Introduction
Clostridium difficile es una de las principales causas de las infecciones diarrea asociada a antibióticos nosocomiales 1. Esta bacteria anaerobia Gram-positiva se transmite a través de su forma de esporas a través de la vía fecal-oral. En la última década, la nueva '' epidemia '' o '' hypervirulent '' (por ejemplo, las cepas de BI / NAP1 / 027) produjo un aumento drástico de las nuevas infecciones y las tasas de mortalidad en América del Norte y Europa 2. C. difficile enfermedad -asociado (CDAD) es una amenaza para la vida inflamación del colon con altas tasas de mortalidad 3. Los síntomas varían desde diarrea 4 a 5 colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico menudo fatal 6.
El tratamiento de la CDAD es difícil, ya que las cepas virulentas son resistentes a múltiples fármacos y la tasa de recurrencia es alto 7. En la terapia de momento incluye el metronidazol antibióticos, fidaxomicina o vancomicina, o en repetitivamente los casos recurrentes de trasplante fecal microbiota. Se necesitan con urgencia 8 nuevas estrategias terapéuticas. Algunos avances se registra como el anticuerpo monoclonal terapéutico Bezlotoxumab, apuntando a la toxina de C. difficile B 9, recientemente ha superado con éxito la fase III de ensayos clínicos y fue presentado para su aprobación por la FDA y EMA. Además, los nuevos antibióticos se están probando en el momento en diferentes etapas de los ensayos clínicos 10.
Para desarrollar un tratamiento eficaz nuevas dianas terapéuticas deben ser identificados. El recientemente descubierto C. difficile proteasa endopeptidasa-1-prolina prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) es un objetivo tan prometedor, ya que la falta de PPEP-1 en una cepa knock-out disminuye la virulencia de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 es una metaloproteasa secretada 12,13 escindir dos adhesinas de C. difficile en su C-terminal 13 liberando así la bacter adherenteia del epitelio intestinal humano. Por lo tanto, está implicado en el mantenimiento del equilibrio entre el fenotipo sésiles y móviles de C. difficile. Para desarrollar inhibidores selectivos contra PPEP-1 y para entender la forma en que reconoce sus sustratos conocimiento íntimo de su estructura tridimensional es indispensable. Hemos resuelto la primera estructura cristalina de PPEP-1 sola y en complejo con un péptido sustrato 14. PPEP-1 es la proteasa primera sabido que selectivamente escinde enlaces peptídicos entre dos residuos de prolina 15. Se une el sustrato de una manera de doble retorcido y la estabiliza a través de una red alifático-aromático prolongado de residuos localizados en el S-bucle que cubre el sitio activo de la proteasa 14. Este modo de unión al sustrato es aplicable sólo a PPEP-1 y no se encuentra en proteasas humanas hasta la fecha. Esto hace que sea un objetivo prometedor fármaco, y fuera de objetivo efectos de los inhibidores muy improbables.
Para el desarrollo y la pantalla selectiva PPEP-1 inhibitors en el futuro se necesita una gran cantidad de proteína pura y monodispersa PPEP-1. Además, para determinar el modo de unión de los primeros inhibidores, estructuras co-cristalinas con PPEP-1 tendrá que ser determinado. En nuestras manos PPEP-1 produce constantemente cristales intergrown. Por lo tanto, hemos desarrollado un procedimiento de optimización para producir monocristales calidad de difracción de PPEP-1. En este protocolo se describe en detalle la solución de producción, purificación, cristalización y la estructura de PPEP-1 14. Utilizamos la expresión intracelular en Escherichia coli de una variante PPEP-1 carece de la secuencia señal de secreción, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión de tamaño con la eliminación de la etiqueta de purificación, seguido por microsiembra 16 en una pantalla de la optimización y la determinación de la estructura a través de zinc única longitud de onda de dispersión anómala (zinc-SAD) 17. Este protocolo puede ser adaptado para la determinación de la producción y la estructura de otras proteínas (por ejemplo, </ Em> metaloproteasas) y en particular para las proteínas que producen cristales entrecrecidos. A petición, el ADN del plásmido de la construcción (pET28a-NHis-rPPEP-1) y los datos de difracción se puede proporcionar con fines educativos.
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Protocol
1. Clonación y Construir Diseño
- Clon de la secuencia de codones optimizados (para E. coli) de C. difficile PPEP-1 sin el péptido señal [los aminoácidos 27-220, llamado de aquí en adelante recombinante PPEP-1 (rPPEP-1) 11] en el vector pET28a usando Nde I y Xho I sitios de restricción (Figura 1) con un codón de parada en el (vector resultante pET28a-NHis-rPPEP-1) extremo 3 '. Esto produce una N-terminal 6xHis de etiquetado de proteínas (NHis-rPPEP-1) con un sitio de escisión de trombina que permite la eliminación de la etiqueta durante la purificación (Figura 1). El plásmido contiene un casete de resistencia a kanamicina para la selección. Los cebadores utilizados para la clonación se describen en otra parte 14.
Figura 1: Representación esquemática de la construcción de pET28a-NHis-rPPEP-1 y SDS-PAGE análisis de expresión y todas las etapas de purificación. (A) Mapa del vector del NHis-rPPEP-1 se clonó en el vector pET28a usando Nde I / Xho que creé con PlasMapper. (B) Representación esquemática de la NHis-rPPEP-1 constructo (panel superior) y la construcción final después de trombina escisión de la etiqueta 6xHis con el GSHM-secuencia adicional resultante en el extremo N-terminal (panel inferior). El análisis por SDS-PAGE (C) de la expresión en BL21 (DE3) de la estrella a 37 ° C durante 4 horas y (D) de las muestras de todas las etapas de purificación (M: marcador de peso molecular). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Expresión y purificación de rPPEP-1
- Expresión de NHis-rPPEP-1
- Maquillaje y autoclave LB (caldo lysogeny) medio (10 g / L de triptona, 5 g / L de extracto de levadura, 10 g / L NaCl, Adjust a pH 7,5 con NaOH). Suplemento con sulfato de kanamicina (50 mg / ml) justo antes de su uso (medio LB / Kan).
- Inocular un cultivo de una noche 200 ml de recién transformado E. coli en medio LB / Kan. Crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a 220 rpm.
- A la mañana siguiente, comprobar el OD 600 (densidad óptica a la longitud de onda de 600 nm) del cultivo durante la noche. Inocular 2,8 l de dos matraces que contienen de 1 l de LB / Kan medio de cada uno con el cultivo de una noche a un OD 600 de 0,1. Suplemento con tres gotas de emulsión acuosa de silicona para evitar la formación excesiva de espuma. Se cultivan las células a 37 ° C con agitación a 180 rpm hasta que la DO 600 alcanza 0,6.
- Tomar una muestra pre-inducción para el análisis de SDS-PAGE (equivalente a 1 ml de un cultivo a una DO 600 = 1); añadir IPTG a 0,5 mM de concentración final para inducir la expresión de NHis-rPPEP-1. Seguir creciendo a 37 ° C / 180 rpm durante 4 horas.
- Determinar el OD 600 en un 10x dilución y tomar una muestra de la cosecha (equivalente a 1 ml de un cultivo a una DO 600 = 1).
- Recoger las células por centrifugación durante 20 min a 7.000 xg y 4 ° C. Para eliminar los sedimentos celulares Resuspender medio LB residuales de 1 l de cultivo en 40 ml de tampón TBS (solución salina tamponada con Tris: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM) y la transferencia a un tubo de centrífuga de 50 ml. Recoger las células por centrifugación durante 10 minutos a 10.000 x g y 4 ° C y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Analizar la expresión (lisados totales y fracciones solubles) por medio de SDS-PAGE 18.
- Purificación de no etiquetado rPPEP-1
- Tomar 50 muestras l de cada etapa de purificación para el análisis SDS-PAGE. Resuspender el sedimento celular de 1 l de cultivo en tampón TBS suplementado con 10 mg / ml DNaseI. Usar 5 ml de TBS / ADNasa I por g de células.
- Lisan las células por sonicación en hielo / agua usando 30% de amplitud durante 15 minutos (2 impulsos por segundo con pausa de 2 segundos). Eliminar los residuos por centrifugation durante 10 min a 10.000 xg y 4 ° C y la transferencia de sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga. lisado claro en una ultracentrífuga durante 30 minutos a 165.000 x g y 4 ° C.
- Trabajar a 4-6 ° C. El uso de un sistema de bomba peristáltica o cromatografía equilibrar 2 ml de resina de níquel-ácido nitrilotriacético (NiNTA) en una columna de vidrio con tampón TBS suplementado con 10 mM de imidazol pH 7,5. Como alternativa, utilice el flujo por gravedad.
- Ajuste el lisado aclarado con 1 M imidazol pH 7,5 a una concentración final de 10 mM. Aplicar el lisado a la columna y lavar por etapas con tampón TBS suplementado con 10 mM e imidazol 30 mM, respectivamente, hasta que la absorción UV a 280 nm ha llegado a la línea de base.
- Eluir la proteína con tampón TBS más imidazol 250 mM. Re-equilibrar la columna de TBS suplementado con imidazol 10 mM y almacenar durante la noche.
- Determinar la concentración de proteína, ya sea a 280 nm utilizando el coefi extinciónciente de 25.900 M-1 cm-1 o por cualquier otro método (por ejemplo, método de Bradford 19). Añadir 2 unidades de trombina por mg de proteína y dializar la solución de proteína durante la noche a 4 ° C contra un volumen 50x de TBS (50x del volumen de elución NiNTA).
NOTA: Tome el blanco correcto para la determinación de la concentración de proteína, como imidazol absorbe fuertemente a 280 nm. - Pasar la solución de proteína sobre la resina NiNTA equilibrada para eliminar la proteína sin escindir. A continuación, se aplica el mismo volumen de TBS suplementado con imidazol 10 mM a la columna para recuperar toda la proteína escindida. Para limpiar la columna, eluir todas las proteínas restantes con imidazol 250 mM. Analizar las muestras a través de SDS-PAGE (Figura 1).
- Se concentra la solución de proteína a 4 ml en intervalos de 10 min a 4.000 xg y 4 ° C utilizando una unidad de ultrafiltración centrífuga. Mezclar la proteína concentrando después de cada intervalo para prevenir la precipitación y agregación. En este paso ocasionalLy alguna precipitación se observa para rPPEP-1 a pesar del procedimiento de mezcla.
- Aplicar la proteína concentrada a una columna de cromatografía de exclusión molecular, equilibrada previamente (en tampón TBS) a 4-6 ° C. La elución de la columna con tampón TBS, recoger fracciones de 1 ml y 5 sujetos l de cada fracción de segundo análisis de SDS-PAGE. rPPEP-1 eluye en un solo pico que corresponde a un monómero (Figura 2). De vez en cuando un pico menor en el peso molecular más grande se observa (pico frente), que corresponde a un dímero de la proteína. El rendimiento debe ser alrededor de 50 mg de proteína pura por litro de cultivo. Analizar todas las muestras a través de SDS-PAGE al 18 (Figura 2).
- Tomar 50 muestras l de cada etapa de purificación para el análisis SDS-PAGE. Resuspender el sedimento celular de 1 l de cultivo en tampón TBS suplementado con 10 mg / ml DNaseI. Usar 5 ml de TBS / ADNasa I por g de células.
Figura 2: cromatografía de exclusión Representante y SDS-PAGE análisis de rPPEP-1. cromatograma de exclusión por tamaños (A280; la absorbancia a 280 nm) de rPPEP-1 sin etiqueta purificada usando un 16/600) columna (en Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM a 6 ° C. Basado en el volumen de elución, rPPEP-1 migra como era de esperar para una proteína de 22 kDa, sugiriendo que es predominantemente monomérica. Rara vez un pico menor fronting parece que corresponde a un dímero. (Recuadro) análisis SDS-PAGE de las fracciones de cromatografía de exclusión molecular (M; marcador de peso molecular). se aplica Cada segunda fracción. Las bandas débiles por debajo de la principal banda de rPPEP-1 corresponden a de vez en cuando se producen impurezas menores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. La cristalización y la optimización del uso de Crystal microsiembra
NOTA: rPPEP-1 cristaliza a partir de las condiciones que producen constantemente cristales altamente intergrown no adecuados para el análisis de difracción de rayos X (Figura 3). Por lo tanto, una estrategia de optimización (Figura 4) fue desarrollado para obtener cristales de alta calidad (Figura 5).
- La selección inicial de rPPEP-1 utilizando pantallas comerciales
NOTA: Realizar ensayos de cristalización en el formato de caída que se sienta usando pantallas disponibles en el mercado estándar y un robot de cristalización.- Se concentra la proteína purificada a 12 mg / ml usando un dispositivo de ultrafiltración centrífuga en intervalos de 5 minutos a 4000 xg y 4 ° C. Mezclar la proteína concentrando después de cada intervalo para prevenir la precipitación y agregación. Determinar la concentración de proteína, ya sea a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción de 25.900 M -1 cm -1 o por cualquier otro método (por ejemplo, método de Bradford). Equilibrar la proteína a 20 ° C. Despejar todas las partículas y el polvo mediante centrifugación durante 10 minutos a 16.000 x g y 20 ° C.
- O bien utilizar placas de cristalización ya precargadas SEaled y se almacenó a 4 ° C o llenar los pozos de depósito de las placas con 70 l de todas las condiciones de cristalización. Permitir que todos los platos de cristalización a 20 ° C. Trabajar con rapidez, ya que los volúmenes pequeños se secan rápidamente. Utilizar una cámara de humedad alrededor del muelle del robot, si es posible.
NOTA: Utilice las siguientes pantallas como un procedimiento estándar: SaltRx, Índice, PEG / Ion, Crystal, mago, PACT ++, JCSG ++. - Configurar la pantalla con la pipeta y el depósito de proteínas en subwells 2-4. volumen de la gota es de 300 nl y las relaciones (proteína: reservorio) son 200: 100 (subwell 2), 150: 150 (subwell 3) y 100: 200 (subwell 4) (en nl). Cerrar inmediatamente la placa y el lugar en una cámara a 20 ° C.
- Inspeccionar bandejas inmediatamente después de la puesta a punto, y luego inspeccionar todos los días durante la primera semana, seguido de la inspección semanal.
- Co-cristalización de rPPEP-1 con ligandos
- Para la co-cristalización de los complejos péptido-1-rPPEP sustrato mezclar rPPEP-1a 24 mg / ml en una proporción de 1: 1 (v / v) con un exceso molar de 7 veces de la solución de péptido (Ac-EVNPPVPD-NH 2) polvo liofilizado solubilizado en tampón TBS), que dará una concentración final de 12 / ml de proteína r-PPEP-1 mg y un exceso molar de 7 veces de péptido sobre PPEP-1. Incubar durante 30 min a 20 ° C y se libera de todas las partículas y el polvo por centrifugación durante 10 min a 16.000 xg y 20 ° C. Proceder con la cristalización utilizando el procedimiento microsiembra que se describe para la proteína no unida r-PPEP-1.
Figura 3: cristales representativos de pantallas iniciales. cristales intercrecida de rPPEP-1 a 12 mg / ml cultivan en condiciones. (A) Pantalla de Cristal I / 38 (citrato de sodio 1,4 M tribásico deshidratar, HEPES 0,1 M pH de sodio 7,5; 200 nl: 100 nl). / 52 (DIB fosfato 2,4 M de amonio (B) Pantalla SaltRxASIC, 0,1 M Tris pH 8,5; 100 nl: 200 nl) y (C) (200 nl: 100 nl). (D) pantalla SaltRx / 96 (60% v / v Tacsimate pH 7,0, 0,1 M BIS-TRIS propano pH 7,0; 200 nl: 100 nl). La barra de escala = 0,2 mm. relaciones de volumen son siempre proteínas: depósito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Procedimiento para la optimización del rPPEP-1 cristalización. cristales iniciales de rPPEP-1 a 12 mg / ml de baja calidad de difracción y con múltiples celosías (intergrown) se reproducen en una pantalla de optimización 24-condición. Una vez más, sólo se observaron cristales intergrown en condiciones que contienen fosfato dibásico de amonio 2,55 M. Un lote de semillas se preparó a partir de un único cristal intergrown y se diluyó 1: 1000 en el mismo Condition (microsiembra). Se añadió un volumen de 0,5 l de stock de semillas diluido en las gotas claras restantes y monocristales creció en casi todas las condiciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Optimización de cristal usando microsiembra
NOTA: cristales altamente intercrecida de rPPEP-1 aparecen después de dos días en una condición que contiene dibásico 2,4 M fosfato de amonio, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 (pantalla SaltRx, condición E4, los tres subwells) (Figura 3). Un procedimiento de optimización utilizando un tamiz de malla alrededor de la condición inicial combinado con microsiembra se aplicó (Figura 4).- Preparar una pantalla de rejilla (Figura 4) que comprende 24 condiciones con 1,8 - 2,55 m de fosfato dibásico de amonio (en pasos de 0,15 M) y 0,1 M Tris-HCl pH 7,5-9,0 (en pasos de 0,5 unidades de pH) desde approprisoluciones comió acciones (4 M de fosfato de amonio y 1 tampones Tris).
NOTA: Utilice el applet de la bandeja Marca (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) para calcular los volúmenes y el esquema de pipeteo para obtener 2 ml de cada condición que permite realizar 10 pantallas de optimización. El fosfato de amonio 4 M de solución madre es difícil de preparar. Calentar la solución durante la agitación para disolver completamente el polvo en agua. - Pipetear 200 l de cada solución de pantalla de rejilla en los pocillos de una placa de 24 pocillos y se equilibre a 20 ° C.
- Configuración manual de la placa de cristalización. El volumen de la gota es 3 l y las relaciones (proteína: de depósito) son 2: 1, 1,5: 1,5 y 1: 2 (en l). Aquí, utilizar una pipeta de desplazamiento positivo para evitar la formación de burbujas de aire. Cerrar inmediatamente la placa y el lugar en una cámara a 20 ° C. Evitar la formación de burbujas de aire.
NOTA: Después de uno a cuatro días cristales altamente intergrown aparecen en las cuatro condiciones que contienen pho 2,55 M de amoniodibásico sphate y 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 a 9,0 (Figura 4). No se forman cristales en las 20 condiciones restantes con concentraciones de fosfato de amonio por debajo de 2,55 M. El procedimiento de microsiembra se utiliza para obtener cristales simples de rPPEP-1 en estas condiciones. - Preparar una microseed de stock de cosecha de un solo cristal intergrown de una de las dos condiciones con fosfato dibásico de 2,55 M de amonio y 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 o 8,5. Los cristales pueden estar unidos a la superficie de plástico. deformación cuidado del plástico que rodea con una aguja de acupuntura ayuda a desprender los cristales.
- Transferencia de 50 l de la respectiva licor madre en un tubo de 1,5 ml que contienen una pequeña perla de cristal pulido (cuentas-de-semillas). El uso de un bucle de nylon montado transferir el cristal en 1 l de la solución madre colocadas en un portaobjetos de cubierta de vidrio.
- Transferir el líquido que contiene el cristal en el tubo y agitar a alta velocidad durante 30 seg. Hacer una mezcla 1:1000 dilución de la población de semillas en un nuevo tubo de 1,5 ml que contiene la misma condición recién preparada y agitar a fondo durante 5 segundos.
NOTA: Las existencias de semillas pueden ser almacenadas a -80 ° C para su uso posterior.
- Retire el sello de la placa que cubre las 20 condiciones con gotas claras y pipeta de 0,5 l de la reserva de semillas (dilución 1: 1.000) en los pocillos. Sellar la placa y el lugar en una cámara a 20 ° C. Monocristales de la calidad de difracción de alta aparecen en 2-7 días (Figura 5).
- Preparar una pantalla de rejilla (Figura 4) que comprende 24 condiciones con 1,8 - 2,55 m de fosfato dibásico de amonio (en pasos de 0,15 M) y 0,1 M Tris-HCl pH 7,5-9,0 (en pasos de 0,5 unidades de pH) desde approprisoluciones comió acciones (4 M de fosfato de amonio y 1 tampones Tris).
Figura 5: cristales representativos de optimización de la pantalla. Cristales individuales de rPPEP-1 a 12 mg / ml se sembró con 1: 1000 dilución de semillas cultivadas en las condiciones siguientes: (A) fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 l: 1,5 l; (B) Fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 l: 1 l; (C) fosfato dibásico de 2,25 M de amonio, 0,1 M Tris pH 8; 2 l: 1 l; (D) fosfato dibásico de amonio 2.1 M, 0.1 M Tris pH 8; 1 l: 2 l. (E) de cristal montado en bucle de nylon 0,1 a 0,2 micras, que se cultiva en fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 8 (2 l: 1 l) y crio-protegida en fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 8, 20% de glicerol. La barra de escala = 0,2 mm en (AD). ración de volumen son siempre proteínas: depósito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Cristal de montaje y de Recogida de Datos
NOTA: Para obtener la mejor calidad de los cristales de datos de difracción se debe montar en el pico de su calidad y tamaño. Los cristales se pueden almacenar en nitrógeno líquido hasta que are sometido a análisis de difracción de rayos X a 100 K. Por lo tanto, la condición de la que se originan se debe ajustar para crio-condiciones. cristales rPPEP-1 pueden ser por adición de 20% de glicerol o 30% de sacarosa (sustitución de agua en la condición por la crio-protector) protegido crio.
- montaje de cristal
NOTA: Todas las etapas de manipulación de cristal deben llevarse a cabo bajo el microscopio estereoscópico.- Elige el tamaño óptimo de bucle de nylon para la longitud máxima de los cristales elegidos. La típica eje más largo de cristales rPPEP-1 es de aproximadamente 100-200 micras (Figura 5). Preparar un portaobjetos de cubierta y la crio-condición apropiada (por ejemplo dibásico de amonio 2,1 M de fosfato, Tris 0,1 M, pH 8,0, glicerol al 20%).
- Llenar los termos de espuma con nitrógeno líquido, cargar la pinza vial con un vial y pre-enfriarlo en el termo de espuma de 800 ml llena de nitrógeno líquido. Colocar una manga crio y un soporte de caña de crio marcado con un identificador adecuadoDewar en espuma de 2 litros llena de nitrógeno líquido. Cargar la varita magnética con un lazo de nylon montado.
NOTA: Use ropa protectora (eyeshield / gafas, guantes) cuando se trabaja con nitrógeno líquido. objetos calientes sumerge en nitrógeno líquido puede producir derrames.
- Llenar los termos de espuma con nitrógeno líquido, cargar la pinza vial con un vial y pre-enfriarlo en el termo de espuma de 800 ml llena de nitrógeno líquido. Colocar una manga crio y un soporte de caña de crio marcado con un identificador adecuadoDewar en espuma de 2 litros llena de nitrógeno líquido. Cargar la varita magnética con un lazo de nylon montado.
- Cortar y abrir la cinta de sellado con un bisturí afilado y quitarlo con los fórceps. Pipeta de 1 l de la crio-condición en la diapositiva de la cubierta (o, alternativamente, en un pozo vacío en el mismo plato) y retirar el cristal de la caída de la pesca con el lazo de nylon montadas (Figura 5). cristales unidos pueden separarse fácilmente del suelo mediante la deformación del plástico que rodea con una aguja de acupuntura.
- transferir rápidamente el cristal de la gota de la crio-estado y dejar reposar y estabilizar durante 1 segundo. Pescar el cristal a cabo lo más rápidamente posible y de inmersión congelación en nitrógeno líquido.
- Cuando el nitrógeno líquido alrededor del circuito montado deja de ebullición, colocar el bucle en el vial.Colocar el vial en el soporte de la caña de crio y cuando está cargado con 6 viales colocar un manguito crio alrededor del soporte. Guarde los cristales en un tanque lleno de nitrógeno líquido hasta su uso.
- Elige el tamaño óptimo de bucle de nylon para la longitud máxima de los cristales elegidos. La típica eje más largo de cristales rPPEP-1 es de aproximadamente 100-200 micras (Figura 5). Preparar un portaobjetos de cubierta y la crio-condición apropiada (por ejemplo dibásico de amonio 2,1 M de fosfato, Tris 0,1 M, pH 8,0, glicerol al 20%).
- Recopilación de datos
NOTA: La recolección de datos puede llevarse a cabo en el difractómetro casa, si está disponible, o en una línea de luz de sincrotrón. Para los datos rPPEP-1 se recogieron en la línea de luz X06DA de la fuente luminosa suizo, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suiza usando un detector de recuento de fotones híbrido. Los datos originales y todos los archivos que se utilizan en la determinación de la estructura pueden ser disponibles bajo petición.- Configurar la longitud de onda del haz a 1.282 Å (9667 keV), que es la energía característica de rayos x borde de absorción (pico) del elemento de zinc. rPPEP-1 es una metaloproteasa que contiene un solo zinc por molécula en el sitio activo.
- Recoger los datos a 100 K en el modo inverso del haz en 10 ° cuñas para un total de 270 ° en cada directionorte. El tiempo de exposición es de 0,1 segundos con 0,1 ° de rotación por imagen. Establecer la transmisión al 14% (0,14).
- Para recoger un conjunto de datos de alta resolución nativa de un segundo cristal procedente de la misma condición de cristalización configurar la longitud de onda del haz a 1,00 Å (12.398 keV). Recoger datos a 100 K. El tiempo de exposición es de 0,1 segundos con 0,1 ° de rotación por imagen. Establecer la transmisión al 70% (0,7).
5. Determinación de la estructura a través de Zinc-SAD
NOTA: Con el fin de determinar la estructura de rPPEP-1 a través de zinc-SAD se necesita algún conocimiento básico cristalográfica, así como los paquetes de software XDS 20, Phenix 21 y el programa Coot 22. Para la visualización de las estructuras se necesita el programa PyMOL 23 o 24 de la quimera. Los datos recogidos en la longitud de onda correspondiente al pico en el borde de absorción del elemento de zinc se pueden utilizar para una sola longitud de onda disp anómalaersion (SAD) 25 para obtener información de fase que puede ser extendido para todos los átomos de la proteína.
- Procesamiento de datos
- Procesar los dos conjuntos de datos de pico (normales e inversas) utilizando el software XDS (alternativamente iMosflm o HKL3000) en el grupo espacial P2 1 2 1 2 1 (grupo espacial 19) que separan los ayudantes del Friedel (datos anómalos). Los parámetros de la celda unidad debe estar alrededor de a, b, c (a) = 43.17, 71.68, 117.70 y α = β = γ (°) = 90. Esto da dos HKL-files (archivos de reflexión).
- Inspeccionar el CORRECT.LP archivo. Utilizar los datos hasta la resolución en la que el CC media es de al menos 50%. Escalar juntos ambos conjuntos de datos / archivos reflexión (HKL-archivos) utilizando XSCALE. Inspeccionar el XSCALE.LP archivo. Compruebe hasta dónde se extiende la señal anómala (SigAno) y tenga en cuenta la resolución con una correlación anómala (anomal Corr) de alrededor de 30%, que es de 2 A en el caso de los datos utilizados aquí recogidos a 1,67 Å. Este es elresolución de corte de la señal anómala utilizado en Phenix AUTOSOL.
- Convertir el (reducido) HKL-archivo en un archivo de formato reflexión CCP4 (con nombre, por ejemplo, peak_anom.mtz) mediante la creación de un subconjunto XDSCONV libre R de 5% y el mantenimiento de los datos anómalos (FRIEDEL'S_LAW = FALSO). Compruebe el MTZ-archivo para mantener la coherencia con el programa mtzdmp la inspección de los parámetros de la unidad de celda, el grupo espacial y la existencia del subconjunto R libre (etiqueta FreeRflag) y los datos anómalos (etiquetas DANO / SIGDANO). Prepara también un MTZ-archivo adicional con XDSCONV sin necesidad de extraer los datos anómalos (FRIEDEL'S_LAW = TRUE; llamado, por ejemplo, peak_native.mtz) para el refinamiento en una etapa posterior.
- Solución subestructura (determinación de fase)
- Ejecutar Phenix AUTOSOL utilizando el archivo de peak_anom.mtz reflexión. Seleccionar pico SAD / MAD como tipo de datos y elegir 2 sitios de zinc (ya que hay dos moléculas por unidad asimétrica). Elegir entre el expe más exactalos valores mentales para el theotetical los valores de f '/ f' '(parámetros determinados en un análisis de fluorescencia a la línea de luz) o f' = -8,245 y f '' = 3.887. También cargar el archivo FASTA que contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína cristalizada.
- Establecer el límite de resolución a la resolución con una correlación anómala (anomal Corr) de aproximadamente el 30% (determinada en 5.1.2), en este caso 2 a y seleccione la opción "modelo autobuild". El uso de las fases de los dos sitios de zinc que se encuentran por Phenix HySS (parte de la tubería Phenix AUTOSOL) las fases de la proteína entera podría ser deducido y el modelo construido (por Phenix RESUELVEN) en la densidad de electrones. El mejor modelo es llamado "overall_best.pdb".
- La construcción de modelos, el refinamiento y la validación
- Seleccionar la opción "modelo autobuild" para construir la mayor parte del modelo de rPPEP-1 de forma automática. Inspeccionar la densidad electrónica en el 1,0 σ nivel de contorno utilizando el program Coot (Figura 6). Debe ser conectivo y que rodea a los átomos del modelo. Lo ideal sería que también algunas moléculas de agua deben ser incorporados en el modelo (con una resolución mejor que 2,5 Å). agua a granel (espacio entre las moléculas) no debe contener densidad.
- Comprobar si todo el modelo es (todos los aminoácidos incorporados en la densidad de electrones) completos. Si no es así, construir manualmente utilizando las herramientas proporcionadas por la focha. Refinar la estructura mediante la ejecución de rondas de reiteración de Phenix Refinar con 5 refinamiento redondea cada uno usando el archivo de modelo overall_best.pdb, el archivo peak_native.mtz reflexión y el archivo de secuencias FASTA; y la creación manual de modelo en la focha.
- Validar la calidad del modelo estructural con las respectivas herramientas de Coot.
Figura 6: mapa de densidad electrónica experimental y el modelo de rPPEP-1 después de laPhenix Autosol ejecutar. la densidad de electrones en azul en un nivel de 1,0 σ contorno que se muestra en la Focha programa. En este mapa inicial de la densidad electrónica está muy bien resuelto y el modelo a construir en la densidad de electrones. El zoom en muestra los residuos His142 y Glu189, así como una molécula de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Estructura Determinación de alta resolución a través de la sustitución molecular
NOTA: Con el fin de obtener una alta resolución de información estructural sobre rPPEP-1 nativo de un conjunto de datos se recoge. A continuación, se emplea un procedimiento de reemplazo molecular utilizando el software de 26,27 Phaser (dentro del paquete de software de Phenix) usando la estructura determinada a través de zinc-SAD como modelo. Este procedimiento también se puede utilizar más tarde, cuando la solución de estructuras de rPPEP-1 complejados con moléculas pequeñas.
- Para obtener una estructura cristalina con una resolución más alta (en este caso hasta 1,4 Å) procesar el conjunto de datos nativo usando el software XDS (alternativamente iMosflm o HKL3000) en el grupo espacial P2 1 2 1 2 1 (grupo espacial 19). Los parámetros de celda unidad deben estar cerca de a, b, c (a) = 43.17, 71.77, 117.80 y α = β = γ (°) = 90. Esto da una HKL-files (archivos de reflexión).
- Inspeccionar el CORRECT.LP archivo. Utilizar los datos hasta la resolución en la que el CC media es de al menos 50%. Convertir el archivo de HKL en un archivo de reflexión CCP4-formato (con nombre, por ejemplo, native.mtz) utilizando XDSCONV la creación de un subconjunto libre R de 5%. Compruebe el MTZ-archivo para mantener la coherencia con el programa mtzdmp la inspección de los parámetros de la celda unidad, el grupo espacial y la existencia del subconjunto R libre (etiqueta FreeRflag).
- Preparar el archivo PDB contiene el modelo de overall_best.pdb determinado anteriormente y eliminar todas las moléculas de agua y todos los ligandos (es decir,. el átomo de zinc). También cargar el archivo FASTA que contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína cristalizada. Phaser ejecutar en Phenix utilizando el archivo de native.mtz reflexión. Búsqueda de dos moléculas por unidad asimétrica.
- Después exitosa resolución de la estructura (TFZ puntuación mayor que 8; aquí 10.2) inspeccionar el modelo (llamado native_phaser.1.pdb) y el mapa de densidad de electrones en la focha. Construir y refinar la estructura mediante la ejecución de rondas de reiteración de Phenix Refinar con 5 refinamiento rondas cada uno usando el archivo de modelo native_phaser.1.pdb, el archivo de la reflexión native.mtz y el archivo de secuencia FASTA; y la creación manual de modelo en la focha.
- Validar la calidad del modelo estructural con las respectivas herramientas de Coot.
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Representative Results
rPPEP-1 se sobreexpresa en varias cepas de E. coli, con el rendimiento más alto en E. coli BL21 (DE3) Star (Figura 1C). Después de la primera etapa de cromatografía de afinidad NiNTA la etiqueta 6xHis se puede escindir con éxito de la mayoría de la proteína y en el segundo paso NiNTA proteína no digerida se puede separar completamente de la proteína trombina digerido (Figura 1D). En una columna S200 16/600 rPPEP-1 sin etiqueta migra como monómero con al frente de vez en cuando, probablemente, la mayor parte corresponde a las especies diméricas (Figura 2A). La proteína es puro (Figura 2B) y el rendimiento es de aproximadamente 50 mg de proteína de 1 L de cultivo de E. coli. rPPEP-1 cristaliza en diversas condiciones (Figura 3), que a menudo contienen fosfato. Los cristales son muy intercrecido en todas las condiciones, por lo que la optimización de cristal tuvo que ser realizado. La Figura 4 representa la scheme del procedimiento de optimización lleva a cabo para los cristales procedentes de condición de pantalla comercial SaltRx E4 (52) (Figura 3B-C). Una vez más cristales intercrecido aparecieron en pozos A6-D6 (Figura 4). Un microseed Se preparó a partir de cristales que crecen en condiciones C6 (fosfato dibásico de amonio 2,55 M, Tris 0,1 M pH 8,5) de la pantalla optimización y diluido 1: 1.000 en aguas madres. Dos a siete días después de la siembra con el stock de semillas diluido en los otros 20 restantes condiciones con clara gotas grandes cristales de un solo reticulares de difracción de alta calidad se observaron (Figura 5) en la mayoría de las gotas. Después del montaje de los cristales en bucles de nylon (Figura 5E) datos de difracción a 1,67 Å de resolución se recogieron para la determinación de la estructura a través de zinc-SAD (Tabla 1), con una señal anómala que se extiende a 2 Å. Además, se recogieron datos de difracción nativa a 1,4 Å de resolución para la determinación de un higestructura de h-resolución (Tabla 1). La estructura cristalina de rPPEP-1 podría ser resuelto (Figura 6) y el modelo de la estructura nativa refinado a R / r factores gratuitas de 0,156 / 0,182 a 1,4 Å de resolución (AP ID: 5A0P) 14 (para un mayor refinamiento estadísticas ver Tabla 1).
| Estructura / fuentes | pico de Zn-SAD | nativo |
| Recopilación de datos | ||
| grupo espacial | P2 1 2 1 2 1 | P2 1 2 1 2 1 |
| a, b, c (Å) | 43.17, 71.68, 117.70 | 43.17, 71.77, 117.80 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 90, 90, 90 | |
| Longitud de onda (Å) | 1.28254 | 1 |
| Resolución (Å) | 45.5-1.67 (1.72-1.67) | 45.5-1.40 (1.49-1.40) |
| No. de observaciones | 779717 (34025) | 310074 (45851) |
| No. de reflexiones únicas | 80960 (5597) | 71874 (11172) |
| Multiplicidad | 9,6 (6,1) | 4.3 (4.1) |
| Exhaustividad (%) | 99,2 (93,0) | 98,2 (95,6) |
| Rmerge (%) | 6.8 (56.5) | 5.2 (52.6) |
| <I / σ (I)> | 21.86 (2.81) | 15.66 (2.48) |
| CC (1/2) (%) | 100 (85.1) | 99,9 (85,5) |
| estadísticas de refinamiento | ||
| R work / R libre d (%) | 15.60 / 18.17 | |
| No. de átomos de la proteína no-H | 3109 | |
| No. de moléculas de agua | 532 | |
| No. de iones / átomos pesados | 2 Zn | |
| No. de otras moléculas | - | |
| Nº de grupos TLS / cadena | 9 | |
| desviaciones de la raíz cuadrada de la media | ||
| longitudes de enlace) (A | 0,006 | |
| ángulos de enlace (°) | 1.022 | |
| Factor medio B (A 2) | ||
| Todos los átomos de la proteína | 16.12 | |
| Agua | 29.74 | |
| otros átomos | 10.12 | |
| Ramachandran parcela e (%) | ||
| Más favorecido | 98.72 | |
| Además permitido | 1.28 | |
| No permitido | 0 | |
| AP entrada | 5a0p |
Tabla 1: Recopilación de datos y estadísticas de refinamiento.
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Discussion
La cristalografía de rayos X sigue siendo el método más rápido y más preciso para determinar las estructuras tridimensionales de resolución casi atómica de proteínas 28. Sin embargo, requiere el crecimiento de cristales únicos bien ordenadas. Estos a menudo son difíciles de conseguir y el estado cristalino es artificial. Sin embargo, una comparación de las estructuras de proteínas determinadas por cristalografía de rayos X con los determinados por otros métodos, especialmente NMR, muestra generalmente una muy buena concordancia. En el caso de PPEP-1, una estructura de RMN publicados recientemente 29 muestra excelente acuerdo con nuestra estructura de cristal 14, incluyendo la movilidad de la S-bucle.
Este protocolo describe la producción y purificación de N-terminal marcada con His proteína rPPEP-1 para estudios estructurales y la determinación de cristalización y la estructura de rPPEP-1 sin etiqueta. monocristales eran difíciles de cultivar en este caso y requieren un procedimiento especial microsiembra. en tlo siguiente sección vamos a discutir los resultados de PPEP-1 e indicar cómo el protocolo podría ser adaptado para la producción y la cristalización de cualquier otra proteína.
Las variaciones en el diseño construcción y expresión
rPPEP-1 se expresa como un N-terminal de His variante (Figura 1A), como para la cristalización es preferible quitar la etiqueta de His por la trombina digerir debido a su posible impacto en el éxito de cristalización y estructura de la proteína 30. Para otras proteínas, puede ser aconsejable para probar adicionalmente un C-terminal marcada con His versión (por ejemplo clonados utilizando los mismos sitios de restricción, el vector pET22b y un cebador inverso sin codón de parada en el extremo 3 ') o para salir de la N-terminal His-tag no escindido, como en algunos casos, una etiqueta puede ayudar durante la cristalización. Para rPPEP-1 el rendimiento y la estabilidad de una construcción de C-terminal Su-etiquetados era inferior. Además, un ensayo inicial de s mejoresexpresión de la proteína oluble debe ser incluido en las siguientes cepas de E. coli: BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS o Lemo21 (DE3), BL21 (DE3) codón más RIPL o Rosetta 2 (DE3), BL21 (DE3) y la estrella C41 (DE3) a tres temperaturas diferentes tiempos de incubación / (3-4 horas a 37 ° C, 5 horas a 30 ° C y durante la noche a 20 ° C). Antes de la clonación, la verificación de la existencia de un sitio de escisión de trombina interna con la función ExPASy PeptideCutter 31 para evitar la escisión de la proteína de interés. Alternativamente, existen vectores disponibles que proporcionan un sitio de escisión para HRV3C (es decir, de EMBL pETM-14 32) o TEV proteasa (es decir, de EMBL pETM-11).
purificación de proteínas
Para rPPEP-1 construye la lisis celular se lleva a cabo a través de sonicación en hielo / agua. Para las proteínas más sensibles que tienden a agregarse o precipitar un método de lisis celular más "suave" que implica un disruptor celular podría ser el usore. Compruebe que grandes cantidades de proteína insoluble después de la primera etapa de centrifugación, que no son detectadas cuando se utiliza el método de lisis tal como la lisis celular química. Para la purificación de rPPEP-1 generalmente se usaron 2 ml de la resina NiNTA. Lea las instrucciones del fabricante en lo grande que es la capacidad de unión a proteínas de la resina elegida y ajustar en consecuencia. En las primeras purificaciones de rPPEP-1, donde sólo se utilizó 1 ml de resina, una gran cantidad de proteína no se unió a la columna y se encontró en el paso de flujo (Figura 1D). Por otra parte el uso de demasiado resina podría reducir la pureza de la proteína purificada. Ajustar la concentración de imidazol a la afinidad de unión de la construcción marcada con His utilizada para la matriz NiNTA. Se prefiere un procedimiento de lavado por pasos aquí (es decir, 10 mM, 30 mM, 50 mM, imidazol 70 mM), en el que se controla la A280 y se le permite llegar a la línea de base durante cada paso. De ese modo no se pierde proteína, aunque sería eluir durante unaalta paso imidazol de lavado (por ejemplo, a 50 ó 70 mM). En el caso de NHis-rPPEP-1 ya un poco de proteína eluye a imidazol 30 mM, pero no está claro qué tipo de especies proteicas que representa. Algunas proteínas precipitan / agregado cuando imidazol se dializa o se diluye de la solución de proteína. En tales casos, reducir la concentración de imidazol en el tampón de elución a 150 mM y el tiempo de exposición a altas concentraciones de imidazol, por ejemplo, disminuir la concentración de imidazol por elución en un vaso de precipitados que contiene un volumen de 5 a 10 veces de tampón de imidazol sin comparación con el volumen de elución estaba previsto. Para NHis-rPPEP-1 de la incubación con 2 unidades de trombina por mg de proteína durante la noche a 4 ° C son suficientes para escindir el His-tag a casi 100%. Ajustar la cantidad de trombina de la proteína de interés mediante el uso de 1-10 unidades por mg de proteína a 4 ° C a 20 ° C. Cuando la concentración de la proteína usando una unidad de ultrafiltración centrífuga pausa en intervalos de 5-10 minutos y mezclar el protein para homogeneizar el gradiente de concentración se acumule en el concentrador. De lo contrario proteína altamente concentrada podría agregar / precipitado.
Cristalización
rPPEP-1 produce constantemente cristales altamente intercrecido (cristales individuales creciente en la parte superior de la otra, por lo tanto tener múltiples redes cristalinas) que no son adecuados para el análisis de difracción de rayos X. La explicación podría ser que demasiados eventos de nucleación están sucediendo en la zona de la nucleación del diagrama de fases (Figura 7).
Figura 7: Diagrama de fase de un experimento de cristalización de proteínas. Cristales sólo pueden formar, cuando está sobresaturada la proteína. La nucleación tiene lugar en la zona de nucleación y crecimiento de cristales en la zona metaestable. Cuando una proteína es insuficientemente saturada, la caída va a quedar claro.
El procedimiento se puede usar para co-cristalizar producto-péptidos y sustrato-péptidos de rPPEP-1. Cristales en grupo espacial P2 1 diffracting hasta 1,25 Å se obtuvieron de las existencias de semillas diluido 1: 250 en el procedimiento de optimización. Los cristales crecen en los dos grupos de espacio P2 1 2 1 2 1 (proteína no unida) y P2 1 (estructuras complejas), mientras que se origina a partir de condiciones muy similares dentro de la pantalla de fosfato de amonio del procedimiento de optimización. Debido a la empaquetamiento cristalino que se encuentra en ambas formas cristalinas r-PPEP-1, principalmente todas las moléculas pequeñas y péptidos que abordan el lado sin imprimación del sitio activo por sí sola podría ser soakeD en los cristales. Este lado de la molécula es accesible desde el disolvente presente en el cristal. Sin embargo moléculas que abordan ambas sub-sitios o el lado imprimado sólo tienen que ser co-cristalizado con rPPEP-1, ya que al abrir S-bucle que se requeriría para acomodarlos en el sitio activo. Además, rPPEP-1 se pone en contacto por las moléculas vecinas en la salida desde el sitio de unión al sustrato cerca de la S3'site (promoción de contactos de cristal en esta zona) - un hecho que también limita la longitud de los péptidos de sustrato para 3 residuos en el lado imprimado en estas dos formas de cristal.
Montaje de cristal y de protección de la crio
El montaje de los cristales de proteínas es un método que requiere cierta habilidad en la manipulación bajo el microscopio estereoscópico y por lo tanto necesita un poco de práctica. Elegir la duración óptima del aro de nylon (u otro bucle de elección, por ejemplo litholoop) para evitar el exceso de disolvente alrededor del cristal que contribuye a background dispersión y por lo tanto una señal inferior a la proporción de ruido de los datos de difracción. El tamaño de bucle / longitud óptima también hace que la pesca de los cristales más fácil ya que el cristal no se deslice a través del bucle. Para cristales rPPEP-1, que son alrededor de 100 a 200 micras de la dimensión más larga, se eligieron los bucles de nylon de tamaño de 0,1 hasta 0,2 mm. El crio-protector también puede contribuir al empeoramiento de la calidad de los datos, como el cristal puede encontrar un choque osmótico cuando se transfiere a la crio-condición. Esto puede dificultar o incluso destruir el orden interior del cristal. seleccionar cuidadosamente el tipo y la concentración del crioprotector. cristales rPPEP-1 eran, ya sea con 20% de glicerol o 30% de sacarosa protegido crio. Si la cristalización de un complejo o un complejo de sustrato-péptido de rPPEP-1 con otro ligando, sacarosa debe ser elegido como crio-protector como glicerol se une al sitio imprimada del sitio de unión al sustrato de rPPEP-1 14.
determinación de la estructura
La solución AUTOSOL obtuvo una BAYES-CC de 49,2 ± 18,4, un FOM (factor de calidad) de 0,41, un sesgo de 0,17 y una correlación de 0,85 RMS. La correlación modelo de mapa es 0,86 y los factores gratuitas R / R son 0,21 / 0,24. Todos estos parámetros indican una solución estructura de éxito.
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Acknowledgments
Agradecemos al personal de la X06DA línea de luz en la fuente de luz suiza, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suiza por su apoyo durante la recolección de datos de sincrotrón. Estamos muy agradecidos a Monika Gompert por su excelente apoyo técnico. El proyecto fue apoyado por la Universidad de Colonia y conceder INST 216 / 682-1 Fugg del Consejo de Investigación Alemán. Una beca de doctorado de la Escuela Internacional de Posgrado en Salud y Enfermedad Desarrollo de CP se reconoce. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención nº 283570 (BioStruct-X).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genes / Vectors / cell strains | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
| E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
| Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Yeast extract | any | ||
| Tryptone | any | ||
| Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
| Agar | any | ||
| Kanamycin | any | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
| NaCl | any | Buffer grade | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | any | purest grade | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (general) | |||
| Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C - 37 °C | |
| Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L) | |
| Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
| Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150,000 x g | |
| NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
| Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
| Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO | any | ||
| UV-Vis spectrophotometer | any | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (crystallography) | |||
| Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
| Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Crystallization robot | any | ||
| 96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2 L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder - White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | any | ||
| Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
| Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
| Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |
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