封容器。治愈PMMA约10 - 15分钟，直到它变得坚硬。
- 树脂固化后，紧紧包裹在盐水浸湿的纸巾/重新包骨，在冷冻室-20℃的塑料袋和存储样本覆盖。
4.成像的X射线骨
（ 注意！使用机器时，与X射线辐射的适当的照顾工作）
- 如果使用用于X射线的薄膜，由旋钮顺时针旋转（在显影剂室）打开X射线显影剂上至少20分钟（按照制造商说明书）扫描前。
- 确保有之前的X射线照相暗盒未曝光的胶片;卡带只能在一个黑暗的房间打开。
- 打开机器上解锁并延长机器头上。
- 放置一个购物的光束的路径下和放置一个盒上的光束（ 图4A）下的车。
- 地点和录像带上（ 图4B）股骨定位;两个方向将被捕获：内侧 - 外侧视图和前 - 后视图。相应地标出标本的图像。
- 第一次曝光后，交换铅和骨骼的位置。
- 覆盖已露出的一半与铅和在未曝光侧的第二取向露出骨。这允许用户使用一个X射线胶片用于在两个取向（ 图4C-D）的一个单一的骨。
- 更换磁带，每个股骨旋转到第二方位。
- 在一个单一的股骨的情况下，覆盖引线盖的磁带盒的一半，以避免整个膜的X射线的初始曝光。
- 移动个人防护铅衬便携式墙后面，使用触发器揭露骨头。
- 完成后，返回X射线头锁定和存储位置，转动钥匙到X射线机上关闭并删除曝光X光片。
- 开发该膜，得到使用普通膜显影剂的X射线图像（ 图4E）。打开白色的光在房间里，找到了电影的开发。打开红灯打开磁带之前关闭的白色光，并与电影发展过程中进行。打开纸盒，并通过开发商放电影。打开白色光，并且一旦膜已经开发关掉红光。
5.骨骼CT扫描
- 从冰箱扫描约24小时前，剔除骨头。骨骼必须在扫描之前完全解冻。
- 确保骨头被包裹在塑料袋进行扫描，以尽量减少清理底。
- 放置并固定股骨和在CT扫描灯具（ 图5A-B）的校准幻像。在Fixture保持校准体模（ 图5C），也保持在一个方向（ 图5D-E）的具有期望用于随后机械测试的取向相同的股骨。这种交叉登记需要在QCT / FEA建模过程（在不同的协议描述）使用从CT扫描（ 图5F）中的数据。
注：夹具被设计为使得它暴露作CT扫描股骨而不妨碍股骨近端（股骨头，颈，大转子，和近侧部轴）。 - 确保与在CT扫描器股骨沿固定装置使用系统激光作为导向件（ 图5D-E）的正确对准。重新检查与CT造影长轴激光夹具的取向（按激光的开/关按钮）。假想不需要，因为它被固定在夹具要与激光对准。按零按钮操零从机器的控制面板的表中的位置N（→0←）在控制面板上。
- 继CT标准作业程序，在120 kVp的，216毫安秒，1秒旋转时间，操作CT机，并使用超高分辨率模式（晌礼）的1间距。这给出了0.4毫米的切片厚度，以及0.30的像素大小 - 取决于视场（FOV）字段的为0.45毫米。
- 前机械测试检查的CT扫描数据，以确保感兴趣的图像被捕获并保存。重新冻结在-20℃的骨，直到实验当天。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该股骨尸体被运冷冻并保持在-20°C，直到准备开始了。使用DXA扫描仪测量每个样品（ 图1）全髋和颈部的BMD以及T分数进行骨密度扫描。 T-分数是所测量骨密度的标准偏差相比，年轻健康受试者的平均值的数量。它的范围可以从-2.5或更低骨质疏松筋骨，-1和-2.5之间的骨质疏松的骨骼和高于-1正常的骨头。一旦完成后，骨头被清洗多余的组织，切成使用一个内部的设计和制造切割夹具（ 图2）以除去远端。然后将试样盆栽远端使用专为持有所需的内旋方向的骨头固定装置;放置远端插入灌封容器后，该聚甲基丙烯酸甲酯以液体形式注入的填充容器（ 图3 图4）。在这样的异常的情况下，考虑用于未来分析当骨的条件应记录。最后，股骨作了CT扫描，以获得CT图像，使用设计成保持在适当预定取向（收和内旋转角）的骨的丙烯酸类的CT扫描固定装置（ 图5）。 CT图像被用于获得三维骨几何形状和容积骨矿物质分布在定量基于CT的有限元分析中使用。之前随后的断裂试验，所有相关的数据表征每个股骨如骨密度值，X射线图像和CT图像进行检查，以确保感兴趣的数据进行记录和保存。
图1：BMD测量采用DXA扫描。 （一）大米袋，内衬塑料袋文件; （B）两个骨骼标本在扫描仪平台所需的方向; （C）股骨近端两端布满了扫描时2大米袋; （D）颈部和总髋部骨密度测量结果与相关的T-分数。 DXA扫描使用扫描仪的临床测量骨密度，估算T值执行。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：清洁和切割骨头。 （A）清洁和切割台; （B）骨样工具清洁ING; （C）的清洗股骨的轴; （D）固定在切割夹具的样品; （E）铸刀; （F）切割后完成的样本。一个特殊的夹具及骨的清洁和切割工具用于制备用于测试的最基端255毫米长度;用于清洗股骨髓内管（G）的刮匙; （H）的工具，用于在样品清洗浅表组织。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：股骨清洁和制陶过程。 （A）灌封胶夹具; （B）灌封在夹具股骨; （C）的调节内部旋转角所需的值;
图4：骨X射线过程。 （A）X光机; （B）与未曝光胶片的暗盒骨样品，盒的第二半被引线覆盖以避免整个膜的曝光; （C）将未曝光的胶片，在黑暗的房间开发商装载托盘; （D）的显影的胶片; （E）得到的健康股骨的X射线图像。 X射线设备用于扫描的骨头两个位置，以排除之前fracturES，植入物，骨转移，或者任何结构异常。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：CT扫描使用丙烯酸夹具持有期望的方向骨头。 （A）CT扫描仪; （B）的玻璃纤维股骨安装在丙烯酸夹具设计成保持在一个期望的方向的骨头; （C）安装在夹具尸体股骨; （D）的使用CT长轴激光夹具的垂直取向;股骨（E）对齐。一个内部设计的夹具被用来保持在相同于随后的测试位置的位置上的骨;骨对准与在CT内置激光器的帮助获得; （F） 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们提出了确保臀部配置横盘下跌股力量力学测试和QCT / FEA建模一个强大的骨骼准备协议。这种方法成了我们的标准的内部协议。在6年的过程中，有不同的人员，成功制备出约200股骨下此协议。该协议的成果包括分类使用DXA骨条件下，排除了转移性疾病，先前的骨折，或利用X射线的植入物，并获得矿物分布和利用CT用于随后QCT / FEA建模的3D几何形状。切割，灌封，并且扫描装置被设计成容纳左和右股骨以及用于未来的测试，建模和分析所需的不同骨取向。酒店内的灯具保证测试样品的重复性和再现性。
由于骨实验的复杂性和需要进行的BMD，X射线，和C的组合机械测试上前t扫描，股骨必须经过多次冷冻/解冻循环。与暴露于室温最小化的合适的协议，冻结骨标本保存用于机械试验，即使长期3,4组织。以前的研究表明，在-20℃冷冻骨骼不会改变它们的机械性能，并且在测试前几个冷冻/解冻循环被认为是一种安全和可行的过程5,6。在我们的研究中，所有股骨在-20℃和室温分别经历了三个冻结/解冻序列，为DXA扫描，CT扫描和机械测试。
在与几个以前的研究路线，标准化的大米包装袋进行测量时使用DXA来模仿周围的骨7 体内软组织标本BMD值使用。我们比较了尸体的c BMD值ohort不同患者人群的骨密度值，发现它们的分布非常相似，这表明我们的协议，为BMD测量8的鲁棒性。
股骨样品缺乏平坦表面可以很容易地和正确地对准以用于测试的所需取向。如果没有正确完成，这可能会影响该过程的可重复性，并限制了实验结果9的准确性。为了解决这个问题，一些灯具进行设计和制造，并实施了标准作业程序，使整个组织在样品制备过程处理独立于用户的技能。而股骨被收购，在过去几年进行试验时，协议和硬件保持不变还原电位制备的错误。
我们的骨制备过程的一个重要步骤是使用进行CT扫描骨折的三维建模QCT / FEA。因此，CT扫描和未来断裂测试的报名是我们股样品制备协议10的必要步骤。
骨制备目前方法具有一定的局限性。虽然精心策划收购的尸体，解剖，灌封和CT扫描过程中执行，调度股骨编制的各个阶段可能是具有挑战性，由于人员和设备的可用性。我们的过程需要标本被冻结，并在多个时间点解冻。然而，冷冻时间从未超过两周以上，和骨头经受共三个冷冻/解冻循环。也骨制备过程的目的是要尽量减少操作错误。我们灌封股骨近端远端观察到的唯一一个错误。一个右腿股骨在其中后，才CT成像发现错误的内旋角盆栽。随后，THI股骨从进一步的数据分析丢弃。因此，可能需要一个第二操作者此步骤浇注的聚甲基丙烯酸甲酯为灌封前检查在股骨的定向。在任何其他步骤中没有观察到其他错误。因此，它是显著地注意到，我们的方法是非常稳健的，允许只有一个错误，与多个运营商，在几年的过程中制备约200近侧股骨的期间。
提供了良好的质量控制系统，这将最小化操作人员错误的可能性，该协议的某些部分需要重复或由第二操作者重新检查。例如，应注意灌封以确保股骨轴钻孔以允许骨水泥进入股骨腔的过程中采取，保证股骨刚性地固定和测试过程中不会松动。此外，在感兴趣的内部旋转角度灌封股骨通常是由一个操作员执行。日之前ëPMMA倾为灌封的远端，第二操作者可能需要检查内部旋转角度设定为所需要的值。最后，股骨的CT扫描过程中，夹具保持在CT扫描器床骨的对准是关键的。一个操作员应当精确地对准夹具与对CT-激光束和第二操作者应确认夹具正确对齐。
虽然目前的协议被用于骨折测试和股骨标本在臀部结构的侧向落下的造型设计的，它可以被容易地扩展到其他装载方案包括无损检测，或通过测试其他骨类型的适当夹具重新设计。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者有没有相关的披露。
Acknowledgments
我们要感谢的材料和结构试验核心设施梅奥诊所寻求技术支持。此外，我们要感谢遵义伯格伦德，布兰特纽曼，乔恩运书房Buijs，博士，在研究过程中他们的帮助。这项研究是由财政从格兰杰基金会格兰杰创新基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CT potting container and scanning fixture | Internally manufactured | N/A | Custom designed and manufactured |
| CT scanner | Siemens | Somatom Definition scanner (Siemens, Malvern, PA) | CT scanning equipment |
| Quantitative CT Phantom | Midways Inc, San Francisco, CA | Model 3 CT calibration Phantom | Used for obtaining BMD values from Hounsfield units in the CT image |
| Dual Energy X-ray Absorptiometry scanner | General Electric | N/A | GE Lunar iDXA scanner for bone health or any similar BMD scanners |
| Hygenic Orhodontic Resin (PMMA) | Patterson Dental Supply | H02252 | Controlled substance and can be purchased with proper approval |
| Freezer | Kenmore | N/A | This is a -20 °C storage for bones |
| X-ray scanner | General Electric | 46-270615P1 | X-ray imaging equipment. |
| X-ray films | Kodak | N/A | Used to display x-ray images |
| X-ray developer | Kodak X-Omatic | M35A X-OMAT | Used for developing X-ray images |
| X-ray Cassette | Kodak X-Omatic | N/A | Used for holding x-ray films |
| 5-pound Rice Bags | Great Value | N/A | Used for mimicking soft tissue during the DXA scanning process |
| Physiologic Saline (0.9% Sodium Chloride) | Baxter | NDC 0338-0048-04 | Used for keeping samples hydrated |
| Scalpels and scrapers | Bard-Parker | N/A | Used to clean the bone from soft tissue |
| Cast cutter | Stryker | 810-BD001 | Used to cut femoral shaft |
| Drilling machine | Bosch | N/A | Used to drill the femoral shaft |
| Fume Hood | Hamilton | 70532 | Used for ventilation when using making PMMA |
References
- Cristofolini, L., Schileo, E., Juszczyk, M., Taddei, F., Martelli, S., Viceconti, M. Mechanical testing of bones: the positive synergy of finite-element models and in vitro experiments. Philos Trans A Math Phys Eng Sci. 368, 2725-2763 (2010).
- Cartner, J. L., Hartsell, Z. M., Ricci, W. M., Tornetta, P. III Can we trust ex vivo mechanical testing of fresh-frozen cadaveric specimens? The effect of postfreezing delays. J Orthop Trauma. 25 (8), 459-461 (2011).
- An, Y. H., Draughn, R. A. Mechanical testing of bone and the bone-implant interface. , CRC press. (1999).
- van Haaren, E. H., van der Zwaard, B. C., van der Veen, A. J., Heyligers, I. C., Wuisman, P. I., Smit, T. H. Effect of long-term preservation on the mechanical properties of cortical bone in goats. Acta Orthop. 79, 708-716 (2008).
- Shaw, J. M., Hunter, S. A., Gayton, J. C., Boivin, G. P., Prayson, M. J. Repeated freeze-thaw cycles do not alter the biomechanical properties of fibular allograft bone. Clin Orthop Relat Res. 470 (3), 937-943 (2012).
- Topp, T., et al. Embalmed and fresh frozen human bones in orthopedic cadaveric studies: which bone is authentic and feasible? Acta Orthop. 83 (5), 543-547 (2012).
- Manske, S., et al. Cortical and trabecular bone in the femoral neck both contribute to proximal femur failure load prediction. Osteoporos Int. 20 (3), 445-453 (2009).
- Rezaei, A., Dragomir-Daescu, D. Femoral Strength Changes Faster With Age Than BMD in Both Women and Men: A Biomechanical Study. J Bone Miner Res. 30, 2200-2206 (2015).
- Cristofolini, L., McNamara, B., Freddi, A., Viceconti, M. In vitro measured strains in the loaded femur: quantification of experimental error. J Strain Anal Eng Des. 32, 193-200 (1997).
- Dragomir-Daescu, D., et al. Robust QCT/FEA models of proximal femur stiffness and fracture load during a sideways fall on the hip. Ann Biomed Eng. 39, 742-755 (2011).
