Summary
Ce protocole décrit l'induction d'un modèle d'ischémie-reperfusion (IR) sur la peau de l'oreille de la souris utilisant un aimant de serrage. En utilisant un modèle d'imagerie intravitale sur mesure, nous étudions dans les réponses inflammatoires in vivo post-reperfusion. La raison derrière le développement de cette technique est d'étendre la compréhension de la façon dont les leucocytes réagissent aux blessures IR de la peau.
Introduction
Ischémie- reperfusion (IRI) se produit lorsqu'il y a une hypoxie transitoire due à l'obstruction de la circulation sanguine (ischémie), suivie d'une ré-oxygénation subséquente des tissus (reperfusion). Dans la peau, l'ischémie-reperfusion (IR) est considéré comme l'un des facteurs qui contribuent à la physiopathologie des ulcères de pression, où alitement prolongé prédispose les patients hospitalisés à long terme à des blessures. Chez ces patients, la peau et les muscles sous - jacents sont constamment exposés à la pression du poids exercé sur les zones de proéminence osseuse, entraînant des blessures localisées qui, l' absence de traitement, peuvent devenir nécrotiques 1.
Les dommages-intérêts impliqués dans un IRI sont doubles. Au cours de l'ischémie, l'occlusion des vaisseaux sanguins conduit à une baisse drastique de l'apport d'oxygène aux tissus. Cela se traduit par une diminution de l'ATP et du pH, qui inactive les ATPases impliqués dans le métabolisme cellulaire. À son tour, le taux de calcium cellulaires pic et stressés ou c endommagésaunes subissent une apoptose ou une nécrose 2. La libération des contenus intracellulaires ou des motifs moléculaires de dommages associés (DAMP), comme la HMGB1, contribue à la réponse inflammatoire 3. La seconde insulte se produit lors de la reperfusion. Bien que les niveaux d'oxygène et de pH sont restaurées au cours de la reperfusion, cela se traduit par la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), ce qui conduit à l'oxydation des lipides intracellulaires, l'ADN et les protéines. Par conséquent, les médiateurs pro-inflammatoires sont activés, ce qui déclenche une réponse inflammatoire secondaire qui comprend le recrutement de cellules immunitaires vers le site inflammatoire 2. Alors que la cascade d'événements biochimiques conduisant à la réponse inflammatoire a été bien décrite, la régulation spatiale et temporelle des activités de cellules immunitaires ne sont pas bien compris.
Ici, nous décrivons un modèle IR robuste sur la peau de l'oreille de souris à l'aide de serrage simple aimant. Couplé avec l'imagerie multiphotonique intravitale (MP-IVM), nousmis en place un modèle pour étudier les réponses inflammatoires in vivo qui se produisent après la reperfusion a lieu. La raison derrière le développement et l'utilisation de cette technique est d'essayer de comprendre comment les cellules interstitielles et infiltrant répondent à IR en temps réel.
Les modèles existants de IR en utilisant la technique de serrage sur le flanc de la peau sont très envahissantes, car elles nécessitent l'implantation chirurgicale de plaques d'acier dans le flanc de la peau, ce qui les rend moins-que-idéal pour les études immunologiques 4. Une technique de serrage non invasive similaire a été décrite dans le flanc de souris 5,6 de la peau. Toutefois, en raison de l'incorporation de la composante d'imagerie intravitale dans cette méthode, nous avons choisi à la place de la peau de l' oreille que le site IR ciblé, car il évite les mouvements dus à la respiration et offre la stabilité lors de l' imagerie 7,8. Par ailleurs, les sous-ensembles de leucocytes qui enjambent interstitiel sont identiques entre la peau de l'oreille et le flanc de la peau, même si lales nombres et les proportions peuvent varier légèrement 9. Ainsi, la peau de l'oreille représente un site d'imagerie idéal.
En outre, la plupart des données récupérées à partir de ces modèles IRI sont limités à des évaluations macroscopiques (de classement des ulcères) et les analyses microscopiques des indicateurs inflammatoires d'extrémité 10. En utilisant ce modèle, la visualisation en temps réel de la réponse cellulaire des neutrophiles après la reperfusion dans la peau d'une souris rapporteur fluorescent est activé. Un modèle d'imagerie de l' oreille intravitale précédemment publié est utilisé 8 avec des modifications supplémentaires (figures 1, 2).
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Protocol
Toutes les expériences portant sur des animaux vivants ont été menées conformément à toute utilisation des animaux et directives pertinentes et règlements soins.
1. Choix de la souris de rapporteur fluorescent
- Utilisez 6 à 12 semaines d'âge LysM-eGFP 11 souris (pas de préférence pour les mâles ou les femelles).
Remarque: L'utilisation de diverses souris rapporteurs fluorescents spécifiques de cellules permet la visualisation des différentes cellules du système immunitaire in vivo. Dans cette souche, neutrophiles circulants (cellules GFP hi), monocytes circulants (cellules GFP lo), et les macrophages dermiques (cellules GFP lo) peuvent être visualisés. Avec les paramètres d'imagerie utilisés, seuls les signaux lumineux de neutrophiles GFP-positives seront détectées.
Remarque: La liste des souches de souris rapporteur fluorescent spécifique immunitaire cellulaire appropriés pour ce type d'étude d'imagerie de la peau peut être trouvé dans la référence 8.
Remarque: Il est fortement recommandé que les souris albinos être utilisé pour l'imagerie, comme pigmensouris ted sont plus enclins à photovieillissement. Ceci est parce que la peau de l'oreille pigmentée est beaucoup plus sensible à la moucheture induite par laser (indicative de la combustion des tissus). En conséquence, le recrutement de neutrophiles et de l' accumulation peuvent être observées , même pendant l'état stationnaire 8,12. - Gardez les souris (SPF) conditions exempts d'agents pathogènes spécifiques avec des cycles de lumière-obscurité de 12 h.
2. Souris Anesthésie
- Anesthésier la souris avec une injection intraperitoneale de kétamine-xylazine (8 pi g -1 de poids vif), composé d'un mélange de 15 mg ml -1 kétamine et 1 mg ml -1 xylazine dissous dans de l' eau stérile.
- Placer la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 ° C pendant toute la procédure de préparation. Vérifiez anesthésie suffisante en observant l'absence d'un réflexe orteil de pincement.
Remarque: Après la première heure, les doses trimestre ultérieures de l'anesthésie devra être administré par voie sous cutanée d'uned dure environ 0,5 h chacun. Le tic des moustaches ou la queue peut également indiquer que l'anesthésie porte au large et qu'un top-up est nécessaire. - Utilisez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Épilation
- Appliquer soigneusement la crème dépilatoire aux deux tiers supérieurs de l'oreille dorsale de la souris en utilisant des applicateurs coton-pointe.
- Attendre 2 - 3 min avant de retirer la crème à l'aide humide applicateurs coton-pointe d'une manière approfondie, mais en douceur.
Remarque: Ne laissez pas la crème d'épilation pour rester sur l'oreille de la souris pendant trop longtemps, car il peut induire une inflammation 13,14.
4. L'induction de l'ischémie et de reperfusion
- Utilisez plaqués or, N42 grade aimants en néodyme, diamètre 12 mm x 2 mm d'épaisseur, et avec une cote Gauss d'environ 3,000 pour induire une ischémie dans la peau de l'oreille de la souris.
Remarque: Dans ce cas, la face alvéolée des aimants Denotes son pôle nord. - Fente les aimants dans leurs guides individuels en plastique.
Remarque: Le guide en plastique sert à faciliter la mise en place et la séparation des aimants à haute résistance. En raison de leur force magnétique forte encore faible résistance à la rupture, ne pas placer des aimants individuels à proximité les uns aux autres ou à d'autres métaux. Chutes et écaillage peuvent se produire s'ils tirent vers l'autre. - Positionner le premier (dorsal) aimant de telle sorte que seul le bord est en contact avec la seconde (ventrale) aimant (figure 3a)
Note: Ceci empêche les aimants de assemblant avant qu'ils aient été correctement positionné. - Positionner les aimants de telle sorte que l'aimant ventrale repose à plat sur l'oreille (figure 3a).
Remarque: Avant l'ischémie est induite, veiller à ce que la souris est maintenue à 37 ° C et que l'anesthésie suffisante est maintenue (voir l'étape 2.2). - Une fois prêt, laissez soigneusement les aimants sont réunis (Figure 3a Remarque: Pour des fins d'imagerie, serrer seulement la moitié de l'oreille de telle sorte qu'un IR et non IR région peuvent être observées.
- Après 1,5 h d'ischémie, retirer les aimants en tordant les aimants loin de l'autre en utilisant les guides en plastique, ce qui permet reperfusion d'avoir lieu.
Note: Des précautions doivent être prises pour empêcher les oreilles de froissement lorsque les aimants sont placés. Ischémie incomplète est évident que si les vaisseaux sanguins majeurs visibles macroscopiquement re-perfuser immédiatement ( par exemple, le sang remplit les récipients immédiatement) après que les aimants sont enlevés. Bien que la reperfusion ne se produit pas immédiatement après l'enlèvement des aimants, l'occlusion des vaisseaux sanguins est seulement transitoire. En tant que tel, il est impératif de préparer l'oreille de la souris pour l'imagerie le plus rapidement possible.
5. L'injection d'agents de marquage des vaisseaux sanguins
- Immédiatement après le retrait de l' aimant, administrer par voie intraveineuse (via rétro-orbitaire ou injection dans la veine de la queue) bleu Evans (10 mg mL -1dans du PBS ou une solution saline; 1 ul -1 g de poids corporel) ou un autre agent de marquage des vaisseaux sanguins de choix.
Remarque: Avant l'injection, veiller à ce que l'anesthésie suffisante est toujours maintenue en effectuant douce toe pincement.
6. Mise en place de l'oreille sur la plate-forme d'imagerie
- Couper 2 morceaux de ruban adhésif de 1,5 cm de longueur et 1,8 cm de largeur.
- Laisser les côtés adhésifs à coller ensemble tout en laissant environ 1 mm d'adhésif le long de sa largeur.
- Couper le ruban de masquage en deux, la longueur, pour tenir compte de son emplacement dans la fente sur la plate-forme de l'oreille.
- Insérer cette ruban de masquage à mi-chemin à travers la fente, de telle sorte que le côté adhésif vers le haut.
- Placez la souris sur le coussin chauffant, de telle sorte que l'oreille à imager est à côté de la bande de ruban de masquage.
- En utilisant deux PBS-humidifiées applicateurs coton-pointe, appuyez doucement sur l'oreille contre la bande adhésive.
- En utilisant la bande comme un guide, mettre l'oreille de la sourisà travers la fente tout en ajustant simultanément la souris plus vers la scène.
- Pour retirer le ruban adhésif, ajouter d'abord une goutte de PBS pour réduire l'adhésivité de la bande.
- Séparer l'oreille de la souris à partir de la bande de masquage aussi doucement que possible à l'aide d'un pinceau fin.
- Aplatir l'oreille contre la plate-forme de l'oreille en faisant rouler doucement un coton humide applicateur-dessus de l'oreille.
- Mettre une goutte de PBS sous la lamelle (qui est maintenu en position sur le support de lamelle en utilisant la graisse; Figure 2) et placez- le doucement sur l'oreille. Compléter avec plus PBS si nécessaire.
Remarque: Le support de lamelle augmente la stabilité lors de l'imagerie. - Insérez la sonde de température rectale et connecter les fils du système de chauffage selon les instructions du fabricant.
Remarque: Réglez la température du coussin chauffant du corps à 37 ° C et la plate-forme de scène de l'oreille à 35 ° C.
7. multiphotonique Microscope Setet paramètres d'imagerie
Remarque: Ce protocole utilise un seul faisceau, multiphotonique microscope avec un accordable (680 - 1.080 nm) Ti: laser Sa (3,3 W à 800 nm, longueur d'impulsion de 140 fs; taux de répétition de 80 MHz) avec un objectif 20X d'eau (NA = 1.0) pour les études d'imagerie intravitale.
- Ouvrez le logiciel d'imagerie.
- Aligner le laser selon les instructions du fabricant.
- Ajuster la longueur d'onde d'excitation à 950 nm.
Note: GFP et bleu Evans peuvent être simultanément excité à 950 nm. - Pour aperçu, utilisez les paramètres suivants: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 pixels de résolution et une fréquence de balayage de 800 Hz dans un balayage de ligne unique. Cliquez sur "Aperçu".
- Basculer l'atténuateur (laser) pouvoir. Veiller à ce que tous les signaux essentiels sont captés sans exposer le champ d'imagerie à des quantités excessives de la puissance du laser, ce qui peut induire des dommages de la chaleur.
Remarque: Commencez à une puissance atténuateur bas et augmenter si le Signal est faible. Comme neutrophiles seront absents de l'interstitium au moment début pointe post-reperfusion, les macrophages peuvent être utilisés comme une jauge pour déterminer la puissance minimale requise, car les premiers sont plus sombres que les neutrophiles.
Remarque: Si cette étape doit être fait pour la première fois, réglez les paramètres dans la zone non ischémique, où il est prévu l'intégrité vasculaire intact et facilitera le réglage de la puissance de l'atténuateur. Dans des expériences ultérieures, ces paramètres ne nécessitent pas beaucoup de modification à moins que la puissance du laser est instable. - Réglez les paramètres PMT.
Remarque: Vérifiez auprès du fabricant pour la tension de gain optimal maximal pour le PMT. Réglage de la tension de PMT au-delà du seuil recommandé se traduira par un rapport signal-bruit. La recommandation générale est de régler la tension de gain PMT au seuil recommandé et d'augmenter la puissance de l'atténuateur nécessaire devrait être le signal trop faible. - Sélectionner une zone d'image qui se trouve à proximité dele bord de l'ischémie, caractérisée par une fuite de bleu Evans massif.
- Recueillir des signaux bleu Evans utilisant 525/50 passe-bande (BP) et 655/40 filtres BP, respectivement GFP et. Pour le second signal harmonique (SHG) de fibres de collagène dans le compartiment dermique, utilisez un filtre 475/42 BP.
- Créez un dossier pour enregistrer les images dans un format qui est compatible avec le logiciel d'analyse d'image disponible.
- Pour acquérir, utiliser les paramètres suivants: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 pixels de résolution, et un balayage de fréquence 400 Hz dans un balayage de ligne unique.
- A 100 um z pile avec une taille de pas de 4 um peut être obtenue de manière répétée dans le temps, à 1 min d'intervalle, pour contrôler l'infiltration neutrophile.
Remarque: en particulier pour les leucocytes (par exemple, les neutrophiles) avec une vitesse de migration plus élevée, un intervalle qui est supérieur à 1 min peut entraîner des difficultés lors de l' analyse de suivi de la cellule. Dans ce cas, l'utilisateur peut soit réduire l'épaisseur de l'acquisition pile ou augmenter la fréquence de balayage.
Remarque: Lors de la pile d'acquisition requise de la zone ischémique peut apparaître plus faible en raison de la compression (en variante, caractérisée par une intensité plus élevée SHG), la reperfusion subséquente entraîne une inflammation massive qui provoque l'oreille à la houle. des dérives importantes dans la direction Z sont attendus. En tant que tel, l'acquisition d'un grand z-stack est nécessaire de tenir compte de la dérive. - Tout au long de l'imagerie, compléter le PBS et de l'eau régulièrement pour garder l'oreille humide et l'objectif immergé dans l'eau.
Remarque: Une expérience typique dure habituellement pendant 2 - 4 h. En fonction de la conception expérimentale, et couplé avec un régime d'anesthésie bien contrôlée, prolongeant ainsi la durée de formation d'image est possible.
8. Finalisation l'expérience
- Euthanasier la souris par le dioxyde de carbone asphyxie selon la Commission institutionnelle soin et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'institution procedures.
Remarque: euthanasier toujours la souris par des méthodes approuvées tel que déterminé par les règles, les règlements et les directives de l'institution. Si l'imagerie répétée est nécessaire, garder la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce que l'anesthésie se dissipe. Une fois que la souris a repris conscience suffisante et est mobile, retourner la souris dans sa cage.
Analyse 9. Image
Note: Les données générées à partir de l'expérience d'imagerie peuvent être visualisés par différents progiciels.
- Ouvrir le logiciel d'analyse d'imagerie.
- Sous Surpass mode, importer le fichier (Open → sélectionner un fichier dans le dossier souhaité → Cliquez sur "ouvrir").
- Modifier les couleurs de pseudo si les couleurs par défaut ne sont pas applicables (de réglage Modifier → Affichage → Sous l'onglet de canal, sélectionnez la couleur souhaitée dans la palette de couleurs).
- Réglez la luminosité, le contraste, et le fond (Réglage Modifier → Affichage → Basculer Max et valeurs Min). Veiller à ce que les dimensions du fichier sont corrects (Edition → Propriétés de l'image → Sous l'onglet de géométrie, vérifier la taille de voxel. Dans ce protocole, X = 0,99, Y = 0,99, et Z = 4).
Remarque: Derive X et Y en divisant la dimension scanfield par la résolution de pixel. Z est l'épaisseur entre chaque tranche.
Remarque: La sortie de ces ensembles de données peuvent être présentées comme des films de projection maximale.
Remarque: l' analyse de suivi est nécessaire pour caractériser complètement les activités cellulaires et les interactions afin de comprendre leur fonction in vivo. Des instructions détaillées de suivi des cellules en utilisant la fonction de place disponible dans le logiciel peuvent être trouvées dans le protocole de référence 15.
Note: Il existe de nombreuses façons de quantifier la migration des leucocytes, dont les détails peuvent être trouvés dans l'article de revue de référence 16.
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Representative Results
Ce protocole utilise une peau de l' oreille plate - forme d'imagerie intégré personnalisé, comme représenté sur la figure 1. Plusieurs caractéristiques de cette plate-forme sont spécifiquement conçus pour faciliter l'imagerie tout en conservant les paramètres physiologiques. Placer l'oreille sur la plate-forme en laiton chauffé maintient non seulement l'oreille à une température physiologique de 35 ° C, mais il isole aussi l'oreille des mouvements inévitables dues à la respiration. L'ajout d'un élément métallique sur la plate-forme de laiton crée un espace pour empêcher le support de lamelle d'exercer sur le poids de l'oreille, ce qui maintient le flux sanguin continu. La plate-forme de scène est également conçue pour recevoir un coussin chauffant permettant de maintenir la souris à 37 ° C tout au long de la procédure d'imagerie.
Le porte-lamelle (figure 2) est conçu pour permettre la lamelle couvre -objet à fixer sur le support métallique à l'aide d'grea à videproprement parler. Le support de lamelle est reliée à un support qui permet un réglage souple dans les axes vertical et horizontal à l'aide de l'adaptateur. De cette façon, l'utilisateur peut ajuster la première avec précision la position de la lamelle sur l'oreille et fixer ensuite cette position en serrant les vis de l'adaptateur.
Dans ce protocole, nous avons décrit l'utilisation d'aimants pour simuler l'ischémie et la reperfusion. Figure 3b affiche des vues représentatives des oreilles avant et immédiatement après l' ischémie. Dans des conditions physiologiques, les principaux vaisseaux sanguins peuvent être visualisées de manière macroscopique. L'effet de pincement des aimants tiges temporairement le flux sanguin, ce qui peut être observé par un effet de blanchissement transitoire (flèche noire) lorsque les aimants sont enlevés.
Dans cette démonstration particulière, l' imagerie est centrée sur le bord de la zone ischémique (Figure 3c (Figure 3d). Cela crée des repères importants pour les études d'imagerie intravitale et aide à maintenir la cohérence entre les expériences indépendantes.
Les données montrent que, en réponse à une insulte IR, infiltrant neutrophiles sortie dans l'interstitium des vaisseaux sanguins intacts alignant le bord de la zone ischémique et de migrer vers le site de la lésion (figure 3d et Movie 1). Nous nous attendons à une réponse retardée de neutrophiles qui migrent dans l'espace interstitiel, par rapport à d'autres modèles d'inflammation en raison d'un manque de perfusant viables vaisseaux sanguins à des instants précédents de post-reperfusion. Pour caractériser ces cellulesactivités Ular, analyse de suivi des cellules peuvent être utilisées pour comprendre leur fonction in vivo. Vitesse, signifie le déplacement, et l'indice chimiotactique sont quelques-uns des lecture-outs potentiels qui peuvent être obtenus à partir de l'analyse de suivi de la cellule.
Figure 1. Schéma d'une étape d' oreille peau sur mesure pour Intravitale multiphotonique Imaging. (a) Vue d'en haut de la scène de l' imagerie de l' oreille avec ses dimensions. (b) Vue frontale et dimensions. A noter que la plaque de laiton est plus épaisse sur les côtés, afin d'assurer la stabilité de la plate-forme et plus mince au milieu, pour réduire au minimum la surface de contact avec la peau, assurant la circulation sanguine sans interruption lorsque l'oreille est pliée sur le bord de la fente, et reposé sur la plate-forme. vue (c) latérale du support incurvé qui épingle en bas de la sonde de rétroaction. Le coussin chauffant peut êtrefixé sur la plate-forme en utilisant du ruban adhésif (non représenté). Modifié à partir de Li et al., Nat Protoc 2012 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Conception du titulaire Coverslip; Side et Top View. Le titulaire de la lamelle détient la lamelle dans une position fixe et réduit z dérive ainsi. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Le modèle IR. (A) Représentation schématique montrant le positionnement des aimants. (B) (C) Schéma de l'oreille montrant la région imagée par rapport à l' endroit où l'aimant avait été placé. (D) Intensité maximale z-projetée instantanés d'une séquence time-lapse montrant l' infiltration de neutrophiles post-reperfusion dans une souris LysM-eGFP. Le temps écoulé indiqué dans le format hh: mm. Barre d'échelle: 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1. neutrophiles Recrutement dans IR blessures. Une séquence time-lapse de projection maximale montrant neutrophiles (vert) infiltration en réponse à la reperfusion dans LysM-eGFP peau de l'oreille de la souris albinos après 1,5 h d'ischémie. Aux points de temps antérieurs, l'absence deEvans signal bleu (rouge) indique l'occlusion du vaisseau temporaire après l'ischémie. Collagène (bleu, génération de seconde harmonique). S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Importance
IR est l'une des principales causes des ulcères de pression de la peau. Les premiers stades (I et II) des escarres de décubitus décrivent l'état de la peau humaine (par rapport aux tissus sous-cutanés sous-jacents et les muscles). Cependant, la compréhension de l'étiologie immunologique fait encore défaut. Ici, nous présentons un modèle simple et robuste IR sur la peau de l'oreille de la souris afin de combler cette lacune. Nous simulons l'ischémie par serrage l'oreille de la souris entre deux aimants et par la suite étudier les réponses immunitaires en aval après le retrait de l'aimant (reperfusion). En utilisant des aimants pour générer une pression constante sur chaque oreille pendant une période de temps déterminée, ce qui induit une ischémie, nous sommes en mesure d'assurer la reproductibilité et la cohérence entre les expériences.
La force de ce modèle IR non-invasive réside aussi dans sa capacité à démontrer, en temps réel, dans les réponses immunitaires in vivo en utilisant un modèle bien établi de imagin intravitaleg de la peau de l'oreille, ce qui offre une plus grande stabilité lors de l'imagerie par rapport à la procédure de flanc de la peau. Certains des modèles de flanc de la peau en cours impliquent des interventions chirurgicales qui peuvent modifier le paysage immunitaire de la peau 4. En outre, l' imagerie du flanc de la peau se présente un défi technique, car les mouvements respiratoires peuvent contribuer à des artefacts liés à mouvement-pendant l' imagerie 5,6. Notre modèle actuel contourne ces problèmes.
En plus d'étudier les réactions physiologiques des cellules immunitaires à IR, ce modèle peut également être applicable aux paramètres physiopathologiques comme le diabète sucré, où le diabète peut aggraver une blessure IR par une augmentation du stress oxydatif. Comprendre les réponses immunitaires contribuera à la compréhension de la cicatrisation des plaies.
étapes critiques
Une fois que la souris sous anesthésie, la thermorégulation est réduite et la température du corps de base diminue de façon drastique. Pour éviter hypotHermia, chauffage externe est indispensable pour maintenir la température centrale du corps à 37 ° C. L'oreille, situé distalement à l'âme du corps, est physiologiquement refroidisseur par 1 - 2 ° C et doit être maintenue à 35 ° C. Cette cohérence dans le chauffage assurera également reproductibles lecture-outs de la dynamique des cellules. Dans le même temps, le système de chauffage doit être vérifié pour s'assurer que la souris ne survole pas de chauffage pendant toute la durée de l'anesthésie.
L'utilisation de souris albinos (BALB / c et C57BL / 6-C 2J) pour toutes les études d'imagerie de la peau est fortement recommandé d'éviter les blessures de mouchetures induite pigment. Si les souris albinos ne sont pas disponibles, ce qui diminue la puissance du laser lors de l'acquisition de l'image peut atténuer le problème pour les souris pigmentées. Cependant, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire, car une profondeur réduite de pénétration des tissus peut entraîner un mauvais pronostic d'acquisition.
La peau de l'oreille est très délicate; par conséquent, des précautions doivent être prises pour éviter les circonstances quipeut causer une inflammation. Des exemples de mauvaises techniques comprennent, mais sans s'y limiter, ce qui suit: 1) en laissant la crème épilatoire pendant une quantité de temps excessive au-dessus de ce qui est recommandé; 2) l'application d'un frottement excessif sur l'oreille de l'oreille lors de la mise à travers la fente de la plate-forme d'imagerie de l'oreille ou lors du retrait de l'oreille de la bande de masquage; et 3) la surchauffe de l'oreille, que ce soit en raison d'un système de chauffage défectueuse ou mal placée une rétroaction sonde de température qui peut être d'enregistrer la température ambiante au lieu de la température au cœur de la souris.
Modifications et dépannage
La plupart du dépannage se rapportant à la procédure de préparation de l' oreille a été précédemment énumérés 8. Si l'oreille est imagée à une post-reperfusion de point de temps plus tard, l'oreille peut gonfler au - delà de l'écart de 0,5 mm créé par le clip en métal pour accueillir l'épaisseur de l'oreille (Figure 1). Dans ce scénario, le placement de la lamelle couvre-objet au-dessus de l'oreillepeut gêner la circulation sanguine, ce qui est évident lorsque les vaisseaux sanguins visibles macroscopiquement disparaissent de la vue. Ceci doit être évité en créant un plus grand écart entre le support de lamelle et la plate-forme en laiton. Cela peut se faire de deux façons, soit en réglant manuellement la hauteur du support de lamelle (figure 2) ou en utilisant une pince métallique plus épaisse.
Limites de la technique
Dans ce protocole, nous avons utilisé le bleu d'Evans pour déterminer l'emplacement de la zone ischémique, depuis la fuite du bleu Evans dans l'interstitium marque la limite de la zone ischémique à des moments précoces post-ischémie. Bleu Evans est couramment utilisé comme agent de marquage des vaisseaux sanguins. Cependant, dans des conditions inflammatoires, l'intégrité vasculaire est gravement compromise. Cela se traduit par une fuite de bleu d'Evans dans l'interstitium. Dans ce modèle, on observe une perte drastique de contraste entre les vaisseaux sanguins et interstitium peu de temps après reperfusion. En tant que tel, à rudies où les interactions leucocytaires-endothélial sont impliqués, nous vous recommandons d' expérimenter avec d' autres agents de marquage des vaisseaux sanguins de tailles différentes (par exemple, les dextranes, etc.).
Les futures applications
Outre l'utilisation de la souris LysM-eGFP pour démontrer comment les neutrophiles répondent aux IR de la peau, ce modèle peut également être utilisé pour l'étude d'autres réponses leucocytaires, tant en infiltrant (monocytes) et interstitiels résident (macrophages) leucocytes. Ce modèle peut également être étendu à d'autres études portant sur le sang et l'intégrité lymphatique, ainsi que les interactions leucocytaires-endothélial après une blessure IR. Couplé avec la possibilité de visualiser le collagène sous forme de signaux SHG par MP-IVM, il serait également intéressant de surveiller l'intégrité du collagène après IR ou pendant la cicatrisation. En résumé, nous avons mis en place, un modèle robuste non-invasive de l'IR pour l'imagerie intravitale afin d'étudier les réponses immunitaires de la peau de l'oreille de la souris.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
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