Summary
Dit protocol beschrijft de inductie van een ischemie-reperfusie (IR) model op de muis oor huid met behulp van magneet klemmen. Met behulp van een custom-built intravitale imaging model, bestuderen we in vivo ontstekingsreacties post-reperfusie. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is om te begrijpen hoe leukocyten reageren op huid IR schade verlengen.
Introduction
Ischemie-reperfusie schade (IRI) treedt op wanneer er een voorbijgaande hypoxie als gevolg van de obstructie van de bloedstroom (ischemie), gevolgd door een latere re-oxygenatie van weefsels (reperfusie). In de huid wordt ischemie-reperfusie (IR) beschouwd als een van de factoren die bijdragen aan de pathofysiologie van decubitus, waarbij langdurige bedrust predisponeert langdurige ziekenhuispatiënten om letsel. Bij deze patiënten wordt zowel de huid en de onderliggende spieren voortdurend blootgesteld aan gewicht uitgeoefende druk over gebieden van botuitsteeksel, waardoor gelokaliseerde verwondingen die, indien onbehandeld, kan necrotisch 1 worden.
De betrokken bij een IRI schade zijn tweeledig. Tijdens ischemie, de occlusie van bloedvaten leidt tot een drastische daling van zuurstofafgifte aan de weefsels. Dit resulteert in een daling van ATP en pH, die ATPasen betrokken celstofwisseling inactiveert. Op zijn beurt, de cellulaire calcium niveaus spike, en gestrest of beschadigde cells ondergaan apoptose of necrose 2. De afgifte van intracellulaire inhoud of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMP), zoals HMGB1 bijdraagt aan de ontstekingsreactie 3. De tweede belediging optreedt tijdens reperfusie. Hoewel zuurstof en pH-niveaus worden hersteld tijdens reperfusie resulteert in de generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die leidt tot de oxidatie van intracellulaire lipiden, DNA en eiwitten. Dientengevolge zijn pro-inflammatoire mediatoren geactiveerd, dat een secundair ontstekingsreactie die de rekrutering van immuuncellen naar de ontstekingsplaats 2 omvat vertrekt. Terwijl de cascade van biochemische gebeurtenissen die leidden tot de ontstekingsreactie is goed beschreven, worden de ruimtelijke en temporele regulatie van het immuunsysteem cel activiteiten niet goed begrepen.
Hier beschrijven we een robuuste IR-model op de muis oor huid met behulp van eenvoudige magneet klemmen. In combinatie met multifoton intravitale beeldvorming (MP-IVM), wewerd een model voor de in vivo ontstekingsreacties die na reperfusie plaatsvindt bestuderen. De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om te proberen te begrijpen hoe zowel de interstitiële en infiltrerende cellen reageren op IR in real time.
Bestaande modellen van IR behulp van de stel- techniek op de huid flank zijn sterk invasieve mocht de chirurgische implantatie van staalplaten in de huid flank vereist, waardoor ze minder dan ideaal voor immunologische studies 4. Een dergelijke niet-invasieve klemming techniek is beschreven in de muizenhuid flank 5,6. Vanwege de integratie van de intravitale beeldvorming component in deze werkwijze, maar wij kozen voor de oorhuid de beoogde IR site, zoals omzeilt bewegingen door ademhaling en stabiliteit biedt tijdens beeldvorming 7,8. Bovendien leukocyten subsets de interstitium overspannen zijn identiek tussen het oor huid en de huid flank, hoewel degetallen en verhoudingen kunnen enigszins variëren 9. Dus de oorhuid vertegenwoordigt een ideale beeldvorming plaats.
Daarnaast hebben de meeste gegevens uit deze IRI modellen zijn beperkt tot macroscopische evaluaties (grading van zweren) en microscopische analyses van endpoint inflammatoire indicatoren 10. Met behulp van dit model wordt real-time visualisatie van de cellulaire respons van neutrofielen na reperfusie in de huid van een tl-reporter muis ingeschakeld. Een eerder gepubliceerd intravitale oor imagingmodel wordt gebruikt 8 met extra modificaties (figuren 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten te maken met levende dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante gebruik van dieren en de richtlijnen en voorschriften zorg.
1. Keuze van Fluorescent Reporter Muizen
- Gebruik 6 tot 12 weken oude LysM-eGFP 11 muizen (geen voorkeur voor mannen of vrouwen).
Opmerking: Het gebruik van verschillende celspecifieke fluorescent reporter muizen maakt de visualisatie van andere immuuncellen in vivo. In deze stam, circulerende neutrofielen (GFP hi-cellen), circulerende monocyten (GFP lo-cellen), en de huid macrofagen (GFP lo-cellen) kunnen worden gevisualiseerd. Met de beeldvormende parameters gebruikt, worden alleen de signalen van heldere GFP-positieve neutrofielen worden gedetecteerd.
Opmerking: Een lijst van immuun-cel-specifieke tl-reporter muis stammen die geschikt zijn voor dit type van de huid imaging studie kan worden gevonden in referentie 8.
Opmerking: Het wordt sterk aanbevolen dat albino muizen worden gebruikt voor de beeldvorming, zo pigmented muizen zijn meer vatbaar voor photodamage. Dit komt omdat de gepigmenteerde oorhuid is veel gevoeliger voor laser geïnduceerde speckling (indicatief weefsel branden). Hierdoor kan neutrofielen werving en accumulatie worden waargenomen, zelfs tijdens de steady state 8,12. - Houd de muizen in specifieke pathogeenvrije (SPF) aandoeningen met 12-uur licht-donker cycli.
2. Muis Anesthesie
- Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine (8 pi -1 g lichaamsgewicht), bestaande uit een mengsel van 15 mg ketamine mL -1 en 1 mg ml -1 xylazine opgelost in steriel water.
- Plaats de muis op een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur op 37 ° C te houden gedurende de bereidingsprocedure. Controleer of er voldoende verdoving door het observeren van een afwezigheid van een teen knijpen reflex.
Let op: Na het eerste uur, later kwartaal doses van verdoving moet subcutaan een te worden toegediendd duurt ongeveer 0,5 uur elk. Het trillen van snorharen of de staart kan ook aangeven dat de verdoving af is het dragen en dat er een top-up nodig is. - Gebruik oogheelkundige smeermiddel op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
3. ontharen
- toepassing ontharingscrème goed naar de bovenste tweederde van de dorsale muizenoor gebruik wattenstaafjes.
- Wacht op 2-3 minuten voor het verwijderen van de crème met behulp van natte katoen-tip applicators op een grondige maar zachte manier.
Opmerking: Sta niet toe dat ontharingscrème te blijven op de muis oor te lang, want het ontsteking 13,14 kan veroorzaken.
4. Inductie van ischemie en reperfusie schade
- Gebruik vergulde, N42-grade neodymium magneten, 12 mm diameter x 2 mm dik en met een Gauss waardering van ongeveer 3.000 tot ischemie induceren in de muis oor huid.
Opmerking: In dit geval is de kuiltjes gezicht van de magneten Denotes de noordpool. - Slot de magneten in hun afzonderlijke plastic gidsen.
Opmerking: De kunststof gids dient voor het plaatsen en scheiding van de zeer sterke magneten vergemakkelijken. Door hun sterke magnetische werking nog laag breukvastheid, geen individuele magneten dicht bij elkaar te plaatsen of andere metalen. Breuk en versplintering kan optreden als ze trekken naar elkaar toe. - Plaats de eerste (dorsale) magneet zodanig dat alleen de rand in contact met de tweede (ventrale) magneet (figuur 3a)
Let op: Dit voorkomt dat de magneten aan elkaar snapping voor dat ze correct zijn gepositioneerd. - Positioneer beide magneten zodanig dat het ventrale magneet ligt plat op het oor (figuur 3a).
Opmerking: Voordat ischemie wordt veroorzaakt, ervoor te zorgen dat de muis bij 37 ° C wordt gehouden en dat er voldoende verdoving wordt gehandhaafd (zie stap 2.2). - Eenmaal klaar, voorzichtig laat de magneten bij elkaar komen (figuur 3a Opmerking: Voor grafische doeleinden klem slechts de helft van het oor, zodat een IR en IR-gebied niet kan worden waargenomen.
- Na 1,5 uur van ischemie, verwijder de magneten door het verdraaien van de magneten uit de buurt van elkaar met behulp van de kunststof geleidingen, waardoor reperfusie te laten plaatsvinden.
Opmerking: Er moet worden voorkomen dat de oren kreukelt wanneer de magneten zijn geplaatst. Onvolledige ischemie is duidelijk als de macroscopisch zichtbare grote bloedvaten opnieuw Perfuseren onmiddellijk (dwz bloed vult de vaten direct) na de magneten worden verwijderd. Reperfusie hoewel niet optreden onmiddellijk na de verwijdering van magneten, bloedvat occlusie slechts voorbijgaand. Als zodanig is het noodzakelijk om de muisoor bereiden op beeldvorming zo spoedig mogelijk.
5. Injectie van Blood Vessel Labeling Agents
- Onmiddellijk na het verwijderen van de magneet, beheren intraveneus (via retro-orbitale of staartader injectie) Evans blauw (10 mg ml -1in PBS of zoutoplossing; 1 gl -1 g lichaamsgewicht) of een ander bloedvat labelingmiddel keuze.
Opmerking: Voordat injectie, ervoor te zorgen dat er voldoende verdoving wordt nog steeds onderhouden door het uitvoeren van zachte teen knijpen.
6. Plaatsing van het oor op de Imaging Platform
- Knip 2 stukjes plakband 1,5 cm in lengte en 1,8 cm in de breedte.
- Laat de lijm kanten aan elkaar blijven terwijl waardoor ongeveer 1 mm lijm over de breedte.
- Snijd het plakband in twee, in de lengte, naar de plaatsing huisvesten binnen de sleuf op het oor platform.
- Plaats deze afplakband ongeveer halverwege de gleuf, zodat de klevende kant naar boven gericht.
- Plaats de muis op de verwarming pad, zodat het oor af te beelden is naast de afplakband strip.
- Door twee PBS-bevochtigd katoen-tip applicators, voorzichtig op het oor tegen de plakstrip.
- Met behulp van de strip als een gids, breng de muis oordoor de sleuf tegelijkertijd instellen van de muis dichter naar het podium.
- Het plakband te verwijderen, eerst een druppel PBS om de hechting van de band te verminderen.
- Scheid de muisoor het plakband zo voorzichtig mogelijk met een fijne kwast.
- Plat het oor tegen het oor platform door zacht glooiende een vochtige katoen-tip applicator over het oor.
- Een druppel PBS onder het dekglaasje (die in positie op de houder dekglaasje behulp vet wordt gehouden; figuur 2) en plaats voorzichtig het over het oor. Bijvullen met meer PBS indien nodig.
Opmerking: De dekglaasje houder verhoogt de stabiliteit tijdens de beeldvorming. - Plaats de rectale temperatuursensor en de draden aan het verwarmingssysteem volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Stel de temperatuur van het lichaam verwarmingselement tot 37 ° C en het oor stage platform 35 ° C.
7. Multiphoton Microscoop Seten Imaging Parameters
Let op: Dit protocol maakt gebruik van een enkele straal, multiphoton microscoop met een instelbare (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W bij 800 nm; puls lengte van 140 fs; 80 MHz herhalingsfrequentie) met een 20X water objectief (NA = 1.0) voor intravitale imaging studies.
- Open de imaging software.
- Lijn de laser volgens de instructies van de fabrikant.
- Stel de excitatiegolflengte naar 950 nm.
Opmerking: GFP en Evans blauw kunnen tegelijkertijd opgewonden bij 950 nm. - Om preview, gebruik de volgende instellingen: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 pixel resolutie, en een scan frequentie van 800 Hz in een enkele lijn scan. Klik op "Preview".
- Schakel de demper (laser) macht. Zorg ervoor dat alle essentiële signalen worden opgepikt zonder bloot het veld beeldvorming om grote hoeveelheden laservermogen, waarbij warmte schade kan veroorzaken.
Opmerking: Start bij een lage demper vermogen en toenemen indien de signal is zwak. Zoals neutrofielen afwezig zal zijn van het interstitium op vroege tijdstippen na reperfusie, kunnen macrofagen worden gebruikt als een maat van de minimale benodigde vermogen te bepalen, omdat de eerstgenoemde zwakker dan neutrofielen.
Opmerking: Als deze stap wordt uitgevoerd voor de eerste keer, pas de instellingen in de niet-ischemische zone, waarbij intacte vasculaire integriteit verwacht en wordt de instelling van de verzwakker vermogen vergemakkelijken. In de daaropvolgende experimenten, hoeft deze instellingen niet veel aanpassingen nodig, tenzij het laservermogen is instabiel. - Pas de PMT-instellingen.
Opmerking: Informeer bij de fabrikant voor het maximale optimale winst spanning voor de PMT. Instellen PMT voltage boven de aanbevolen drempel leidt tot een hogere signaal-ruisverhouding. Algemeen wordt aangeraden om de versterking PMT voltage op de aanbevolen drempel en de verzwakker te verhogen als noodzakelijk zou het signaal te zwak. - Selecteer een beeldgebied dat dicht bijde rand van de ischemie, gekenmerkt door grote Evans blauwe lekkage.
- Verzamel GFP en Evans blauw signalen met behulp van 525/50 bandpass (BP) en 655/40 BP filters, respectievelijk. Voor de tweede harmonische generatie (SHG) signalen van collageen vezels in de huid compartiment, gebruik dan een 475/42 BP filter.
- Maak een map om de afbeeldingen in een formaat dat compatibel is voor de beschikbare beeldanalyse-software is op te slaan.
- Te verwerven, gebruik de volgende instellingen: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 pixel resolutie, en een scan frequentie van 400 Hz in een enkele lijn scan.
- Een 100-um z-stack met een stapgrootte van 4 urn herhaaldelijk kan worden verkregen in de tijd, op 1 min tussenpozen neutrofielen infiltratie controleren.
Opmerking: Speciaal voor leukocyten (bijvoorbeeld neutrofielen) met een hogere snelheid trekkende, een interval dat langer is dan 1 min kan leiden tot problemen tijdens cell tracking analyse. In dit geval kan de gebruiker verlaagt de dikte van de acinquisitie stapelen of verhoog de scan frequentie.
Opmerking: Als het vereiste verwerving stapel van de ischemische zone kleiner als gevolg van de compressie (alternatief gekenmerkt door een hogere intensiteit SHG) weergegeven, zal later reperfusie resulteren in massieve ontsteking die veroorzaakt het oor te zwellen. Aanzienlijke afwijkingen in de Z-richting worden verwacht. Als zodanig is de verwerving van een groot z-stack moet de drift tegemoet. - Gedurende de beeldvorming, boven het PBS en water regelmatig het oor vochtig en het objectief ondergedompeld in water te houden.
Opmerking: Een typisch experiment duurt gewoonlijk 2-4 uur. Afhankelijk van de experimentele opzet, en in combinatie met een goed gecontroleerde anesthesie regime verlengen beeldvorming mogelijk.
8. Het beëindigen van het Experiment
- Euthanaseren de muis door kooldioxide stikken volgens de instelling Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) procedures.
Opmerking: euthanaseren altijd de muis door erkende methoden, zoals bepaald door de instelling van de regels, voorschriften en richtlijnen. Als herhaalde beeldvorming nodig is, houdt de muis op de verwarming pad totdat de verdoving is uitgewerkt. Zodra de muis voldoende bewustzijn herwonnen en is mobiel, de terugkeer van de muis zijn kooi.
9. Beeldanalyse
Opmerking: de gegevens gegenereerd door de beeldvormende experiment kan zichtbaar worden gemaakt door verschillende softwarepakketten.
- Open de imaging-analyse software.
- Onder overtreffen Mode, importeert u het bestand (Open → selecteert u een bestand in de gewenste map → Klik op "open").
- pseudo bewerken kleuren als standaard kleuren zijn niet van toepassing (aanpassing bewerken → Display → Onder de tab-kanaal, selecteert u de gewenste kleur uit het kleurenpalet).
- Pas de helderheid, contrast en achtergrond (Edit → Display Adjustment → Toggle Max en Min waarden). Zorg ervoor dat het bestand afmetingen juist zijn (Edit → Beeld eigenschappen → Onder de tab geometrie, controleer dan de voxel grootte. In dit protocol, X = 0,99, Y = 0,99, en Z = 4).
Let op: Leid X en Y door de scanfield dimensie te delen door de pixel resolutie. Z is de dikte van elke plak.
Opmerking: Het resultaat van deze datasets kan worden gepresenteerd als maximale projectie films.
Opmerking: Tracking analyse vereist het volledig karakteriseren van de cellulaire activiteiten en interacties om hun functie in vivo te begrijpen. Gedetailleerde instructies van cell tracking met behulp van ter plaatse beschikbare functie in de software kan worden gevonden in het protocol in referentie 15.
Let op: Er zijn vele manieren van het kwantificeren leukocyten migratie, waarvan de details zijn te vinden in het overzichtsartikel in referentie 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakt gebruik van een op maat gemaakte oorhuid imaging platform, zie figuur 1. Verschillende functies van dit platform zijn specifiek ontworpen om beeldvorming te vergemakkelijken, terwijl fysiologische instellingen behoud. Het plaatsen van het oor op de verwarmde koperen platform niet oefent slechts het oor bij een fysiologische temperatuur van 35 ° C, maar isoleert het oor van onvermijdelijke bewegingen als gevolg van ademhaling. De toevoeging van een metalen clip op de koperen platform creëert een spleet te voorkomen dat de houder dekglaasje gewicht uitoefent op het oor, waardoor een ononderbroken bloedstroom handhaven. Het podium platform is ook ontworpen om een verwarmingselement dat de muis bij 37 ° C gedurende de beeldvorming procedure zal handhaven tegemoet te komen.
Het dekglaasje houder (figuur 2) is ontworpen om het dekglaasje wordt bevestigd op de metalen houder met behulp van vacuüm grease. Het dekglaasje houder is aangesloten op een stand die flexibele aanpassing in de verticale en horizontale as met behulp van de adapter. Op deze manier kan de gebruiker eerst nauwkeurig de positie van de dekglaasje over het oor te passen en vervolgens die positie vast te stellen door de schroeven van de adapter.
In dit protocol beschrijven we het gebruik van magneten ischemie en reperfusie simuleren. Figuur 3b toont vertegenwoordiger uitzicht op de oren voor en direct na ischemie. Onder fysiologische omstandigheden, kunnen grote bloedvaten macroscopisch zichtbaar. Het knijp effect van de magneten tijdelijk stelen de bloedstroom, die kan worden waargenomen door een voorbijgaand effect blancheren (zwarte pijl) als de magneten worden verwijderd.
In dit bewijs wordt beeldvorming gericht op de rand van de ischemische zone (Figuur 3c (Figuur 3d). Dit zorgt voor belangrijke mijlpalen voor intravitale imaging studies en helpt om de samenhang tussen de onafhankelijke experimenten te houden.
Uit de gegevens blijkt dat, in reactie op een IR insult, infiltreren neutrofielen uitgang in het interstitium van intacte bloedvaten langs de rand van de ischemische zone migreren naar de verwonding (figuur 3d en Film 1). We verwachten een vertraagde respons van neutrofielen migreren in het interstitium in vergelijking met andere inflammatiemodellen vanwege het ontbreken van levensvatbare perfusie bloedvaten in eerdere tijdstippen na reperfusie. Om volledig te karakteriseren deze celheid op activiteiten kan volgen cel analyse worden gebruikt om de functie in vivo te begrijpen. Snelheid, gemiddelde verplaatsing en chemotactische index zijn enkele van de mogelijke uitlezingen die worden verkregen uit de cel volgen analyse.
Figuur 1. Schematische weergave van een op maat gemaakte Ear Skin Stage voor intravitale Multiphoton Imaging. (a) Bovenaanzicht van het oor afbeeldeenheid met afmetingen. (b) Frontale mening en afmetingen. Merk op dat de koperen plaat dikker aan de zijkanten, om stabiliteit aan het platform, en dunner in het midden, om contactgebied minimaliseren de huid, zodat een ononderbroken bloedstroom wanneer het oor over de rand van de spleet wordt gevouwen en rustte op het platform. (c) Zij aanzicht van de gebogen houder die pinnen langs de feedback sonde. De verwarming pad kan zijnop het platform middels plakband vast (niet getoond). Gewijzigd ten opzichte van Li et al., Nat Protoc 2012 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Het ontwerp van de Coverslip Holder; Side en Top View. Het dekglaasje houder houdt het dekglaasje in een vaste positie en vermindert z-drift. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De IR model. (A) Schematische weergave van de plaatsing van magneten. (B) (C) Schematische voorstelling van het oor die de regio afgebeeld met betrekking tot waar de magneet was geplaatst. (D) Maximale intensiteit-z geprojecteerd snapshots van een time-lapse-sequentie toont neutrofielen infiltratie post-reperfusie in een LysM-eGFP muis. Verstreken tijd weergegeven in hh: mm formaat. Schaal Bar: 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1. neutrofielen Recruitment in IR Injury. Een time-lapse sequentie van maximale projectie toont neutrofielen (groen) infiltratie in reactie op reperfusie in LysM-eGFP albino muis oor huid na 1,5 uur van ischemie. Bij eerdere tijdstippen, het gebrek aanEvans blauw-signaal (rood) geeft tijdelijke vaartuig occlusie na ischemie. Collageen (blauw, tweede harmonische generatie). Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betekenis
IR is een van de belangrijkste oorzaken van de huid decubitus. De vroege stadia (I en II) van decubitus beschrijft de toestand van de menselijke huid (ten opzichte van de onderliggende onderhuidse weefsels en spieren). Echter, is een begrip van de immunologische etiologie ontbreekt nog. Hier presenteren we een eenvoudige en robuuste IR model op muis oorhuid om deze in te lopen. We simuleren ischemie door het klemmen van de muis oor tussen twee magneten en vervolgens de studie van de downstream-immuunreacties na het verwijderen van de magneet (reperfusie). Door het gebruik van magneten om een constante druk op elk oor voor een vaste periode van tijd te genereren, het induceren van ischemie, zijn we in staat om de reproduceerbaarheid en de samenhang tussen experimenten te waarborgen.
De sterkte van deze niet-invasieve IR model ligt ook in het vermogen aan te tonen, in real time, in vivo immuunrespons met behulp van een gevestigde model van intravitale Imaging oorhuid, die meer stabiliteit biedt tijdens de beeldvorming ten opzichte van de huid flank procedure. Een aantal van de huidige huid flank modellen betrekken chirurgische procedures die het immuunsysteem landschap van de huid 4 kunnen veranderen. Daarnaast is de beeldvorming van de huid flank zich presenteert een technische uitdaging, omdat de luchtwegen bewegingen kan bijdragen aan-motion-gerelateerde artefacten tijdens beeldvorming 5,6. Onze huidige model omzeilt deze problemen.
Naast het bestuderen van de fysiologische respons van immuuncellen op IR, kan dit model ook voor pathofysiologische instellingen zoals diabetes mellitus, waarbij diabetes IR schade verergeren door verhoogde oxidatieve stress. Inzicht in de immuunrespons zal bijdragen aan het inzicht van wondgenezing.
kritische stappen
Zodra de muis wordt onder narcose wordt thermoregulatie aangetast en de kerntemperatuur van het lichaam daalt drastisch. Om te voorkomen dat de sthermia, uitwendige verhitting is essentieel voor de lichaamstemperatuur op 37 ° C te houden. Het oor, distaal ligt ten lichaamskern, fysiologisch koeler door 1-2 ° C en moet 35 ° C gehouden. Deze consistentie in de verwarming zal ook zorgen voor reproduceerbare read-outs van de cel dynamiek. Tegelijkertijd moet de verwarming worden gecontroleerd dat de muis niet oververhitting gedurende de gehele duur van de anesthesie.
Het gebruik van albino muizen (BALB / c en C57BL / 6-C 2J) voor alle huid imaging studies wordt sterk aangeraden om-geïnduceerde pigment vlekjes verwondingen te voorkomen. Als albino muizen zijn niet beschikbaar, het verminderen van het laservermogen tijdens beeldacquisitie kan het probleem voor gepigmenteerde muizen te verlichten. Echter, kan verdere optimalisatie nodig zijn, als een verminderde diepte van penetratie kan leiden tot een slechtere uitkomst acquisitie.
Het oor huid is zeer delicaat; Daarom moet ervoor worden gezorgd dat alle omstandigheden te voorkomen dateen ontsteking kunnen veroorzaken. Voorbeelden van onjuist technieken omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de volgende: 1) waardoor de ontharingscrème voor een overmatige hoeveelheid tijd gedurende welke aanbevolen; 2) het aanbrengen van overmatige wrijving op de oor wanneer het brengen van het oor door de spleet van het oor imaging platform of wanneer het losmaken van het oor van de afplakband; en 3) oververhitting het oor, als gevolg van een defecte verwarmingsinstallatie of een misplaatste temperatuurfeedback probe aan te opnemen omgevingstemperatuur plaats van de muis kerntemperatuur.
Wijzigingen en problemen oplossen
De meeste problemen met betrekking tot het oor bereidingsprocedure is eerder opgenomen 8. Indien het oor wordt afgebeeld op een later tijdstip na reperfusie, kan het oor zwellen dan de 0,5-mm gat gemaakt door de metalen clip aan de dikte van het oor (figuur 1) plaats. In dit scenario, het plaatsen van het dekglaasje over het oorkan de doorbloeding, dat is duidelijk wanneer de macroscopisch zichtbare bloedvaten verdwijnen uit het zicht belemmeren. Dit moet worden voorkomen door een grotere afstand tussen het dekglaasje houder en de koperen platform. Dit kan op twee manieren, hetzij door de hoogte van het dekglaasje houder (figuur 2) handmatig instellen of door een dikkere metalen clip.
Beperkingen van de Techniek
In dit protocol, gebruikten we Evans blauw naar de locatie van de ischemische zone te bepalen, aangezien lekkage van Evans blauw in het interstitium vormt de grens van de ischemische zone op vroege tijdstippen na ischemie. Evans Blue wordt vaak gebruikt als een bloedvat labelingmiddel. Echter, onder ontstekingsaandoeningen, vasculaire integriteit ernstig aangetast. Dit resulteert in lekkage van Evans Blue in het interstitium. In dit model zien we een drastisch verlies van contrast tussen bloedvaten en interstitium snel na reperfusie. Als zodanig, in studies waar de leukocyten-endotheel interacties betrokken zijn, raden we experimenteren met andere bloedvat etikettering agenten van verschillende grootte (bijvoorbeeld dextranen, enz.).
toekomstige toepassingen
Naast gebruikmaking van de LysM-eGFP muis om te demonstreren hoe neutrofielen reageren op huid IR, kan dit model worden gebruikt voor het bestuderen van andere leukocyt reacties, zowel infiltreren (monocyten) en resident interstitiële (macrofagen) leukocyten. Dit model kan ook worden uitgebreid tot andere studies naar bloed en lymfatische integriteit alsook leukocyt-endotheel interacties na IR blessure. Gekoppeld aan het vermogen om collageen SHG signalen door MP-IVM visualiseren, zou het interessant zijn om collageen integriteit controleren na IR of tijdens wondgenezing. Samengevat, hebben we het opzetten van een niet-invasieve, robuuste model van IR voor intravitale beeldvorming om immuunreacties in de muis oor huid te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
