Introduction
Clostridium difficile er en af de hyppigste årsager til nosokomielle antibiotikum-associeret diarré infektioner 1. Dette Gram-positive anaerobe bakterie overføres gennem sin sporen form via det fækale-oral vej. I det seneste årti, nye '' epidemi '' eller '' hypervirulente '' stammer (f.eks BI / NAP1 / 027) forårsagede en drastisk stigning i nye infektioner og dødelighed i Nordamerika og Europa 2. C. difficile-associeret sygdom (CDAD) er en livstruende kolon inflammation med høje dødelighed 3. Symptomerne spænder fra diarré 4 til pseudomembranøs colitis 5 og ofte fatal toksisk megacolon 6.
Behandling af CDAD er svært som de virulente stammer er multiresistent og fornyet er høj 7. I øjeblikket terapi omfatter antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vancomycin, eller i repetitiholdsvis tilbagevendende sager fækal mikrobiota transplantation. Nye terapeutiske strategier er et presserende behov 8. Visse fremskridt er registreret som den terapeutiske monoklonale antistof Bezlotoxumab, rettet mod C. difficile toksin B 9, har for nylig bestået kliniske fase III studier og blev indgivet til godkendelse hos FDA og EMA. Derudover er nye antibiotika, der testes i øjeblikket på forskellige stadier af kliniske forsøg 10.
At udvikle effektiv behandling skal identificeres nye terapeutiske mål. Den nyligt opdagede C. difficile protease prolin-prolin endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1, EF 3.4.24.89) er sådan en lovende mål, som den manglende PPEP-1 i en knock-out stammen reducerer virulens C . difficile in vivo 11. PPEP-1 er et secerneret metalloprotease 12,13 spaltning to C. difficile adhæsiner ved deres C-terminus 13 derved frigør det vedhængende Bacterbl.a. fra det menneskelige tarm epitel. Derfor er det involveret i at opretholde balancen mellem siddende og bevægelige fænotype af C. difficile. At udvikle selektive inhibitorer mod PPEP-1 og til at forstå, hvordan det anerkender sine substrater indgående kendskab til sin tredimensionelle struktur er uundværlig. Vi har løst den første krystalstruktur PPEP-1 alene og i kompleks med et substrat peptid 14. PPEP-1 er den første kendte protease der selektivt spalter peptidbindinger mellem to prolinrester 15. Det binder substratet i en dobbelt-bøjet måde og stabiliserer det via en udvidet alifatisk-aromatisk netværk af rester placeret i S-sløjfe, der omfatter protease aktive sted 14. Dette substrat-bindende tilstand er unik for PPEP-1 og ikke fundet i humane proteaser til dato. Dette gør det en lovende lægemiddel mål, og off-target effekter af inhibitorer meget usandsynlige.
At udvikle og skærm selektiv PPEP-1 inhibitors i fremtiden er behov for en stor mængde af ren og monodisperse PPEP-1 protein. Endvidere at bestemme tilstanden af binding af første inhibitorer, co-krystalstrukturer med PPEP-1 skal bestemmes. I vores hænder PPEP-1 konstant producerer sammenvoksede krystaller. Vi har således udviklet en optimering procedure til fremstilling af enkeltkædede diffraktion kvalitet krystaller af PPEP-1. I denne protokol vi beskriver i detaljer produktion, rensning, krystallisering og struktur løsning af PPEP-1 14. Vi bruger intracellulær ekspression i Escherichia coli af et PPEP-1-varianten mangler sekretionssignalsekvens, affinitetskromatografi og gelpermeationskromatografi med fjernelse af rensning tag, efterfulgt af mikropodning 16 ind en optimering skærm og strukturbestemmelse via zink enkelt bølgelængde anomale dispersion (zink-SAD) 17. Denne protokol kan tilpasses til produktion og strukturbestemmelse af andre proteiner (f.eks </ Em> metalloproteaser), særlig for proteiner producerer sammenvoksede krystaller. På anmodning, plasmid-DNA af konstruktionen (pET28a-NHis-rPPEP-1) og diffraktionsdata kan leveres til undervisningsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning og Construct design
- Klone codon-optimerede sekvens (for E. coli) af C. difficile PPEP-1 uden signalpeptidet [aminosyrerne 27-220, at nedennævnte rekombinant PPEP-1 (rPPEP-1) 11] ind i pET28a-vektoren under anvendelse NdeI og Xhol restriktionssites (figur 1) med en stopkodon ved 3'-enden (resulterende vektor pET28a-NHis-rPPEP-1). Dette frembringer en N-terminalt 6xHis-mærkede protein (NHis-rPPEP-1) med et thrombin-spaltningssite tillader fjernelse af tagget under oprensning (figur 1). Plasmidet indeholder et kanamycin-resistente kassette til udvælgelse. Primerne anvendt til kloning, er beskrevet andetsteds 14.
Figur 1: Skematisk fremstilling af konstruktionen pET28a-NHis-rPPEP-1 og SDS-PAGE-analyse af EXPREssion og alle oprensningstrin. (A) Vector kort over NHis-rPPEP-1 klonet ind pET28a vektor hjælp Nde I / Xhol oprettet med PlasMapper. (B) Skematisk afbildning af NHis-rPPEP-1-konstruktionen (øverste felt) og den endelige konstruktion efter thrombin-spaltning af 6xHis-tag med heraf følgende yderligere GSHM-sekvens i den N-terminale ende (nedre panel). SDS-PAGE analyse (C) af ekspressionen i BL21 (DE3) Star at 37 ° C i 4 timer og (D) af prøver fra alle oprensningstrin (M: molekylvægt markør). Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Ekspression og oprensning af rPPEP-1
- Ekspression af NHis-rPPEP-1
- Der fyldes op og autoklave LB (lysogeni bouillon) medium (10 g / l trypton, 5 g / l gærekstrakt, 10 g / l NaCl, adjust til pH 7,5 med NaOH). Supplere med kanamycinsulfat (50 ug / ml) lige inden brug (LB / Kan medium).
- Inokulere en 200 ml overnatskultur fra frisk transformerede E. coli i LB / Kan medium. Vokse natten over ved 37 ° C under omrystning ved 220 rpm.
- På den næste morgen, kontrollere OD600 (optisk densitet ved 600 nm bølgelængde) af overnatskulturen. Pode to 2.8 L forvirret kolber indeholdende 1 L LB / Kan medium hver med overnatskulturen til en OD 600 på 0,1. Supplere med tre dråber vandig-silikone emulsion at forhindre dannelse meget skum. Grow celler ved 37 ° C under omrystning ved 180 rpm, indtil OD600 når 0,6.
- Tag en præ-induktion prøve til SDS-PAGE-analyse (svarer til 1 ml fra en kultur ved OD600 = 1); tilføje IPTG til 0,5 mM slutkoncentration at inducere ekspression af NHis-rPPEP-1. Fortsætte væksten ved 37 ° C / 180 rpm i 4 timer.
- Bestem OD 600 i en 10x diurening og tage en høst prøve (ækvivalent af 1 ml fra en kultur ved OD600 = 1).
- Indsamle cellerne ved centrifugering i 20 minutter ved 7.000 xg og 4 ° C. At fjerne resterende LB medium resuspender cellepellets fra 1 liter kultur i 40 ml TBS-buffer (Tris-bufret saltopløsning: 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 200 mM NaCl) og overføres til et 50 ml centrifugerør. Indsamle cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 10.000 xg og 4 ° C og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse. Analyser ekspression (total lysater og opløselige fraktioner) via SDS-PAGE 18.
- Oprensning af umærket rPPEP-1
- Tag 50 pi prøver af hver oprensningstrin til SDS-PAGE-analyse. Resuspender cellepelleten fra 1 liter kultur i TBS puffer suppleret med 10 ug / ml DNasel. Brug 5 ml TBS / DNasel pr g celler.
- Lysere cellerne ved sonikering på is / vand under anvendelse af 30% amplitude i 15 minutter (2 sec pulser med 2 sek pause). Fjern snavs ved centrifugation i 10 minutter ved 10.000 xg og 4 ° C og overførsel supernatanten til et ultracentrifugerør. Klart lysat i en ultracentrifuge i 30 minutter ved 165.000 xg og 4 ° C.
- Arbejde ved 4-6 ° C. Anvendelse af en peristaltisk pumpe eller kromatografi-system i ligevægt 2 ml af nikkel-nitrilotrieddikesyre (NiNTA) harpiks i en glaskolonne med TBS-buffer suppleret med 10 mM imidazol pH 7,5. Alternativt kan du bruge tyngdekraften flow.
- Juster klarede lysat med 1 M imidazol pH 7,5 til en slutkoncentration på 10 mM. Påfør lysatet til søjlen og vaskes trinvis med TBS-buffer suppleret med 10 mM og 30 mM imidazol, henholdsvis indtil UV-absorption ved 280 nm har nået basislinjen.
- Eluering af proteinet med TBS-buffer plus 250 mM imidazol. Re-ækvilibrering af søjlen til TBS suppleret med 10 mM imidazol og opbevares natten over.
- Bestemme koncentrationen protein enten ved 280 nm ved anvendelse af udryddelse coeffikelig af 25.900 M -1 cm-1 eller ved enhver anden metode (f.eks Bradford metode 19). Tilsæt 2 enheder thrombin per mg protein og dialyseres proteinopløsningen natten over ved 4 ° C mod en 50x volumen af TBS (50x af NiNTA elueringsvolumen).
BEMÆRK: Tag den rigtige blank for bestemmelse af koncentrationen protein, som imidazol absorberer stærkt ved 280 nm. - Passere proteinopløsningen over ækvilibreret NiNTA harpiksen for at fjerne uspaltet protein. Dernæst gælder det samme volumen af TBS suppleret med 10 mM imidazol til kolonnen til at inddrive alle spaltede protein. For at rengøre kolonnen, elueres alle resterende protein med 250 mM imidazol. Analysere prøver via SDS-PAGE (figur 1).
- Koncentrer proteinopløsningen til 4 ml i 10 minutters intervaller ved 4.000 xg og 4 ° C under anvendelse af en centrifugal ultrafiltreringsenhed. Bland koncentrere protein efter hvert interval for at forhindre udfældning og aggregering. På dette trin lejlighedsvisly nogle udfældning observeres for rPPEP-1 trods blandingsproceduren.
- Påfør koncentreret protein til en præækvilibreret gelpermeationskromatografisøjle (i TBS buffer) ved 4-6 ° C. Søjlen elueres med TBS buffer, indsamle 1 ml fraktioner og emne 5 pi af hver anden fraktion til SDS-PAGE analyse. rPPEP-1 eluerer i en enkelt top svarende til en monomer (figur 2). Lejlighedsvis en mindre top ved større molekylvægt observeres (fronting peak), der svarer til en dimer af proteinet. Udbyttet bør være omkring 50 mg ren protein pr liter kultur. Analyser alle prøver via SDS-PAGE 18 (Figur 2).
- Tag 50 pi prøver af hver oprensningstrin til SDS-PAGE-analyse. Resuspender cellepelleten fra 1 liter kultur i TBS puffer suppleret med 10 ug / ml DNasel. Brug 5 ml TBS / DNasel pr g celler.
Figur 2: Repræsentativ gelpermeationskromatografi og SDS-PAGE-analyse af rPPEP-1. Størrelsesudelukkelseskromatografi kromatogram (A280; absorbans ved 280 nm) renset umærket rPPEP-1 under anvendelse af a (16/600) søjle i Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl ved 6 ° C. Baseret på elueringsvolumenet, som rPPEP-1 migrerer forventet for en 22 kDa-protein, hvilket antyder, at det er overvejende monomert. Sjældent en mindre fronting toppen fremkommer der svarer til en dimer. (Indsat) SDS-PAGE-analyse af fraktionerne fra gelpermeationskromatografi (M; molekylvægtmarkør). Hver anden fraktion påføres. De svage bånd under den vigtigste rPPEP-1 bånd svarer til lejlighedsvis forekommende mindre urenheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Krystallisation og Crystal Optimization Brug mikropodning
BEMÆRK: rPPEP-1 krystalliserer af forhold, der konstant producere meget sammenvoksede krystaller ikke egnet til røntgendiffraktion analyse (figur 3). Derfor blev en optimering strategi (figur 4) udviklet for at opnå en høj kvalitet krystaller (figur 5).
- Indledende screening af rPPEP-1 ved hjælp af kommercielle skærme
BEMÆRK: Udfør krystallisering forsøg i den siddende drop-format ved hjælp af standard kommercielt tilgængelige skærme og en krystallisering robot.- Koncentrer det oprensede protein til 12 mg / ml under anvendelse af en centrifugal ultrafiltrering enhed i 5 minutters intervaller ved 4.000 xg og 4 ° C. Bland koncentrere protein efter hvert interval for at forhindre udfældning og aggregering. Bestem proteinkoncentrationen enten ved 280 nm ved anvendelse af ekstinktionskoefficienten for 25.900 M-1 cm-1 eller ved enhver anden metode (f.eks Bradford-metoden). Ækvilibrering af proteinet til 20 ° C. Rydde alle partikler og støv ved centrifugering i 10 minutter ved 16.000 xg og 20 ° C.
- Brug enten allerede fyldte krystallisering plader SEAled og opbevaret ved 4 ° C eller fyld beholderen brønde på pladerne med 70 pi af hver krystallisation tilstand. Ækvilibrer alle krystallisations- plader til 20 ° C. Arbejde hurtigt, som de små volumener hurtigt tørre ud. Brug et fugtighedskammer omkring dokken af robotten, hvis muligt.
BEMÆRK: Brug følgende skærme som en standard procedure: SaltRx, Index, PEG / Ion, Crystal, Wizard, PACT ++, JCSG ++. - Indstil skærmen ved pipettering protein og reservoir i subwells 2-4. Drop volumen er 300 nl og forholdene (protein: reservoir) er 200: 100 (subwell 2), 150: 150 (subwell 3) og 100: 200 (subwell 4) (i nl). tætne straks pladen og anbringes i et kammer ved 20 ° C.
- Undersøg bakker umiddelbart efter opsætning, og derefter inspicere alle dage i den første uge, efterfulgt af ugentlige inspektion.
- Co-krystallisering af rPPEP 1 med ligander
- For co-krystallisering af substrat peptid-rPPEP-1-komplekser mix rPPEP-1ved 24 mg / ml i en 1: 1-forhold (volumen / volumen) med en 7-gange molært overskud af peptidopløsning (Ac-EVNPPVPD-NH2) lyofiliseret pulver solubiliseret i TBS-buffer), som vil give en slutkoncentration på 12 mg / ml r-PPEP-1-protein og en 7-fold molært overskud af peptid forhold PPEP-1. Inkuber i 30 minutter ved 20 ° C og rydde væk alle partikler og støv ved centrifugering i 10 minutter ved 16.000 xg og 20 ° C. Fortsæt med krystallisation under anvendelse af mikropodning procedure som beskrevet for den ubundne r-PPEP-1-protein.
Figur 3: Repræsentative krystaller fra indledende skærme. Sammenvoksede krystaller fra rPPEP-1 ved 12 mg / ml dyrket i stand. (A) Crystal skærm I / 38 (1,4 M natriumcitrat tribasisk dehydrere, 0,1 M HEPES natrium pH 7,5; 200 nl: 100 nl). (B) sigte SaltRx / 52 (2,4 M ammoniumphosphat dibASIC, 0,1 M Tris pH 8,5; 100 nl: 200 nl) og (C) (200 nl: 100 nl). (D) sigte SaltRx / 96 (60% v / v Tacsimate pH 7,0, 0,1 M BIS-TRIS propan pH 7,0; 200 nl: 100 nl). Scale bar = 0,2 mm. Volumenforhold er altid protein: reservoir. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Optimering procedure for rPPEP-1 krystallisering. Indledende krystaller fra rPPEP-1 ved 12 mg / ml lav diffraktion kvalitet og med flere gitre (sammenvoksede) blev gengivet i en 24-tilstand optimering skærm. Igen blev der kun sammenvoksede krystaller observeret i forhold indeholdende 2,55 M ammonium dibasisk. En stamkultur blev fremstillet fra en enkelt sammenvoksede krystal og fortyndet 1: 1.000 i den samme condition (mikropodning). Et volumen på 0,5 pi af den fortyndede stamkultur blev tilsat til de resterende klare dråber og enkeltkrystaller voksede i næsten alle forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Crystal optimering ved hjælp mikropodning
BEMÆRK: Stærkt sammenvoksede krystaller af rPPEP-1 forekommer efter to dage i en tilstand indeholdende 2,4 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris-HCI, pH 8,5 (skærm SaltRx, tilstand E4, alle tre subwells) (figur 3). En optimering procedure under anvendelse af et gitter skærm omkring begyndelsestilstanden kombineret med mikropodning blev påført (figur 4).- Forbered et gitter skærm (Figur 4) omfatter 24 betingelser 1,8 - 2,55 M ammoniumphosphat dibasisk (i trin på 0,15 M) og 0,1 M Tris-HCI pH 7,5-9,0 (i trin på 0,5 pH-enheder) fra er passende,spiste stamopløsninger (4 M ammoniumphosphat og 1 M Tris-buffere).
BEMÆRK: Brug Make Bakke applet (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) til beregning af mængder og den pipettering ordningen for at opnå 2 ml hver tilstand, der gør det muligt at udføre 10 optimering skærme. 4 M ammoniumphosphat stamopløsning er vanskeligt at fremstille. Opvarm opløsningen under omrøring for fuldstændigt at opløse pulveret i vand. - Pipetter 200 pi af hver gittersigten opløsning i brøndene på en 24-brønds plade og ækvilibrere ved 20 ° C.
- Manuelt oprettet krystallisering plade. Faldet volumen er 3 pi og af forholdene (protein: reservoir) er 2: 1, 1,5: 1,5 og 1: 2 (i pi). Her skal du bruge en positiv fortrængning pipette for at undgå luftbobler formation. tætne straks pladen og anbringes i et kammer ved 20 ° C. Undgå luftboble formation.
BEMÆRK: Efter en til fire dage meget sammenvoksede krystaller vises i de fire betingelser, der indeholder 2,55 M ammonium phosphate dibasisk og 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 - 9.0 (figur 4). Ingen krystaller dannes i de resterende 20 betingelser med ammonium fosfat koncentrationer under 2,55 M. Proceduren for mikropodning er anvendt ved fremstillingen af enkeltkrystaller af rPPEP-1 under disse forhold. - Der fremstilles en microseed lager ved at høste en enkelt sammenvoksede krystal fra en af de to betingelser med 2,55 M ammonium dibasisk og 0,1 M Tris-HCI pH 8,0 eller 8,5. Krystallerne kan være fastgjort til plastoverfladen. Omhyggelig deformation af den omgivende plast med en akupunkturnål hjælper til at frigøre krystallerne.
- Transfer 50 pi af den respektive moderlud i et 1,5 ml rør indeholdende en lille højpoleret glasperle (perler-til-frø). Ved hjælp af en monteret nylon loop overføre krystal i 1 pi moderluden placeres på et glas dækglas.
- Overfør væsken indeholdende krystaller ind i røret og vortex ved høj hastighed i 30 sek. Lav en 1:1.000 fortynding af stamkultur til en ny 1,5 ml rør indeholdende samme frisk fremstillede tilstand og vortex grundigt i 5 sekunder.
BEMÆRK: Frø lagre kan opbevares ved -80 ° C til senere brug.
- Fjern forseglingen af pladen, der dækker de 20 betingelser med klare dråber og pipette 0,5 pi frø materiel (1: 1000 fortynding) i brøndene. Forsegle skiltet og anbringes i et kammer ved 20 ° C. Enkelte krystaller af høj kvalitet diffraktion vises i 2-7 dage (figur 5).
- Forbered et gitter skærm (Figur 4) omfatter 24 betingelser 1,8 - 2,55 M ammoniumphosphat dibasisk (i trin på 0,15 M) og 0,1 M Tris-HCI pH 7,5-9,0 (i trin på 0,5 pH-enheder) fra er passende,spiste stamopløsninger (4 M ammoniumphosphat og 1 M Tris-buffere).
Figur 5: Repræsentative krystaller fra optimering skærmen. Enkelte krystaller fra rPPEP-1 ved 12 mg / ml podet med 1: 1000-fortynding stamkultur dyrket under følgende betingelser: (A) 2,1 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 pi: 1,5 pi; (B) 2,1 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 pi: 1 pi; (C) 2,25 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris pH 8; 2 pi: 1 pi; (D) 2,1 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris pH 8; 1 pi: 2 pi. (E) monteret krystal i 0,1-0,2 um nylon loop, dyrket i 2,1 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris pH 8 (2 pi: 1 pi) og cryo-beskyttet i 2,1 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris pH 8, 20% glycerol. Scale bar = 0,2 mm i (AD). Volumen ration er altid protein: reservoir. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Crystal Montering og dataindsamling
BEMÆRK: For at opnå den bedste kvalitet af diffraktion data krystaller skal monteres på toppen af deres kvalitet og størrelse. Krystaller kan opbevares i flydende nitrogen indtil de pae underkastes røntgendiffraktion analyse ved 100 K. Derfor skal den sygdom, som de stammer justeres til cryo-betingelser. rPPEP-1-krystaller kan være cryo-beskyttet ved tilsætning af enten 20% glycerol eller 30% saccharose (udskiftning af vand i den tilstand, som kryo-beskyttelsesmiddel).
- Crystal montering
BEMÆRK: bør udføres Alle krystal manipulation trin under stereomikroskop.- Vælge den optimale størrelse af nylon loop for den maksimale længde af de valgte krystaller. Den typiske længste akse rPPEP-1-krystaller er ca. 100-200 um (figur 5). Forbered et dækglas og den passende cryo-tilstand (f.eks 2,1 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glycerol).
- Fyld skum Dewars med flydende nitrogen, indlæse hætteglasset klemme med et hætteglas og pre-køle det i flydende nitrogen fyldt 800 ml skum dewar. Placer en cryo ærme og en cryo stok holder markeret med en egnet identifikatori flydende nitrogen-fyldt 2 L skum dewar. Læg den magnetiske stav med en monteret nylon løkke.
BEMÆRK: Bær beskyttelsestøj (Eyeshield / briller, handsker), når der arbejdes med flydende nitrogen. Varme genstande kastet ud i flydende nitrogen kan frembringe udslip.
- Fyld skum Dewars med flydende nitrogen, indlæse hætteglasset klemme med et hætteglas og pre-køle det i flydende nitrogen fyldt 800 ml skum dewar. Placer en cryo ærme og en cryo stok holder markeret med en egnet identifikatori flydende nitrogen-fyldt 2 L skum dewar. Læg den magnetiske stav med en monteret nylon løkke.
- Skær åbne forseglingstape med en skarp skalpel og tag den med pincet. Pipette 1 ul af cryo-tilstand over på låget dias (eller alternativt i en tom brønd på den samme plade) og fjern krystal fra drop ved at fiske den med den monterede nylon loop (figur 5). Vedhæftede krystaller let kan frigøres fra jorden ved at deformere omgivende plast med en akupunkturnål.
- Hurtigt overføre krystal til dråbe kryo-tilstand og lad den ligevægt i 1 sekund. Fisk krystal ud så hurtigt som muligt og dyk-freeze i flydende nitrogen.
- Når væsken nitrogen omkring den påsatte løkken stopper kogning, placere løkken i hætteglasset.Placer hætteglasset på indehaveren af cryo sukkerrør og når lastet med 6 hætteglas placere en cryo ærme omkring holderen. Opbevar krystallerne i en tank fyldt med flydende nitrogen indtil anvendelse.
- Vælge den optimale størrelse af nylon loop for den maksimale længde af de valgte krystaller. Den typiske længste akse rPPEP-1-krystaller er ca. 100-200 um (figur 5). Forbered et dækglas og den passende cryo-tilstand (f.eks 2,1 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glycerol).
- Dataindsamling
BEMÆRK: Dataindsamling kan udføres i hjemmet diffraktometer, hvis den er tilgængelig, eller på et synkrotron beamline. For rPPEP-1-data blev indsamlet ved beamline X06DA af den schweiziske Light Source, Paul-Scherrer-Institut, Villigen, Schweiz ved hjælp af en hybrid foton optælling detektor. De oprindelige data og alle filer, der anvendes i strukturbestemmelse kan leveres efter anmodning.- Opsætning af bølgelængden af strålen til 1,282 Å (9667 keV), som er den karakteristiske røntgen absorption kant energi (top) af elementet zink. rPPEP-1 er en metalloprotease, der indeholder en enkelt zink pr molekyle i det aktive sted.
- Indsaml data ved 100 K i den inverse-beam-tilstand i 10 ° kiler for i alt 270 ° i hver direction. Eksponeringstiden er 0,1 sek med 0,1 ° rotation per billede. Sæt transmission til 14% (0,14).
- At indsamle en nativ høj opløsning datasæt fra et andet krystal, der stammer fra den samme krystallisation tilstand oprettet bølgelængden af strålen til 1,00 Å (12.398 keV). Indsaml data ved 100 K. eksponeringstid er 0,1 sek med 0,1 ° rotation per billede. Sæt transmission til 70% (0,7).
5. Struktur Bestemmelse via Zink-SAD
BEMÆRK: For at bestemme strukturen af rPPEP-1 via zink-SAD er nødvendig nogle grundlæggende krystallografiske viden samt de softwarepakker XDS 20, Phenix 21 og programmet Coot 22. Til visualisering af strukturer er behov programmet PyMOL 23 eller Chimera 24. Data indsamlet ved den bølgelængde, der svarer til toppen ved absorptionen kant af elementet zink kan anvendes til enkelt-bølgelængde anomale dispersion (SAD) 25 for at få fase oplysninger, der kan udvides til alle protein atomer.
- Databehandling
- Behandle de to peak datasæt (normale og inverse) ved hjælp af softwaren XDS (alternativt iMosflm eller HKL3000) i rummet gruppe P2 1 2 1 2 1 (mellemrum gruppe 19) adskiller Friedel hjælpere (unormale data). Enhedscellen parametre bør være omkring a, b, c (Å) = 43,17, 71,68, 117,70 og α = β = γ (°) = 90. Dette giver to HKL-filer (refleksion filer).
- Undersøg filen CORRECT.LP. Brug data op til den beslutning, hvori CC 1/2 er mindst 50%. Skala sammen begge datasæt / refleksion filer (HKL-filer) ved hjælp af XScale. Undersøg filen XSCALE.LP. Tjek hvor langt anormale signal udvider (SigAno) og bemærk opløsning med en unormal korrelation (Anomal Corr) på omkring 30%, hvilket er 2 Å i tilfældet med de anvendte data her indsamlet til 1,67 Å. Dette eropløsning cut-off for anormale signal anvendes i Phenix Autosol.
- Konverter (skaleret) HKL-fil i en CCP4-format refleksion fil (navngivet for eksempel peak_anom.mtz) ved hjælp af XDSCONV skabe en R gratis delmængde af 5% og holde afvigende data (FRIEDEL'S_LAW = FALSK). Kontroller MTZ-fil for konsistens med programmet mtzdmp inspicere enheden celle parametre, rummet gruppen og eksistensen af R gratis delmængde (etiket FreeRflag), og de unormale data (etiketter DANO / SIGDANO). Forbered også en ekstra MTZ-fil med XDSCONV uden at udtage de afvigende data (FRIEDEL'S_LAW = TRUE, navngivet, for eksempel peak_native.mtz) for raffinement på et senere tidspunkt.
- Underkonstruktion opløsning (fasebestemmelse)
- Kør Phenix Autosol hjælp refleksion fil peak_anom.mtz den. Vælg SAD / MAD højdepunkt som datatype og vælge 2 zink sites (som der er to molekyler pr asymmetriske enhed). Vælg enten den mere præcise erfamentale værdier for f '/ f' 'parametre (bestemt i et fluorescens-scanning i beamline) eller theotetical værdier f' = -8,245 og f '' = 3,887. indlæse Også FASTA fil, der indeholder aminosyresekvensen af det krystalliserede protein.
- Indstil grænsen beslutning til opløsning med en unormal korrelation (Anomal Corr) på omkring 30% (bestemt i 5.1.2), i dette tilfælde 2 Å og vælg "autoopbygningssystemet model" valgmulighed. Brug af faser af de to zink sites fundet af Phenix HySS (del af Phenix Autosol rørledning) faserne for hele protein kunne udledes, og den model, bygget (ved Phenix LØSE) ind i elektron tæthed. Den bedste model kaldes "overall_best.pdb".
- Model bygning, raffinement og validering
- Vælg indstillingen "autoopbygningssystemet model" til at bygge det meste af rPPEP-1 model automatisk. Undersøg elektron massefylde ved 1,0 σ kontur niveau ved hjælp af program Coot (figur 6). Det bør være binde- og omgivende atomerne i modellen. Ideelt set også nogle vandmolekyler bør være indbygget i modellen (med en opløsning bedre end 2,5 Å). Bulk vand (mellemrum mellem molekylerne) bør indeholde densitet.
- Kontrollere, om hele modellen er fuldstændig (alle aminosyrer indbygget i elektrontæthed). Hvis ikke, bygge dem manuelt ved hjælp af værktøjer, som Coot. Avanceret strukturen ved at køre iterative runder af Phenix Afgræns med 5 raffinement runder hver bruge overall_best.pdb model fil, den peak_native.mtz refleksion filen og FASTA sekvens fil; og manuel model bygning i Coot.
- Godkend kvaliteten af den strukturelle model med de respektive værktøjer i Coot.
Figur 6: Eksperimentel elektron tæthed kort og model af rPPEP-1 efterPhenix Autosol løbe. Elektrontæthed i blåt en kontur niveau på 1,0 σ vises i programmet Coot. I denne indledende kort elektrontætheden er pænt løst, og modellen bygge ind i elektron densitet. Zoom-i viser resterne His142 og Glu189 samt et vandmolekyle. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Struktur Bestemmelse til High Resolution via Molekylær Udskiftning
BEMÆRK: For at opnå høj opløsning strukturel information om rPPEP-1 en nativ datasæt opsamles. Så en molekylær udskiftning procedure ved hjælp af softwaren Phaser 26,27 (i Phenix softwarepakken) er ansat ved hjælp af strukturen bestemmes via zink-SAD som model. Denne procedure kan også bruges senere, når løse strukturer af rPPEP-1 kompleksbundet med små molekyler.
- At opnå en krystalstruktur med højere opløsning (i dette tilfælde op til 1,4 Å) behandler den native datasæt ved hjælp af softwaren XDS (alternativt iMosflm eller HKL3000) i rumgruppe P2 1 2 1 2 1 (mellemrum gruppe 19). Enhedscellen parametre bør være omkring a, b, c (Å) = 43,17, 71,77, 117,80 og α = β = γ (°) = 90. Dette giver en HKL-filer (refleksion fil).
- Undersøg filen CORRECT.LP. Brug data op til den beslutning, hvori CC 1/2 er mindst 50%. Konverter HKL-fil i en CCP4-format refleksion fil (navngivet for eksempel native.mtz) ved hjælp af XDSCONV skabe en R gratis delmængde af 5%. Kontroller MTZ-fil for konsistens med programmet mtzdmp inspicere enheden celle parametre, rummet gruppen og eksistensen af R gratis delmængde (etiket FreeRflag).
- Forbered FBF-fil, der indeholder den model fra overall_best.pdb tidligere bestemt, og fjerne alle vandmolekyler og alle ligander (dvs.. zink atom). indlæse Også FASTA fil, der indeholder aminosyresekvensen af det krystalliserede protein. Kør Phaser i Phenix hjælp refleksion fil native.mtz den. Søg efter to molekyler pr asymmetriske enhed.
- Efter en vellykket struktur løsning (TFZ-score større end 8; her 10.2) inspicere modellen (opkaldt native_phaser.1.pdb) og elektrontæthedskort i Coot. Byg og forbedre strukturen ved at køre iterative runder af Phenix Afgræns med 5 raffinement runder hver bruge native_phaser.1.pdb model fil, den native.mtz refleksion filen og FASTA sekvens fil; og manuel model bygning i Coot.
- Godkend kvaliteten af den strukturelle model med de respektive værktøjer i Coot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
rPPEP-1 overudtrykkes i flere E. coli stammer, med det højeste udbytte i E. coli BL21 (DE3) Star (figur 1C). Efter den første NiNTA affinitetskromatografitrin 6xHis-tagget held kan fraspaltes fra det meste af proteinet og i det andet NiNTA trin ufordøjet protein kan adskilles fuldstændigt fra thrombin-spaltet protein (figur 1D). På en S200 16/600 kolonne umærket rPPEP-1 migrerer som monomer med lejlighedsvis Fronting sandsynligvis svarer til de dimere arter (figur 2A). Proteinet er ren (Figur 2B), og udbyttet er ca. 50 mg protein fra 1 liter E. coli-kultur. rPPEP-1 krystalliserer i forskellige betingelser (figur 3), der ofte indeholder phosphat. Krystallerne stærkt sammenvoksede under alle forhold, så krystal optimering skulle udføres. Figur 4 afbilder Scheme af optimeringen procedure udført for krystaller oprindelse fra betingelse kommerciel skærm SaltRx E4 (52) (figur 3B-C). Igen sammenvoksede krystaller dukkede op i brøndene A6-D6 (figur 4). En microseed bestand blev fremstillet ud fra krystaller dyrket i stand C6 (2,55 M ammonium dibasisk, 0,1 M Tris pH 8,5) af optimeringen skærmen og fortyndet 1: 1.000 i moderluden. To til syv dage efter podning med den fortyndede stamkultur til de øvrige resterende 20 betingelser med klart dråber store single-lattice krystaller af høj kvalitet diffraktion blev observeret (figur 5) i de fleste dråber. Efter montering af krystallerne i nylon sløjfer (figur 5e) diffraktionsdata til 1,67 Å opløsning blev indsamlet til strukturbestemmelse via zink-SAD (tabel 1), med en anomal signal strækker sig til 2 Å. Derudover blev indfødte diffraktionsdata til 1,4 Å resolution indsamles til bestemmelse af en HIGh-opløsning struktur (tabel 1). Krystalstrukturen af rPPEP-1 kunne løses (figur 6), og modellen for den native struktur raffineret til R / R gratis faktorer af 0,156 / 0,182 ved 1,4 Å opløsning (FBF ID: 5A0P) 14 (for yderligere forfinelse se statistik Tabel 1).
| Struktur / datasæt | peak Zn-SAD | hjemmehørende |
| Dataindsamling | ||
| rumgruppe | P2 1 2 1 2 1 | P2 1 2 1 2 1 |
| a, b, c (Å) | 43,17, 71,68, 117,70 | 43,17, 71,77, 117,80 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 90, 90, 90 | |
| Bølgelængde (Å) | 1,28254 | 1 |
| Opløsning (Å) | 45.5-1.67 (1.72-1.67) | 45.5-1.40 (1.49-1.40) |
| Antal observationer | 779717 (34025) | 310074 (45851) |
| Antal unikke refleksioner | 80960 (5597) | 71874 (11172) |
| mangfoldighed | 9.6 (6.1) | 4.3 (4.1) |
| Fuldstændighed (%) | 99,2 (93,0) | 98,2 (95,6) |
| Rmerge (%) | 6,8 (56,5) | 5,2 (52,6) |
| <I / σ (I)> | 21.86 (2,81) | 15,66 (2,48) |
| CC (1/2) (%) | 100 (85,1) | 99,9 (85,5) |
| statistik raffinement | ||
| Rwork / R fri d (%) | 15.60 / 18.17 | |
| Antal ikke-H-protein-atomer | 3109 | |
| Antal vandmolekyler | 532 | |
| Antal ioner / tunge atomer | 2 Zn | |
| Antal andre molekyler | - | |
| Antal TLS grupper / kæde | 9 | |
| Root-middelværdi-square afvigelser | ||
| Bond længder (A) | 0,006 | |
| Bond vinkler (°) | 1,022 | |
| Gennemsnitlig B faktor (Å 2) | ||
| Alle protein atomer | 16.12 | |
| Vand | 29,74 | |
| andre atomer | 10.12 | |
| Ramachandran plot e (%) | ||
| mest begunstigede | 98,72 | |
| Derudover tilladt | 1,28 | |
| Udelukkede | 0 | |
| FBF post | 5a0p |
Tabel 1: Dataindsamling og raffinement statistik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Røntgenkrystallografi er stadig den hurtigste og mest præcise metode til bestemmelse af tredimensionale nær-atomare strukturer af proteiner 28 opløsning. Men det kræver, at væksten i velordnede enkelte krystaller. Disse er ofte vanskeligt at få og den krystallinske tilstand er kunstig. Men en sammenligning af proteinstrukturer bestemt ved røntgenkrystallografi med dem, som andre metoder, især NMR, viser generelt en meget god overensstemmelse. I tilfælde af PPEP-1, et NMR-struktur offentliggjort for nylig 29 viser fremragende overensstemmelse med vores krystalstruktur 14, herunder mobiliteten af S-sløjfe.
Denne protokol beskriver produktionen og oprensningen af N-terminalt His-mærket rPPEP-1 protein for strukturelle studier og krystallisation og strukturbestemmelse af umærket rPPEP-1. Enkelte krystaller var vanskeligt at dyrke i denne sag og krævede en særlig mikropodning procedure. i than følgende afsnit vil vi diskutere resultaterne for PPEP-1 og angive, hvordan protokollen kunne tilpasses til produktion og krystallisering af alle andre protein.
Variationer over konstrukt design og udtryk
rPPEP-1 er udtrykt som et N-terminalt His-mærket variant (figur 1A), som for krystallisering er det at foretrække at fjerne His-tag ved thrombin fordøje på grund af dens mulige indvirkning på krystallisering succes og proteinstruktur 30. For andre proteiner kan det være tilrådeligt at desuden teste en C-terminalt His-mærket version (f.eks klonet anvendelse af de samme restriktionssteder, vektoren pET22b og en revers primer uden stopkodon ved 3'-enden) eller at forlade den N-terminale His-mærke-spaltede, som i nogle tilfælde et tag kan hjælpe under krystallisation. For rPPEP-1 udbyttet og stabiliteten af en C-terminalt His-mærket konstrukt var ringere. Derudover en indledende test for bedste soluble proteinekspression bør indgå i de følgende E. coli stammer: BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS eller Lemo21 (DE3), BL21 (DE3) codon plus RIPL eller Rosetta 2 (DE3), BL21 (DE3) Star og C41 (DE3) ved tre forskellige temperaturer / inkubationstider (3-4 timer ved 37 ° C, 5 timer ved 30 ° C og natten over ved 20 ° C). Før kloning, kontrollere, om der findes en intern thrombinspaltningssted ved hjælp af ExPASy PeptideCutter værktøjet 31 for at forhindre spaltning af proteinet af interesse. Alternativt er der vektorer tilgængelige tilvejebringer et spaltningssted for HRV3C (dvs. EMBL s PETM-14 32) eller TEV protease (dvs. EMBL s PETM-11).
proteinoprensning
For rPPEP-1-konstruktioner cellelyse udføres via sonikering på is / vand. For mere følsomme proteiner, der har tendens til at aggregere eller fremskynde en mere "blid" cellelyse metode involverer en celle disruptor kunne være brugd. Check for store mængder af uopløseligt protein efter den første centrifugeringstrin, der ikke er påvist ved brug lysismetode såsom kemiske cellelysering. Til oprensning af rPPEP-1 sædvanligvis blev anvendt 2 ml af NiNTA harpiks. Læs producentens instruktioner om, hvor stor den proteinbindingskapaciteten af den valgte harpiks er og justere i overensstemmelse hermed. I de første oprensninger af rPPEP-1, hvor der blev anvendt kun 1 ml harpiks, en masse protein blev ikke bundet til søjlen og blev fundet i gennemløbet (figur 1D). På den anden side ved hjælp af for meget harpiks kan sænke renheden af det oprensede protein. Juster imidazolkoncentration til bindingsaffiniteten af det anvendte His-mærket konstrukt til NiNTA matrix. En trinvis vaskeprocedure foretrækkes her (dvs. 10 mM, 30 mM, 50 mM, 70 mM imidazol), hvori A280 overvåges og får lov til at nå basislinje under hvert trin. På den måde intet protein er tabt, selv om det ville eluere under ethøj imidazol vasketrin (f.eks ved 50 eller 70 mM). I tilfælde af NHis-rPPEP-1 nogle protein allerede eluerer ved 30 mM imidazol, men det er uklart, hvilken slags proteinarter det repræsenterer. Nogle proteiner udfældes / aggregat når imidazol dialyseres eller fortyndes ud af proteinopløsningen. I sådanne tilfælde reducere koncentrationen af imidazol i elueringspufferen til 150 mM og tidspunktet for eksponering for høj imidazol koncentrationer, f.eks reducere koncentrationen af imidazol ved eluering i et bægerglas indeholdende en 5-10-fold volumen buffer uden imidazol i forhold til den planlagte elueringsvolumen. For NHis-rPPEP-1 inkubering med 2 enheder thrombin per mg protein natten over ved 4 ° C er tilstrækkelige til at spalte det His-tag til næsten 100%. Justere mængden af thrombin for proteinet af interesse ved anvendelse af 1-10 enheder pr mg protein ved 4 ° C til 20 ° C. Når koncentrering af proteinet under anvendelse af en centrifugal ultrafiltreringsenhed pause i intervaller på 5-10 min og blandes protein at homogenisere koncentrationsgradient opbygning i koncentratoren. Ellers kunne meget koncentreret protein sammenlægge / bundfald.
Krystallisation
rPPEP-1 producerer konstant højt sammenvoksede krystaller (enkelte krystaller vokser oven på hinanden og har således flere krystalgitre), der ikke er egnet til røntgendiffraktion analyse. Forklaringen kan være, at alt for mange nukleeringsbegivenheder sker i kimdannelseszonen af fasediagrammet (figur 7).
Figur 7: Fase diagram af et protein krystallisering eksperiment. Krystaller kan kun danne, når proteinet er overmættet. Nukleering finder sted i kimdannelseszonen og krystalvækst i den metastabile zone. Når et protein er undermættet, vil dråben forblive klar.
Proceduren kan anvendes til at co-krystallisere produkttyper peptider og substrat-peptider af rPPEP-1. Krystaller i rumgruppe P2 1 diffrakterer op til 1,25 Å blev opnået fra frø lagre fortyndet 1: 250 i optimeringen procedure. Krystaller vokser i de to rum grupper P2 1 2 1 2 1 (ubundet protein) og P2 1 (komplekse strukturer), mens stammer fra meget lignende forhold i ammonium fosfat skærmen på optimering procedure. På grund af den krystal pakning i både r-PPEP-1 krystal former, hovedsagelig alle små molekyler og peptider rettet den primede side af det aktive site alene kunne være soaked ind i krystaller. Denne side af molekylet er tilgængelig fra opløsningsmidlet til stede i krystallen. Men molekyler rettet både underordnede websteder eller den primede side kun behøver at være co-krystalliseret med rPPEP-1, som S-loop åbning ville være forpligtet til at imødekomme dem i det aktive site. Derudover er rPPEP-1 kontaktes af nabomolekyler ved afgangen fra substratet-bindingssted nær S3'site (fremme af krystal kontakter på dette område) - et faktum, der også begrænser længden af substratpeptider til 3 rester på primet side i disse to krystalformer.
Crystal montering og cryo-beskyttelse
Montering af protein krystaller er en metode, der kræver nogle færdigheder i manipulation under stereomikroskop og dermed brug for nogle praksis. Vælge den optimale længde af nylon loop (eller anden løkke af valg, f.eks litholoop) for at forhindre overskud af opløsningsmiddel omkring krystal, der bidrager til background spredning og dermed en lavere signal-støjforhold af de diffraktionsdata. Den optimale loop størrelse / længde også gør fiskeri af krystallerne lettere som krystal ikke glider gennem løkken. For rPPEP-1-krystaller, som er ca. 100-200 um i den længste dimension, blev nylon sløjfer af 0,1-0,2 mm størrelse valgt. Den cryo-beskyttelsesmiddel kan også bidrage til forværring af datakvalitet, da krystallen kan støde en osmotisk chok, når de overføres til cryo-tilstand. Dette kan hindre eller endog ødelægge den indre orden af krystallen. Vælg omhyggeligt typen og koncentrationen af kryo-beskyttelsesmiddel. rPPEP-1-krystaller var cryo-beskyttet med enten 20% glycerol eller 30% saccharose. Hvis krystallisering af et substrat-peptidkompleks eller et kompleks af rPPEP 1 med en anden ligand, bør saccharose vælges som kryo-beskyttelsesmiddel glycerol binder til det primede site af substratet-bindingssted rPPEP-1 14.
strukturbestemmelse
Den Autosol opløsning opnået en Bayes-CC af 49,2 ± 18,4, en FOM (godhedstal) på 0,41, en skævhed på 0,17 og en korrelation RMS på 0,85. Modellen map korrelation er 0,86, og R / R gratis faktorer er 0,21 / 0,24. Alle disse parametre indikere en succesfuld struktur opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker personalet på beamline X06DA på den schweiziske Light Source, Paul-Scherrer-Institut, Villigen, Schweiz til støtte under indsamlingen synkrotron data. Vi er taknemmelige for Monika Gompert for fremragende teknisk support. Projektet blev støttet af universitetet i Köln og giver INST 216 / 682-1 FUGG fra forskningsrådet tysk. Et ph.d.-stipendium fra den internationale Graduate School i Udvikling Sundhed og Sygdom til CP anerkendes. Den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) i forbindelse med tilskudsaftale nr 283.570 (BioStruct-X).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genes / Vectors / cell strains | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
| E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
| Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Yeast extract | any | ||
| Tryptone | any | ||
| Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
| Agar | any | ||
| Kanamycin | any | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
| NaCl | any | Buffer grade | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | any | purest grade | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (general) | |||
| Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C - 37 °C | |
| Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L) | |
| Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
| Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150,000 x g | |
| NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
| Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
| Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO | any | ||
| UV-Vis spectrophotometer | any | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (crystallography) | |||
| Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
| Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Crystallization robot | any | ||
| 96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2 L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder - White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | any | ||
| Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
| Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
| Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |
References
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
- O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).
- Mitchell, B. G., Gardner, A. Mortality and Clostridium difficile infection: a review. Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).
- George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease. J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).
- George, R. H., et al. Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis. Br Med J. 1 (6114), 695 (1978).
- Bartlett, J. G. Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease. Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T.
- Ünal, C. M., Steinert, M. Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections. Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).
- Kelly, C. P., et al. The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes. Gastroenterology. 150 (4), S122 (2016).
- Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review. Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).
- Hensbergen, P. J., et al. Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831. FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).
- Cafardi, V., et al. Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins. PLoS One. 8 (11), e81306 (2013).
- Hensbergen, P. J., et al. A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins. Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).
- Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile. Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).
- Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).
- Bergfors, T.
- Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Kabsch, W.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- The PyMOL Molecular Graphics System. , Schrödinger, LLC. (2002).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J.
- Zwart, P. H., et al. Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).
- Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).
- Rubino, J. T., et al. Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile. J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).
- Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J.
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors. Microb Cell Fact. 4, 34 (2005).
- Stura, E. A., Wilson, I. A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).
