Summary
Yeşil floresan protein ve lusiferaz muhabir ifade lentiviral parçacıklar ile hasta edilen ksenograftlan (PDXs) sabit etiketlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, birinci bölgede PDXs büyümesini izlemek, hem de in vivo görüntüleme sistemleri kullanarak kendiliğinden ve deney metastazları sağlar.
Introduction
Cerrahi rezeksiyon tümör örnekleri doğrudan bağışıklık tehlikeye farelere aşılanan hasta kaynaklı tümör ksenograftlarının (PDXs), geliştirilmesi, standart hücre hattı ksenograft modelleri üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor ve kanser araştırmalarına 1,2 büyük bir ilerlemeyi temsil etmektedir. PDXs muhafaza ve birinci geçit yetiştirilen tümörün genetik ve biyolojik özelliklerinin çok az bir değişiklik ile arka arkaya geçişlerinin genişletilebilir; ve daha doğru bir insan kanser hücre çizgileri 3-8 türetilen ksenograftlarının göre tümör heterojenliğini yansıtmaktadır. Bu modeller artık yaygın ilaç geliştirme 6,11 bir preklinik bir platform olarak ve kanser biyoloji 4,12 eğitimi için deneysel bir araç olarak, kanser terapötikler 9,10 kişiselleştirmek için bir platform olarak kullanılır.
Çoğu PDXs implante ve fizibil kumpas kullanılarak zamanla tümör büyümesinin ölçümü sağlayan, deri altına yayılır. ancakMetastatik hastalık PDXs kullanarak model daha zor olmuştur. Özellikle meme kanseri, farklı organlara metastatik kapasiteli xenografts 3,5,13 tarif edilmiştir, fakat, metastatik sitelere kendiliğinden yayılma sıklığı, son derece düşüktür. rapor halinde, metastatik yükünün tanımlanması ve ölçülmesi otopsi hedef organların zahmetli histolojik incelemesinde dayanır. biyolojik olarak ışık veren (lusiferaz Luc) ya da floresan eksprese eden kanser hücre çizgileri (yeşil floresan protein GFP) geni muhabir yaygın beyin, akciğer, kemik ve karaciğer intrakardiyak sonra kuyruk damarından, intrafemoral ve dalak enjeksiyon göğüs kanseri metastazlarının deneysel modellerde kullanılan 14-16. bu modeller primer tümörlerden yayılması atlamak olurken, organ tropizm ve metastatik kolonizasyon mekanizmaları incelemek için değerlidir. Bununla birlikte, birincil, hasta tümörleri ve PDXs türetilen hücreler düşük transfeksiyon ya da transdüksiyon oranları usin olabilirg standart prosedürler. Bir alternatif daha sonra geleneksel doku kültür protokolleri kullanılarak etiketlenebilir vitro 17'de PDX-türevi hücre hatlarının kurmaktır. Ancak bu yaklaşım, hücre hattı türetilmesi zordur ve hücrelerin fenotipini değişebilen en PDXs, etiketleme için uygun değildir. Burada, in vivo görüntüleme için uygun lentiviral vektörleri ile PDX-ayrışmış tümör hücrelerinin transdüksiyonu için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, bağışıklık yetersizliği olan farelerde ayrışmış Luc-GFP etiketli PDX hücreleri intrakardiyak enjeksiyonu ile deneysel metastaz tarif eder.
Gen-haberci ifade lentivirüs PDX-ayrışmış organoids transdüksiyonu için temel protokol daha önce 18 tarif edilmiştir. Mevcut protokolde, insan tümör hücreleri zenginleştirmek ve% 100 transdüksiyon verimliliği yakınındaki elde yanı sıra deney göğüs kanserinin tespit edilmesi için etiketli PDXs kullanımı için ek yöntemler tarifmetastaz. Bu protokol, birden fazla kanser, çeşitli ışık saçan ve flüoresan işaretler ile PDXs türleri yanı sıra, gen ekspresyonu (ilgi genlerinin yani shRNA demonte) modülasyonunu etiketlenmesi için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde hayvanların kullanımını gerektiren tüm adımlar Colorado hayvan araştırma etik komitesi Üniversitesi (IACUC) kuralları takip eder.
Araçların, Kültür Medya ve Diğer Reaktiflerin hazırlanması 1.
- (1: 1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng / ml), epidermal büyüme faktörü (EGF, 10 ng / ml Hazırlama 100 mi Dulbecco Modifiye Eagle ortamı ve Han, F-12 ortamı (DMEM / F12) ihtiva eden ortam mammosphere ), heparin (4 ug / ml), 1 x B27, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml). 3 aya kadar, 4 ° C'de steril koşullar altında ortam ve mağaza sağlayın.
- PBS pH 7.2,% 0.5 Sığır Serum Albumin (BSA), 2 mM EDTA ihtiva eden epitelyal zenginleştirme tamponu (EEB) hazırlayın. en fazla 6 ay için 4 ° C'de filitre ile steril edilmiş ve saklayın.
- ay için -20 ° C'de steril 15 ml konik tüp ve mağaza sindirim tamponu 5 mi alikotları sağlayın. Tümör sindirim, çözülme sindirim tampon gece önce (500 mg başına 5 ml4 ° C 'de buz üzerinde tümörü). Kullanmadan önce 1x antibiyotik antimikotik karışımı ekleyin.
- Otoklav (121 ° C 30 dakika boyunca) PDXs diseksiyonu için en az iki forseps, neşter ve makas.
- F12 ve% 5 cenin sığır serumu (FBS): DMEM ihtiva eden 500 ml yıkama tamponu sağlayın. ay 4 ° C'de saklayın. Kısım tümörün başına 10 ml tümör diseksiyonu gün.
- steril su ile 4 mg / ul bir polybrene stok hazırlayın. -20 ° C'de 100 ul her biri deposu ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine filtre ve kısım.
İzlenebilir İşaretleyiciler Taşıma Yüksek Titre lentiviral Parçacıkların 2. Nesil
- 18,19 (tümör büyümesinin in vivo takibi için yani., GFP ve Luc) satın veya bir raportör genini taşıyan yüksek titre lentiviral parçacıkları üretmek.
Not: bir lentiviral titre> 10 8 TU / ml (mililitre başına transdüksiyon birimi) PDXs başarılı iletimi için tavsiye edilir. lentiviral phaberler memeli hücrelerinin geniş bir yelpazede transdüksiyonunu sağlayan Vesicular Stomatitis Virüsü (VSV-G), bir kaplama G glikoproteinin psödotiplendirilmiş olmalıdır.
NOT: yüksek titre lentiviral parçacıkların üretimi ve titrasyon için burada kullanılan protokol mevcuttur www.kottonlab.com . Bu protokolde kullanılan vektörler pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro ve çift promotör faj EF1aL-lusiferaz-UBC-GFP-W vardır. Bu vektör, faj EF1aL-DsRed-UBC-GFP B vektöründe EF1aL promotörün aşağı lusiferaz geni, Darrell KOTTON, Boston Üniversitesi bir tür hediye DsRed değiştirerek elde edilmiştir.
Hasta türetilmiş ksenograftlarının 3. Nesil
- Immün sistemi baskılanmış farelerin 3,4 meme yağ yastığı primer veya metastatik meme tümörleri implante meme kanseri hasta türetilen xenografts (PDX) oluşturun. Büyük tümörler l olarak 1 cm çapında bir tavsiye edilen maksimum boyutta tümörler oluşturmakikely nekrotik çekirdeği içeren.
Not:. Xenografts oluşturulması ve nakli için ayrıntılı yöntemler DeRose diğ 18 tarif edilmiştir. > 1 cm çaplı tümörler içine kurulan-transplante PDXs Büyüme immün sistemi baskılanmış NOD implantasyon sonrası 4 ve 24 hafta arasında sürer / SCID / ILIIrg - / - (NTG), içsel tümör büyüme oranlarına bağlı olarak. Bu protokol, meme kanseri PDXs transdüksiyonunu açıklanmış olsa da, bu in vitro geçiş kısa vadeli uygun olan herhangi bir tümörün viral transdüksiyon için kullanılabilir. Kısa vadeli PDXs duyarlılığı - nitro sağkalım (24 96 saat) her tümör için esas olan ve deneysel olarak tespit edilmelidir.
PDX-türevli Tümör Hücreleri 4. Tümör Diseksiyon ve ayrışma
- CO servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon kullanarak PDX taşıyan Euthanize fareler (hayvan araştırma etik komitesinin kurumsal yönergeleri izleyin). Bir% 0.2 Ch fareler daldırın1 dakika için lorhexidine çözeltisi. Bir diseksiyon kurulu üstünde sırtüstü pozisyonda fare ayarlayın ve yönetim kuruluna genişletilmiş üst ve alt ekstremite düzeltmek için işaretçilerine kullanın.
- Aseptik teknik kullanarak, tümör çevresindeki deri kesmek için bir neşter kullanabilirsiniz. forseps bir set ile cildi çekin ve tümör tamamen açığa çıkana kadar temiz bir neşter kullanılarak tümör ayırın. forseps ve neşter temiz bir dizi kullanarak, tümörün çıkarılması ve buz üzerinde medya yıkayın 5 ml yerleştirin.
- daha sonraki işlemler için bir BLS2 kabin parçalandığı tümör al. iki kez Ortamı çıkarın ve 10 mM Hepes (HBSS / HEPES) Modifiye Hank'in dengeli tuz sodyum 10 ml tümör yıkayın.
- steril önceden tartılmış 60 cm doku kültür plakasına tümör bırakın. Tümör kütlesi tahmin etmek tümörü içeren plaka tartılır.
- Bir neşter kullanılarak, daha sonra, yarım tümör kesilmiş bir yarısından itibaren 3 mm disk kesilmiş ve 24 saat süreyle% 10 formalin ile bir kaba koyun. heterojen doğrulamak için bu doku kullanınTümör örneği (ebeveyn PDX). ve forseps ve temiz bir neşter kullanılarak mümkün olan en küçük parçalar halinde kalan tümör kıyma (kurumasına doku önlemek için yeterli) HBSS / Hepes 200 ul ekleyin.
- Bir steril 50 ml konik bir tüp içine kıyılmış tümör aktarın. tümör, 100 mg başına 1 x antimikotik antibiyotik ihtiva eden sindirim tamponu, en az 1 ml ilave edilir.
Not: antibiyotik / antimikotik eklenmesi, in vitro olarak tümör hücreleri kirlenmesini önler. - 200 rpm - 125 çalkalama, 30 ° C'de 3 saat tümör Digest.
Not: 37 ° C 'ye kadar sıcaklığı arttıkça (zaman içinde daha fazla tek hücreler) sindirim verimini artırır ancak genelde artan hücre ölümü ile eşlik eder. Birçok tümör için, yaşayabilir ayrışmış hücrelerin yeterli sayıda 3 saat sonuçlar için 30 ° C'de sindirim etiketleme adımla devam etmek. - 35 ml (% 5 FBS içeren DMEM / F12) ortam yıkama ilave sindirim durdurun. Temiz 50 mi C içine gözlü 70 um naylon filtre vasıtasıylaonical tüp sindirilmemiş doku kaldırmak için. 5 dakika boyunca 400 xg'de sindirilmiş hücreleri içeren süzülmüş medyayı santrifüj.
- 1 ml Kırmızı kan hücre parçalama tamponu aspire supernatant ve tekrar süspansiyon pelet. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- lizis durdurmak için: 10 ml yıkama tamponu (F12,% 5 FBS DMEM) ekleyin. 40 uM naylon yoluyla hücreler kümeleri kaldırmak için Mesh geçirin. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve buz üzerinde, yer süpernatant kaldırmak.
- Süspanse tampon ve tripan mavisi dışlama kullanarak canlı ve cansız her iki hücreleri saymak yıkamak 5 ml hücreleri sindirilir. Kısaca, hücrelerin 50 ul ve tripan mavisi 50 ul karıştırın ve bir hemasitometre kullanarak-tripan mavisi hariç hücreleri saymak.
NOT: Bu ham sindirim ürününün, insan PDX türetilen tümör hücrelerini, hem de fare stromal hücreler içerir (fibroblastlar, kan hücreleri, vb.). Sindirilen Hücreler artık etiketleme (aşama 6) için işlenebilir veya insan kanser hücreleri anlatılan prosedürlerin biri kullanılarak zenginleştirilebilirReferans 5.
İnsan Epitelyal Kanser Hücreleri 5. zenginleştirilmesi
- Bir soy (Lin +) hücre tükenmesi kiti 20 kullanarak fare stromal hücreler tüketmek.
NOT: EpCAM ifade bilinmeyen veya kayıp olan yüksek stromal içeriği) ile son derece vaskülarize tümörlerin ve / veya tümörler için önerilir.- Temiz bir 5 mi polipropilen tüp içinde 10 7 canlı hücrelere alın 5 dakika boyunca 300 x g'de 2 mi EEB ve santrifüj ekleyin. tamamen süpernatant Pipet.
- 10 7 hücre başına buz EEB 40 ul tekrar süspansiyon hücre pelet.
- 10 7 hücre başına biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekle, hafifçe pipetleme karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 ° C (kokteyli Lin + fare hücreleri antikorları içerir) inkübe edilir.
- 10 7 hücre başına soğuk EEB 30 ul ekleyin, hafifçe pipetleme karıştırın.
- Hafifçe pipetleme 10 7 hücre başına anti-biyotin microbeads 20 ul mix ekleyin ve 4 & # inkübe176, 15 dakika bekletilmiştir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 3 ml soğuk EEB, santrifüj ile hücreler yıkanır. Dikkatle süpernatant aspire. Buz üzerinde EEB ve yerine 500 ul içinde süspanse pelet.
- Bir manyetik ayırıcı manyetik alan sütun. 0.5 ml epitel zenginleştirme tamponu ile sütun yıkayın ve içinden akmasına izin. sütun kurumasına izin vermeyin.
- sütununun altında yeni bir polipropilen toplama tüpü yerleştirin. Yavaş yavaş kolonu üzerinde etiketlenmiş hücreler ihtiva eden 500 ul (Lin + hücreleri manyetik sütun korunur etiketli). Zenginleştirilmiş soy negatif (tümör) hücre fraksiyonu temsil etiketsiz hücreleri ile bir kesir olarak atık toplamak.
- EBB 500 ul ile sütun 3 kez durulayın ve adım 5.1.8 atık aynı tüp içinde atık toplamak. buz üzerinde atık tutmak ve etiketleme adım (6) geçin.
- İsteğe bağlı: Manyetik alanın dışında sütun alın. altında yeni bir polipropilen tüp yerive EEB 500 ul, üç kez ilave edilmesi ve temin edilen bir piston ile Lin + fraksiyonu elüte.
- İnsan EpCAM + epitel kanser hücrelerinin zenginleştirilmesi (CD326 + ekspres ve yüksek fare stromal içerik barındırdığı bilinen tümörler için önerilir).
- Temiz bir 5 mi polipropilen tüp içinde 10 7 canlı hücrelere alın 5 dakika boyunca 300 x g'de 2 ml soğuk EEB ve santrifüj ekleyin. tamamen süpernatant Pipet.
- 10 7 hücre başına buz EBB 60 ul tekrar süspansiyon hücre pelet.
- 10 7 hücre başına EpCAM mikro boncuklar 20 ul ekle, hafifçe pipetleme karıştırın ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 3 ml soğuk EEB, santrifüj ile hücreler yıkanır. Dikkatle süpernatant aspire. Süspanse EEB 500 ul pelet ve buz koymak.
- mini ayırıcının manyetik alan sütun yerleştirin. 0.5 ml EEB ile sütun yıkayın ve içinden akmasına izin. sütun kurumasına izin vermeyindışarı.
- sütununun altında yeni bir polipropilen toplama tüpü yerleştirin. Yavaşça, (EpCAM + etiketli hücreler manyetik sütunda muhafaza edilecektir) kolonu üzerinde etiketli hücreleri içeren 500 ul ekleyin. Fare stromal hücreler temsil etiketsiz hücreleri ile bir kesir olarak atık toplamak.
- ME Buffer 500 ul sütun 4 kez durulayın ve adım 5.1.8 atık aynı tüp içinde atık toplamak.
- manyetik alanın dışında sütun alın. altında yeni bir polipropilen tüp yerleştirin ve ME 500 ul tampon, üç kez ekleyerek EpCAM + fraksiyonu Zehir. sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın. atık zenginleştirilmiş EpCAM + tümör hücre fraksiyonu içeren toplayın ve buz üzerinde tutmak. 6. adıma geçin.
PDX-türevi Tümör Hücreleri 6. İletimi
- Santrifüj 2 ml mammosphere medi 300 gx 5 dakika ve tekrar süspansiyon de tümör hücrelerini ayrışmışa. 4.11 gibi tripan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri saymak.
- Hazırlama 8 ug / ml polibren (ortam ml'si başına hazır polibren 2 ul) ihtiva eden mammosphere ortam, 10 ml.
- 2 x 10 5 canlı tümör hücreleri için gerekli hacmi belirlemek. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücreleri ve polibren ihtiva eden ortam, 2 ml içinde süspanse pelet. 6-çukurlu, ultra düşük yapışkan bir doku kültürü plakasında çukur başına Plaka 2 x 10 5 canlı tümör hücreleri.
Not: Bu, bir lentiviral vektör ile transdüksiyonu için gerekli olan hücrelerin optimal bir sayıdır.
DİKKAT! Lentiviral parçacıklar ve lentiviral parçacıklar ile kullanılan tüm sarf rekombinant DNA biyolojik tehlikeler için kurumsal prosedürler izlenerek ele alınmalıdır.
NOT: primer meme hücrelerinin lentiviral transdüksiyon kuvvetle 21 etiketleme sırasında luminal hücreler ve tümör hücrelerinin alt popülasyonlarının seçimi kötü etiketleme neden olabilir myoepitelyal hücreleri yanadır. <li> Bu potansiyel önyargı 21 için farklı primer hücre alt viral parçacıklar bağlanmasını ve doğru geliştirmek için transdüksiyon önce 1 saat boyunca 37 ° C'de 200 mU / mL, nöraminidaz ile virüs inkübe edin. - PDX-ayrışmış hücreler Lin + fare hücrelerinden tükenmiş veya EpCam + hücreler zenginleştirilmiş ise 10 İçişleri Bakanlığı (2 x 10 5 canlı hücreler için 2 x 10 6 TU) de lentiviral parçacıkları ekleyin. Olmayan zenginleştirilmiş PDX-ayrışmış hücreleri kullanarak eğer 30 İçişleri Bakanlığı (2 x 10 5 canlı hücreler için 6 x 10 6 TU) de lentiviral parçacıkları ekleyin.
NOT: artmış MOI da moloz büyük miktarda ham ekstrelerinde ölü hücrelerin mevcudiyetinde verimli transdüksiyonu sağlar. canlılık ve transdüksiyon verimliliği için kontrol olarak hizmet etiketsiz hücreleri ile bir kuyu tutun. - hücrelerle virüsü karıştırmak için çalkalanır. 37 ° C, en fazla 96 saat boyunca% 5 CO2 inkübe edin. 24 saat transfeksiyon sonrası taze mammosphere medya 500 ul ekleyin. Hücreler ATTAC olmazplakalara h medya aspire yok.
Değerlendirme İmmün Farelerde İletimi Verimliliği ve etiketli Hücreler Yeniden implantasyon 7.
- izlenebilir işaretleyici (GFP) 10X büyütme floresan mikroskop kullanılarak her 24 saat ifadesini izleyin.
Not: GFP ifade, enfeksiyondan sonra kadar erken fazla 24 saat gözlenebilir ama en PDXs GFP ekspresyon 72 saat (Şekil 1) sonra, açık bir şekilde görülebilir. - Toplam oyuk içindeki GFP + hücrelerin yüzdesi değerlendirerek transdüksiyonun verimi tahmin.
Not: kültürleri çeşitli derecelerde tümör hücrelerini, rezidüel stromal hücreleri ve ölü hücreleri ihtiva ettiğinden, 10'u kadar düşük bir% GFP + hücreleri ile kuyu bir konakçı fare implante edilebilir. - 15 ml konik bir tüp içine 6 oyuklu plakalar ile kalıt aktarılan hücrelerin aktarın. geride kalan tüm hücreleri toplamak için kuyuya mammosphere medya 1 ml ekleyin. buz üzerine yerleştirin.
- dönüştürülmüş hücreler ve C HBSS / HEPES 10 ml5 dakika, 4 ° C, 300 xg'de entrifuge. Dikkatle buz üzerinde 50 ul bodrum matris ekstresi (BME) supernatant ve tekrar süspansiyon aspirat.
Not: BME alikotları 1, buz üzerinde eritildi olmalıdır - kullanmak 2 saat önce. BME oda sıcaklığında pekiştireceğiz; her zaman buz üzerinde tutmak. - , 0.5 ml insülin şırınga içine BME-gömülü hücreleri Yük buz üzerinde tutmak ve NSG farelere reimplantasyon için hayvan tesisine getirmek.
- % 2 izofluran /% 98 oksijen veya protokolü onayladı onaylı hayvan araştırma etiği göre takip 5 dakika için% 5 izofluran /% 95 oksijen kullanarak, 8 haftalık NSG fareler - kadın 4 uyutmak.
- Hayvan ağrı uyaranlara (ayak tutam) tepkisiz olduğunda, etanol mendil ardından betadin enjeksiyon alanını temizlemek ve 4. meme yağ yastığı hücrelerin 50 ul enjekte edilir. onaylanan protokolde belirtildiği gibi enjeksiyon rahatsızlığı hafifletmek için analjezi ile fareler sağlamak.
- Hücreler tümörler oluşturmak için izin verir (2-12 hafta) ve GFP'yi izlemek ve / veyaayarlanabilir bir ışık sistemi ve / veya in vivo lusiferaz görüntüleme sisteminde (Şekil 2) kullanılarak lusiferaz aktivitesi.
NOT: Kurumsal hayvan araştırma etik komitesi tarafından onaylanmış olarak anestezi, analjezi, tümör yükü ölçümleri ve ötenazi kriterleri için yönergeleri izleyin.
Etiketli PDXs 8. Kalite Kontrolü
- etiketli tümörlerde lusiferaz ve GFP değerlendirerek etiketleme etkinliğini belirlemek.
NOT: Takip kurumsal hayvan araştırma etik komitesi, in vivo biyoparlaklık görüntüleme prosedürlerini (Şekil 2, 3) onayladı.- tümör büyüklüğü 1.0 ulaştığında Öldürülen farelerin tümörleri teşrih - 1,5 cm çapa (ya da 4'te tarif edildiği gibi, onaylanmış protokollere göre önce). Diseksiyon ayarlanabilir bir ışık sistemi (veya GFP floresans değerlendirme sağlar eşdeğer sistem) altında yapılmalıdır.
- Her tümörden, niteliksel pe tahminGFP + tümör mikroskobu kullanarak rcentage. % 100'den daha az ise, GFP + kısmını sadece teşrih. 3 mm diski inceleyin ve parafine ve histolojik analiz için% 10 formalin içinde çözmek, RNA veya diğer istenen analizler için küçük bir parça kaydetmek ve% 90 FBS /% 10 ihtiva eden ayrı ayrı 1.5 mi kriyotüplerde mümkün olduğu tümör kadar tasarruf dondurulması için DMSO.
- Yeni alıcı NSG fareler 18 içine etiketli tümörün yeniden implant parçaları genişletmek ve deneysel metastaz çalışmalarında kullanmak üzere.
- önce iletimi ve her nesil tümörlerden elde edilen parafine gömülü doku standart immünohistokimyasal boyama gerçekleştirmek sonra doğrulayın etiketli PDXs orijinal PDXs için histolojik benzer kalması.
NOT: Kalite kontrolü için kullanılan belirteçler her PDXs değişir. meme kanseri PDXs, estrojen reseptörü ifadesi, progesteron reseptörü, epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2), epidermal büyüme faktörü reseptörü 1 (HER1 veya EGFR), paketn-sitokeratin (pan-CK) ilk taraması için tavsiye edilir.
Etiketli PDXs 9. Deneysel metastaz Modelleri
- etiketli PDX tümör hücreleri ayırmak, 4. bölümde açıklanan adımları izleyerek. Tümör oldukça vaskülarize veya fare stromada zengin ise 4.5 veya 4.6 de tarif edildiği gibi, kanser hücrelerinin çoğalmasını, yapar.
- Farelerde başına (Ca 2+, Mg 2+ ücretsiz) tripan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri saymak ve 100 ul PBS içinde 250.000 hücreleri sulandırmak. hücreleri buz üzerinde tutun. Birden fareler enjeksiyon için, buna uygun olarak numaraları ayarlayın (ve pipetleme hataları hesaba katmak için, en az bir ilave enjeksiyonu bir fazlalığı hazırlama).
- Uygun hayvan prosedürü odasına buz üzerinde hücreleri getirmek ve onaylı IACUC protokole göre intra-kardiyak enjeksiyon geçin.
Not: kanser hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu ayrıntılı protokolleri, başka 22,23 tarif edilmiştir. - Parça ve metastatik ölçmekbioluminescent görüntüleme kullanılarak zamana yayılmış. Işıldaması ve / veya otopsi 24 izole organların GFP görüntüleme (Şekil 6) kullanılarak farklı organlarda makroskopik metastazı gözünüzde canlandırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, yüksek titre lentiviral vektörler pSIH1-H1 copGFP-T2A-Puro ve faj-EF1aL-lusiferaz UBC-GFP-W kullanılarak PDX-ayrışmış meme kanseri hücrelerinin transdüksiyonunu açıklanmaktadır. Bu vektörler, enfeksiyon (Şekil 1a) sonra en erken 24 olarak hr in vitro transdüksiyon etkinliğini tahmin sağlayan bir floresan işaretleyici ifade eder. En PDXs için, GFP ifade hücre agrega oluşumu sık gözlenen bu anda, enfeksiyon (Şekil 1b) 72 saat sonra kadar gecikecektir. İletimi ve ham olarak PDX-ayrışmış hücreler (Lin + hücresi kaybı, Şekil 1a ile örneğin,), insan kanser hücrelerinin zenginleştirici sonra elde edilebilir (Şekil 1b). tümör epitelial hücrelerin zenginleştirilmesi oldukça vaskülarize tümör fare kan hücreleri canlı hücre sayısı önemli bir bölümünü temsil etmektedir önerilir.
in vitro doğrulandıktan sonra "1">, etiketli hücreler toplanır ve hücre dışı matriks içinde süspanse edildi ve NSG farelerde yeniden implante edilir. Etiketli tümör hücreleri biyoparlaklık veya floresan (Şekil 2) kullanılarak izlenebilir tümörleri yeniden. İletimi verimliliği aşağıdaki tümör oluşumunu değerlendirilmelidir ve in vitro transdüksiyon farklı PDXs duyarlılık bağlı olarak değişecektir. Bir başarıyla etiketli PDX% 100 GFP yakın + birinci kuşak sonrası transdüksiyon (Şekil 2b, c) ve daha sonraki pasajlar% 100 GFP yakın + kalır (Şekil 3) olacaktır. Bununla birlikte, bazı PDXs nitro transdüksiyonunda suboptimal gösteren GFP + hücreleri (şekil 4) "lekeli" dağılım gösterir. Bu gibi durumlarda, tümörler etiketli subpop genişlemesi için yeniden implante edilebilir GFP + alanların seçilmesi için flöresanlı bir görüntüleme sisteminde parçalara edilebilirulation veya tümörler ayrışmış olabilir ve GFP + hücreleri NTG farelerde yeniden implantasyonu takiben FACS kullanılarak izole edilebilir.
PDX ayrışma ve transdüksiyon tümörün içindeki hücre alt seçiminde neden olabilir bu yana, araştırmacılar etiketli tümörler yakından elde edilmiştir hangi ebeveyn tümörleri benzer olduğunu doğrulamak gerekir. PDXs kritik işaretleri EGFR, hormon reseptörleri (örneğin, estrojen reseptörü) ve pan-sitokeratin göstermek için, her nesil IHC ile boyanmış olmalıdır (PanCK, epitel hücreleri işaretleri) etiketli PDXs halinde muhafaza edilmektedir. EGFR için boyama Şekil 5 Şekil ve üçlü negatif meme kanseri PDX içinde panCK (bu PDX östrojen ve progesteron reseptörü yoksun olarak hormon reseptör boyanması gösterilmemiştir).
Etiketli PDXs kendiliğinden metastatik yayılması ve deney metastatik izlemek için kullanılabilirdolaşıma doğrudan tohum hücreleri ile yayılır. Meme kanseri PDXs spontan metastaz daha az sıklıkla meydana, ama birkaç grup 3,13,25 tarafından rapor edilmiştir. metastaz deneysel modelleri metastatik kaskad organ tropizm ve organ-kolonizasyon adımlarını incelemek için bir alternatif sunmak. etiketli tümörlerden ayrışmış hücreler intrakardiyak enjekte edilir ve metastatik yükü biyolüminesens görüntüleme kullanılarak izlenir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, bir PDX faj EF1aL-lusiferaz UBC-GFP-W ile transduse kolay organ ex vivo, in vivo olarak lusiferaz görüntüleme ve GFP ifade ile tespit edildi akciğer ve karaciğerdeki 250,000 hücre / fare oluşan metastaz enjekte .
Şekil 1:. Dissosiye PDX Hücrelerde İletimi Verimliliği İzleme A) PDX-ayrışmış) 72 saat insan epitelyum hücrelerinin (Lin + tükenmesi) pSIH1-H1 copGFP-T2A-Puro lentiviral parçacıklar. B transdüksiyon sonra 24 saat süre ile zenginleştirilmiş hücrelerin PDX-ayrışmış Faj-EF1aL-lusiferaz UBC-GFP W transdüksiyon sonra. Her iki panel, canlı hücreleri göstermektedir. BF: Aydınlık alan görüntüler, çubuk 50 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Kurulması ana Farelerde Etiketli PDXs 72 saat boyunca faj EF1aL-lusiferaz UBC-GFP W ile dönüştürülmüş hücreler bir dişi NTG fare meme yağ tabanına yerleştirildi. Tümör enjeksiyonundan. A), lusiferaz sonra 14 hafta boyunca büyümeye bırakıldı raportör etkinliği bir floresan görüntüleme sistemi kullanılarak sağlam deriden gözlemlenebilir luciferase. B) GFP intraperitoneal enjeksiyondan sonra in vivo olarak görüntülenmesi suretiyle değerlendirilir. C) GFP tanımı, tümör etiketleme kapsamını belirlemek için diseksiyon olarak kontrol edilmelidir. Bu örnek her yerde GFP ifade tümör gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Etiketli PDXs In Vivo Çoklu Passages sonra İzlenebilir İşaretleyiciler Koru faj EF1aL-lusiferaz-UBC-GFP-W ile etiketlenmiş bir meme kanseri PDX transdüksiyon sonra 3 pasajlar gösterilmiştir.. GFP tanımı geçen tümör yaklaşık% 100 olarak kalır.54944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Suboptimal İletimi Verimliliği İle PDXs 4. örneği. A) Meme kanseri PDX suboptimal iletim gerçekleşti sonra faj EF1aL-lusiferaz-UBC-GFP-W geçirilmiştir ile etiketlenmiş. Ortaya çıkan tümörler, GFP + ve GFP- tümör hücrelerinin karışık popülasyonları içerir. Sol tümör yayılımıyla için uygun değildir. Sağ tümörü floresan görüntüleme sistemi altında GFP + bölgeleri diseksiyon tarafından yayılan olabilir. B) karışık tümörlerde GFP + hücrelerin Bölgeler kolayca floresan ışığı altında tespit edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. PDX Kalite Kontrol geçişi 2 üçlü negatif meme kanseri PDX F2-7 gelen parafin dokuda EGFR ve Pan-sitokeratin (PanCK) ve İletimi ve Pasajlanması. İfade (P2, transdüksiyon öncesinde), tümör sonra Özellikler transdüksiyon (P2-I0) hemen sonra oluşturulan ve aşağıdaki pasaj (P2-i1). 20X görüntüleri, Barlar 100 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Etiketli PDXs kullanılarak Şekil 6. Deneysel metastaz. PDX faj EF1aL-lusiferaz UBC-GFP-W 4'te tarif edildiği gibi, 3 saat ve 250.000 hücre biz ayrışmış ekspresyonlayanNSG farelerin sol kalp ventrikül enjekte yeniden. A) Metastatik büyüme lüminesans görüntüleme kullanarak canlı hayvan izlenebilmektedir. Bu meme kanseri PDX Metastatik yükü floresan görüntüleme sistemi altında disseke organların ex-vivo görüntüleme kullanarak B) karaciğer ve C) akciğerlerde görülebilir. Barlar yaklaşık 1 cm. Temsil bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolü içinde kritik adımlar:
In vitro transdüksiyon sırasında medya kompozisyonu dikkatli kontrol sağlar kadar yüksek titre lentiviral parçacıkların kullanımı (> 10 8 TU / ml), bu protokolün başarısında kritik bir adımdır. Yüksek titreli viral parçacıkların üretimi için birden fazla yöntem de 18,19 anlatılmış olmasına rağmen, Bu protokol, ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi üretilen lentiviral parçacıkları kullanır www.kottonlab.com . Kanser hücrelerinin tümör sindirim ve ayrılması için nazik bir yöntem başarılı etiketleme ve etiketli tümörlerin büyümesi için kritik önemdedir. Üç saat ötesinde sindirim süresinin uzatılması ya da 37 ° C sindirim sıcaklığının artmasıyla ayrışmış hücrelerin sayısını artırır ancak çoğu tümörlerde hücre canlılığı ve etiketleme başarısını azaltır.
Değişiklikler ve sorun giderme:
Bu protokol, dinamik olarak kabul edilir ve her adımda dikkatli izlenmesi ile benzersiz PDX için uyarlanmasını gerektirir edilmelidir. Bu standart bir protokol çoğu ksenogreflenmiş tümörleri için iyi çalışır iken, küçük varyasyonları farklı PDXs etiketleme optimize etmek için gerekli olabilir. Örneğin, bolluk ve stroma ve hücre dışı matriks kompozisyonu genellikle ayrışma ve daha sonra elde edilen tümör hücrelerinin verimi için gereken süreyi etkileyebilir, PDXs arasında farklılık gösterir. nekrotik ve oldukça vaskülarize tümörler haline Büyük tümörler nedeniyle enkaz ve aşırı fare kan hücrelerine etiketlemek zor olabilir. Lin + tükenmesi ve bu protokolü açıklanan epitel EpCam + hücre zenginleştirme kullanımı, PDXs içinde iletimi verimliliğini artırır. Bununla birlikte, EpCam + hücrelerinin ekspresyon böylece ifadesi, her PDX doğrulanması gerekir, hatta epitelyal menşeli tümörlerin değişen hücre zenginleştirilmesi için bir yöntem olarak, kullanımdan önce.
kısıtlamalarlatekniğin leri:
Ayrılan hücreler ve in vitro geçici kültür İletimi da Ebeveyn PDXs temelde farklı etiketlenmiş tümörlere neden olacaktır hücre alt, seçilmesine de neden olabilir. Nöraminidaz ile lentiviral parçacıkların Ön kuluçka ve böylece bu adımda sokulabilir transdüksiyon önyargı azaltılması transdük zor hücre alt 21 viral partiküllerin bağlanmasını geliştirmek için tavsiye edilir. Bizim tecrübelerimize göre, dönüştürülmüş hücreler tarafından yeniden tümörler yakından sadece histolojik ebeveyn PDXs özelliklerini benzer, ama aynı zamanda (veriler gösterilmemiştir RNA seq) mRNA hiyerarşik kümeleme analizi kullanılarak. işaretleme verimliliğine ve tümör aslına açısından kalite kontrolü her bölümü her PDX için yapılmalıdır. PDX etiketleme in vivo ve tümör sürüklenme tümör genişleme gerektirdiğinden tekrarlanan p sonra oluşabilirassaging, transdüksiyon mümkün olduğu kadar erken geçit yapılmalıdır.
Tekniğin önemi:
Bu protokol meme kanseri PDXs floresan bir bioluminescently in vitro etiketli ve ortotopik ve metastatik tümör büyümesinin izlenmesi için in vivo yeniden implante olabilir açıklar. Önceki çalışmalar PDX-türevli organoids 18 etiketlemek için benzer bir strateji kullanmış olsa da, mevcut protokol birden PDXs yüksek iletim verimliliği neden tümör sindirim ve etiketleme varyasyonları içerir.
Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamalar veya yön:
Stabil izlenebilir belirteçleri (GFP, lusiferaz) ifade etmek ve aşın veya belirli genleri demonte yeteneği (yani, pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro shRNAs sunmak için kullanılabilir) ile ilgili temel soruları cevaplamak için PDXs kullanımına izin verirKurulan hücre hatlarına benzer bir şekilde, tümör büyümesi ve metastazı. Özel olarak, bu protokol, metastatik kademeli olarak organ kolonizasyon adımları çalışma deneysel metastaz modelleri etiketli PDXs kullanımını gösterir. farklı organlara metastaz kolayca görüntülendi ve canlı hayvan bioluminescent görüntüleme kullanılarak ölçülebilir ve GFP güdümlü diseksiyonlara kullanılan ve eksize organlarda metastaz görselleştirmek olabilir. Bu metastaz araştırma için PDXs kullanımını kolaylaştırmak için güçlü bir araç temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmalarda kullanılan yüksek titre lentiviral üretimi için faj EF1aL-DsRed-UBC-GFP-B vektör ve protokolleri temin Boston Üniversitesi'nde Dr. Darrel KOTTON ederiz. Bu çalışma .NCI P30CA046934 Merkezi hibe in vivo görüntüleme desteklenen DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) ve R01 CA140985 (CAS) tarafından finanse edildi ve doku kültürü Colorado AMC Üniversitesi çekirdekler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M.
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
