Summary
Nous décrivons une méthode pour l'étiquetage stable de xénogreffes dérivées de patients (PDXs) avec des particules lentiviraux exprimant la protéine et la luciférase reporters vert fluorescent. Cette méthode permet de suivre la croissance de PDXs au niveau du site primaire, ainsi que la détection des métastases spontanées et expérimentales en utilisant des systèmes d'imagerie in vivo.
Introduction
Le développement de xénogreffes dérivées de patients tumorales (PDXs), où des échantillons de tumeurs réséquées chirurgicalement sont greffées directement dans des souris immunodéprimées, offre plusieurs avantages par rapport aux modèles standards de xénogreffes de lignées cellulaires et représente une avancée majeure dans la recherche sur le cancer 1,2. PDXs peuvent être maintenues et développées par des passages successifs avec un minimum de modifications des caractéristiques génétiques et biologiques de la tumeur développée au premier passage; et refléter plus précisément l' hétérogénéité tumorale de xénogreffes dérivées de lignées de cellules cancéreuses humaines 3-8. Ces modèles sont maintenant largement utilisés comme une plate - forme pour la personnalisation thérapeutique du cancer 9,10, comme une plate - forme préclinique dans le développement de médicaments 6,11 et comme un outil expérimental pour l' étude de la biologie du cancer 4,12.
La plupart PDXs sont implantés et propagées par voie sous- cutanée, ce qui permet en pratique en mesure de la croissance de la tumeur au fil du temps en utilisant des compas. toutefois, La maladie métastatique a été plus difficile à modéliser en utilisant PDXs. En particulier pour le cancer du sein, des xénogreffes avec une capacité métastatique aux différents organes ont été décrits 3,5,13, mais la fréquence de la dissémination spontanée de sites métastatiques est extrêmement faible. Où signalé, l'identification et la quantification de la charge métastatique repose sur l'examen histologique laborieux des organes cibles post-mortem. des lignées de cellules cancéreuses exprimant bioluminescente (luciférase, de Luc) ou de fluorescence (protéine fluorescente verte, GFP) reporters de gènes sont couramment utilisés dans des modèles expérimentaux de métastases du cancer du sein au cerveau, les poumons, les os et le foie après intracardiaque, la queue veine intrafemoral et l'injection splénique 14-16. Bien que ces modèles contournent la diffusion des tumeurs primaires, ils sont précieux pour étudier les mécanismes de tropisme d'organe et de la colonisation métastatique. Cependant, les cellules dérivées de tumeurs et PDXs patients primaires peuvent avoir une faible transfection ou les taux de transduction using procédures standard. Une alternative consiste à établir des lignées cellulaires dérivées PDX-17 in vitro, qui peut être ensuite marqué en utilisant des protocoles de culture de tissus classiques. Cependant, cette approche ne convient pas à l'étiquetage la plupart des PDXs, pour lequel la lignée cellulaire dérivée est difficile et peut changer le phénotype des cellules. Ici , nous présentons un protocole pour la transduction de cellules tumorales dissociées PDX avec des vecteurs lentiviraux appropriés pour l' imagerie in vivo. En outre, nous décrivons des métastases expérimentales par injection intracardiaque de cellules PDX-luc GFP marquées dissociées dans des souris immunodéprimées.
Un protocole de base pour la transduction des organites PDX-dissociées avec lentivirus gène rapporteur exprimant a déjà été décrit 18. Dans le protocole en vigueur, nous décrivons des procédés supplémentaires pour enrichir les cellules tumorales humaines et d'obtenir près de 100% d'efficacité de transduction, ainsi que l'utilisation de PDXs marquées pour détecter le cancer du sein expérimentalmétastases. Ce protocole peut être adapté pour le marquage de plusieurs types de cancer de PDXs avec différents marqueurs luminescents et fluorescents, ainsi que la modulation de l' expression génique ( par exemple, shRNA knock - down de gènes d'intérêt).
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Protocol
Toutes les étapes nécessitant l'utilisation d'animaux dans ce protocole suit les lignes directrices de l'Université du Colorado comité d'éthique de la recherche sur les animaux (IACUC).
1. Préparation des instruments, Culture Media et autres réactifs
- Préparer 100 ml mammosphere milieux contenant du milieu de Eagle modifié et Han F-12 du milieu de Dulbecco (DMEM / F12) (1: 1), fibroblaste de base de facteur de croissance (bFGF, 20 ng / ml), le facteur de croissance épidermique (EGF, 10 ng / ml ) héparine (4 ug / ml), 1 x B27, de la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml). Faire des médias dans des conditions stériles et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
- Préparer un tampon d'enrichissement de l'épithélium (BEE) contenant du PBS pH 7,2, 0,5% de sérum-albumine bovine (BSA), 2 mM d'EDTA. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
- Faire aliquotes de 5 ml de tampon de digestion stérile dans 15 ml tubes coniques et stocker à -20 ° C pendant plusieurs mois. La nuit avant la digestion de la tumeur, le tampon dégel de digestion (5 ml par 500 mgtumeur) sur la glace, à 4 ° C. Ajouter 1x mélange antibiotique-antimycosique avant utilisation.
- Autoclave (121 ° C pendant 30 min) au moins deux pinces, scalpel et les ciseaux pour la dissection des PDXs.
- Faire 500 ml de tampon de lavage contenant du DMEM: F12 et 5% de sérum bovin fœtal (FBS). Conserver à 4 ° C pendant des mois. Aliquote de 10 ml par tumeur le jour de la dissection de la tumeur.
- Préparer un polybrène stock à 4 pg / pl avec de l'eau stérile. Filtre et aliquote dans 1,5 ml microtubes contenant 100 pi chacun, conserver à -20 ° C.
2. Génération de titre élevé Lentiviral Particles Porter traçable Marqueurs
- Achetez ou générer un titre élevé de particules lentiviraux portant un gène rapporteur (ie., GFP et Luc pour le suivi in vivo de la croissance tumorale) 18,19.
NOTE: Un titre lentiviral> 10 8 TU / ml (unités de transduction par millilitre) est recommandée pour la transduction réussie de PDXs. Le lentiviral ples articles doivent être pseudotypé avec une enveloppe glycoprotéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G), ce qui permet la transduction d'une grande variété de cellules de mammifères.
NOTE: Le protocole utilisé ici pour la génération et le titrage des particules lentiviraux à titre élevé est disponible à www.kottonlab.com . Les vecteurs utilisés dans ce protocole sont pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro et le double promoteur phage-EF1aL-luciférase-UBC-GFP-W. Ce vecteur a été généré par le remplacement DsRed avec le gène en aval du promoteur EF1aL luciférase dans le vecteur phage-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W, une sorte de cadeau Darrell Kotton, l'Université de Boston.
3. Génération de xénogreffes de patients dérivés
- Générer dérivées patient xénogreffes (PDX) de cancer du sein par l' implantation de tumeurs primaires ou métastatiques du sein dans le coussinet adipeux mammaire de souris immunodéprimées 3,4. Générer des tumeurs à une taille maximale recommandée de 1 cm de diamètre que les tumeurs plus grandes sont lontants envisageables pour contenir des noyaux nécrotiques.
NOTE: détaillée des méthodes d'établissement et de la transplantation de xénogreffes sont décrits dans DeRose et al 18.. La croissance des établis-transplantables PDXs dans> 1 tumeurs cm de diamètre prend entre 4 et 24 semaines après l'implantation dans NOD immunodéprimés / SCID / ILIIrg - / - (NSG), en fonction des taux de croissance de la tumeur intrinsèques. Alors que ce protocole décrit transduction des PDXs du cancer du sein, il peut être utilisé pour la transduction virale de toute tumeur apte à court terme dans le passage in vitro. La sensibilité du PDXs à court terme (24-96 h) de la survie in vitro est intrinsèque à chaque tumeur et doit être déterminée expérimentalement.
4. tumeur Dissection et la dissociation des cellules tumorales dérivées PDX
- Euthanasier des souris porteuses PDX utilisant inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale (suivent les directives institutionnelles du comité d'éthique de la recherche animale). Immerger souris dans un 0,2% Chlorhexidine solution pendant 1 min. Réglez la souris sur une position couchée sur le dessus d'une planche de dissection, et utiliser des épingles pour fixer les membres supérieurs et inférieurs étendus à la carte.
- En utilisant une technique aseptique, utiliser un scalpel pour couper la peau autour de la tumeur. Tirer la peau avec un ensemble de pinces et de le séparer de la tumeur en utilisant un scalpel propre jusqu'à ce que la tumeur est complètement exposée. L'utilisation d'un ensemble propre de pinces et scalpel, enlever la tumeur et le placer dans 5 ml laver les médias sur la glace.
- Prendre la tumeur disséquée dans une armoire BLS2 pour un traitement ultérieur. Retirez le support et rincer la tumeur avec 10 ml de sel de sodium équilibrée de Hank modifié avec Hepes 10 mM (HBSS / HEPES), deux fois.
- Déposer la tumeur dans 60 cm de la plaque pré-pesée stérile de culture tissulaire. Peser la plaque contenant la tumeur pour estimer la masse tumorale.
- L'utilisation d'un scalpel, couper la tumeur dans la moitié, puis coupez un disque de 3 mm d'une moitié et placez-le dans un récipient avec 10% de formol pendant 24 heures. Utilisez ce tissu pour vérifier l'hétérogénéité de laéchantillon de tumeur (PDX parental). Ajouter 200 ul de HBSS / Hepes (assez pour éviter le tissu à sécher) et émincer la tumeur restante dans les plus petites pièces possibles à l'aide de pinces et un scalpel propre.
- Transférer la tumeur hachée dans un 50 ml tube conique stérile. Ajouter au moins 1 ml de tampon de digestion contenant 1x antibiotique antimycotique pour 100 mg de tumeur.
REMARQUE: L' ajout d'antibiotiques / antimycosiques prévient la contamination des cellules tumorales in vitro. - Digest tumeur pendant 3 heures à 30 ° C, en agitant à 125-200 rpm.
NOTE: L'augmentation de la température jusqu'à 37 ° C augmente l'efficacité de la digestion (cellules plus simples au fil du temps), mais elle est généralement accompagnée par une augmentation de la mort cellulaire. Pour la plupart des tumeurs, la digestion à 30 ° C pendant 3 résultats hr dans un nombre suffisant de cellules dissociées viables pour passer à l'étape de marquage. - Arrêter la digestion en ajoutant 35 ml laver les médias (DMEM / F12 avec 5% de FBS). Filtrer à travers un nylon de 70 um de maille dans un endroit propre 50 ml cTube onical pour enlever le tissu non digérés. Centrifuger les médias filtrés contenant des cellules digérées à 400 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon de lyse des globules rouges. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 10 ml de tampon de lavage (DMEM: F12, 5% de FBS) pour arrêter la lyse. Passez les cellules à travers un nylon 40 uM Mesh pour éliminer les grumeaux. Centrifuger à 400 xg pendant 5 minutes et retirer le surnageant, placer sur la glace.
- Resuspendre les cellules dans 5 ml digéré tampon de lavage et de compter les cellules à la fois viables et non viables en utilisant l'exclusion du bleu trypan. En bref, mélanger 50 pi de cellules et 50 pi de bleu trypan et compter les cellules à l'exclusion trypan-bleu en utilisant un hémocytomètre.
NOTE: Ce produit de digestion brut contiendra des cellules humaines tumorales dérivées de la PDX, ainsi que les cellules stromales de la souris (fibroblastes, cellules sanguines, etc.). cellules digérées peuvent maintenant être traitées pour l'étiquetage (étape 6), ou des cellules cancéreuses humaines peuvent être enrichies en utilisant l'une des procédures décritesdans la référence 5.
5. Enrichissement des cellules cancéreuses épithéliales humaines
- Appauvrissent les cellules stromales de la souris en utilisant une lignée (Lin +) cellule kit de déplétion 20.
NOTE: Recommandé pour les tumeurs hautement vascularisées et / ou des tumeurs dont la teneur en stromal élevée dans laquelle l'expression de EpCAM est inconnu ou perdu).- Prenez jusqu'à 10 7 cellules viables dans un 5 ml tube en polypropylène propre, ajouter 2 ml EEB et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Pipeter le surnageant complètement.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 40 pi de glace froide EEB par 10 7 cellules.
- Ajouter 10 ul de biotine-cocktail d' anticorps par 10 7 cellules, mélanger par pipetage doucement et incuber à 4 ° C pendant 10 min (cocktail contient des anticorps à des cellules de souris Lin +).
- Ajouter 30 pl de BEE froid par 10 7 cellules, mélanger par pipetage.
- Ajouter 20 ul de microbilles anti-biotine par 10 7 cellules mélanger par pipetage doucement et incuber à 4 & #176; C pendant 15 min.
- Laver les cellules avec 3 ml EEB froid, centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer soigneusement surnageant. Resuspendre le culot dans 500 ul de BEE et placer sur la glace.
- Placer la colonne dans le champ magnétique d'un séparateur magnétique. Rincer la colonne avec 0,5 ml de tampon d'enrichissement épithéliale et lui permettre de couler à travers. Ne pas laisser la colonne de sécher.
- Placer un nouveau tube de collecte de polypropylène sous la colonne. Lentement, ajouter les 500 ul contenant des cellules marquées sur la colonne (Lin + étiqueté cellules seront conservées dans la colonne magnétique). Recueillir l'effluent en tant que fraction de cellules non marquées, ce qui représente la fraction cellulaire enrichie lignée négative (tumeur).
- Rincer la colonne 3 fois avec 500 pi de EBB et de recueillir l'effluent dans le même tube que l'effluent de l'étape 5.1.8. Gardez l'effluent sur la glace et passer à l'étape d'étiquetage (6).
- Facultatif: Prendre la colonne en dehors du champ magnétique. Placez un nouveau tube en polypropylène souset éluer la fraction LIN + en ajoutant 500 pi de BEE, trois fois et en utilisant le piston fourni.
- Enrichissement des cellules humaines cancéreuses épithéliales EpCAM + (recommandé pour les tumeurs connues pour exprimer CD326 + et contiennent une teneur élevée du stroma de la souris).
- Prenez jusqu'à 10 7 cellules viables dans un 5 ml tube en polypropylène propre, ajouter 2 ml EEB froid et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Pipeter le surnageant complètement.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 60 pi de glace-froid EBB par 10 7 cellules.
- Ajouter 20 ul de microbilles de EpCAM par 10 7 cellules, mélanger par pipetage doucement et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
- Laver les cellules avec 3 ml EEB froid, centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer soigneusement surnageant. Resuspendre le culot dans 500 ul de BEE et mis sur la glace.
- Placer la colonne dans le champ magnétique d'un mini-séparateur. Rincer la colonne avec 0,5 ml EEB et lui permettre de couler à travers. Ne pas laisser la colonne sécheren dehors.
- Placer un nouveau tube de collecte de polypropylène sous la colonne. Lentement, ajouter les 500 ul contenant des cellules marquées sur la colonne (cellules marquées EpCAM + seront conservés dans la colonne magnétique). Recueillir l'effluent en tant que fraction de cellules non marquées, ce qui représente les cellules stromales de souris.
- Rincer la colonne 4 fois avec 500 pi de tampon ME et de recueillir l'effluent dans le même tube que l'effluent de l'étape 5.1.8.
- Prenez la colonne en dehors du champ magnétique. Placer un nouveau tube en polypropylène et en dessous éluer la fraction EpCAM + en ajoutant 500 pi de tampon, de ME trois fois. Rincer les cellules magnétiquement marquées en poussant fermement le piston dans la colonne. Recueillir l'effluent contenant le EpCAM + cellule tumorale fraction enrichie et garder sur la glace. Passez à l'étape 6.
6. La transduction des cellules tumorales dérivées PDX
- Centrifugeuse dissocié les cellules tumorales à 300 gx 5 min et remettre en suspension dans 2 ml mammosphere mediune. Nombre de cellules viables en utilisant l'exclusion du bleu trypan comme dans 4.11.
- Préparer 10 ml de milieu mammosphere contenant 8 pg / ml de polybrène (2 pl de stock polybrène par ml de médias).
- Déterminer le volume nécessaire pour les cellules tumorales viables 2 x 10 5. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min, et remettre le culot dans 2 ml de polybrène contenant les médias. Planche 2 10 5 cellules viables x tumorales par puits dans une plaque de culture à 6 puits ultra-faible tissu d'adhérence.
NOTE: Ceci est un nombre optimal de cellules requises pour la transduction avec un vecteur lentiviral.
ATTENTION! Particules lentiviraux et tous les consommables utilisés avec des particules lentiviraux doivent être traitées suivant les procédures institutionnelles pour biohazards d'ADN recombinant.
REMARQUE: transduction de cellules primaires lentiviraux de sein favorise fortement les cellules myoépithéliales qui peuvent entraîner des mauvais marquage des cellules et la sélection des sous - populations de cellules tumorales lors de l' étiquetage luminal 21. <li> Incuber le virus avec 200 mU / ml de neuraminidase à 37 ° C pendant 1 heure avant de transduction pour augmenter la liaison des particules virales à différentes sous - populations de cellules primaires et de corriger ce biais potentiel 21. - Ajouter des particules lentivirales à 10 MOI (2 x 10 6 TU pour 2 x 10 5 cellules viables) si des cellules dissociées PDX sont appauvris à partir de cellules de souris Lin + ou enrichies en cellules EpCAM +. Ajouter des particules lentiviraux à 30 MOI (6 x 10 6 TU pour 2 x 10 5 cellules viables) si l'on utilise des cellules PDX-dissociées non enrichis.
NOTE: L'augmentation de MOI permet une transduction efficace même en présence de grandes quantités de débris et les cellules mortes dans des extraits bruts. Gardez un puits avec des cellules non marquées pour servir de contrôle pour la viabilité et l'efficacité de transduction. - Agiter pour mélanger virus avec les cellules. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant jusqu'à 96 heures. Ajouter 500 ul de milieu mammosphere frais 24 heures après la transfection. Les cellules n'attach à des plaques, ne pas aspirer les médias.
7. Évaluation de l'efficacité de transduction et Re-implantation de cellules marquées chez la souris immunodéprimée
- Surveiller l'expression du marqueur traçable (GFP) toutes les 24 heures en utilisant un microscope à fluorescence à un grossissement de 10X.
NOTE: expression GFP peut être observée dès 24 heures après l' infection , mais dans la plupart des PDXs expression de la GFP est clairement visible après 72 heures (Figure 1). - Estimer l'efficacité de la transduction en évaluant le pourcentage de cellules GFP + dans le puits au total.
REMARQUE: Etant donné que les cultures contiennent des cellules tumorales, des cellules stromales résiduelles et des cellules mortes à des degrés divers, les puits avec aussi peu que 10% de cellules GFP + peuvent être implantés dans une souris hôte. - Transférer les cellules transduites à partir de plaques à 6 puits dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 1 ml de milieu de mammosphere au puits pour recueillir toutes les cellules laissées. Placer sur la glace.
- Ajouter 10 ml de HBSS / hépès aux cellules transduites et centrifuge à 300 xg pendant 5 min, 4 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension dans 50 ul d'extrait de matrice de sous-sol (BME) sur la glace.
NOTE: aliquotes BME doivent être décongelés sur de la glace, 1 - 2 h avant utilisation. BME va se solidifier à la température ambiante; garder sur la glace en tout temps. - Chargez les cellules BME-embarqués dans une seringue de 0,5 ml d'insuline, garder sur la glace, et porter à l'animalerie pour la réimplantation des souris NSG.
- Anesthetize femelle 4 - souris âgées NSG 8 semaine, en utilisant 5% d'isoflurane / 95% d'oxygène pendant 5 minutes, puis 2% d'isoflurane / 98% d'oxygène ou selon l'éthique de la recherche sur les animaux approuvés protocole approuvés.
- Lorsque l' animal est insensible aux stimuli douloureux (orteil-pincement), nettoyer la zone d'injection avec de la bétadine suivie par des lingettes d'éthanol, et injecter les 50 pi de cellules dans le 4 e mammaire coussinet adipeux. Fournir des souris avec l'analgésie pour soulager l'inconfort d'injection comme indiqué dans le protocole approuvé.
- Laisser les cellules pour former des tumeurs (2 - 12 semaines) et de surveiller la GFP et / oul' activité de luciférase en utilisant un système d'éclairage réglable et / ou in vivo d'imagerie à la luciférase (figure 2).
REMARQUE: Suivez les directives pour l'anesthésie, l'analgésie, les mesures de la charge de la tumeur et les critères d'euthanasie approuvée par le comité d'éthique de la recherche sur les animaux dans les institutions.
8. Contrôle de la qualité de PDXs Labellisées
- Déterminer l'efficacité de marquage par l'évaluation de la luciférase et l'expression de GFP dans les tumeurs marquées.
REMARQUE: Suivez comité d'éthique de la recherche animale institutionnelle procédures d'imagerie in vivo de bioluminescence (figures 2, 3) a approuvé.- Disséquer les tumeurs des souris euthanasiées lorsque la taille de la tumeur a atteint 1,0 à 1,5 cm de diamètre (ou avant selon des protocoles approuvés, tels que décrits dans 4). Dissection doit être effectuée dans un système de lumière accordable (ou un système équivalent qui permet l'évaluation de la fluorescence de la GFP).
- A partir de chaque tumeur, une estimation qualitative de la peourcentage de la GFP + tumeur en utilisant la microscopie. Si elle est inférieure à 100%, disséquer partie GFP + seulement. Disséquer un mm disque 3 et fixer dans 10% de formaline pour inclusion dans la paraffine et l'analyse histologique, sauf un petit morceau pour l'ARN ou d'autres analyses souhaitées, et enregistrer autant de la tumeur que possible dans chaque 1,5 ml cryotubes contenant 90% de FBS / 10% DMSO pour la cryoconservation.
- Morceaux Re-implant de tumeur marqué dans nouveau destinataire NSG souris 18 pour développer et utiliser dans les études de métastases expérimentales.
- Effectuer une coloration immunohistochimique standard inclus dans la paraffine tissu obtenu à partir de tumeurs avant transduction et à chaque génération par la suite, pour vérifier que les PDXs marqués restent histologiquement similaires aux PDXs originaux.
NOTE: Les marqueurs utilisés pour le contrôle de la qualité varient avec chaque PDXs. PDXs pour le cancer du sein, l'expression du récepteur des oestrogènes, le récepteur de la progestérone, le récepteur Epidermal growth factor 2 (HER2), le récepteur du facteur de croissance épidermique 1 (HER1 ou EGFR), pan-cytokératine (pan-CK) sont recommandés pour le dépistage initial.
9. Les modèles expérimentaux Métastase avec PDXs Labellisées
- En suivant les étapes décrites à la section 4, dissocier les cellules tumorales d'un PDX marqué. Si la tumeur est très vascularisé ou riche en stroma de la souris, effectuer l'enrichissement des cellules cancéreuses comme décrit dans 4.5 ou 4.6.
- Nombre de cellules viables en utilisant l' exclusion du bleu trypan, et diluer 250.000 cellules dans 100 ul de PBS (Ca 2+, Mg 2+ libre) par souris. Gardez les cellules sur la glace. Pour l'injection de plusieurs souris, d'ajuster en conséquence les chiffres (et préparer un excès d'au moins une injection supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage).
- Apportez des cellules sur la glace à la salle de procédure animal approprié et procéder à l'injection intra-cardiaque selon le protocole IACUC approuvé.
REMARQUE: Les protocoles détaillés pour l' injection intra-cardiaque de cellules cancéreuses ont été décrites ailleurs 22,23. - Suivre et quantifier métastatiqueétalée dans le temps en utilisant l'imagerie bioluminescente. Visualiser les métastases macroscopiques à différents organes , à l' aide de la bioluminescence et / ou à l' imagerie de la GFP d'organes isolés à l' autopsie 24 (figure 6).
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Representative Results
Cette méthode décrit la transduction des cellules cancéreuses du sein PDX-dissociées en utilisant un titre élevé vecteurs lentiviraux pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro et phage-EF1aL-luciférase UBC-GFP-W. Ces vecteurs expriment un marqueur fluorescent qui permet d' estimer l'efficacité de la transduction in vitro, aussi tôt que 24 heures après l' infection (figure 1a). Pour la plupart des PDXs, l' expression de GFP sera retardée jusqu'à 72 heures après l' infection (Figure 1b), à ce moment la formation d'agrégats de cellules est couramment observée. La transduction peut être obtenu après l' enrichissement des cellules cancéreuses humaines ( par exemple, en utilisant l' épuisement Lin + de la cellule, la figure 1a) ou de cellules brut PDX dissociées (figure 1b). L'enrichissement des cellules épithéliales tumorales est recommandée pour les tumeurs hautement vascularisées sont des cellules sanguines de souris représentent un pourcentage significatif du nombre total de cellules viables.
in vitro, les cellules marquées sont recueillies et mises en suspension dans la matrice extracellulaire et re-implantés chez des souris NSG. Les cellules tumorales marquées régénèrent les tumeurs qui peuvent être suivis en utilisant la bioluminescence ou de fluorescence (Figure 2). L' efficacité de transduction doit être évalué suivant la formation de tumeurs, et il variera en fonction de la sensibilité des différentes PDXs à une transduction in vitro. Un PDX marqué avec succès sera proche de 100% GFP + à la première génération post-transduction (figure 2b, c) et restera proche de 100% GFP + dans les passages suivants (Figure 3). Cependant, certains PDXs montreront la distribution "inégale" des cellules GFP + (figure 4), ce qui indique un suboptimale dans la transduction in vitro. Dans ces cas, les tumeurs peuvent être disséquées sous un système de fluorescence de visualisation pour sélectionner GFP + zones qui peuvent être réimplantés pour l'expansion du SUBPOP marquéulation, ou les tumeurs peuvent être dissociés et les cellules GFP + peuvent être isolées en utilisant FACS puis en ré-implantation chez la souris NSG.
Etant donné que la dissociation et la transduction PDX peut se traduire par la sélection des sous-populations de cellules au sein de la tumeur, les chercheurs doivent vérifier que les tumeurs marquées ressemblent étroitement aux tumeurs parentales dont elles sont dérivées. PDXs devraient être colorées par IHC à chaque génération pour démontrer que les marqueurs critiques tels EGFR, récepteurs hormonaux (c. -à- récepteur d'oestrogène) et pan-cytokératines (PanCK, marqueurs de cellules épithéliales) sont conservés dans PDXs marqués. La figure 5 montre une coloration pour l' EGFR et panCK dans un cancer du sein triple négatif PDX (coloration des récepteurs hormonaux est pas représenté car il manque PDX oestrogène et récepteur de la progestérone).
PDXs Labellisées peuvent être utilisés pour suivre la propagation métastatique spontanée ainsi que métastatique expérimentalepropagée par ensemencement des cellules directement dans la circulation. Métastases spontanées de PDXs de cancer du sein sont moins fréquentes, mais ont été rapportés par plusieurs groupes 3,13,25. Les modèles expérimentaux de métastases fournissent une alternative à étudier tropisme d'organes et d'organes colonisation étapes de la cascade métastatique. Les cellules dissociées de tumeurs marquées sont injectées intracardiaque et la charge métastatique est suivi en utilisant l'imagerie bioluminescente. Comme on le voit sur la figure 6, un PDX transduite avec un phage EF1aL luciférase UBC-GFP-W injecté à 250.000 cellules de souris formé des métastases / dans les poumons et le foie qui ont été facilement identifiées avec l' imagerie à la luciférase in vivo et l' expression de GFP dans des organes ex vivo .
Figure 1:. Suivi transduction efficacité dans les cellules dissociées PDX A) B PDX-dissociées) cellules PDX-dissocié d'une expérience séparée, sans enrichissement des cellules épithéliales, 72 h après transduction avec le phage-EF1aL-luciférase-UBC-GFP-W. Les deux panneaux montrent des cellules vivantes. BF: images de champ lumineux, barre représente 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Mise en place d'PDXs Labellisées chez les souris de cellules hôtes transduites avec le phage-EF1aL-luciférase-UBC-GFP-W pendant 72 heures ont été implantés dans le coussinet adipeux mammaire d'une souris NSG femelle. On a laissé la tumeur se développer pendant 14 semaines après l' injection. A) Luciférase l' activité du rapporteur est évaluée par imagerie in vivo après injection intrapéritonéale de luciférine. B) expression de la GFP peut être observée à travers la peau intacte à l' aide d' un système de fluorescence de visualisation. l' expression C) GFP doit également être vérifié à dissection pour déterminer le degré de marquage des tumeurs. Cet exemple montre omniprésente exprimant la GFP tumeur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Étiqueté PDXs Conserver traçables Marqueurs après Passages multiples in vivo A PDX du cancer du sein marqué avec le phage-EF1aL-luciférase-UBC-GFP-W est représenté 3 passages après transduction.. expression de la GFP reste à près de 100% dans la tumeur à des passages.54944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Exemple d'un PDXs avec Suboptimal transduction efficacité. A) Le cancer du sein PDX marqué avec phage-EF1aL-luciférase-UBC-GFP-W a été passé après une transduction suboptimale a eu lieu. Les tumeurs résultantes contiennent des populations mixtes de cellules GFP + et les cellules tumorales GFP. La tumeur gauche ne convient pas à la propagation ultérieure. La tumeur droit peut être propagé par la dissection du GFP + régions sous un système de visualisation de fluorescence. B) Régions de cellules GFP + dans les tumeurs mixtes peuvent être facilement identifiés sous une lumière fluorescente. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Contrôle de la qualité de PDX Caractéristiques après transduction et repiquage. L' expression de l' EGFR et pan-cytokératine (PanCK) dans de la paraffine tissu enrobé d'un cancer du sein triple négatif PDX F2-7 au passage 2 (P2, avant transduction), la tumeur générée immédiatement après transduction (P2-i0) et le passage (P2-I1) suivant. Images 20X, Bars représente 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Métastases expérimentales utilisant PDXs Labellisées. Un PDX-phage exprimant EF1aL-luciférase-UBC-GFP-W a été dissocié pendant 3 heures comme décrit dans 4 et 250.000 cellules nousre injecté dans le ventricule cardiaque gauche de souris NSG. A) la croissance métastatique peut être tracée d'animaux vivants à l' aide de l' imagerie par luminescence. Fardeau métastatique de cette PDX du cancer du sein peut être observé dans B) foie et C) en utilisant les poumons ex-imagerie in vivo des organes disséqués sous un système de visualisation de fluorescence. Bars représente environ 1cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes critiques au sein du protocole:
L'utilisation de particules lentiviraux à titre élevé (> 10 8 TU / ml) est une étape critique dans le succès de ce protocole, que permet un contrôle minutieux de la composition des médias pendant la transduction in vitro. Bien que plusieurs méthodes pour la production de particules virales à titre élevé ont été bien décrits 18,19; ce protocole utilise des particules lentiviraux produites comme décrit en détail à www.kottonlab.com . Une méthode douce pour la digestion des tumeurs et de la dissociation des cellules cancéreuses est essentielle pour le marquage et la croissance des tumeurs marquées avec succès. L'extension de la durée de digestion au-delà de trois heures ou en augmentant la température de digestion à 37 ° C, augmente le nombre de cellules dissociées, mais diminue la viabilité des cellules et à la réussite de marquage dans la plupart des tumeurs.
Modifications et dépannage:
Ce protocole doit être considéré comme dynamique et nécessite une adaptation pour PDX unique avec une surveillance attentive à chaque étape. Bien que ce protocole standard fonctionne bien pour la plupart des tumeurs xénogreffes, les petites variations peuvent être nécessaires pour optimiser l'étiquetage des différents PDXs. Par exemple, l'abondance et la composition de stroma et la matrice extracellulaire diffèrent généralement entre PDXs, ce qui peut affecter le temps nécessaire à la dissociation et le rendement des cellules tumorales obtenues par la suite. De grandes tumeurs qui deviennent nécrotiques des tumeurs et hautement vascularisées peuvent être difficiles à étiqueter due à des débris et des cellules du sang de souris excessives. L'utilisation de Lin + épuisement et EpCam + cellules épithéliales enrichissement décrites dans ce protocole améliore l'efficacité de transduction dans ces PDXs. Cependant, l'expression de EpCAM + cellules varie même dans les tumeurs d'origine épithéliale, donc son expression doit être vérifiée dans chaque PDX avant d'utiliser comme méthode d'enrichissement cellulaire.
limitations de la technique:
La transduction des cellules dissociées et leur culture in vitro temporaire pourrait se traduire par la sélection des sous - populations de cellules, qui seront ensuite donner lieu à des tumeurs marquées fondamentalement différentes des PDXs parentales. La pré-incubation des particules lentivirales à la neuraminidase est recommandé d'augmenter la fixation des particules virales à des sous - populations de cellules 21 difficile à transduire, diminuant ainsi la polarisation de transduction qui pourrait être introduite à ce stade. Dans notre expérience, les tumeurs reconstituées par les cellules transduites ressemblent étroitement aux caractéristiques des PDXs parentales non seulement histologiquement, mais aussi en utilisant hiérarchique analyse de la concentration de l'expression de l'ARNm (ARN suivants, données non présentées). Contrôle de la qualité en termes d'efficacité de l'étiquetage et de la fidélité de la tumeur doit être effectuée pour chaque PDX à chaque passage. Etant donné que l' étiquetage PDX exige l' expansion de la tumeur in vivo , et la dérive de la tumeur peut se produire après répété passaging, transduction doit être effectuée au plus tôt passage possible.
Importance de la technique:
Ce protocole décrit comment PDXs du cancer du sein peuvent être marquées par fluorescence d' un bioluminescently in vitro et ré-implantées in vivo pour la poursuite de la croissance tumorale métastatique et orthotopique. Bien que des études antérieures ont utilisé une stratégie similaire à étiqueter organites PDX-18 dérivés, le protocole courant comprend des variations dans la digestion de la tumeur et à l' étiquetage qui se traduisent par une grande efficacité de transduction de multiples PDXs.
Applications ou orientations futures après la maîtrise de cette technique:
La capacité d'exprimer de manière stable des marqueurs traçables (GFP, luciférase), et surexpriment ou knockdown gènes spécifiques (c. -à- pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro peut être utilisé pour délivrer des shRNA) permet l'utilisation de PDXs pour répondre à des questions fondamentales surla croissance tumorale et les métastases d'une manière similaire à des lignées cellulaires établies. Plus précisément, ce protocole démontre l'utilisation de PDXs marqués dans les modèles de métastases expérimentales pour étudier les étapes orgue colonisation dans la cascade métastatique. Métastases à différents organes peuvent être facilement visualisées et quantifiées en utilisant l'imagerie bioluminescente d'animaux vivants, et l'expression de la GFP utilisés pour dissections guidées et de visualiser des métastases dans les organes excisés. Cela représente un outil puissant pour faciliter l'utilisation des PDXs pour la recherche de métastases.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Darrel Kotton à l'Université de Boston pour fournir le-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vecteur de phage et des protocoles pour la production de lentiviral à titre élevé utilisés dans ces études. Ce travail a été financé par le DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) et R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Centre subvention prise en charge dans l' imagerie in vivo et la culture de tissus noyaux à l'Université du Colorado AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
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