Проксимальный трупной Femur Подготовка к Перелом проверки прочности и количественный КТ на основе анализа методом конечных элементов

Summary

Мы представляем надежный протокол о том, как сохранить и тщательно подготовить трупной бедрами для тестирования переломов и количественной компьютерной томографии. Способ обеспечивает точный контроль над входными условиями для целей определения соотношения между минеральной плотностью костной ткани, трещиностойкости, и определение конечной геометрии и свойств элемента модели.

Abstract

Трупной тестирование трещины обычно используется, чтобы понять факторы, влияющие на прочность проксимального отдела бедренной кости. Поскольку бывшие естественных биологических тканей склонны терять свои механические свойства в течение долгого времени, образец подготовки к экспериментальной проверки должны выполняться тщательно , чтобы получить достоверные результаты , которые представляют в условиях естественных условиях. По этой причине мы разработали протокол и набор приспособлений для приготовления бедренную образцов таким образом, что их механические свойства испытывали минимальные изменения. В бедренные хранились в замороженном состоянии, за исключением во время этапов подготовки и механических испытаний. Соответствующие клинические показатели общего бедра и шейки бедренной кости минеральной плотности костной ткани (МПКТ) были получены с клиническим двойной Х абсобциометрией (ДРА) костный денситометр, а 3D геометрия и распределение костного материала были получены с использованием КТ с калибровочный образец для количественные оценки, основанные на полутоновых значений. Любое возможное заболевание костей, переломИли наличие имплантатов или артефактов, влияющих на структуру кости, была исключена с помощью рентгеновских сканирования. Для приготовления, все кости были тщательно очищены от избытка мягких тканей, а также вырезались и герметизированы на внутреннем угле поворота интерес. Режущее приспособление позволило Дистальный конец кости, чтобы отрезать оставив проксимального отдела бедренной кости при желаемой длины. Чтобы разрешить размещение шейки бедренной кости в заданных углов при последующем КТ и механических испытаний, проксимальных бедренных валы были герметизированы в полиметилметакрилат (ПММА), используя прибор, разработанный специально для желаемых ориентаций. Данные, собранные из наших экспериментов были затем использованы для проверки достоверности количественной компьютерной томографии (QCT) основе анализ методом конечных элементов (FEA), как описано в другом протоколе. В этой рукописи, мы приводим протокол для точной подготовки кости для механических испытаний и последующего моделирования ККТ / FEA. Текущий протокол был успешно применен для подготовки около 200 хамаaveric бедренные в течение периода времени 6 лет.

Protocol

Примечание: Все исследования, представленные в этом протоколе были одобрены Советом по институциональному (IRB) в клинике Mayo. Кости были получены в течение 6 лет с различными организациями. Все образцы были собраны в течение 72 часов после смерти, завернутые в солевых насыщенными полотенца, и хранили при -20 ° С до приготовления.

1. Измерение минеральной плотности костной ткани с помощью DXA

1. Удалить образцы выдерживали при -20 ° C морозильнике оттаивают при комнатной температуре в течение примерно 24 ч; Образцы не должны быть удалены из оригинальной упаковки, если большинство мягких тканей была удалена.
2. Используйте два 5 фунтов мешков риса для учета мягких тканей. Накройте два мешка риса на столе DXA с полиэтиленовыми пакетами, чтобы предотвратить загрязнение. Мешки риса будет имитировать окружающих мягких тканей (в естественных условиях) во время сканирования , как показано на рисунке 1.
3. Защитите поверхность сканера DXA с пластиковой подкладкой бумагу и поместите 2 пластиковые завернутые риCE сумки на столе сканера (Рис . 1А)
4. Положите 2 бедрами (справа и слева) в верхней части риса мешки таким образом, что ближний конец ( в том числе головки бедренной кости) сосредоточена на мешках и задняя сторона вниз (рис 1В). Это имитирует пациента, лежащего на спине.
5. Крышка передняя / подвергается проксимального конца бедренной кости с дополнительными двумя мешками 5 фунтов риса (рис 1C).
6. Положение головки машины над проксимального отдела бедренной кости и сканирования бедренной кости в соответствии со стандартной процедурой институциональной для измерения пациента BMD (рис 1C). Следуйте конкретным инструкциям производителя DXA.
   1. Из машинного интерфейса программного обеспечения DXA выполнить обычную проверку бедренной кости. Выберите бедренной кости экзамен, поместите руку DXA на верхней части трупной бедренной кости, нажав на стрелку влево или вправо, соответственно, на руке DXA, и начать экзамен, нажав на кнопку "Старт". Выполните анализ BMD, нажав на "Анализ".
      НЕE: в результате автоматического Т-баллов из проверки классифицирует кости , как обычно, остеопенический или остеопорозом (рис 1D). Следуйте конкретным инструкциям производителя DXA.

2. Очистка, резки и сверления Дистальный конец кости

1. Очистите наиболее проксимальных 300 мм бедренной кости, тщательно удаляя все оставшиеся мягкие ткани от кости. Этот шаг необходим, чтобы позволить ПММА связаться кости во время процесса заливки при подготовке к механическим испытаниям. Кости не нужно размораживать до комнатной температуры в течение этого процесса.
2. Санируйте рабочее пространство с 70% изопропилового спирта и покрывают стол впитывающей бумагой колодки с пластиковой пленкой с одной стороны (рис 2А). Установите всю бедренную кость на столе (рис 2B) для всего процесса , начиная с очистки для резки (рис 2А-2Н). Использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчаткии средства защиты глаз.
3. Соскоблите избыток надкостницу и отрезать лишнюю ткань с помощью скребка и скальпелем (рис 2С, 2H).
4. Поместите кость в заказном резки арматуры , как показано на рисунке 2D с головки бедренной кости по отношению к акриловой пластине светильника.
5. Выравнивание и удерживайте диафизе против двух штырьков на разделочной приспособление (рис 2D).
6. Закрепите кость к приспособлению, затянув вниз щелевой пластины на диафизе; если кость не лежать на арматуре, повесить дистального конца от столешницу , а также при необходимости стяжку шейки бедренной кости , сколько необходимо для удержания образца на месте (рис 2D).
7. Вырезать дистального вал бедренной кости с помощью ножа литой (рис 2E) через щелевой пластины в качестве направляющей; держать кость сухой тряпкой / полотенцем для лучшего сцепления.
8. Удалить кости из прибора; нормальная длина кости после разреза составляет 255 мм (рис2F).
9. Очистите костномозговой полости мозга с помощью кюретки глубоко примерно 25 мм. Затем вставьте марлевую губкой, чтобы помочь высушить внутреннюю поверхность. Удалить марлю только до размещения дистального конца бедренной кости в пресс-форме. Захватите кость с сухим полотенцем / тряпки и просверлить 10 мм отверстие через дистального конца на приблизительно 25 мм от проксимального конца вырезать образца. Примечание: Это должно позволить ПММА проникнуть в канал и зафиксировать кость прочно.

3. Герметизация Bone

1. Спроектировать и изготовить контейнер заливки. Герметизирующий контейнеры изготовлены из 5 мм толщины акриловых листов и имеют следующие внешние размеры: 50 мм на 50 мм с квадратным поперечным сечением и высотой 100 мм (рисунок 3а).
2. Этикетка заливкой контейнер с соответствующей идентификации кости (рис 3A и 3B - см ярлык на акриловой коробке).
3. Отрегулируйте вложенности приспособление для правильной ориентации (левая ногаили правую ногу; например , 15 ° или 30 ° внутреннее вращение).
4. Поместите заливочной контейнер в базе встраивания светильника, место кости в горшечной контейнере (рис 3B) и выровнять шею с указателем в приспособлении (рис 3C) для регулировки внутреннего угла поворота кости до требуемого значения.
5. Мера 60 г порошка ПММА и смешивают с 30 г жидкой смолы под вытяжкой, пока порошок не растворится. Смесь должна быть текучими. Используйте одноразовые бумажный стаканчик для этого процесса.
6. Вылейте смесь в горшечной контейнер с костью под вытяжкой (рис 3D), позволяют вылечить в течение приблизительно 10 - 15 мин до ПММА не ясна и трудно. Это должно заполнить только ~ 1/2 заливки контейнера с ПММА. Тщательно оберните кость в засоленных насыщенное полотенца , чтобы предотвратить сухость тканей вследствие выделения тепла в процессе полимеризации ПММА (рис 3Е).
7. Периодически проверяйте бедренной кости, чтобы убедиться, что он остается выровнен вконтейнер во время отверждения.
8. Удалить из бедренной кости горшечной арматуре и завернуть с солевым пропитанной бумажным полотенцем (рис 3Е).
9. Приготовьте 90 г ПММА под вытяжкой, как описано в шаге 3.5 и полностью заполнить контейнер заливки. Лечение ПММА в течение приблизительно 10 - 15 минут, пока не станет трудно.
10. После того, как смола затвердеет, плотно завернуть / обернув кость в засоленных пропитанной бумажным полотенцем, накрыть полиэтиленовым пакетом и хранения образцов при -20 ° C в морозильной камере.

4. Визуализация кости с рентгеновской

(ВНИМАНИЕ! Эксплуатация при надлежащем уходе за рентгеновского излучения при использовании аппарата)

1. При использовании пленок для рентгеновских лучей, включите рентгеновского разработчика, по крайней мере, 20 минут (на одного производителя инструкции) перед сканированием, повернув ручку по часовой стрелке (в комнате разработчиков).
2. Убедитесь, что есть нераскрытый пленка в кассете до просвечивания; кассета должна быть открыта только в темной комнате.
3. Включите машину наразблокировать и расширить головку машины.
4. Поместите тележку под пути луча и поместите кассету на тележке под балкой (фиг.4А).
5. Место и положение бедренной кости на кассете (Рисунок 4В); две ориентации будут захвачены: медиально-вид сбоку и передне-задний вид. Этикетка с образцами изображений соответственно.
6. После первой экспозиции, поменять местами свинца и кости.
7. Накройте уже открытую половину со свинцом и разоблачить кости во второй ориентации на необогреваемой стороне. Это позволяет пользователю использовать один рентгеновской пленки для одной кости в двух направлениях (рис 4C-D).
8. Замените кассету и вращать каждую бедренную кость во второй ориентации.
9. В случае одной бедренной кости, покрывают половину кассеты с свинцовой крышкой, чтобы избежать первоначальной экспозиции всего фильма до рентгеновских лучей.
10. Перемещение за свинцовой подкладкой портативной стене для личной защиты и использовать триггер, чтобы выставитькости.
11. По завершении возврата рентгеновской головки, чтобы зафиксировать и сохранить положение, поверните ключ в положение OFF на рентгеновский аппарат и удалить подвергаются рентгеновской пленки.
12. Разработка фильма для получения рентгеновских изображений (рис 4д) с помощью обычного разработчика пленки. Включите белый свет в комнате и найдите строительную пленку. Включите красный свет и выключить белый свет, прежде чем открывать кассету и продолжить процесс разработки фильма. Откройте кассету и положите пленку через разработчика. Включите белый свет и выключить красный свет после того, как фильм был разработан.

5. КТ сканирование костей

1. Удалить кости из морозильной камеры около 24 ч перед сканированием. Кости должны быть полностью разморожены перед сканированием.
2. Убедитесь, что кости, завернутые в полиэтиленовые пакеты для сканирования, чтобы минимизировать очистку в конце.
3. Место и закрепите бедренной и калибровочный образец в КТ сканирования прибора (Рис 5A-B). еixture имеет калибровочный образец (рис 5C) , а также имеет бедренную кость в ориентации (рис 5D-E) совпадает с ориентацией , требуемой для последующего механического тестирования. Этот крест регистрация требуется использовать данные КТ (рис 5F) в моделировании процесса ККТ / FEA (описано в другом протоколе).
   Примечание: Прибор сконструирован таким образом, что он подвергает бедренной кости для КТ, не загораживая проксимального отдела бедренной кости (бедренной кости головы, шеи, большого вертела, и проксимальный вал).
4. Убедитесь , что прибор вместе с бедренной кости в КТ - сканера правильно выровнен с помощью системы лазеров в качестве направляющих (рис 5D-E). Повторно проверьте выравнивание прибора с длинной осью лазера CT (нажатием лазера кнопки включения / выключения). Фантом не нужно быть выровнен с лазером, как он закреплен в арматуре. Нулевой положение таблицы с панели управления аппарата, нажав на нулевую переключатеп (→ 0 ←) на панели управления.
5. После стандартной процедурой КТ, управлять машиной КТ при 120 кВп, 216 MAS, 1 сек времени вращения, и шаг 1, используя ультра режим высокого разрешения (Зухра). Это дает толщину среза 0,4 мм, а размер пикселя 0,30 - 0,45 мм в зависимости от размера поля зрения (FOV).
6. Проверить КТ Данные до механических испытаний, чтобы гарантировать, что изображения интереса захвачены и сохранены. не замораживать кости при -20 ° С до дня эксперимента.

Representative Results

В трупные бедренные были транспортироваться в замороженном состоянии и выдерживают при -20 ° С до тех пор, пока начала подготовки. Сканирование БМД была выполнена с помощью сканера DXA для измерения общего бедра и шеи БМД, а также Т-балл для каждого образца (рисунок 1). Т-подсчитано число стандартных отклонений измеренных БМД по сравнению со средними значениями для молодых здоровых субъектов. Она может варьироваться от -2,5 или ниже для остеопорозом костей, от -1 до -2,5 для остеопенией костей и выше, чем -1 для нормальных костей. После завершения, кости были очищены от избыточной ткани, и вырезать , чтобы удалить дальний конец , используя в доме спроектированы и изготовлены для резки арматуры (Рисунок 2). Образцы были затем герметизированы в дистальном направлении, используя приспособление, предназначенное для проведения кости в желаемой ориентации внутреннего вращения; после размещения дистального конца в контейнер горшечной, ПММА в жидком виде выливалась для заполнения контейнера (рисунок 3 (рисунок 4). При наличии таких аномалий, состояние кости следует документировать, если рассматривать для будущих анализов. Наконец, бедренные кости были КТ-сканирования для получения КТ - изображений, используя акриловый КТ сканирования прибор , предназначенный для удержания кости в соответствующих предварительно определенных ориентаций (приведением и внутренних углов поворота) (рисунок 5). Изображения КТ используются для получения 3-мерную геометрию кости и объемную распределение минеральных веществ в кости, которые будут использоваться в количественной основе КТ анализ методом конечных элементов. Перед последующим тестированием перелома, все соответствующие данные, характеризующие каждый бедренной кости, такие как значения BMD, рентгеновские снимки и КТ-изображений были проверены, чтобы гарантировать, что данные, представляющие интерес, были записаны и сохранены.

Рисунок 1: БМД измерения с помощью DXA сканирования. (A) Рисовые пакеты и пластиковые подкладке бумаги; (В) два образца кости в желаемых направлениях в планшете сканера; (C) проксимального отдела бедра концы покрыты 2 мешков риса во время сканирования; (D) шеи и полные измерения бедра BMD с сопутствующими Т-баллов. Сканирование ДРА осуществляется с использованием клинического сканера для измерения минеральной плотности костной ткани и оценка Т-балл. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Очистка и резки костей. (A) для очистки и резки письменный стол; (B) инструменты образец кости для чистойING; (C) очистка вала бедренной кости; (D) , крепящих образца в приспособлении режущим; (Е) резака произнесения; (F) , готовый пример после резки. Специальная арматура и средства для очистки костей и режущие инструменты используются для подготовки наиболее проксимальную длину 255 мм для испытаний; (G) кюретки используется для очистки интрамедуллярный канал бедренной кости; (H) средство для очистки поверхностной ткани в образцах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: бедренная Очистка и Поттинг процесса. (A) Potting приспособление; (B) сыгрыванием бедренную кость в арматуре; (С) регулирование внутреннего угла поворота к требуемому значению; (E) герметизированы кости , завернутые в солевом насыщенное полотенца. Специальное приспособление используется для установки внутреннего угла поворота к заданному значению. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Костный Рентгеновское процесса. (A) рентгеновский аппарат; (В) образец кости на кассету с пленкой неэкспонированные, вторая половина кассеты покрыта свинцом , чтобы избежать воздействия на протяжении всего фильма; (C) размещение неэкспонированную пленки в лоток загрузки проявителя в темной комнате; (D) разработали пленку; (Е) , в результате рентгеновское изображение здорового бедренной кости. Рентгеновское оборудование используется для сканирования костей в двух положениях, чтобы исключить предварительное fracturэс, имплантанты, метастазами в кости, или любые структурные аномалии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: КТ Сканирование с использованием акрилового крепежом к Держать кости в нужной ориентации. (A) томограф; (B) из стекловолокна бедренной кости , смонтированные в акриловую арматура , предназначенная для хранения костей в нужной ориентации; (C) монтажа трупной бедренной кости в арматуре; (D) вертикальное выравнивание прибора с помощью длинной оси лазера CT; (E) Выравнивание бедренной кости. В дом предназначен приспособление используется для удержания кости в положении, идентичной последующей позиции тестирования; выравнивание кости получают с помощью встроенных в лазерах КТ; (F) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Мы представили надежный протокол подготовки костной ткани для обеспечения механического моделирования и тестирования ККТ / FEA бедренной силы в боковом падении на конфигурации бедра. Этот метод стал наш стандартный протокол в доме. В течение 6 лет, с той или иной персонал, около 200 бёдра были успешно получены в соответствии этому протоколу. Результаты протокола включает в себя классификацию условий кости с помощью DXA, что исключает метастатических заболевания, предыдущие переломы, или имплантаты с использованием рентгеновского излучения, и получение распределения полезных ископаемых и 3D геометрии с использованием КТ для последующего моделирования / FEA ККТ. Резка, заливочных и сканирующие приборы были разработаны для размещения левого и правого бедрами, а также для различных ориентации кости, необходимые для дальнейшего тестирования, моделирования и анализа. В доме светильники уверены, повторяемости и воспроизводимости результатов испытаний образцов.

Из-за сложности костных экспериментов и необходимость в комбинации BMD, рентгеновского, и CT сканирование до механических испытаний, бедренные должен пройти несколько циклов замораживания / оттаивания. При правильном протоколом , который сводит к минимуму воздействие комнатной температуры, замораживание образцов кости сохраняет ткани на наличие механических испытаний, даже длительный срок ^{3, 4.} Предыдущие исследования показали , что при заморозке кости при -20 ° С , не изменяет свои механические свойства и , что несколько замораживания / оттаивания циклов до тестирования считается безопасной и выполнимой процесс ^{5, 6.} В нашем исследовании, все бедренные пережила три замораживания / оттаивания последовательности при температуре от -20 ° C до комнатной температуры, соответственно, для DXA сканирования, сканирование КТ и механических испытаний.

В соответствии с несколькими предыдущими исследованиями, стандартизированные пакеты риса были использованы при измерении значения МПКТ образцов с использованием DXA , чтобы имитировать в естественных условиях мягких тканей вокруг кости ^7. Мы сравнили значения BMD нашего трупной Cohort со значениями МПКТ различных групп пациентов и обнаружили их распределения очень похожи, что свидетельствует о надежности нашего протокола для измерения BMD ^8.

Бедренные образцы не имеют плоские поверхности, чтобы можно было легко и правильно выровнены к нужной ориентации для тестирования. Если это не сделано должным образом, это может повлиять на повторяемость процедуры и ограничить точность экспериментальных результатов ^9. Для решения этой проблемы, несколько светильников были разработаны и изготовлены и стандартные операционные процедуры были реализованы, чтобы сделать обработку зависит от мастерства пользователей на протяжении всего процесса подготовки образца ткани. В то время как бедренные были приобретены и проходят в течение нескольких лет, протокол и аппаратные средства остались теми же уменьшая потенциальные ошибки подготовки.

Одним из важных шагов нашего процесса подготовки кости должна была выполнить КТ сканирование для 3D моделирования перелома кости с использованиемККТ / FEA. Таким образом, регистрация между КТ и будущего тестирования переломов было необходимым шагом в нашем протоколе подготовки бедренной кости образца ^10.

В настоящее время способ получения костной имеет некоторые ограничения. Несмотря на тщательное планирование был реализован при приобретении Трупы, рассечение, заливкой и КТ, планирование различных этапов подготовки бедренной кости может быть сложной задачей из-за наличия персонала и оборудования. Наш процесс требует образцы должны быть заморожены и разморожены в различные моменты времени. Тем не менее, время замораживания никогда не превышал более чем за две недели, а кости были подвергнуты в общей сложности трех циклов замораживания / оттаивания. Кроме того, процесс подготовки кости был разработан, чтобы свести к минимуму ошибки оператора. Мы наблюдали только одну ошибку в сыгрыванием дистальный конец проксимальной части бедренной кости. Один правое бедро нога герметизированы при неправильном внутреннего угла поворота, который был обнаружен только после компьютерной томографии. Впоследствии Тхиs бедренной кости был отброшен из дальнейшего анализа данных. Таким образом, второй оператор может понадобиться для этого шага, чтобы проверить ориентацию бедренной кости перед заливкой ПММА для заливки. Никакие другие ошибки не наблюдалось ни в одном из других стадий. Таким образом, важно отметить, что наш процесс был очень надежен позволяет только одну ошибку, с несколькими операторами, в ходе подготовки около 200 проксимального бедрами в течение нескольких лет.

Для того, чтобы обеспечить хорошую систему контроля качества, что позволит свести к минимуму вероятность ошибок оператора, некоторые части протокола должны быть повторены или повторно проверяется вторым оператором. Например, следует соблюдать осторожность во время заливки, чтобы гарантировать, что бедренная вал сверлится, чтобы костный цемент, чтобы войти в полость бедренной кости, гарантируя, что бедренная кость жестко закреплен и не ослабит во время тестирования. Кроме того, заливочные бедренную кость на внутреннем угле поворота интерес обычно выполняется одним оператором. До гое ПММА наливают для заливки дистального конца, второй оператор может потребоваться, чтобы проверить, что внутренний угол поворота был установлен на требуемое значение. Наконец, во время КТ бедренной кости, выравнивание арматуры, держащего кости на кровати КТ сканера имеет решающее значение. Один оператор должен точно выровнять прибор с CT-лазерных лучей и второй оператор должен подтвердить, что прибор правильно выровнен.

Хотя в настоящее время протокол был разработан специально для тестирования разрушения и моделирования бедренной кости образцов в боковом падении на конфигурации бедра, он может быть легко расширена для других сценариев нагрузки, включая неразрушающего контроля, или приняты для проверки других типов костей с соответствующим арматуре редизайн ,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CT potting container and scanning fixture	Internally manufactured	N/A	Custom designed and manufactured
CT scanner	Siemens	Somatom Definition scanner (Siemens, Malvern, PA)	CT scanning equipment
Quantitative CT Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Model 3 CT calibration Phantom	Used for obtaining BMD values from Hounsfield units in the CT image
Dual Energy X-ray Absorptiometry scanner	General Electric	N/A	GE Lunar iDXA scanner for bone health or any similar BMD scanners
Hygenic Orhodontic Resin (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Controlled substance and can be purchased with proper approval
Freezer	Kenmore	N/A	This is a -20 °C storage for bones
X-ray scanner	General Electric	46-270615P1	X-ray imaging equipment.
X-ray films	Kodak	N/A	Used to display x-ray images
X-ray developer	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Used for developing X-ray images
X-ray Cassette	Kodak X-Omatic	N/A	Used for holding x-ray films
5-pound Rice Bags	Great Value	N/A	Used for mimicking soft tissue during the DXA scanning process
Physiologic Saline (0.9% Sodium Chloride)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Used for keeping samples hydrated
Scalpels and scrapers	Bard-Parker	N/A	Used to clean the bone from soft tissue
Cast cutter	Stryker	810-BD001	Used to cut femoral shaft
Drilling machine	Bosch	N/A	Used to drill the femoral shaft
Fume Hood	Hamilton	70532	Used for ventilation when using making PMMA