Summary
Мы опишем метод стабильной классификации пациентов происхождения ксенографтов (PDXs) с лентивирусов частиц, выражающих зеленого флуоресцентного белка и люциферазы журналистам. Этот метод позволяет отслеживать рост PDXs на основной сайт, а также обнаружение спонтанных и экспериментальные метастазы , используя в естественных условиях систем формирования изображения.
Introduction
Развитие пациента , полученных ксенотрансплантатов (PDXs), где хирургическим резецированные образцы опухолей привиты непосредственно в ослабленным иммунитетом мышей, имеет ряд преимуществ по сравнению со стандартными моделями клеточных линий ксенотрансплантатных и представляет собой значительный шаг вперед в исследовании рака 1,2. PDXs может быть сохранена и расширена за счет последовательных проходов с минимальным изменением генетических и биологических характеристик опухоли, выращенной при первом прохождении; и более точно отражает гетерогенность опухоли , чем ксенотрансплантаты , полученные из клеточных линий рака у человека 3-8. Эти модели в настоящее время широко используются в качестве платформы для персонализации лечения рака 9,10, как доклинических платформы в разработке лекарственных средств 6,11 и в качестве экспериментального инструмента для изучения биологии рака 4,12.
Большинство PDXs имплантируются и культивируют подкожно, что посильно позволяет производить измерение роста опухоли с течением времени с использованием калибров. Однако, Метастатическое заболевание было более сложно смоделировать с помощью PDXs. Специально для рака молочной железы, ксенотрансплантаты с метастатической способности к различным органам были описаны 3,5,13, но частота спонтанного распространения на метастазами крайне низка. Там, где сообщалось, идентификация и количественное определение метастатического бремени опирается на кропотливого гистологического исследования органов-мишеней посмертных. линии раковых клеток, экспрессирующих биолюминесцентного (люциферазы, Luc) или флуоресцентный (зеленый флуоресцентный белок, GFP), репортеры ген обычно используются в экспериментальных моделях рака молочной железы метастазы в головном мозге, легких, костей и печени после внутрисердечной, хвостовой вены, intrafemoral и селезеночной инъекции 14-16. В то время как эти модели обходят распространение от первичных опухолей, они имеют важное значение для изучения механизмов тропности органов и метастатического колонизации. Однако клетки, полученные из первичных опухолей пациентов и PDXs может иметь низкую цену или трансфекцию трансдукции USINг стандартные процедуры. Один из альтернативных вариантов заключается в создании PDX-клеточных линий , полученных в пробирке 17, который может быть затем метили с использованием традиционных протоколов культуры ткани. Такой подход, однако, не подходит для маркировки большинства PDXs, для которых клеточная линия вывод является трудным и может изменить фенотип клеток. Здесь мы приводим протокол для трансдукции PDX-диссоциированных опухолевых клеток с лентивирусов векторы , подходящие для работы с изображениями в естественных условиях. Кроме того, мы описываем экспериментальную метастаз с помощью внутрисердечной инъекции диссоциированных Luc-GFP меченых клеток PDX мышей с иммунодефицитом.
Базовый протокол для трансдукции PDX-диссоциированных органоидам с геном-репортером , выражающей лентивирусов ранее был описан 18. В текущем протоколе мы опишем дополнительные методы для обогащения опухолевых клеток человека и получить около 100% эффективность трансдукции, а также использование меченых PDXs для обнаружения экспериментального рака молочной железыметастаз. Этот протокол может быть адаптирован для маркировки нескольких типов рака согласно PDXs с различными люминесцентными и флуоресцентных маркеров, а также модуляции экспрессии генов (т.е. shRNA нокдауна интерес генов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все шаги, требующие использования животных в этом протоколе следует руководству Университета Колорадо комитета по этике исследований на животных (IACUC).
1. Подготовка инструментов, медиакультуры и другие реагенты
- Приготовьте 100 мл mammosphere среды, содержащей модифицированную по Дульбекко и Хана F-12 среде Дульбекко (DMEM / F12) (1: 1), базовый фактор роста фибробластов (bFGF, 20 нг / мл), эпидермальный фактор роста (ЭФР, 10 нг / мл ), гепарин (4 мкг / мл), 1x В27, пенициллин (100 ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл). Сделать СМИ в стерильных условиях и хранят при температуре 4 ° С в течение 3-х месяцев.
- Готовят эпителиальную буфер обогащения (ЕЭБ), содержащий PBS рН 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 мМ ЭДТА. Фильтр стерилизовать и хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
- Сделайте 5 мл аликвоты пищеварения буфера в стерильные 15 мл конические пробирки и хранят при -20 ° С в течение нескольких месяцев. В ночь перед опухолевой пищеварения, оттепель пищеварения буфера (5 мл на 500 мгопухоль) на льду, при температуре 4 ° С. Добавить 1x антибиотик-противогрибковое смесь перед использованием.
- Автоклавы (121 ° С в течение 30 мин) по меньшей мере, два пинцеты, скальпель и ножницы для рассечения PDXs.
- Сделать 500 мл промывочного буфера, содержащего DMEM: F12 и 5% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Алиготе 10 мл на опухоль в день опухоли рассечение.
- Подготовьте полибрен запас на 4 мкг / мкл стерильной водой. Фильтр и аликвоты в 1,5 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие 100 мкл каждого, хранить при температуре -20 ° C.
2. Генерация высоких титрах Lentiviral частицы, несущие прослеживаемы Маркеры
- Покупка или генерировать высокий титр лентивирусов частицы , несущие ген - репортер (т.е.., GFP и Люк для отслеживания в естественных условиях роста опухоли) 18,19.
ПРИМЕЧАНИЕ: лентивирусов титр> 10 8 TU / мл (трансдукции единиц на миллилитр) рекомендуется для успешной трансдукции PDXs. Лентивирусов рСтатьи должны быть pseudotyped с конвертом G гликопротеин из Вирус везикулярного стоматита (VSV-G), что позволяет трансдукции самых разнообразных клетках млекопитающих.
Примечание: Протокол , используемый здесь для генерации и титрования с высоким титром лентивирусов частиц можно найти на www.kottonlab.com . Векторы, используемые в настоящем протоколе являются pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro и двойственное промотор фага EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W. Этот вектор был создан путем замены Dsred с геном люциферазы ниже по течению от EF1aL промотора в фаг-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W вектор, своего рода дар Даррелл Коттон, Бостонский университет.
3. Генерация пациента, полученных ксенотрансплантатов
- Сформировать пациента получены ксенотрансплантаты (PDX) от рака молочной железы путем имплантации первичных и метастатических опухолей молочной железы в молочной жировой слой иммунодефицитами мышей 3,4. Сформировать опухоли при максимальной рекомендуемой величины диаметра 1 см, как более крупные опухоли лikely содержат некротические ядра.
Примечание: Подробные методы создания и пересадки ксенотрансплантаты описаны в Дероз и др. 18. Рост установленных перевивных-PDXs в> опухолей см диаметр 1 занимает от 4 до 24 недель после имплантации в иммунодефицитами NOD / SCID / ILIIrg - / - (NSG), в зависимости от собственных темпов роста опухоли. В то время как этот протокол описывает трансдукции рака молочной железы PDXs, он может быть использован для вирусной трансдукции любой опухоли , подходящей для краткосрочных экстракорпорального прохода. Чувствительность PDXs к краткосрочным (24 - 96 ч) в пробирке выживания присуща каждой опухоли и должна быть определена экспериментально.
4. Опухоль Вскрытие и диссоциация PDX-производных опухолевых клеток
- Усыпить мышей , несущих PDX с использованием CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков (следуют институциональные рекомендации исследовательской комиссии по этике животных). Погрузитесь мышей в 0,2% Chlorhexidine раствор в течение 1 мин. Установите курсор на положении лежа на спине на верхней части рассечение доски, а также использовать штифты для фиксации расширенные верхние и нижние конечности к доске.
- С помощью асептической техники, использовать скальпель, чтобы разрезать кожу вокруг опухоли. Подтягивает кожу с набором щипцов и отделить его от опухоли с помощью чистой скальпелем до тех пор, пока опухоль не полностью подвергается. Используя чистую набор щипцов и скальпеля, удалить опухоль и поместить его в 5 мл мыть носитель на льду.
- Возьмите рассеченные опухоль в шкаф BLS2 для дальнейшей обработки. Удалить вложение и прополоскать опухоль с 10 мл Хэнкса сбалансированном солевом натрия модифицированными с 10 мМ HEPES (HBSS / HEPES), в два раза.
- Отбросьте опухоль в стерильном предварительно взвешенную 60 см планшета для культуры ткани. Взвесить пластину, содержащую опухоль, для оценки массы опухоли.
- Используя скальпель, разрезал опухоль пополам, а затем вырезать 3 мм диск из одной половины и поместить его в контейнер с 10% -ным формалином в течение 24 часов. Используйте эту ткань для того чтобы проверить гетерогенностьОбразец опухоли (родительская PDX). Добавить 200 мкл HBSS / HEPES (достаточно, чтобы избежать ткани высохнуть) и пропустить через мясорубку оставшуюся опухоль в минимально возможные части, используя пинцет и чистый скальпель.
- Передача рубленое опухоль в стерильный 50 мл коническую трубку. Добавить по крайней мере, 1 мл буферного раствора, содержащего переваривания 1x противогрибковое-антибиотик на 100 мг опухоли.
Примечание: добавление антибиотиков / противогрибкового средства предотвращает загрязнение опухолевых клеток в пробирке. - Дайджест опухоли в течение 3 ч при 30 ° С, встряхивая при 125 - 200 оборотов в минуту.
Примечание: Повышение температуры до 37 ° С повышает эффективность пищеварения (более отдельных клеток с течением времени), но это, как правило, сопровождается увеличением гибели клеток. Для большинства опухолей, сбраживание при 30 ° С в течение 3 ч приводит в достаточном количестве жизнеспособных диссоциированных клеток, чтобы перейти к шагу маркировки. - Остановить пищеварение, добавляя 35 мл мыть носителя (DMEM / F12 с 5% FBS). Фильтруют через нейлон 70 мкм сито в чистый мл C 50onical трубка для удаления непереваренной ткани. Центрифуга отфильтрованные средах, содержащих переваренные клетки при 400 мкг в течение 5 мин.
- Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл красных кровяных клеток лизис буфера. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавляют 10 мл промывочного буфера (DMEM: F12, 5% FBS), чтобы остановить лизиса. Проходят клетки через 40 мкМ нейлоновая сетка, чтобы удалить сгустки. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин и удаления надосадочной жидкости, место на льду.
- Ресуспендируют переваривали клетки в 5 мл буфера для промывок и рассчитывать как жизнеспособные и нежизнеспособные клетки с использованием трипанового синего. Если коротко, то смешайте 50 мкл клеток и 50 мкл трипанового синего и считать трипанового-синих исключающие клеток с помощью гемоцитометра.
Примечание: Этот неочищенный переваривания продукт будет содержать клетки опухоли человека , полученные из PDX, а также мышь стромальных клеток (фибробласты, клетки крови и др.). Переваренной клетки теперь могут быть обработаны для маркировки (стадия 6), или раковые клетки человека могут быть обогащены с помощью одной из процедур, описанныхв работе 5.
5. Обогащение клеток человека рака эпителиальной
- Разрушающим клетки мыши стромальные с помощью родословие Истощение набора (Lin +) клеток 20.
Примечание: Рекомендуется для высоко васкуляризированных опухолей и / или опухолей с высоким содержанием стромы, в которых экспрессия EpCAM неизвестна или утраченного).- Возьмите до 10 7 жизнеспособных клеток в чистой 5 мл полипропиленовую пробирку, добавляют 2 мл ЕЭБ и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Отбирают пипеткой супернатант полностью.
- Осадок клеток Ресуспендируют в 40 мкл охлажденного льдом EEB на 10 7 клеток.
- Добавьте 10 мкл биотин-антитело коктейле на 10 7 клеток, перемешать, осторожно пипеткой и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 10 мин (коктейль содержит антитела к клеткам Lin + мышь).
- Добавьте 30 мкл холодной EEB на 10 7 клеток, перемешать, осторожно пипеткой.
- Добавьте 20 мкл анти-биотин микрошариков на 10 7 клеток перемешать, осторожно пипеткой и инкубировать при температуре 4 & #176 ° С в течение 15 мин.
- Вымойте клеток с 3 мл холодной EEB, центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл EEB и место на льду.
- Поместите колонку в магнитном поле магнитного сепаратора. Промыть колонку с 0,5 мл эпителиальной буфера обогащения и дайте ему капать через. Не допускайте, чтобы столбец высохнуть.
- Поместите новую коллекцию полипропиленовую трубку под колонкой. Медленно, добавьте 500 мкл, содержащих меченых клеток через колонку (Lin + меченых клеток будут сохранены в магнитном колонке). Сбор сточных вод в качестве фракции с немеченых клеток, представляющих фракцию клеток, обогащенной родословная отрицательной (опухоль).
- Полоскание в столбце 3 раза с помощью 500 мкл приливами и собирают сточные воды в той же трубе в виде стоков на этапе 5.1.8. Хранить сточные воды на льду и переходите к шагу маркировки (6).
- Дополнительно: Возьмите столбец вне магнитного поля. Поместите новую полипропиленовую трубу поди элюции LIN + фракции путем добавления 500 мкл EEB, три раза и с помощью прилагаемого плунжера.
- Обогащение EpCAM + эпителиальных раковых клеток человека (рекомендуется для лечения опухолей, известных выразить CD326 + и содержат высокое содержание стромы мыши).
- Возьмите до 10 7 жизнеспособных клеток в чистой 5 мл полипропиленовую пробирку, добавляют 2 мл холодной ЕЭБ и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Отбирают пипеткой супернатант полностью.
- Осадок клеток Ресуспендируют в 60 мкл охлажденного льдом ЕВВ на 10 7 клеток.
- Добавьте 20 мкл EpCAM микрошариков на 10 7 клеток, перемешать, осторожно пипеткой и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
- Вымойте клеток с 3 мл холодной EEB, центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл EEB и поставить на лед.
- Поместите колонку в магнитном поле мини-сепаратора. Промыть колонку с 0,5 мл EEB и дайте ему капать через. Не допускайте, чтобы высушить колонкувне.
- Поместите новую коллекцию полипропиленовую трубку под колонкой. Медленно, добавьте 500 мкл, содержащих меченых клеток через колонку (EpCAM + меченые клетки будут сохранены в магнитном колонке). Сбор сточных вод в качестве фракции с немеченых клеток, представляющих мышь стромальных клеток.
- Промыть колонке 4 раза 500 мкл буфера для ME и собирать сточные воды в той же трубе в виде стоков на этапе 5.1.8.
- Возьмем столбец вне магнитного поля. Поместите новую полипропиленовую трубу под и элюции EpCAM + фракции путем добавления 500 мкл буфера, МЕ три раза. Вымывать магнитно меченых клеток, плотно нажимая на поршень в колонну. Сбор стоков, содержащий обогащенную EpCAM + опухолевых клеток фракции и держать на льду. Перейдите к шагу 6.
6. Трансдукция PDX-производных опухолевых клеток
- Центрифуга диссоциированных опухолевых клеток при 300 5 мин GX и ресуспендируют в 2 мл mammosphere лечеба. Количество жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего, как и в 4.11.
- Приготовьте 10 мл mammosphere среды, содержащей 8 мкг / мл полибрена (2 мкл акций полибрена на мл носителя).
- Определить объем , необходимый для 2 - х 10 5 жизнеспособных опухолевых клеток. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют осадок в 2 мл полибрена средах. Пластина 2 х 10 5 жизнеспособных опухолевых клеток на лунку в культуральной пластины 6-хорошо сверхнизкой прилипание ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптимальное количество клеток, необходимых для трансдукции с одним лентивирусов вектора.
ВНИМАНИЕ! Lentiviral частицы и все расходные материалы, используемые с лентивирусов частиц должны быть обработаны следующие организационные процедуры рекомбинантных ДНК биологической опасности.
Примечание: лентивирусов трансдукции первичных клеток молочной железы сильно способствует миоэпителиальных клеток , которые могут привести к плохому маркировке просветными клеток и селекции субпопуляций опухолевых клеток во время мечения 21. <литий> Выдержите вирус с 200 мЕд / мл нейраминидазы при 37 ° С в течение 1 ч до начала трансдукции , чтобы увеличить связывание вирусных частиц в различных субпопуляций первичных клеток и коррекции этого потенциального смещения 21. - Добавить лентивирусов частиц при 10 MOI (2 × 10 6 ТУ в течение 2 × 10 5 жизнеспособных клеток) , если PDX-диссоциированные клетки истощаются из клеток Lin + мышь или обогащены EpCAM + клеток. Добавить лентивирусов частиц при 30 MOI (6 х 10 6 ТУ на 2 х 10 5 жизнеспособных клеток) при использовании не-обогащенных PDX-диссоциированных клеток.
Примечание: Увеличение МВД России позволяет эффективно трансдукции даже при наличии большого количества мусора и мертвых клеток в сырых экстрактах. Держите одну скважину с немеченых клеток, чтобы служить в качестве контроля для жизнеспособности и эффективности трансдукции. - Вихревой смешивать вируса с клетками. Инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2 в течение до 96 часов. Добавьте 500 мкл свежей mammosphere СМИ 24 ч после трансфекции. Клетки не АТТАКч к пластинам, не аспирата средств массовой информации.
7. Оценка эффективности трансдукции и повторной имплантации меченых клеток мышей с иммунодефицитом
- Монитор экспрессии отслеживаемой маркера (GFP) каждые 24 часа в сутки с помощью флуоресцентного микроскопа на 10-кратным увеличением.
Примечание: GFP выражение можно наблюдать уже через 24 часа после заражения , но в большинстве PDXs экспрессия GFP отчетливо видна через 72 часа (рисунок 1). - Оценить эффективность трансдукции путем оценки процентного содержания GFP + клеток в пределах общей скважины.
Примечание: Поскольку культуры содержат опухолевые клетки, остаточные стромальные клетки и мертвые клетки в различной степени, лунки ниже 10% GFP + клетки могут быть имплантированы в хост-мыши. - Передача трансдуцированных клеток из 6-луночные планшеты в 15 мл коническую пробирку. Добавляют 1 мл mammosphere носителя в скважину, чтобы собрать все клетки остались позади. Место на льду.
- Добавьте 10 мл HBSS / HEPES для трансдуцированных клеток и Сentrifuge при 300 мкг в течение 5 мин, 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют в 50 мкл подвальный матрицы экстракта (BME) на льду.
Примечание: BME аликвоты должны быть оттаивали на льду, 1 - 2 ч до использования. БМЭ будет затвердевать при комнатной температуре; держать на льду во все времена. - Загрузите BME внедренных клеток в шприц 0,5 мл инсулина, держать на льду, и привести к виварии для реимплантации в ГЯП мышей.
- Обезболить самка 4 - 8 недель старых мышей ГЯП, используя 5% изофлуран / 95% кислорода в течение 5 мин, а затем 2% изофлуран / 98% кислорода или в соответствии с утвержденными этике исследований на животных утвержденным протоколом.
- Когда животное не реагирует на болевые раздражители (схождение-пинч), очистите область инъекции с последующим бетадин салфетками этанолом, и вводят в 50 мкл клеток в 4 - й молочной жировой ткани. Обеспечить мышей с обезболивании для облегчения инъекции дискомфорта, как указано в протоколе утвержденного.
- Разрешить клетки образуют опухоли (2 - 12 недель) и следить за GFP и / илиактивность люциферазы с использованием перестраиваемого системы света и / или в естественных условиях системы люциферазы визуализации (рисунок 2).
Примечание: Следуйте рекомендациям для анестезии, анальгезии, измерения опухолевой и критериев эвтаназии, утвержденных институциональное животных комитетом по этике.
8. Контроль качества меченых PDXs
- Определить эффективность маркировки путем оценки люциферазы и экспрессии GFP в меченых опухолях.
Примечание: Следуйте институциональное животных исследования комитет по этике утвердил процедуры в естественных условиях биолюминесценции томографии (рис 2, 3).- Dissect опухоли размером от умерщвленных мышей, когда размер опухоли достиг 1,0 - 1,5 см в диаметре (или до того в соответствии с утвержденными протоколами, как описано в разделе 4). Препарирование следует проводить в соответствии с системой перестраиваемый света (или эквивалентную систему, которая позволяет оценить флуоресценции GFP).
- От каждой опухоли, качественно оценить реrcentage из GFP + опухоли с помощью микроскопии. Если меньше, чем 100%, рассекают только GFP + часть. Рассекают мм диск 3 и зафиксировать в 10% формалине для парафин и гистологического анализа, за исключением небольшой кусочек для РНК или других желаемых анализов, и сохранить как большую часть опухоли, как это возможно в отдельных 1,5 мл криопробирок, содержащих 90% FBS / 10% ДМСО для криоконсервации.
- Re-имплантатах части меченых опухоли в новые реципиента NSG мышей 18 , чтобы расширить и использовать в экспериментальных исследованиях метастазирования.
- Выполните стандартную иммуногистохимическое окрашивание парафином тканей, полученных из опухолей до трансдукции и в каждом поколении после этого проверить, что меченые PDXs остаются гистологическое похожи на оригинальные PDXs.
Примечание: Маркеры, используемые для контроля качества меняются в зависимости от каждого PDXs. Для рака молочной железы PDXs, экспрессия рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2), рецептор эпидермального фактора роста 1 (HER1 или EGFR), годовыхн-цитокератин (пан-CK) рекомендуются для первичного скрининга.
9. Экспериментальные модели метастаза с мечеными PDXs
- После действия, описанные в разделе 4, диссоциируют опухолевых клеток из меченого PDX. Если опухоль насыщена сосудами или богатой стромы мыши, выполняют обогащение раковых клеток, как описано в 4.5 или 4.6.
- Количество жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего, и разбавьте 250000 клеток в 100 мкл PBS (Ca 2+, Mg 2+) бесплатно на мышь. Сохранить клетки на льду. Для инъекции нескольких мышей, корректировать число, соответственно (и подготовить избыток по меньшей мере, одной дополнительной инъекции, чтобы учесть наличие ошибок при использовании пипеток).
- Доведите клетки на льду в соответствующей процедуре помещения для животных и перейти к внутриотраслевой сердца инъекций в соответствии с утвержденным протоколом IACUC.
Примечание: Подробные протоколы внутри сердца инъекции раковых клеток, были описаны в другом месте 22,23. - Отслеживание и количественно метастатическогорастянут во времени с использованием биолюминесцентного изображений. Визуализируйте макроскопические метастазы в различных органах с помощью биолюминесценции и / или GFP визуализации изолированных органов при аутопсии 24 (рисунок 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод описывает трансдукции PDX-диссоциированных клеток рака молочной железы с использованием высоких титрах лентивирусов векторов pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro и фаг-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W. Эти векторы экспрессии флуоресцентный маркер , который позволяет оценить эффективность трансдукции в пробирке, а уже через 24 ч после заражения (рис 1а). Для большинства PDXs, экспрессия GFP будет задержано до 72 часов после инфицирования (рис 1b), в это время , образование агрегатов клеток обычно наблюдается. Трансдукция может быть достигнуто после обогащения для раковых клеток человека (то есть, используя истощение Lin + клеток, рис 1а) или в сырых PDX-диссоциированных клеток (рис 1b). Обогащение опухолевых эпителиальных клеток рекомендуется для насыщена сосудами опухолей были мышиные клетки крови представляют собой значительный процент от общего количества жизнеспособных клеток.
в лабораторных условиях , меченые клетки собирают и суспендируют в внеклеточного матрикса и повторно имплантировали мышам NSG. Меченые опухолевые клетки регенерируют опухоли , которые могут быть отслежены с помощью биолюминесценции или флуоресценции (рисунок 2). Эффективность трансдукции необходимо оценивать образование следующей опухоли, и она будет варьироваться в зависимости от восприимчивости различных PDXs к трансдукции в пробирке. Успешно маркированы PDX будет около 100% GFP + на первого поколения пост-трансдукции (рис 2b, с) и будет оставаться около 100% GFP + в последующих проходах (рисунок 3). Тем не менее, некоторые PDXs покажет "пятнистый" распределение GFP + клеток (рисунок 4), что указывает на неоптимальный в пробирке трансдукции. В этих случаях, опухоли могут быть расчленены под флуоресцентным-системы просмотра, чтобы выбрать GFP + области, которые могут быть повторно имплантированы для расширения меченого SubPopавляет, или опухоли могут быть диссоциированы и GFP + клетки могут быть выделены с помощью FACS с последующей повторной имплантации в NSG мышей.
Поскольку PDX диссоциации и трансдукции может привести к выбору клеточных субпопуляций в пределах опухоли, исследователи должны проверить, что меченые опухоли очень похожи на родительские опухоли, от которых они были получены. PDXs должен быть запятнана IHC в каждом поколении , чтобы продемонстрировать , что критические маркеры , такие EGFR, рецепторы гормонов (например, эстроген - рецептор) и пан-Цитокератины (PanCK, маркеры эпителиальных клеток) сохраняются в маркированных PDXs. На рисунке 5 показано окрашивание на EGFR и panCK в тройной рака молочной железы PDX отрицательной (в окрашивании рецептора гормона не показан, так как это PDX испытывает недостаток эстрогена и прогестерона рецептор).
Меченые PDXs может использоваться для отслеживания спонтанного распространения метастатического, а также экспериментальную метастатическийраспространяемая высева клеток непосредственно в кровоток. Спонтанные метастазы рака молочной железы PDXs встречаются реже, но было зарегистрировано несколько групп 3,13,25. Экспериментальные модели метастазов обеспечивают альтернативу для изучения тропизм орган и орган-колонизацию шаги в метастатического каскада. Клетки отделено от меченых опухолей вводят внутрисердечно и метастатического нагрузка отслеживается с помощью биолюминесцентного изображений. Как показано на рисунке 6, с PDX трансдуцированных фагом-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W вводили в 250000 клеток / мышь образуются метастазы в легких и печени , которые были легко идентифицируются с люциферазы визуализации в естественных условиях, и экспрессии GFP в органах бывших естественных условиях ,
Рисунок 1:. Отслеживание эффективности трансдукции в Диссошиэйтед PDX клеток A) B) PDX-диссоциированных клеток из отдельного эксперимента, без обогащения эпителиальных клеток, 72 ч после того, как трансдукции фагом-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W. Обе панели показывают живые клетки. BF: Светлое поле изображения, полоса представляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Создание меченых PDXs в принимающих мышей Клетки трансдуцированных фагом-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W в течение 72 ч были имплантированы в жировой ткани молочных желез женской NSG мыши. Опухоль оставляли расти в течение 14 недель после инъекции. A) люциферазы репортер активность оценивают путем визуализации в естественных условиях после внутрибрюшинного введения B) экспрессии GFP люциферин. можно наблюдать через неповрежденную кожу с помощью системы просмотра флуоресценции. Выражение С) GFP , также должны быть проверены на рассечение , чтобы определить степень маркировки опухоли. Этот пример показывает повсеместное GFP выражения опухоли. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Маркированный PDXs Сохранил прослеживаемы Маркеры после нескольких пассажей в Vivo PDX рак молочной железы помечены фаг-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W показан 3 пассажей после трансдукции.. экспрессия GFP остается на уровне почти 100% в пассированного опухоли.54944 / 54944fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Пример сетевой PDXs с Субоптимальное трансдукции эффективности. А) Рак молочной железы PDX помечены фаг-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W пассируют после того, как неоптимальный трансдукции имело место. Полученные в результате опухоли содержат смешанные популяции GFP + и опухолевых клеток GFP-. Левая опухоль не пригодна для дальнейшего распространения. Право опухоль может быть размножен рассекает GFP + участки под системой просмотра флуоресценции. B) Регионы GFP + клеток в смешанных опухолей могут быть легко идентифицированы при освещении лампами дневного света. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Контроль качества PDX Характеристики после трансдукции и пассажей. Экспрессия EGFR и Pan-цитокератином (PanCK) в парафином ткани из тройного негативного рака молочной железы PDX F2-7 при прохождении 2 (P2, до трансдукции), опухоли генерируется сразу после трансдукции (P2-i0), и следующий проход (Р2-1 '). 20X изображения, Барс представляет 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Экспериментальные Метастазы с помощью меченых PDXs. PDX , экспрессирующие фаг-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W разбирают в течение 3 ч , как описано в 4, и 250000 ячеек используетсяповторно вводили в левый желудочек сердца мышей NSG. А) Метастатическим рост можно проследить в живых животных с использованием визуализации люминесценции. Метастатический бремя этой груди PDX рака может наблюдаться в печени B) и C) с использованием легких экс-естественных изображений расчлененного органов в рамках системы просмотра флуоресценции. Бары составляет примерно 1 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в протоколе:
Применение с высоким титром лентивирусов частиц (> 10 8 TU / мл) является важным шагом в успехе этого протокола, так как позволяет тщательный контроль состава СМИ во время трансдукции в пробирке. В то время как многочисленные методы производства с высоким титром вирусных частиц были хорошо описаны 18,19; этот протокол использует лентивирусов частицы , полученные , как описано подробно на www.kottonlab.com . Мягкое метод переваривания опухолей и диссоциации раковых клеток имеет решающее значение для успешной маркировки и роста меченых опухолей. Увеличение времени переваривания за три часа или повышения температуры переваривания до 37 ° С увеличивает количество диссоциированных клеток, но снижает жизнеспособность клеток и успешность маркировки в большинстве опухолей.
Модификации и устранение неисправностей:
Этот протокол следует считать динамичным и требует адаптации для уникальной PDX с тщательным контролем на каждом этапе. В то время как этот стандартный протокол работает одинаково хорошо для большинства ксенотрансплантированной опухолей, небольшие вариации могут быть необходимы для оптимизации маркировки различных PDXs. Например, обилие и состав стромы и внеклеточной матрицы, как правило, различаются между PDXs, которые могут повлиять на время, необходимое для диссоциации и выход опухолевых клеток, полученных после этого. Большие опухоли, которые некротизировалась и насыщена сосудами опухоли может быть трудно маркировать из-за мусора и излишних клеток крови мышей. Использование Lin + истощением и эпителиальную EpCAM + клеток обогащения, описанного в этом протоколе повышает эффективность трансдукции в таких PDXs. Тем не менее, экспрессия EpCAM + клеток варьирует даже в опухолях эпителиального происхождения, таким образом, его выражение должно быть проверено в каждом PDX перед использованием в качестве способа для обогащения клеток.
Лимитаные методики:
Трансдукция диссоциированных клеток и их временной культуры в пробирке может привести к селекции клеточных субпопуляций, которые затем приводят к меченых опухолей принципиально отличается от родительских PDXs. Предварительная инкубация лентивирусов частиц с нейраминидазы рекомендуется увеличивать связывание вирусных частиц в клеточных субпопуляций 21 трудных для трансдукции, таким образом уменьшая смещение трансдукции , которые можно было бы ввести на этом шаге. По нашему опыту, опухоли реконструируется трансдуцированных клеток близко напоминают черты родительских PDXs не только гистологически, но и с помощью иерархического кластерного анализа экспрессии мРНК (Секвенирование РНК, данные не показаны). Контроль качества с точки зрения эффективности и маркировки опухоли точности должны выполняться для каждого PDX при каждом проходе. Поскольку PDX маркировка требует расширения опухоли в естественных условиях и дрейфа опухоли может происходить после повторного рassaging, трансдукция должны быть выполнены в кратчайшие сроки прохождения.
Значение техники:
Этот протокол описывает , как рак молочной железы PDXs может быть флуоресцентно bioluminescently промаркированы в пробирке и повторно имплантированы в естественных условиях для отслеживания ортотопической и метастатического роста опухоли. В то время как предыдущие исследования использовали подобную стратегию маркировать PDX-18 , полученные органоиды, текущий протокол включает в себя изменения в пищеварении опухоли и маркировки , которые приводят к высокой эффективности трансдукции нескольких PDXs.
Будущие приложения или направления после освоения этой техники:
Возможность стабильной экспрессии отслеживаемые маркеров (GFP, люциферазы), и к сверхэкспрессии или нокдаун специфических генов (т.е. pSIH1-H1-copGFP-Т2А-Puro может быть использован для доставки shRNAs) позволяет использовать PDXs , чтобы ответить на фундаментальные вопросырост опухоли и метастазирование аналогичным образом с установленными клеточными линиями. В частности, этот протокол демонстрирует использование меченых PDXs в экспериментальных моделях метастазирования для изучения действия органа-колонизацию в метастатического каскада. Метастазы в различных органах можно легко визуализировать и количественно с использованием биолюминесцентного изображений в живых животных, и экспрессия GFP используется для управляемых вскрытий и визуализировать метастазы в вырезанных органов. Это представляет собой мощный инструмент для облегчения использования PDXs для исследования метастаза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Даррел Kotton в Бостонском университете для обеспечения фаг-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W вектор и протоколы для производства лентивирусов с высоким титром, используемых в этих исследованиях. Эта работа была профинансирована DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) и R01 CA140985 (CAS) грант .NCI P30CA046934 Центр поддерживается в естественных изображений и тканевой культуры, сердечники в университете Колорадо AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M.
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
