Summary
Este protocolo describe la inducción de un modelo de isquemia-reperfusión (IR) en la piel de oreja de ratón utilizando sujeción imán. El uso de un modelo de imágenes intravital hecha a la medida, se estudia en las respuestas inflamatorias in vivo después de la reperfusión. La razón fundamental detrás del desarrollo de esta técnica es extender la comprensión de cómo los leucocitos responden a la lesión IR piel.
Introduction
la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) se produce cuando hay una hipoxia transitoria debido a la obstrucción del flujo sanguíneo (isquemia) seguido de una posterior re-oxigenación de los tejidos (reperfusión). En la piel, se cree que por isquemia-reperfusión (IR) para ser uno de los factores que contribuyen a la fisiopatología de las úlceras por presión, en reposo en cama prolongado predispone a los pacientes del hospital a largo plazo a las lesiones. En estos pacientes, la piel y los músculos subyacentes están constantemente expuestos a la presión ejercida sobre el peso áreas de prominencia ósea, lo que resulta en lesiones localizadas que, si no se tratan, pueden llegar a ser necrótico 1.
Los daños que participan en un IRI son dos. Durante la isquemia, la oclusión de los vasos sanguíneos conduce a una caída drástica de la entrega de oxígeno a los tejidos. Esto se traduce en una disminución de ATP y del pH, que inactiva ATPasas implicadas en el metabolismo celular. A su vez, los niveles de calcio celulares pico, y destacaron oc dañadosells sufren apoptosis o necrosis 2. La liberación del contenido intracelular o patrones moleculares asociados de daños (DAMP), al igual que la HMGB1, contribuye a la respuesta inflamatoria 3. El segundo insulto se produce durante la reperfusión. Aunque los niveles de oxígeno y pH se restauran durante la reperfusión, esto da como resultado la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que conduce a la oxidación de los lípidos intracelulares, el ADN y las proteínas. En consecuencia, los mediadores pro-inflamatorios se activan, lo que pone en marcha una respuesta inflamatoria secundaria que implica el reclutamiento de células inmunes en el sitio inflamatorio 2. Mientras que la cascada de eventos bioquímicos que conducen a la respuesta inflamatoria ha sido bien descrita, la regulación espacial y temporal de las actividades de las células inmunes no son bien entendidos.
A continuación, describimos un modelo IR robusta en la piel de oreja de ratón usando sencilla sujeción del imán. Junto con las imágenes multifotónica intravital (MP-IVM), queestablecido un modelo para estudiar las respuestas inflamatorias in vivo que se producen después de la reperfusión se lleva a cabo. La razón de ser del desarrollo y el uso de esta técnica es tratar de comprender cómo tanto las células intersticiales e infiltrantes responden a IR en tiempo real.
Los modelos existentes de IR utilizando la técnica de sujeción en el flanco de la piel son altamente invasivo, ya que requieren la implantación quirúrgica de placas de acero en el flanco de la piel, haciendo que sean menos que ideales para estudios inmunológicos 4. Una técnica de sujeción no invasivo similar se ha descrito en el 5,6 ratón piel flanco. Sin embargo, debido a la incorporación del componente de imagen intravital en este método, en vez elegimos la piel de la oreja como el sitio IR específica, ya que evita los movimientos debidos a la respiración y ofrece una estabilidad durante la formación de imágenes 7,8. Por otra parte, subconjuntos de leucocitos que abarcan el intersticio son idénticos entre la piel de la oreja y el flanco de la piel, aunque elnúmeros y proporciones pueden variar ligeramente 9. Por lo tanto, la piel de la oreja representa un sitio de formación de imágenes ideal.
Además, la mayoría de los datos recuperados de estos modelos IRI están limitados a evaluaciones macroscópicas (clasificación de las úlceras) y análisis microscópicos de indicadores de inflamación de punto final 10. Usando este modelo, la visualización en tiempo real de la respuesta celular de los neutrófilos después de la reperfusión en la piel de un ratón reportero fluorescente está habilitada. Un modelo de formación de imágenes oído intravital publicado anteriormente se utiliza 8 con modificaciones adicionales (Figuras 1, 2).
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Protocol
Todos los experimentos se ocupan de animales vivos se realizaron de acuerdo a todo el uso de animales relevante y directrices y regulaciones de cuidado.
1. Elección de ratones indicador fluorescente
- Utilizar de 6 a 12 semanas de edad LysM-eGFP 11 ratones (sin preferencia por machos o hembras).
Nota: El uso de varios ratones reportero fluorescente de células específicas permite la visualización de diferentes células inmunes in vivo. En esta cepa, los neutrófilos circulantes (células GFP hi), monocitos (células GFP LO), y los macrófagos (células dérmicas GFP lo) que circula puede ser visualizado. Con los parámetros de imagen empleadas, sólo se detectará las señales luminosas de neutrófilos GFP-positivas.
Nota: Una lista de las cepas fluorescente indicador de ratón inmune específica de células adecuadas para este tipo de estudio por imágenes de la piel se puede encontrar en la Referencia 8.
Nota: Es muy recomendable que los ratones albinos ser utilizado para obtener imágenes, como pigmentaciónratones TED son más propensos a fotodaño. Esto es porque la piel de la oreja pigmentada es mucho más sensible a speckling inducida por láser (indicativo de la quema de tejido). Como resultado, el reclutamiento de neutrófilos y la acumulación se pueden observar incluso durante el estado estacionario 8,12. - Mantener los ratones en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) con ciclos de luz-oscuridad de 12 h.
2. Ratón Anestesia
- Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina-xilazina (8 l g-1 de peso corporal), compuesto por una mezcla de 15 mg ml -1 de ketamina y 1 mg ml -1 xilacina disuelto en agua estéril.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 ° C durante todo el procedimiento de preparación. Compruebe si hay suficientes anestesia mediante la observación de una ausencia de un reflejo del dedo del pie sujetador.
Nota: Después de la primera hora, tendrán que ser administrado por vía subcutánea una dosis cuartos posteriores de anestesiad tendrá una duración de aproximadamente 0,5 horas cada una. La contracción de los bigotes o la cola también puede indicar que la anestesia se está desvaneciendo y que se requiere una recarga. - Utilice lubricante oftálmica en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
3. Depilación
- Con cuidado aplique crema depilatoria a los dos tercios superiores de la oreja dorsal del ratón, utilizando aplicadores de algodón con punta.
- Espere durante 2 - 3 minutos antes de retirar la crema usando aplicadores con punta de algodón mojado de una manera minuciosa pero delicada.
Nota: No permita que la crema de depilación para alojarse en la oreja de ratón durante demasiado tiempo, ya que puede inducir inflamación 13,14.
4. Inducción de isquemia y lesión por reperfusión
- Utilice, N42 grado imanes de neodimio chapados en oro de 12 mm de diámetro x 2 mm de espesor y con una calificación de aproximadamente 3.000 Gauss para inducir isquemia en la piel de oreja de ratón.
Nota: En este caso, la cara con hoyuelos de los imanes DenoTES su polo norte. - Slot los imanes en sus guías de plástico individuales.
Nota: La guía de plástico sirve para facilitar la colocación y la separación de los imanes de alta resistencia. Debido a su fuerte fuerza magnética sin embargo, una baja resistencia a la rotura, no coloque imanes individuales en estrecha proximidad entre sí o con otros metales. La rotura y astillamiento pueden ocurrir si retiran uno hacia el otro. - Coloque el primer imán (dorsal) de tal manera que sólo el borde está en contacto con la segunda (ventral) imán (Figura 3a)
Nota: Esto evita que los imanes de romperse juntos antes de que se han colocado correctamente. - Coloque ambos imanes de tal manera que el imán quede plano ventral en la oreja (Figura 3a).
Nota: Antes de que se indujo la isquemia, asegúrese de que el ratón se mantiene a 37 ° C y se mantiene que la anestesia suficiente (véase el paso 2.2). - Una vez listo, permiten cuidadosamente los imanes se unen (Figura 3a Nota: Para fines de imagen, utilice únicamente la mitad de la oreja de manera que se puede observar un IR y la región no-IR.
- Después de 1,5 horas de isquemia, quitar los imanes retorciendo los imanes de distancia el uno del otro usando las guías de plástico, lo que permite que tenga lugar la reperfusión.
Nota: Se debe tener cuidado para evitar que se arruguen los oídos cuando se colocan los imanes. Isquemia incompleta es evidente si los vasos sanguíneos principales macroscópicamente visibles-perfuse re inmediatamente (es decir, la sangre llena los vasos inmediatamente) después se retiran los imanes. Aunque la reperfusión no se produce inmediatamente después de la eliminación de los imanes, la oclusión de los vasos sanguíneos sólo es transitoria. Como tal, es imperativo para preparar la oreja de ratón para obtener imágenes de la mayor rapidez posible.
5. La inyección de agentes de marcaje Vaso sanguíneo
- Inmediatamente después de retirar el imán, administrar por vía intravenosa (a través de retro-orbital o inyección en la vena de la cola) de azul de Evans (10 mg ml -1en PBS o solución salina; 1 l g-1 de peso corporal) u otro agente de marcaje de los vasos sanguíneos de elección.
Nota: Antes de la inyección, asegúrese de que la anestesia suficiente todavía se mantiene mediante la realización de pellizco del dedo del pie suave.
6. Colocación de la oreja en la Plataforma de Imagen
- Corte 2 pedazos de cinta adhesiva de 1,5 cm de longitud y 1,8 cm de ancho.
- Permitir a los lados adhesivos se peguen entre sí dejando aproximadamente 1 mm de adhesivo a lo largo de su anchura.
- Cortar la cinta de enmascarar en dos, a lo largo, para dar cabida a su colocación dentro de la ranura en la plataforma de la oreja.
- Inserte esta cinta de enmascarar a mitad de camino a través de la hendidura, de manera que el lado adhesivo hacia arriba.
- Coloque el ratón sobre el cojín eléctrico, de tal manera que el oído en ser fotografiado está al lado de la tira de cinta adhesiva.
- Mediante el uso de dos aplicadores de algodón levemente humedecido con PBS, presionar suavemente la oreja contra la tira adhesiva.
- El uso de la tira como una guía, llevar el oído de ratóna través de la ranura mientras se ajusta simultáneamente el ratón más cerca hacia el escenario.
- Para retirar la cinta adhesiva, añadir primero una gota de PBS para reducir la adhesividad de la cinta.
- Se separa la oreja de ratón de la cinta de enmascarar lo más suavemente posible utilizando un pincel fino.
- Aplanar la oreja a la plataforma de la oreja haciendo rodar suavemente un aplicador con punta de algodón húmedo sobre el oído.
- Ponga una gota de PBS debajo de la cubreobjetos (que se mantiene en posición en el soporte de cubreobjetos con grasa; Figura 2) y suavemente se coloca sobre la oreja. Rellene con PBS más si es necesario.
Nota: El titular cubreobjetos aumenta la estabilidad durante la exploración. - Insertar la sonda de temperatura rectal y conectar los cables al sistema de calefacción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Nota: Ajuste la temperatura de la resistencia de calentamiento del cuerpo a 37 ° C y la plataforma fase oreja a 35 ° C.
7. Multifotónica Microscopio Sety los parámetros de imagen
Nota: Este protocolo utiliza un solo haz, microscopio multifotónica con un sintonizable (680 - 1.080 nm) Ti: Sa láser (3,3 W a 800 nm; longitud de pulso de 140 fs; tasa de repetición de 80 MHz) con un objetivo 20X agua (NA = 1.0) para los estudios de imagen intravital.
- Abra el software de imágenes.
- Alinear el láser de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Ajustar la longitud de onda de excitación a 950 nm.
Nota: GFP y azul de Evans pueden ser simultáneamente excitado a 950 nm. - Para vista previa, utilice los siguientes valores: 500 m 2 scanfield, 505 x 505 píxeles de resolución y una frecuencia de barrido de 800 Hz en una sola línea de exploración. Haga clic en "Vista previa".
- Cambiar la potencia de atenuador (láser). Asegúrese de que todas las señales esenciales son recogidos sin exponer el campo de la imagen a cantidades excesivas de la potencia del láser, que pueden inducir el daño por calor.
Nota: Comience en un atenuador de baja potencia y aumentar si el signal es tenue. Como los neutrófilos estarán ausentes del intersticio en el momento temprano señala post-reperfusión, los macrófagos se pueden usar como un indicador para determinar la potencia mínima necesaria, ya que los primeros son más débiles que los neutrófilos.
Nota: Si este paso se va a hacer por primera vez, ajustar la configuración de la zona no isquémica, donde se espera que la integridad vascular intacto y facilitará el ajuste de la potencia atenuador. En experimentos posteriores, estos ajustes no requieren mucha modificación a menos que la potencia del láser es inestable. - Ajuste la configuración de PMT.
Nota: Consulte con el fabricante para la tensión máxima ganancia óptima para el PMT. Ajuste de la tensión PMT más allá del umbral recomendado resultará en una mayor relación de señal a ruido. La recomendación general es fijar el voltaje PMT ganar al umbral recomendado y para aumentar la potencia atenuador según sea necesario debe ser la señal demasiado tenue. - Seleccionar una región de imagen que se encuentra en las proximidades deel borde de la isquemia, caracterizado por masiva fuga de azul de Evans.
- Recoger las buenas prácticas agrarias y las señales de color azul Evans utilizando 525/50 de paso de banda (BP) y 655/40 filtros BP, respectivamente. Para las señales de segunda generación armónica (SHG) de las fibras de colágeno dentro del compartimento dérmica, utilizar un filtro de 475/42 BP.
- Crear una carpeta para guardar las imágenes en un formato que es compatible para el software de análisis de imágenes disponibles.
- Adquirir, utilice los siguientes valores: 500 m 2 scanfield, 505 x 505 píxeles de resolución y un análisis de frecuencia de 400 Hz en una sola línea de exploración.
- A 100 m z-pila con un tamaño de paso de 4 micras, se puede adquirir repetidamente en el tiempo, a intervalos de 1 min, para controlar la infiltración de neutrófilos.
Nota: Especialmente para los leucocitos (por ejemplo, neutrófilos) con una velocidad más alta migratoria, un intervalo que es mayor que 1 min puede dar lugar a dificultades durante el análisis de rastreo celular. En este caso, el usuario puede reducir o bien el espesor de la acquisition pila o aumentar la frecuencia de barrido.
Nota: Mientras que la pila de adquisición requerido de la zona isquémica puede aparecer más pequeña, como resultado de la compresión (como alternativa que se caracteriza por una intensidad SHG superior), la reperfusión posterior resultará en la inflamación masiva que hace que la oreja se hinche. Se espera que las derivas importantes en la dirección Z. Como tal, la adquisición de un gran z-pila es necesario para dar cabida a la deriva. - A lo largo de la proyección de imagen, llenar completamente la PBS y agua regularmente para mantener el oído húmedo y la lente del objetivo sumergido en el agua.
Nota: Un experimento típico por lo general dura de 2 - 4 h. Dependiendo del diseño experimental, y se acopla con un régimen de anestesia bien controlado, que se extiende la duración de la formación de imágenes es posible.
8. Terminación del Experimento
- La eutanasia a los ratones por asfixia con dióxido de carbono de acuerdo con la institución del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) procedures.
Nota: Siempre sacrificar al ratón con métodos reconocidos, según lo determinado por las reglas, regulaciones y directrices de la institución. Si se necesita la imagen repetida, mantenga el ratón sobre el cojín eléctrico hasta que el efecto de la anestesia. Una vez que el ratón se ha recuperado el conocimiento suficiente y es móvil, devolver el ratón a su jaula.
Análisis 9. Imagen
Nota: Los datos generados a partir del experimento de imágenes pueden ser visualizadas por los diferentes paquetes de software.
- Abra el software de análisis de imágenes.
- Bajo Supera modo, importar el archivo (Open → seleccionar cualquier archivo en la carpeta deseada → Haga clic en "abrir").
- Editar seudo colores si los colores por defecto no se aplican (ajuste Edición → Pantalla → En la pestaña del canal, seleccionar el color deseado en la paleta de colores).
- Ajustar el brillo, el contraste y el fondo (Editar → Ajuste de pantalla → Activar valores máximo y mínimo). Asegúrese de que las dimensiones del archivo son correctos (propiedades Editar → → En la ficha geometría, comprobar el tamaño del voxel. En este protocolo, X = 0.99, Y = 0,99, y Z = 4).
Nota: Derivar X e Y dividiendo la dimensión scanfield por la resolución de píxeles. Z es el espesor entre cada rebanada.
Nota: La salida de estos conjuntos de datos se puede presentar como películas de proyección máxima.
Nota: se requiere un análisis de seguimiento para caracterizar completamente las actividades celulares e interacciones con el fin de comprender su función in vivo. Las instrucciones detalladas de seguimiento de celda utilizando la función de lugar disponible en el software se pueden encontrar en el protocolo de referencia 15.
Nota: Hay muchas formas de cuantificar la migración de leucocitos, cuyos detalles se pueden encontrar en el artículo de revisión de referencia 16.
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Representative Results
Este protocolo utiliza una plataforma de imágenes piel de la oreja hecha a la medida, como se muestra en la Figura 1. Varias características de esta plataforma se han diseñado específicamente para facilitar la formación de imágenes mientras se mantiene la configuración fisiológicas. La colocación de la oreja en la plataforma de latón calentado no sólo mantiene el oído a una temperatura fisiológica de 35 ° C, pero también aísla el oído de los movimientos inevitables debido a la respiración. La adición de un clip de metal en la plataforma de latón crea una brecha para evitar que el soporte de cubreobjetos de ejercer peso en la oreja, manteniendo de ese modo el flujo de sangre sin interrupciones. La plataforma de etapa también se diseña para acomodar una resistencia de calentamiento que mantenga el ratón a 37 ° C durante todo el procedimiento de formación de imágenes.
El titular de cubreobjetos (Figura 2) está diseñado para permitir que el cubreobjetos que se adjunta en el soporte de metal con la ayuda de vacío grease. El titular de cubreobjetos está conectado a un soporte que permite el ajuste flexible de los ejes verticales y horizontales con la ayuda del adaptador. De esta manera, el usuario puede ajustar primero con precisión la posición del cubreobjetos sobre la oreja y posteriormente fijar esa posición apretando los tornillos en el adaptador.
En este protocolo, hemos descrito el uso de imanes para simular la isquemia y la reperfusión. La Figura 3b muestra vistas representativas de los oídos antes e inmediatamente después de la isquemia. En condiciones fisiológicas, los principales vasos sanguíneos pueden ser visualizados macroscópicamente. El efecto de apriete de los imanes se deriva temporalmente el flujo de sangre, que puede ser observado por un efecto de blanqueo transitoria (flecha negro) cuando se retiran los imanes.
En esta demostración particular, la formación de imágenes se centra en el borde de la zona isquémica (Figura 3c (Figura 3d). Esto crea importantes puntos de referencia para los estudios de imagen intravital y ayuda a mantener la coherencia entre los experimentos independientes.
Los datos muestran que, en respuesta a un insulto IR, la infiltración de neutrófilos salida en el intersticio de los vasos sanguíneos intactos que recubre el borde de la zona isquémica y migrar hacia el sitio de la lesión (Figura 3d y de la película 1). Esperamos que un retraso en la respuesta de neutrófilos que migran hacia el intersticio en comparación con otros modelos de inflamación debido a la falta de los vasos sanguíneos que perfunde viables en puntos de tiempo anteriores post-reperfusión. Para caracterizar completamente estas célulasactividades lares, el análisis de rastreo celular se pueden emplear para comprender su función in vivo. Velocidad, significa el desplazamiento, y el índice de quimiotaxis son algunas de las posibles lectura de los que pueden ser obtenidos a partir del análisis de seguimiento de la célula.
Figura 1. Diagrama esquemático de una etapa del oído de la piel a medida para intravital Multifotónica Imaging. (a) Vista superior de la etapa de formación de imágenes oído con sus dimensiones. (b) Vista frontal y dimensiones. Tenga en cuenta que la placa de latón es más grueso en los lados, con el fin de proporcionar estabilidad a la plataforma, y más delgada en el centro, para reducir al mínimo el área de contacto con la piel, asegurando el flujo de sangre sin interrupción cuando el oído está plegada sobre el borde de la ranura y descansado en la plataforma. Ver (c) laterales del soporte curvado que los pasadores de abajo de la sonda de realimentación. La resistencia de calentamiento puede serfija sobre la plataforma con cinta de enmascarar (no mostrado). Modificado de Li et al., Nat protoc, 2012 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Diseño del titular de la Cubreobjetos; Lateral y superior. El titular de cubreobjetos tiene el cubreobjetos en una posición fija y por lo tanto reduce z-deriva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El modelo IR. (A) Diagrama esquemático que muestra el posicionamiento de los imanes. (SEGUNDO) (C) Esquema de la oreja que muestra la región fotografiado con respecto a donde se había colocado el imán. (D) Intensidad máxima de instantáneas z-proyectado desde una secuencia de lapso de tiempo que muestra la infiltración de neutrófilos después de la reperfusión en un ratón LysM-eGFP. El tiempo transcurrido se muestra en el formato hh: mm. Barra de escala: 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Reclutamiento película de neutrófilos en la lesión IR. Una secuencia de lapso de tiempo de máxima proyección que muestra la infiltración de neutrófilos (verde) en respuesta a la reperfusión en LysM-eGFP piel de oreja de ratón albino después de 1,5 h de isquemia. En los puntos de tiempo anteriores, la falta deAzul de Evans señal (rojo) indica oclusión de los vasos temporales después de la isquemia. El colágeno (azul, generación de segundo armónico). Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)
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Discussion
Significado
IR es una de las principales causas de las úlceras por presión de la piel. Las etapas tempranas (I y II) de las úlceras por presión describen el estado de la piel humana (en comparación con los tejidos subcutáneos subyacentes y los músculos). Sin embargo, una comprensión de la etiología inmunológica todavía falta. A continuación, presentamos un modelo IR simple y robusto en la piel de oreja de ratón con el fin de llenar este vacío. Simulamos la isquemia mediante la sujeción de la oreja del ratón entre dos imanes y, posteriormente, estudiar las respuestas inmunes aguas abajo después de retirar el imán (reperfusión). Mediante el uso de imanes para generar una presión constante sobre cada oído por un período fijo de tiempo, inducir isquemia, estamos en condiciones de asegurar la reproducibilidad y la coherencia entre los experimentos.
La fuerza de este modelo IR no invasiva también reside en su capacidad de demostrar, en tiempo real, en las respuestas inmunes in vivo mediante la utilización de un modelo bien establecido de IMAGin intravitalg de la piel de la oreja, lo que ofrece una mayor estabilidad durante la formación de imágenes en comparación con el procedimiento de flanco de la piel. Algunos de los modelos actuales de los flancos de la piel implican procedimientos quirúrgicos que pueden alterar el paisaje inmunológico de la piel 4. Además, la formación de imágenes del propio flanco de la piel presenta un reto técnico, ya que los movimientos respiratorios pueden contribuir a artefactos relacionados con el movimiento durante el diagnóstico por 5,6. Nuestro modelo actual evita estos problemas.
Además de estudiar las respuestas fisiológicas de las células inmunitarias a IR, este modelo también puede ser aplicable a la configuración fisiopatológicos como la diabetes mellitus, donde la diabetes puede empeorar la lesión IR a través de un aumento del estrés oxidativo. La comprensión de las respuestas inmunes contribuirá a un entendimiento de la cicatrización de heridas.
Los pasos críticos
Una vez que el ratón está bajo anestesia, la termorregulación se deteriora y la temperatura corporal central cae drásticamente. Para evitar hypothermia, calentamiento externo es esencial para mantener la temperatura corporal central a 37 ° C. El oído, situado distalmente a la base del cuerpo, es fisiológicamente refrigerador por 1 - 2 ° C y debe mantenerse a 35 ° C. Esta consistencia en la calefacción también asegurará reproducibles lectura de los dinámica celular. Al mismo tiempo, el sistema de calefacción debe ser comprobado para asegurarse de que el ratón no está sobre-calentamiento a lo largo de toda la longitud de la anestesia.
El uso de ratones albinos (BALB / cy C57BL / 6-C 2J) para todos los estudios de imagen de la piel es muy recomendable para evitar lesiones pigmentadas speckling inducida. Si ratones albinos no están disponibles, la disminución de la potencia del láser durante la adquisición de la imagen puede aliviar el problema para los ratones pigmentados. Sin embargo, una optimización adicional puede ser necesaria, como una reducida profundidad de penetración en el tejido puede dar lugar a un resultado más pobre adquisición.
La piel de la oreja es muy delicada; por lo tanto, se debe tener cuidado para evitar cualquier circunstancia quepuede causar inflamación. Ejemplos de técnicas inapropiadas incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: 1), dejando la crema depilatoria en una cantidad de tiempo excesiva sobre lo que se recomienda; 2) la aplicación de una fricción excesiva en la oreja cuando se lleva el oído a través de la ranura de la plataforma de formación de imágenes oído o al separar el oído de la cinta de enmascaramiento; y 3) el sobrecalentamiento de la oreja, ya sea debido a un sistema de calefacción defectuoso o una sonda de realimentación de temperatura fuera de lugar que se puede registrar la temperatura ambiente en lugar de la temperatura del núcleo del ratón.
Modificaciones y solución de problemas
La mayor parte de la solución de problemas relacionados con el procedimiento de preparación del oído ha sido incluido previamente 8. Si el oído es proyectado en una tarde punto de tiempo posterior a la reperfusión, el oído puede hincharse más allá de la brecha de 0,5-mm creado por el clip de metal para acomodar el espesor de la oreja (Figura 1). En este escenario, la colocación del cubreobjetos sobre el oídopueden obstaculizar el flujo de sangre, que es evidente cuando los vasos sanguíneos visibles macroscópicamente desaparecen de la vista. Esto debe evitarse mediante la creación de un espacio más grande entre el soporte de cubreobjetos y la plataforma de latón. Esto puede hacerse de dos maneras, ya sea ajustando manualmente la altura del soporte cubreobjetos (Figura 2) o mediante el uso de un clip de metal más grueso.
Limitaciones de la Técnica
En este protocolo, se utilizó azul de Evans para determinar la ubicación de la zona isquémica, ya que la fuga del azul de Evans en el intersticio marca el límite de la zona isquémica en los puntos de tiempo tempranos post-isquemia. Evans Blue se usa comúnmente como un agente de marcaje de los vasos sanguíneos. Sin embargo, en condiciones inflamatorias, la integridad vascular se ve gravemente comprometida. Esto da lugar a la fuga de azul de Evans en el intersticio. En este modelo, se observa una drástica pérdida de contraste entre los vasos sanguíneos y el intersticio poco después de la reperfusión. Como tal, en studies cuando se trata de interacciones leucocitos endotelial, se recomienda la experimentación con otros agentes de marcaje de los vasos sanguíneos de diferentes tamaños (por ejemplo, dextranos, etc.).
Las aplicaciones futuras
Además de utilizar el ratón LysM-eGFP para demostrar cómo los neutrófilos responden a IR de la piel, este modelo también se puede utilizar para el estudio de otras respuestas de leucocitos, tanto en la infiltración (monocitos) y en intersticiales residente (macrófagos) leucocitos. Este modelo también se puede extender a otros estudios que examinan la sangre y la integridad linfático, así como las interacciones leucocito-endotelial después de una lesión IR. Junto con la capacidad de visualizar colágeno como señales de SHG a través de MP-IVM, también sería interesante para supervisar la integridad del colágeno después de IR o durante la curación de heridas. En resumen, hemos creado una manera no invasiva, robusto modelo de IR para intravital de imágenes con el fin de estudiar las respuestas inmunes en la piel de oreja de ratón.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
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