Summary
Detta protokoll beskriver induktion av en ischemi-reperfusion (IR) modell på mus öra huden med hjälp av magnetfastspänning. Med hjälp av en specialbyggd intravital imaging modell, studerar vi in vivo inflammatoriska svar efter reperfusion. Logiken bakom utvecklingen av denna teknik är att utöka förståelsen för hur leukocyter svarar på huden IR skada.
Introduction
Ischemi-reperfusionsskada (IRI) uppstår när det finns en övergående hypoxi på grund av obstruktion av blodflödet (ischemi) följt av en efterföljande återsyresättningen av vävnader (reperfusion). I huden är ischemi-reperfusion (IR) tros vara en av de bidragande faktorerna till patofysiologin av trycksår, där långvarig sängläge predisponerar sjukhuspatienter långsiktiga skada. Hos dessa patienter, både hud och underliggande muskler ständigt utsätts för vikt påtryckningar över områden av benig framträdande, vilket resulterar i lokala skador som, om den lämnas obehandlad, kan bli nekrotiska en.
Skadorna är inblandade i en IRI är tvåfaldig. Under ischemi, ocklusionen av blodkärl leder till en drastisk droppe syreavgivning till vävnaderna. Detta resulterar i en minskning av ATP och pH, som inaktiverar ATPaser involverade i cellulär metabolism. I sin tur, cellulära kalciumnivåer spik, och stressade eller skadade calnar genomgå apoptos eller nekros 2. Frisläppandet av intracellulära innehåll eller skador i samband molekylära mönster (DAMP), som HMGB1, bidrar till det inflammatoriska svaret 3. Den andra insult inträffar under reperfusion. Fastän syre och pH-nivåer återställs under reperfusion, resulterar detta i generering av reaktiva syreradikaler (ROS), vilket leder till oxidation av intracellulära lipider, DNA och proteiner. Följaktligen pro-inflammatoriska mediatorer aktiveras, vilket sätter igång en sekundär inflammatorisk respons som innebär rekrytering av immunceller till inflammationsstället 2. Medan kaskad av biokemiska händelser som leder fram till det inflammatoriska svaret har varit väl beskrivits, är den rumsliga och tidsmässiga regleringen av immuncellaktiviteter inte väl förstådd.
Här beskriver vi en robust IR modell på mus öra huden med hjälp av enkel magnet fastspänning. Tillsammans med multifoton intravital imaging (MP-IVM), vietablerat en modell för att studera de inflammatoriska svar in vivo som inträffar efter reperfusion sker. Logiken bakom utvecklingen och användningen av denna teknik är att försöka förstå hur både interstitiella och infiltrerande celler svarar på IR i realtid.
Befintliga modeller av IR med hjälp av klämteknik på huden flanken är mycket invasiva, eftersom de kräver kirurgisk implantation av stålplattor i huden flanken, vilket gör dem mindre än idealisk för immunologiska studier 4. En liknande icke-invasiv klämtekniken har beskrivits i mushud flanken 5,6. Men på grund av införlivandet av intravital avbildning komponent i detta förfarande, i stället valde vi örat huden som den inriktade IR stället, eftersom det kringgår rörelser på grund av andning och erbjuder stabilitet under avbildning 7,8. Dessutom leukocyt delmängder som spänner interstitium är identiska mellan öron huden och huden flank, även omsiffror och proportioner kan variera något nio. Således representerar örat huden en perfekt avbildning plats.
Dessutom har de flesta data som hämtas från dessa IRI modeller är begränsade till makroskopiska utvärderingar (betygs av sår) och mikroskopiska analyser av endpoint inflammatoriska indikatorer 10. Med hjälp av denna modell, är i realtid visualisering av cellulära responsen hos neutrofiler efter reperfusion i huden av en fluorescerande reporter musaktiverade. En tidigare publicerad intravital öra imaging modell utnyttjas 8 med ytterligare modifieringar (figurer 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som handlar med levande djur genomfördes i enlighet med all relevant användning djur och riktlinjer vård och förordningar.
1. Val av fluorescerande reporter möss
- Använd 6- till 12 veckor gamla LysM-EGFP 11 möss (ingen förkärlek för antingen män eller kvinnor).
Obs: Användningen av olika cellspecifika fluorescerande reporter möss möjliggör visualisering av olika immunceller in vivo. I denna stam, cirkulerande neutrofiler (GFP hi celler), cirkulerande monocyter (GFP lo celler), och dermala makrofager (GFP lo celler) kan visualiseras. Med bildparametrar används, kommer endast de ljusa signaler från GFP-positiva neutrofiler detekteras.
Notera: En lista med immun-cellspecifika fluorescerande reporter musstammar som är lämpliga för denna typ av hud imaging study kan hittas i referens 8.
Obs: Det rekommenderas att albino möss användas för avbildning, som pigmenTED-möss är mer benägna att fotoskador. Detta beror på att den pigmenterade örat huden är mycket känsligare för laserinducerad fläck (indikativ för vävnadsbränning). Som ett resultat, kan observeras neutrofil rekrytering och ackumulering även under steady state 8,12. - Håll mössen i specifika patogenfria (SPF) förhållanden med 12-timmars ljus-mörker cykler.
2. Mus Anestesi
- Söva musen med en intraperitoneal injektion av ketamin-xylazin (8 pl g -1 kroppsvikt), som består av en blandning av 15 mg ml -1 ketamin och 1 mg ml -1 xylazin upplösas i sterilt vatten.
- Placera musen på en värmedyna för att bibehålla sin kroppstemperatur vid 37 ° C under hela förfarandet beredning. Kolla tillräckliga anestesi genom att observera en avsaknad av en tå nypa reflex.
Obs: Efter den första timmen, kommer efterföljande kvartal doser av narkosmedel måste ges subkutant end kommer att pågå i cirka 0,5 timmar vardera. Ryckningar av whiskers eller svansen kan också indikera att anestesi avta och att en top-up krävs. - Använd ögon smörjmedel på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
3. Depilation
- Applicera försiktigt hårborttagningskräm till de övre två tredjedelar av rygg musen örat med bomull-tip applikatorer.
- Vänta 2-3 minuter innan du tar bort krämen med hjälp av våt bomull-tip applikatorer i en grundlig men skonsamt sätt.
Obs: Låt inte hårborttagningskräm att stanna på musen öra för länge, eftersom det kan orsaka inflammation 13,14.
4. Induktion av ischemi och reperfusion skada
- Använd guldpläterade, N42-grade neodymmagneter, 12 mm diameter x 2 mm tjocka, och med en Gauss rating på ca 3000 för att inducera ischemi i musen örat huden.
Obs: I detta fall, dimpled yta av magneterna deNOtes dess nordpol. - Slot magneterna i deras individuella plaststyrningar.
Obs: Plast guide tjänar till att underlätta placering och separation av höghållfasta magneter. På grund av deras starka magnetiska kraft ännu lågt motstånd mot brott, inte placera enskilda magneter i närheten av varandra eller med andra metaller. Brott och splittring kan uppstå om de drar i riktning mot varandra. - Placera den första (dorsala) magnet på sådant sätt att endast kanten är i kontakt med den andra (ventrala) magnet (figur 3a)
Obs: Detta hindrar magneterna från att snäppa samman innan de har rätt läge. - Placera båda magneterna så att den ventrala magneten ligger platt på örat (figur 3a).
Obs! Innan ischemi induceras, se till att musen hålls vid 37 ° C och att tillräcklig anestesi upprätthålls (se steg 2,2). - När klar, försiktigt låta magneterna möts (figur 3a Notera: För avbildningsändamål, klämma endast hälften av örat så att kan observeras en IR och icke-IR-området.
- Efter 1,5 h ischemi, ta bort magneterna genom att vrida magneterna bort från varandra med hjälp av plaststyrningar, så reperfusion ske.
Anmärkning: Försiktighet måste vidtas för att förhindra öronen veckar när magneterna är placerade. Ofullständig ischemi är uppenbar om makroskopiskt synliga kärlen större blodåter BEGJUTA omedelbart (dvs blod omedelbart fyller kärlen) efter magneterna avlägsnas. Även reperfusion inte sker omedelbart efter avlägsnandet av magneter är blodkärl ocklusion endast övergående. Som sådan, är det absolut nödvändigt att förbereda musörat för avbildning av så snabbt som möjligt.
5. Injektion av blodkärlsmärkningsmedel
- Omedelbart efter magnet avlägsnande, administrera intravenöst (via retroorbital eller injektion i svansvenen) Evans blue (10 mg ml -1i PBS eller saltlösning; 1 mikroliter g -1 kroppsvikt) eller ett annat blodkärl märkningsmedel val.
Obs! Innan injektion, se till att det finns tillräckligt anestesi fortfarande upprätthålls genom att utföra mild tå nypa.
6. Placering av örat på Imaging plattformen
- Klipp 2 bitar av maskeringstejp 1,5 cm i längd och 1,8 cm i bredd.
- Låt limmet sidor att hålla ihop samtidigt som man lämnar ca 1 mm av lim längs dess bredd.
- Skär maskeringstejpen i två, på längden, för att tillgodose dess placering i skåran på örat plattformen.
- Sätt denna maskeringstejp ungefär halvvägs genom slitsen, så att limsidan vänd uppåt.
- Placera musen på värmedyna, så att örat som skall avbildas är bredvid maskeringstejpremsan.
- Genom att använda två PBS-fuktade bomulls-tip applikatorer, tryck försiktigt örat mot klisterremsan.
- Med användning av remsan som en guide, föra musöratgenom slitsen samtidigt justera musen närmare mot scenen.
- För att ta bort tejp, först lägga en droppe PBS för att minska vidhäftning av bandet.
- Separera musörat från maskeringstejpen så försiktigt som möjligt med hjälp av en fin pensel.
- Platta örat mot örat plattform genom att försiktigt rulla en fuktig bomull-tip applikator över örat.
- Sätt en droppe PBS under täck (som hålls i läge på täckhållaren med fett, Figur 2) och försiktigt placera den över örat. Fyll på med mer PBS vid behov.
Obs! Täckhållaren ökar stabiliteten under avbildning. - Infoga den rektala temperaturen sonden och anslut kablarna till värmesystemet enligt tillverkarens instruktioner.
Obs: Ställ in temperaturen i kroppen värmedynan till 37 ° C och örat steget plattform till 35 ° C.
7. multifotonmikroskop Setupp och Imaging parametrar
Obs: Detta protokoll använder en enda stråle, multifotonmikroskop med en avstämbar (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W vid 800 nm, pulslängd på 140 fs, 80 MHz repetitionsfrekvens) med en 20X vatten objektiv (NA = 1,0) för intravital imaging studier.
- Öppna bildprogram.
- Rikta lasern enligt tillverkarens anvisningar.
- Justera excitationsvåglängden till 950 nm.
Obs: GFP och Evans blue kan vara samtidigt exciteras vid 950 nm. - Att förhandsgranska, använd följande inställningar: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 bildpunkters upplösning och en skanningsfrekvens på 800 Hz i en enda rad skanning. Klicka på "Preview".
- Växla dämparen (laser) makt. Se till att alla viktiga signaler plockas upp utan att utsätta bildfältet till stora mängder lasereffekt, som kan inducera värmeskador.
Obs: Starta på en låg dämpare makt och öka om signal är svagt. Som neutrofiler kommer att vara frånvarande från interstitium vid tidig tidpunkter efter reperfusion, kan makrofager användas som en mätare för att bestämma den minimala effekt som krävs, eftersom den förstnämnda är dimmer än neutrofiler.
Obs: Om det här steget är att göras för första gången, justera inställningarna i det icke-ischemiska zonen, där intakt kärl integritet förväntas och kommer att underlätta inställningen av dämparen makt. I efterföljande experiment, dessa inställningar kräver inte mycket ändring om lasereffekten är instabil. - Justera PMT-inställningarna.
Obs: Kontrollera med tillverkaren för maximal optimala förstärkningsspänningen för PMT. Inställning av PMT spänning utöver det rekommenderade tröskel kommer att resultera i en högre signal-till-brus-förhållande. Den allmänna rekommendationen är att ställa in PMT förstärkningsspänningen till rekommenderade tröskeln och öka dämpningsstyrka som behövs bör signalen vara alltför svag. - Välj en avbildningsregion som är i nära anslutning tillkanten av ischemi, som kännetecknas av massiv Evans blue läckage.
- Samla GFP och Evans blåa signaler med hjälp av 525/50 bandpass (BP) och 655/40 BP filter, respektive. För andra harmonisk generation (SHG) signaler av kollagenfibrer inom huden facket, använd en 475/42 BP filter.
- Skapa en mapp för att spara bilderna i ett format som är kompatibelt för den tillgängliga bildanalysmjukvara.
- Att förvärva, använda följande inställningar: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 bildpunkters upplösning, och en skanningsfrekvens 400 Hz i en enda rad skanning.
- En 100-um z-stack med en stegstorlek av 4 | j, m kan förvärvas upprepade gånger över tiden, på 1 min intervaller, för att övervaka neutrofil infiltration.
Obs: Speciellt för leukocyter (t.ex. neutrofiler) med en högre migrationshastighet, ett intervall som är längre än en minut kan resultera i svårigheter under spårning cellanalys. I detta fall, kan användaren antingen minska tjockleken hos växelströmsförvärvs stack eller öka skanningsfrekvensen.
Obs: Medan den erforderliga förvärvs stapeln av den ischemiska zonen kan verka mindre som ett resultat av kompressionen (alternativt kännetecknas av en högre SHG intensitet), kommer efterföljande reperfusion resulterar i massiv inflammation som orsakar örat för att svälla. Betydande drift i Z-riktningen förväntas. Som sådan, är det nödvändigt att förvärva en stor z-stack för att rymma drift. - Hela bild, fylla på PBS och vatten regelbundet för att hålla örat fuktig och objektivlinsen nedsänkt i vatten.
Obs: Ett typiskt experiment varar vanligtvis 2-4 timmar. Beroende på experimentell design, och i kombination med en väl kontrollerad anestesi regim, förlängning av avbildning är möjlig.
8. Avsluta experimentet
- Euthanize musen genom kvävning med koldioxid enligt institutets Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) procedures.
Obs: avliva alltid musen genom godkända metoder som bestäms av institutionens regler, föreskrifter och riktlinjer. Om det behövs upprepad avbildning, hålla musen på värmedyna tills anestesi avtar. När musen har återfått tillräcklig medvetenhet och är mobil, tillbaka musen till sin bur.
9. Bildanalys
Notera: Data som genereras från bild experimentet kan visualiseras genom olika mjukvarupaket.
- Öppna bildanalys programvara.
- Under Surpass läget importera filen (Open → välja en fil i en mapp → Klicka på "öppna").
- Redigera pseudo färger om standardfärger inte gäller (Redigera → Display inställning → Under fliken kanalen välja önskad färg från färgpaletten).
- Justera ljusstyrka, kontrast och bakgrund (Redigera → Display Justering → Växla Max och Min värden). Se till att filen dimensioner är korrekta (egenskaper Redigera → Bild → Under fliken geometri, kontrollera voxelstorleken. I detta protokoll, X = 0.99, Y = 0,99 och Z = 4).
Obs: Härleda X och Y genom att dividera scanfield dimension genom upplösning pixel. Z är tjockleken mellan varje skiva.
Obs: Resultatet av dessa datamängder kan presenteras som maximal projektion filmer.
Obs: Spårning analys krävs för att fullständigt karaktärisera de cellulära aktiviteter och interaktioner för att förstå deras funktion in vivo. Detaljerade instruktioner för cellspårning med spot funktion som är tillgänglig i programvaran kan hittas i protokollet i referens 15.
Obs: Det finns många sätt att kvantifiera leukocytmigrering, enligt vad som finns i översiktsartikeln i referens 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll använder en specialbyggd örat hud imaging plattform, som visas i figur 1. Flera funktioner i denna plattform är särskilt utformade för att underlätta avbildning bibehållen fysiologiska inställningar. Placera örat på den uppvärmda mässing plattformen bibehåller inte bara örat vid en fysiologisk temperatur av 35 ° C, men den isolerar också örat från oundvikliga rörelser på grund av andning. Tillsatsen av en metallklämma på mässings plattformen skapar en lucka för att förhindra att täckhållaren från att utöva vikt på örat, och därigenom bibehålla oavbruten blodflödet. Scenen plattformen är också utformad för att rymma en värmedyna som kommer att bibehålla den mus vid 37 ° C under hela avbildningsproceduren.
Täckhållaren (Figur 2) är utformad så att täck att fästas på metallhållaren med hjälp av vakuum grease. Täckglas hållaren är förbunden med ett stativ som medger flexibel justering i de vertikala och horisontella axlar med hjälp av adaptern. På detta sätt kan användaren först noggrant justera läget av täck över örat och därefter fixa det läge genom att dra åt skruvarna på adaptern.
I detta protokoll har vi beskrivit användningen av magneter för att simulera ischemi och reperfusion. Figur 3b visar representativa utsikt över öronen före och omedelbart efter ischemi. Under fysiologiska betingelser, kan större blodkärl visualiseras makroskopiskt. Kläm effekten av magneterna beror tillfälligt blodflödet, vilket kan observeras av en övergående blanche effekt (svart pil) när magneterna avlägsnas.
I detta särskilda demonstration, är avbildning fokuserad på kanten av den ischemiska zonen (figur 3c (figur 3d). Detta skapar viktiga landmärken för intravital imaging studier och bidrar till att upprätthålla konsekvens mellan oberoende försök.
Data visar att, som svar på en IR förolämpning, infiltrerande neutrofiler utgång i interstitium från intakta blodkärl kantar kanten av den ischemiska zonen och migrerar till skadestället (Figur 3d och Film 1). Vi förväntar oss en fördröjd respons av neutrofiler som migrerar in i interstitium i jämförelse med andra inflammationsmodeller på grund av brist av livsdugliga perfusion blodkärl vid tidigare tidpunkter efter reperfusion. För att till fullo karakterisera dessa cellUlar aktiviteter, kan cell spårning analys användas för att förstå deras funktion in vivo. Hastighet, menar förskjutning, och kemotaktiskt index är några av de potentiella avläsningar som kan erhållas från cell spårning analys.
Figur 1. Schematisk beskrivning av en skräddarsydd Ear Skin Scen Intravital multifoton Imaging. (a) Uppifrån av öron avbildning scenen med dess dimensioner. (b) Frontal vy och dimensioner. Notera att mässingsplattan är tjockare vid sidorna, för att ge stabilitet till plattformen, och tunnare i mitten, för att minimera kontaktytan med huden, säkerställa oavbruten blodflöde när örat är vikt över kanten av slitsen och vilade på plattformen. (c) från sidan för den krökta hållare som stift ner återkopplingssonden. Värmedyna kan varafast på plattformen med hjälp av maskeringstejp (ej visad). Modifierad från Li et al., Nat Protoc 2012 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Konstruktion av Cover Hållare; Side och uppifrån. Täckhållaren håller täck i ett fast läge och därmed minskar z-drift. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. IR Model. (A) Schematiskt diagram som visar positioneringen av magneter. (B) (C) Schematisk bild av örat visar regionen avbildas i förhållande till den plats där magneten hade placerats. (D) maximal intensitet z-projicerade bilder från en time-lapse-sekvens som visar neutrofila infiltration efter reperfusion i en LysM-EGFP mus. Förfluten tid visas i hh: mm format. Skala Bar: 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Neutrofil Rekrytering IR skada. En time-lapse-sekvens av maximal projektion visar neutrofiler (grön) infiltration som svar på reperfusion i LysM-EGFP albinomöss örat huden efter 1,5 h av ischemi. Vid tidigare tidpunkter, bristen påEvans blue signal (röd) indikerar tillfällig kärlocklusion efter ischemi. Kollagen (blå, andra harmoniska generationen). Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelse
IR är en av de främsta orsakerna till huden trycksår. De tidiga stadier (I och II) av trycksår beskriva tillståndet av den mänskliga huden (i jämförelse med de underliggande subkutana vävnader och muskler). Dock saknas fortfarande en förståelse för immunologiska etiologi. Här presenterar vi en enkel och robust IR modell mus öra huden för att ta itu med denna brist. Vi simulerar ischemi genom att klämma musen öra mellan två magneter och därefter studera nedströms immunsvar efter magnet borttagning (reperfusion). Genom att använda magneter för att generera ett konstant tryck på varje öra för en bestämd tidsperiod, inducera ischemi, har vi möjlighet att säkerställa reproducerbarhet och överensstämmelse mellan experiment.
Styrkan i denna icke-invasiv IR modell ligger också i dess förmåga att visa i realtid, in vivo immunsvar genom att använda en väl etablerad modell av intravital imaging av öronhuden, som erbjuder mer stabilitet under avbildning jämfört med huden flanken förfarandet. Några av de nuvarande hud flank modeller innebär kirurgiska ingrepp som kan ändra immun landskapet i huden 4. Dessutom avbildning huden flanken själv utgör en teknisk utmaning, eftersom andningsrörelser kan bidra till rörelserelaterade artefakter under avbildning 5,6. Vår nuvarande modell kringgår dessa problem.
Förutom att studera de fysiologiska reaktioner av immunceller till IR, kan denna modell också tillämpas på patofysiologiska inställningar som diabetes mellitus, där diabetes kan förvärra IR skada genom ökad oxidativ stress. Förstå immunsvar kommer att bidra till en förståelse för sårläkning.
kritiska steg
När musen är under narkos, är termo nedsatt och kroppstemperaturen sjunker drastiskt. För att förhindra hypothermia, är extern värme viktigt att bibehålla kroppstemperaturen vid 37 ° C. Örat, som ligger distalt till kroppen kärnan, är fysiologiskt svalare med 1-2 ° C och måste hållas vid 35 ° C. Denna konsekvens i uppvärmning kommer också att säkerställa reproducerbara avläsningar av celldynamik. Samtidigt, måste värmesystem kontrolleras för att säkerställa att musen inte är över-värmning utmed hela längden av anestesi.
Användningen av albino möss (BALB / c och C57BL / 6-C 2J) för alla hud imaging studier rekommenderas att undvika pigment inducerad fläckskador. Om albinomöss inte är tillgängliga, kan minska lasereffekt under bildtagning lindra problemet för pigmenterade möss. Emellertid kan ytterligare optimering behövas, eftersom ett reducerat djup av vävnadspenetration kan resultera i en sämre förvärvs utfall.
Öron hud är mycket känslig; därför måste man vara försiktig för att undvika några omständigheter somkan orsaka inflammation. Exempel på felaktig tekniker inkluderar, men är inte begränsade till, följande: 1) lämnar hårborttagningskräm på för en alltför lång tid över vad som rekommenderas, 2) använda onödigt friktion på örat när de sätter örat genom skåran i örat imaging plattform eller när du tar bort örat från maskeringstejpen; och 3) överhettning örat, antingen på grund av en felaktig värmesystem eller en felplacerad temperaturåterkopplings sond som kan spela in omgivningstemperatur i stället för mus kärntemperaturen.
Ändringar och felsökning
De flesta av felsökningen om förfarandet örat preparatet har tidigare noterat åtta. Om örat avbildas vid en senare tidpunkt efter reperfusion, kan örat svälla bortom 0,5-mm gap som skapas av metallklämman för att inrymma tjockleken hos örat (figur 1). I detta scenario, placeringen av täck över öratkan hindra blodflödet, vilket är uppenbart när de makroskopiskt synliga blodkärl försvinner ur sikte. Detta måste undvikas genom att skapa en större spalt mellan täckglas hållaren och mässings plattformen. Detta kan göras på två sätt, antingen genom att manuellt justera höjden på täckglas hållaren (fig 2) eller genom användning av en tjockare metallklämma.
Begränsningar av tekniken
I detta protokoll använde vi Evans blue för att bestämma läget för den ischemiska zonen, eftersom läckage av Evans-blått i interstitium markerar gränsen av den ischemiska zonen vid tidiga tidpunkter efter ischemi. Evans Blue används ofta som ett blodkärl märkningsmedel. Men under inflammatoriska tillstånd, vaskulär integritet allvarligt äventyras. Detta resulterar i läckage av Evans Blue in i interstitium. I denna modell, ser vi en drastisk förlust av kontrasten mellan blodkärl och interstitium snart efter reperfusion. Som sådan, i studies där leukocyter-endothelial interaktioner är inblandade, rekommenderar vi att experimentera med andra medel blodkärls märkning av olika storlekar (t.ex. dextraner, osv.).
framtida tillämpningar
Förutom att utnyttja LysM-EGFP musen för att visa hur neutrofiler svarar på huden IR, kan denna modell också användas för att studera andra leukocyt svar både i infiltrera (monocyter) och bosatt interstitiell (makrofager) leukocyter. Denna modell kan också utvidgas till andra studier som undersökt blod och lymfatisk integritet samt leukocyter-endothelial interaktion efter en IR-skada. Tillsammans med förmågan att visualisera kollagen som SHG signaler via MP-IVM, skulle det också vara intressant att följa kollagen integritet efter IR eller under sårläkning. Sammanfattningsvis har vi inrättat en icke-invasiv, robust modell IR för intravital avbildning för att studera immunsvar i musen örat huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
