Introduction
Clostridium difficile est l' une des principales causes de diarrhées infections associées aux antibiotiques nosocomiales 1. Cette bactérie anaérobie à Gram positif est transmis par sa forme de spores par voie fécale-orale. Dans la dernière décennie, le nouveau '' épidémie '' ou '' hypervirulent '' souches (par exemple BI / NAP1 / 027) a provoqué une augmentation drastique des nouvelles infections et des taux de mortalité en Amérique du Nord et en Europe 2. C. maladie -Associated difficile (DACD) est un danger pour la vie du côlon inflammation avec des taux de létalité élevés 3. Les symptômes vont de la diarrhée 4 à la colite pseudomembraneuse 5 et le mégacôlon toxique souvent mortelle 6.
Le traitement de la DACD est difficile , car les souches virulentes sont multirésistante et le taux de récidive est élevé 7. A la thérapie de couple comprend le métronidazole antibiotiques, fidaxomicine ou vancomycine, ou repetiticas récurrents de transplantation fécale vement du microbiote. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont nécessaires d' urgence 8. Certains progrès sont enregistrés en tant que thérapeutique anticorps monoclonal Bezlotoxumab, ciblant la toxine C. difficile B 9, a récemment passé avec succès la phase III des essais cliniques et a été soumis à l' approbation de la FDA et de l' EMA. En outre, les nouveaux antibiotiques sont testées à l'heure actuelle à différents stades d'essais cliniques 10.
Pour développer un traitement efficace de nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiés. Récemment découvert C. protease difficile endopeptidase-1 proline-proline (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; CE 3.4.24.89) est une cible prometteuse, comme le manque de PPEP-1 dans une souche de knock-out diminue la virulence de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 sécrété est une métalloprotéase 12,13 cliver deux adhésines de C. difficile à leur extrémité C-terminale 13 libérant ainsi l'adhérence bacterentre autres de l'épithélium de l'intestin humain. Par conséquent, il est impliqué dans le maintien de l'équilibre entre le phénotype et sessiles motiles de C. difficile. Pour développer des inhibiteurs sélectifs contre PPEP-1 et de comprendre comment il reconnaît ses substrats connaissance intime de sa structure tridimensionnelle est indispensable. Nous avons résolu la première structure cristalline de PPEP-1 seul ou en complexe avec un peptide substrat 14. PPEP-1 est la première protéase connue qui clive sélectivement les liaisons peptidiques entre les deux résidus de proline 15. Elle lie le substrat d'une manière double entortillé et stabilise via un réseau étendu aliphatique-aromatique de résidus situés dans le S-boucle qui couvre le site actif de la protéase 14. Ce mode de liaison au substrat est unique à PPEP-1 et ne trouve pas dans les protéases humaines à ce jour. Cela en fait une cible de médicament prometteur, et les effets hors-cible des inhibiteurs très improbables.
Pour développer et écran sélective PPEP-1 inhibitors à l'avenir, une grande quantité de pur et monodisperse PPEP-1 protéine est nécessaire. En outre, pour déterminer le mode de liaison des premiers inhibiteurs, des structures co-cristallines avec PPEP-1 devra être déterminée. Dans nos mains PPEP-1 produit constamment cristaux enchevêtrés. Ainsi, nous avons mis au point une procédure d'optimisation pour produire des cristaux simples Diffraction qualité de PPEP-1. Dans ce protocole , nous décrivons en détail la solution de PPEP-1 14 production, la purification, la cristallisation et de la structure. Nous utilisons l' expression intracellulaire dans Escherichia coli d'une variante PPEP-1 dépourvu de la séquence signal de sécrétion, une Chromatographie d' affinité et Chromatographie d'exclusion de taille avec l' enlèvement de l'étiquette de purification, suivie microseeding 16 dans un écran d'optimisation et la détermination de la structure par l' intermédiaire du zinc longueur d' onde unique dispersion anormale (zinc-SAD) 17. Ce protocole peut être adapté pour la production et la détermination de la structure d'autres protéines (par exemple </ Em> métalloprotéases) et en particulier pour les protéines produisant des cristaux enchevêtrés. Sur demande, l'ADN plasmidique de la construction (pET28a-NHis-rPPEP-1) Les données de diffraction et peut être fourni à des fins éducatives.
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Protocol
1. Clonage et Construct Conception
- Clone la séquence de codon optimisé (pour E. coli) de C. difficile PPEP-1 sans le peptide signal [acides aminés 27-220, mentionnées ci - après recombinant PPEP-1 (rPPEP-1) 11] dans le vecteur pET28a utilisant Nde I et Xho I sites de restriction (figure 1) avec un codon stop au niveau du (vecteur résultant pET28a-NHis-de rPPEP-1) , l' extrémité 3 '. On obtient ainsi une N-terminale 6xHis-tagged protéine (NHis-rPPEP-1) avec un site de clivage de thrombine qui permet de retirer l'étiquette lors de la purification (Figure 1). Le plasmide contient une cassette de résistance à la kanamycine pour la sélection. Les amorces utilisées pour le clonage sont décrits ailleurs 14.
Figure 1: Représentation schématique de la construction pET28a-NHis-rPPEP-1 et analyse SDS-PAGE des expression et toutes les étapes de purification. (A) Vecteur carte de NHis-rPPEP-1 clone dans pET28a vecteur en utilisant Nde I / Xho I créé avec PlasMapper. (B) Représentation schématique du (panneau supérieur) NHis-rPPEP-1 construit et la construction finale après la thrombine clivage de la balise 6xHis avec le GSHM-séquence supplémentaire obtenue à l'extrémité N-terminale (panneau inférieur). Analyse SDS-PAGE (C) de l'expression dans des cellules BL21 (DE3) Etoile à 37 ° C pendant 4 heures et (D) des échantillons de toutes les étapes de purification (M: marqueur de poids moléculaire). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Expression et purification de rPPEP-1
- L' expression de NHis-1-rPPEP
- Maquillage et autoclave LB (bouillon de lysogénie) milieu (10 g / L de tryptone, 5 g / L d'extrait de levure, 10 g / L de NaCl, ADJUr à pH 7,5 avec NaOH). Compléter avec du sulfate de kanamycine (50 pg / ml) juste avant l'emploi (milieu LB / Kan).
- Inoculer un 200 ml de culture de nuit de fraîchement transformé E. coli dans du milieu LB / Kan. Cultivez la nuit à 37 ° C sous agitation à 220 tours par minute.
- Le lendemain matin, vérifier l'OD 600 (densité optique à 600 nm de longueur d' onde) de la culture de la nuit. Inoculer deux 2.8 L dérouté flacons contenant 1 milieu L LB / Kan chacune avec la culture de la nuit à une DO 600 de 0,1. Supplément avec trois gouttes d'eau-émulsion de silicone pour empêcher la formation de mousse excessive. Cultiver les cellules à 37 ° C sous agitation à 180 tours par minute jusqu'à ce que la DO 600 atteigne 0,6.
- Prenez un échantillon de pré-induction pour l' analyse SDS-PAGE (équivalent de 1 ml d'une culture à DO 600 = 1); ajouter de l'IPTG à 0,5 mM de concentration finale pour induire l'expression de NHis-rPPEP-1. Continuer de croître à 37 ° C / 180 rpm pendant 4 heures.
- Déterminer les 600 OD dans un 10x dirésolu- et prélever un échantillon de récolte (équivalent de 1 ml d'une culture à DO 600 = 1).
- Recueillir les cellules par centrifugation pendant 20 min à 7000 xg et 4 ° C. Pour éliminer les résidus LB milieu resuspendre les culots cellulaires à partir de 1 litre de la culture dans 40 ml du tampon TBS (solution saline tamponnée au Tris: 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM) et transférer dans un tube à centrifugation de 50 ml. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 10 min à 10 000 x g et 4 ° C et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Analyser l' expression (lysats totaux et fractions solubles) par SDS-PAGE 18.
- Une purification du non marqué rPPEP-1
- Prendre des échantillons de 50 ul de chaque étape de purification pour l'analyse SDS-PAGE. Remettre en suspension le culot de cellules à partir de 1 litre de culture dans du tampon TBS supplémenté avec 10 pg / ml de DNasel. Utilisez 5 ml de TBS / DNaseI par g de cellules.
- Lyse des cellules par sonication sur de la glace / eau en utilisant 30% d'amplitude pendant 15 min (2 impulsions sec avec 2 sec pause). Enlever les débris par centrifugation pendant 10 min à 10 000 x g et 4 ° C et le transfert surnageant à un tube d'ultracentrifugeuse. Effacer lysat dans une ultracentrifugation pendant 30 min à 165.000 xg et 4 ° C.
- Travailler à 4-6 ° C. En utilisant un système de pompe péristaltique ou une Chromatographie équilibrer 2 ml de nickel-acide nitrilotriacétique (NiNTA) une résine dans une colonne en verre avec du tampon TBS supplémenté avec 10 mM d'imidazole pH 7,5. Vous pouvez également utiliser l'écoulement par gravité.
- Ajuster le lysat clarifié avec 1 M d'imidazole pH 7,5 à une concentration finale de 10 mM. Appliquer le lysat sur la colonne de lavage par étapes et avec un tampon TBS supplémenté avec 10 mM d'imidazole et 30 mM, respectivement, jusqu'à ce que l'absorption UV à 280 nm ait atteint la ligne de base.
- Eluer la protéine avec du tampon TBS plus 250 mM imidazole. Re-équilibrer la colonne de TBS supplémenté avec 10 mM d'imidazole et de stocker du jour au lendemain.
- Déterminer la concentration en protéine soit à 280 nm en utilisant le cient d'extinctioncient de 25900 M -1 cm -1 , soit par toute autre méthode (méthode de Bradford , par exemple 19). Ajouter 2 unités de thrombine par mg de protéine et on dialyse la solution de protéine pendant une nuit à 4 ° C contre un volume de TBS 50x (50x du volume d'élution NiNTA).
REMARQUE: Prenez le bon blanc pour la détermination de la concentration de protéines, que l'imidazole absorbe fortement à 280 nm. - Passez la solution de protéine sur la résine NiNTA équilibrée pour éliminer la protéine non clivée. Ensuite, appliquer le même volume de TBS supplémenté avec 10 mM d'imidazole à la colonne pour récupérer la totalité de la protéine clivée. Pour nettoyer la colonne, éluer toutes les protéines restant avec 250 mM imidazole. Analyser les échantillons par SDS-PAGE (Figure 1).
- Concentrer la solution de protéine à 4 ml à des intervalles de 10 min à 4000 x g et 4 ° C en utilisant une unité d'ultrafiltration centrifuge. Mélanger la protéine de concentration après chaque intervalle pour éviter la précipitation et de l'agrégation. A cette étape occasionnellement une certaine précipitation est observée pour rPPEP-1 en dépit de l'opération de mélange.
- Appliquer la protéine concentrée dans une colonne de chromatographie d'exclusion de taille pré-équilibrée (dans du tampon TBS), à 4-6 ° C. Éluer la colonne avec du tampon TBS, collecter des fractions de 1 ml et soumis 5 ul de chaque fraction à une seconde analyse par SDS-PAGE. rPPEP-1 élué dans un seul pic correspondant à un monomère (figure 2). De temps en temps un pic mineur à poids moléculaire plus importante est observée (pic de façade), qui correspond à un dimère de la protéine. Le rendement devrait être d'environ 50 mg de protéine pure par litre de culture. Analyser tous les échantillons par SDS-PAGE 18 (Figure 2).
- Prendre des échantillons de 50 ul de chaque étape de purification pour l'analyse SDS-PAGE. Remettre en suspension le culot de cellules à partir de 1 litre de culture dans du tampon TBS supplémenté avec 10 pg / ml de DNasel. Utilisez 5 ml de TBS / DNaseI par g de cellules.
Figure 2: chromatographie d'exclusion de taille représentant et analyse SDS-PAGE des rPPEP-1. exclusion de taille chromatogramme (A280; absorbance à 280 nm) non marqué rPPEP-1 purifié en utilisant une 16/600) colonne (dans du Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM de NaCl à 6 ° C. En fonction du volume d'élution, rPPEP-1 migre comme attendu pour une protéine de 22 kDa, ce qui suggère que ce sont essentiellement monomère. Rarement un pic mineur fronting apparaît qui correspond à un dimère. (Encart) d'une analyse SDS-PAGE des fractions issues de la Chromatographie d'exclusion de taille (M, marqueur de poids moléculaire). Chaque seconde fraction est appliquée. Les bandes faibles en dessous de la principale rPPEP-1 bande correspondent à se produire occasionnellement des impuretés mineures. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
3. Cristallisation et optimisation cristal utilisant Microseeding
NOTE: rPPEP-1 cristallise dans des conditions qui produisent constamment des cristaux très enchevêtrés ne convenant pas à une analyse par diffraction des rayons X (Figure 3). Par conséquent, une stratégie d'optimisation (figure 4) a été développé pour obtenir des cristaux de haute qualité (figure 5).
- Le dépistage initial des rPPEP-1 en utilisant des écrans commerciaux
REMARQUE: Effectuer des essais de cristallisation dans le format de chute assis en utilisant standards écrans disponibles dans le commerce et un robot de cristallisation.- Concentrer la protéine purifiée à 12 mg / ml en utilisant un dispositif d'ultrafiltration centrifuge à intervalles de 5 minutes à 4000 x g et 4 ° C. Mélanger la protéine de concentration après chaque intervalle pour éviter la précipitation et de l'agrégation. Déterminer la concentration en protéine soit à 280 nm en utilisant le coefficient d'extinction de 25900 M -1 cm -1 , soit par tout autre moyen (par exemple , la méthode de Bradford). Equilibrer la protéine à 20 ° C. Dégagez toutes les particules et la poussière par centrifugation pendant 10 min à 16 000 xg et 20 ° C.
- Soit utiliser des plaques de cristallisation déjà pré-remplies soiAled et conservé à 4 ° C ou à remplir les puits de réservoir des plaques avec 70 ul de chaque condition de cristallisation. Equilibrer toutes les plaques de cristallisation à 20 ° C. Travaillez rapidement, car les petits volumes sèchent rapidement. Utiliser une chambre d'humidité autour de la station d'accueil du robot, si possible.
REMARQUE: Utilisez les écrans suivants comme une procédure standard: SaltRx, Index, PEG / Ion, cristal, Assistant, PACT ++, JCSG ++. - Mettre en place l'écran par pipetage protéines et réservoir dans subwells 2-4. volume de goutte est de 300 nl et les ratios (protéine: réservoir) sont 200: 100 (subwell 2), 150: 150 (subwell 3) et 100: 200 (subwell 4) (en nl). Fermer immédiatement la plaque et placer dans une chambre à 20 ° C.
- Inspecter plateaux immédiatement après set-up, puis inspecter chaque jour pendant la première semaine, suivi par une inspection hebdomadaire.
- Co-cristallisation de rPPEP-1 avec des ligands
- Pour la co-cristallisation de substrats complexes peptide-rPPEP-1 mélanger rPPEP-1à 24 mg / ml dans un rapport 1: 1 (v / v) avec un excès molaire de 7 fois de la solution de peptide (Ac-EVNPPVPD-NH 2) d' une poudre lyophilisée solubilisé dans un tampon TBS), ce qui donnera une concentration finale de 12 mg / ml de r-1 PPEP-protéine et d'un excès molaire de 7 fois du peptide sur PPEP-1. Incuber pendant 30 min à 20 ° C et enlever toutes les particules et la poussière par centrifugation pendant 10 min à 16 000 xg et 20 ° C. Procéder à la cristallisation en utilisant la procédure de microseeding comme décrit pour la non liée r-PPEP-1 protéine.
Figure 3: cristaux représentatifs de écrans initiaux. cristaux enchevêtrés de rPPEP-1 à 12 mg / ml cultivées en état. (A) de l' écran de cristal I / 38 (citrate 1,4 M de sodium tribasique déshydrater, 0,1 M HEPES pH de sodium 7,5; 200 nl: 100 nl). (B) écran SaltRx / 52 (2,4 M phosphate d' ammonium dibase, 0,1 M de Tris pH 8,5; 100 nl: 200 nl) et (C) (200 nl: 100 nl). (D) écran SaltRx / 96 (60% v / v Tacsimate pH 7,0, 0,1 propane M BIS-TRIS pH 7,0; 200 nl: 100 nl). La barre d'échelle = 0,2 mm. les ratios de volume sont toujours protéines: réservoir. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: procédure d'optimisation pour rPPEP-1 cristallisation. cristaux initiaux de rPPEP-1 à 12 mg / ml de faible qualité de diffraction et avec plusieurs réseaux (entremêlée) ont été reproduites dans un écran d'optimisation 24-état. Encore une fois, seuls les cristaux enchevêtrés ont été observés dans des conditions contenant 2,55 M phosphate d'ammonium dibasique. Un stock de semences a été préparé à partir d'un seul cristal entremêlée et dilué 1: 1000 dans le même condition (microseeding). Un volume de 0,5 pi de stock de semences dilué a été ajouté dans les gouttes claires restantes et monocristaux a augmenté dans presque toutes les conditions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Optimisation Crystal à l' aide microseeding
NOTE: Cristaux très enchevêtrés de rPPEP-1 apparaissent au bout de deux jours dans un état contenant 2,4 M ammonium phosphate disodique, 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,5 (écran SaltRx, état E4, les trois subwells) (Figure 3). Une procédure d'optimisation à l' aide d' un écran de grille autour de la condition initiale combinée avec microseeding a été appliquée (figure 4).- Préparer un écran de grille (figure 4) comprenant 24 des conditions de 1,8 à 2,55 M de phosphate d'ammonium dibasique (par incréments de 0,15 M) et 0,1 M de Tris-HCl , pH 7,5 à 9,0 (par incréments de 0,5 unité pH) à partir approsolutions ate d'achat d'actions (4 M phosphate d'ammonium et 1 M tampons Tris).
REMARQUE: Utilisez le bac applet Marque (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) pour calculer les volumes et le schéma de pipetage pour obtenir 2 ml de chaque condition qui permet d'effectuer des 10 écrans d'optimisation. Le phosphate solution mère 4 M d'ammonium est difficile à préparer. Chauffer la solution pendant l'agitation pour dissoudre complètement la poudre dans l'eau. - Pipette 200 pi de chaque solution d'écran de grille dans les puits d'une plaque de 24 puits et équilibrer à 20 ° C.
- Configuration manuelle de la plaque de cristallisation. Le volume de la goutte est de 3 pi et les rapports (protéines: réservoirs) sont 2: 1, 1,5: 1,5 et 1: 2 (en ul). Ici, utiliser une pipette volumétrique pour éviter la formation de bulles d'air. Fermer immédiatement la plaque et placer dans une chambre à 20 ° C. Eviter la formation de bulles d'air.
NOTE: Après un à quatre jours des cristaux très entremêlées apparaissent dans les quatre conditions contenant 2,55 M d'ammonium phocique et dibasique 0,1 M de Tris-HCl , pH 7,5 à 9,0 (figure 4). Pas de cristaux sont formés dans les 20 autres conditions avec des concentrations de phosphate d'ammonium 2,55 M ci-après le mode opératoire de microseeding est utilisé pour obtenir des monocristaux de rPPEP-1 dans ces conditions. - Préparer un microseed Stock en récoltant un seul cristal entremêlée de l'une des deux conditions avec 2,55 M ammonium phosphate disodique et 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0 ou 8,5. Les cristaux peuvent être fixés à la surface du plastique. déformation attentive du plastique entourant avec une aiguille d'acupuncture aide à détacher les cristaux.
- Transfert 50 pi de la liqueur mère respective dans un tube de 1,5 ml contenant une petite perle de verre poli (perles-pour-graines). En utilisant une boucle en nylon monté transférer le cristal dans 1 pl de la liqueur mère placées sur une lame de verre de protection.
- Transférer le liquide contenant le cristal dans le tube et le vortex à grande vitesse pendant 30 secondes. Faire un 1:1000 dilution du stock de semences dans un nouveau tube de 1,5 ml contenant le même état fraîchement préparé et le vortex à fond pendant 5 secondes.
NOTE: Semences stocks peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Retirez le joint de la plaque recouvrant les 20 conditions avec des gouttes claires et pipette 0,5 ul du stock de semences (1: 1000 dilution) dans les puits. Sceller la plaque et placer dans une chambre à 20 ° C. Monocristaux de haute qualité de diffraction apparaissent dans 2-7 jours (figure 5).
- Préparer un écran de grille (figure 4) comprenant 24 des conditions de 1,8 à 2,55 M de phosphate d'ammonium dibasique (par incréments de 0,15 M) et 0,1 M de Tris-HCl , pH 7,5 à 9,0 (par incréments de 0,5 unité pH) à partir approsolutions ate d'achat d'actions (4 M phosphate d'ammonium et 1 M tampons Tris).
Figure 5: cristaux représentatifs de l' écran d'optimisation. Monocristaux de rPPEP-1 à 12 mg / ml ensemencée avec 1: 1000 dilution stock de semences cultivées dans les conditions suivantes: (A) 2,1 M ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris pH 7,5; : 1,5 pl 1,5 pl; (B) 2.1 M ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 pl: 1 ul; (C) 2,25 M phosphate d' ammonium dibasique, Tris 0,1 M pH 8; 2 pl: 1 ul; (D) 2,1 M ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris pH 8; 1: 2 ul ul. (E) Monté cristal dans 0,1-0,2 um boucle de nylon, cultivées dans 2,1 M d' ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris pH 8 (2 pi: 1 pi) et cryo-protégé dans 2,1 M d' ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris pH 8, 20% de glycérol. La barre d'échelle = 0,2 mm (AD). Volume ration sont toujours protéines: réservoir. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
4. Crystal Collection Montage et données
REMARQUE: Pour obtenir la meilleure qualité de cristaux de données de diffraction doit être monté au sommet de leur qualité et de la taille. Les cristaux peuvent être stockés dans de l'azote liquide jusqu'à ce qu'elles are soumis à une analyse par diffraction des rayons X à 100 K. Par conséquent, la condition d'où elles proviennent doit être ajusté à cryo-conditions. rPPEP-1 cristaux peuvent être cryo-protégé par addition soit 20% de glycérol ou de saccharose à 30% (remplacement de l'eau dans l'état de la cryo-protecteur).
- montage cristal
REMARQUE: Toutes les étapes de manipulation de cristal doivent être effectuées sous la loupe binoculaire.- Choisissez la taille optimale de la boucle en nylon pour la longueur maximale des cristaux choisis. Le plus long axe typique des cristaux rPPEP-1 est d' environ 1-200 um (figure 5). Préparer une diapositive de couverture et la cryo-condition appropriée (par exemple 2,1 M ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% de glycérol).
- Remplissez les dewars en mousse avec de l'azote liquide, charger la pince flacon avec un flacon et pré-refroidir dans le liquide 800 ml de mousse dewar rempli d'azote. Placer un manchon de cryo et un support de canne à cryo marquée d'un identifiant appropriédans un liquide rempli d'azote 2 L mousse dewar. Chargez la baguette magnétique avec une boucle en nylon monté.
REMARQUE: Porter des vêtements de protection (Eyeshield / lunettes, gants) lorsque vous travaillez avec de l'azote liquide. objets chauds plongés dans l'azote liquide peut produire des déversements.
- Remplissez les dewars en mousse avec de l'azote liquide, charger la pince flacon avec un flacon et pré-refroidir dans le liquide 800 ml de mousse dewar rempli d'azote. Placer un manchon de cryo et un support de canne à cryo marquée d'un identifiant appropriédans un liquide rempli d'azote 2 L mousse dewar. Chargez la baguette magnétique avec une boucle en nylon monté.
- Découper la bande d'étanchéité avec un scalpel et retirez-le avec la pince. Pipette 1 pl de la cryo-état sur la lame de couverture (ou alternativement dans un puits vide sur la même plaque) et retirer le cristal de la goutte à la pêche avec la boucle en nylon monté (figure 5). cristaux attachés peuvent être facilement détachés du sol par déformation du plastique entourant avec une aiguille d'acupuncture.
- Transférez rapidement le cristal à la chute de cryo-état et laisser équilibrer pendant 1 seconde. Poisson cristal aussi rapidement que possible et plongez-gel dans de l'azote liquide.
- Lorsque l'azote liquide autour de la boucle monté arrête l'ébullition, placer la boucle dans le flacon.Placer le flacon sur le support de canne à cryo et lorsqu'il est chargé avec 6 flacons placer un manchon cryo autour du support. Stocker les cristaux dans un réservoir rempli d'azote liquide jusqu'à utilisation.
- Choisissez la taille optimale de la boucle en nylon pour la longueur maximale des cristaux choisis. Le plus long axe typique des cristaux rPPEP-1 est d' environ 1-200 um (figure 5). Préparer une diapositive de couverture et la cryo-condition appropriée (par exemple 2,1 M ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% de glycérol).
- Collecte de données
NOTE: La collecte des données peut être effectuée au diffractomètre à domicile, le cas échéant, ou à une ligne de lumière synchrotron. Pour les données de rPPEP-1 ont été recueillies au X06DA ligne de lumière de la Source de Lumière Suisse, Paul-Scherrer Institut, Villigen, en Suisse en utilisant un détecteur de comptage de photons hybride. Les données d'origine et tous les fichiers utilisés dans la détermination de la structure peuvent être fournis sur demande.- Configurer la longueur d'onde du faisceau à 1,282 Å (9,667 KeV), qui est le rayon X d'énergie de pointe d'absorption caractéristique (pic) de l'élément zinc. rPPEP-1 est une métalloprotéase qui contient un seul zinc par molécule dans le site actif.
- Recueillir des données à 100 K dans le mode inverse faisceau à 10 ° coins pour un total de 270 ° dans chaque direction. Le temps d'exposition est de 0,1 sec avec 0,1 ° rotation par image. Réglez la transmission à 14% (0,14).
- Pour recueillir un ensemble de données à haute résolution native à partir d'un second cristal provenant de la même condition de cristallisation mis en place la longueur d'onde du faisceau à 1,00 Å (12,398 keV). Recueillir des données à 100 K. Le temps d'exposition est de 0,1 sec avec 0,1 ° rotation par image. Régler la transmission à 70% (0,7).
5. Détermination de la structure par l'intermédiaire de zinc-SAD
NOTE: Afin de déterminer la structure de rPPEP-1 via le zinc-SAD quelques connaissances cristallographique de base est nécessaire, ainsi que les progiciels XDS 20, Phenix 21 et le programme Foulque 22. Pour la visualisation des structures du programme PyMOL 23 ou Chimera 24 est nécessaire. Les données collectées à la longueur d'onde correspondant au pic au niveau du bord d'absorption de l'élément zinc peut être utilisé pour une seule longueur d'onde anormale Affersion (SAD) 25 pour obtenir des informations de phase qui peut être étendue à tous les atomes de protéines.
- Traitement de l'information
- Traiter les deux ensembles de données (normales et inverses) de pointe utilisant le logiciel XDS (alternativement iMosflm ou HKL3000) dans le groupe spatial P2 1 2 1 2 1 (groupe d'espace 19) séparant les copains de Friedel (données anormales). Les paramètres de la cellule de l'unité devrait être autour de a, b, c (Å) = 43.17, 71.68, 117.70 et α = β = γ (°) = 90. Cela donne deux HKL fichiers (fichiers de réflexion).
- Inspectez le fichier CORRECT.LP. Utiliser les données de la résolution , dans lequel le CC 1/2 est au moins 50%. Échelle ensemble les deux ensembles de données / fichiers de réflexion (HKL-files) en utilisant XSCALE. Inspectez le fichier XSCALE.LP. Vérifiez dans quelle mesure le signal anormal étend (SigAno) et notez la résolution avec une corrélation anormale (Anomal Corr) d'environ 30%, ce qui est de 2 Å dans le cas des données utilisées ici recueillies à 1,67 Å. C'est lerésolution de coupure pour le signal anormal utilisé dans Phenix Autosol.
- Convertir le (échelle) HKL-fichier dans un fichier de réflexion CCP4 format (nommé, par exemple, peak_anom.mtz) en utilisant XDSCONV la création d' un sous - ensemble de libre R de 5% et la conservation des données anormales (FRIEDEL'S_LAW = FALSE). Vérifiez le MTZ-dossier pour la cohérence avec le programme mtzdmp inspecter les paramètres de l' unité de cellules, le groupe d'espace et l'existence de la partie libre de R (label FreeRflag) et les données anormales (étiquettes DANO / SIGDANO). Préparer également un MTZ-fichier supplémentaire avec XDSCONV sans extraire les données anormales (FRIEDEL'S_LAW = TRUE; le nom, par exemple, peak_native.mtz) pour le raffinement à un stade ultérieur.
- Solution Ossature (détermination de phase)
- Exécutez Phenix Autosol en utilisant le fichier de réflexion peak_anom.mtz. Sélectionnez pic SAD / MAD comme type de données et choisissez 2 sites de zinc (comme il y a deux molécules par unité asymétrique). Choisissez soit l'expé plus exactvaleurs mentales pour le f '/ f' 'paramètres (déterminés dans une analyse de fluorescence à la ligne de lumière) ou les valeurs theotetical f' = -8,245 et f '' = 3,887. charger également le fichier FASTA contenant la séquence d'acides aminés de la protéine cristallisée.
- Réglez la limite de résolution à la résolution avec une corrélation anormale (Anomal Corr) d'environ 30% (déterminée en 5.1.2), dans ce cas, 2 Å et sélectionnez l'option "modèle autobuild". En utilisant les phases des deux sites de zinc trouvés par Phenix HySS (partie du gazoduc Phenix Autosol) les phases de la protéine entière pourraient être déduites et le modèle construit (par Phenix RESOLVE) dans la densité électronique. Le meilleur modèle est appelé "overall_best.pdb".
- Construction de modèles, de raffinement et de validation
- Sélectionnez l'option "modèle autobuild" pour construire la plupart du modèle rPPEP-1 automatiquement. Inspecter la densité électronique à 1,0 σ niveau de contour en utilisant le program macroule (Figure 6). Il doit être conjonctif et entourant les atomes du modèle. Idéalement aussi quelques molécules d'eau doivent être intégrées dans le modèle (à une résolution meilleure que 2,5 Å). l'eau en vrac (espace entre les molécules) ne doit pas contenir densité.
- Vérifiez si l'ensemble du modèle est (tous les acides aminés incorporés dans la densité d'électrons) complets. Sinon, les construire manuellement à l'aide des outils fournis par Foulque. Affiner la structure en exécutant tours itératifs de Phenix Affiner avec 5 raffinement arrondit chacun utilisant le fichier modèle overall_best.pdb, le fichier peak_native.mtz de réflexion et le fichier de séquence FASTA; et la construction du modèle manuel Foulque.
- Valider la qualité du modèle structurel avec les outils respectifs dans Foulque.
Figure 6: Experimental carte de densité d'électrons et le modèle de rPPEP-1 après laPhenix Autosol exécuté. Densité électronique en bleu à un niveau de 1,0 σ de contour affiché dans la Foulque du programme. Dans cette carte initiale densité électronique est bien résolu et le modèle à construire dans la densité électronique. Le zoom montre les résidus His142 et Glu189, ainsi qu'une molécule d'eau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
6. Détermination de la structure à haute résolution via remplacement moléculaire
NOTE: Afin d'obtenir des informations à haute résolution structurelle à propos de rPPEP-1 un ensemble de données native est recueillie. Ensuite , une procédure de remplacement moléculaire en utilisant la 26,27 phaser logiciel (dans le progiciel Phénix) est employée en utilisant la structure déterminée par l' intermédiaire de zinc-SAD comme modèle. Cette procédure peut également être utilisé ultérieurement lors de la résolution des structures de rPPEP-1 complexé avec de petites molécules.
- Pour obtenir une structure cristalline avec une résolution supérieure (dans ce cas jusqu'à 1,4 Å) traiter l'ensemble de données natif à l' aide du logiciel XDS (alternativement iMosflm ou HKL3000) dans le groupe spatial P2 1 2 1 2 1 (groupe d'espace 19). Les paramètres de la cellule de l'unité devrait être autour de a, b, c (Å) = 43.17, 71.77, 117.80 et α = β = γ (°) = 90. Cela donne un HKL-fichiers (fichier de réflexion).
- Inspectez le fichier CORRECT.LP. Utiliser les données de la résolution , dans lequel le CC 1/2 est au moins 50%. Convertir le HKL-fichier dans un fichier de réflexion CCP4 format (nommé, par exemple, native.mtz) en utilisant XDSCONV la création d' un sous - ensemble de libre R de 5%. Vérifiez le MTZ-dossier pour la cohérence avec le programme mtzdmp inspecter les paramètres de cellules unitaires, le groupe d'espace et l'existence de la partie libre de R (label FreeRflag).
- Préparer le PDB-fichier contenant le modèle de overall_best.pdb déterminé plus tôt et supprimer toutes les molécules d'eau et tous les ligands (c.. l'atome de zinc). charger également le fichier FASTA contenant la séquence d'acides aminés de la protéine cristallisée. Exécutez Phaser à Phenix en utilisant le fichier de réflexion native.mtz. Rechercher deux molécules par unité asymétrique.
- Après résolution de la structure réussie (TFZ-score supérieur à 8; ici 10.2) inspecter le modèle (native_phaser.1.pdb nommé) et la carte de densité d'électrons dans Foulque. Construire et affiner la structure en exécutant tours itératifs de Phenix Affiner avec 5 raffinement arrondit chacun utilisant le fichier modèle native_phaser.1.pdb, le fichier de réflexion native.mtz et le fichier de séquence FASTA; et la construction du modèle manuel Foulque.
- Valider la qualité du modèle structurel avec les outils respectifs dans Foulque.
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Representative Results
rPPEP-1 est surexprimé dans plusieurs souches de E. coli, avec le rendement le plus élevé dans E. coli BL21 (DE3) étoile (figure 1C). Après la première étape de Chromatographie d'affinité 6xHis-NiNTA le marqueur peut être clivé avec succès à partir de la plupart de la protéine et dans la deuxième étape NiNTA protéine non digérée peut être complètement séparée de la thrombine digérée par la protéine (figure 1D). Sur un S200 16/600 colonne rPPEP-1 untagged migre comme monomère occasionnelle donnant correspondant le plus probablement à l'espèce dimères (Figure 2A). La protéine est pure (figure 2B) et le rendement est d' environ 50 mg de protéine de 1 L de culture de E. coli. rPPEP-1 cristallise dans diverses conditions (figure 3), qui contient souvent du phosphate. Les cristaux sont très enchevêtrée dans toutes les conditions, de sorte que l'optimisation des cristaux devait être effectuée. La figure 4 représente la scheme de la procédure d'optimisation effectuée pour les cristaux provenant de l' état écran commercial SaltRx E4 (52) (figure 3B-C). Encore une fois les cristaux enchevêtrés sont apparus dans les puits A6-D6 (figure 4). Un microseed a été préparée à partir de cristaux cultivés en état C6 (2,55 M ammonium phosphate disodique, 0,1 M Tris pH 8,5) de l'écran d'optimisation et dilué 1: 1000 dans la liqueur mère. Deux à sept jours après le semis avec le stock de semences dilué dans les autres 20 conditions restantes avec des gouttes claires de gros cristaux de haute qualité de diffraction unique en treillis ont été observées (figure 5) dans la plupart des gouttes. Après le montage des cristaux dans des boucles de nylon (figure 5E) les données de diffraction à 1,67 Å de résolution ont été recueillis pour la détermination de la structure par l' intermédiaire de zinc-SAD (tableau 1), avec un signal anormal étendant à 2 Å. En outre, les données de diffraction indigènes à 1,4 Å de résolution ont été recueillies pour la détermination d'un higStructure h résolution (tableau 1). La structure cristalline de rPPEP-1 pourrait être résolu (Figure 6) et le modèle de la structure native raffinée à R / R facteurs libres de 0,156 / 0,182 à 1,4 Å de résolution (PDB ID: 5A0P) 14 (pour plus de raffinement des statistiques , voir le tableau 1).
| Structure / jeu de données | pic Zn-SAD | originaire de |
| Collecte de données | ||
| groupe spatial | P2 1 2 1 2 1 | P2 1 2 1 2 1 |
| a, b, c (Å) | 43.17, 71.68, 117.70 | 43.17, 71.77, 117.80 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 90, 90, 90 | |
| Longueur d'onde (nm) | 1,28254 | 1 |
| Résolution (Å) | 45,5 à 1,67 (1,72 à 1,67) | 45,5 à 1,40 (1,49 à 1,40) |
| Nombre d'observations | 779717 (34025) | 310074 (45851) |
| Nombre de réflexions uniques | 80960 (5597) | 71874 (11172) |
| Multiplicité | 9.6 (6.1) | 4.3 (4.1) |
| Exhaustivité (%) | 99,2 (93,0) | 98,2 (95,6) |
| Rmerge (%) | 6,8 (56,5) | 5,2 (52,6) |
| <I / σ (I)> | 21.86 (2.81) | 15.66 (2.48) |
| CC (1/2) (%) | 100 (85,1) | 99,9 (85,5) |
| statistiques Raffinement | ||
| Rwork / R libre d (%) | 15.60 / 18.17 | |
| Nombre d'atomes de H non protéiques | 3109 | |
| Nombre de molécules d'eau | 532 | |
| Nombre d'ions / atomes lourds | 2 Zn | |
| Nombre d'autres molécules | - | |
| Nombre de groupes TLS / chaîne | 9 | |
| écarts racine carrée moyenne | ||
| longueurs de Bond (A) | 0,006 | |
| angles de Bond (°) | 1.022 | |
| Facteur moyen de B (A 2) | ||
| Tous les atomes protéiques | 16.12 | |
| Eau | 29,74 | |
| D'autres atomes | 10.12 | |
| Ramachandran parcelle e (%) | ||
| la plus favorisée | 98,72 | |
| En outre permis | 1,28 | |
| rejeté | 0 | |
| PDB entrée | 5a0p |
Tableau 1: La collecte des données et des statistiques de raffinement.
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Discussion
Cristallographie aux rayons X est encore la méthode la plus rapide et la plus précise pour déterminer trois dimensions des structures de résolution quasi atomique de protéines 28. Cependant, il nécessite la croissance de monocristaux bien ordonnées. Ceux-ci sont souvent difficiles à obtenir et l'état cristallin est artificiel. Toutefois, une comparaison des structures protéiques déterminées par cristallographie aux rayons X avec celles déterminées par d'autres méthodes, en particulier RMN, montre généralement un très bon accord. Dans le cas de PPEP-1, une structure de RMN a publié récemment 29 montre un excellent accord avec notre structure cristalline 14, y compris la mobilité de la boucle S.
Ce protocole décrit la production et la purification de l'extrémité N-terminale marquée par His rPPEP-1 protéine pour des études structurales et la cristallisation et la détermination de structure non marqué rPPEP-1. monocristaux étaient difficiles à cultiver dans ce cas et requis une procédure de microseeding spéciale. en til section suivante, nous allons discuter des résultats pour PPEP-1 et indiquer comment le protocole pourrait être adapté pour la production et la cristallisation de toute autre protéine.
Variations sur la conception de construction et d' expression
rPPEP-1 est exprimé en N-terminale marquée par His variante (figure 1A), comme pour la cristallisation , il est préférable d'enlever le marqueur His par la thrombine digérer en raison de son impact possible sur le succès de la cristallisation et la structure des protéines 30. Pour d' autres protéines , il peut être souhaitable de tester en outre une extrémité C-terminale marquée par His Version (par exemple clonées en utilisant les mêmes sites de restriction, le vecteur pET22b et une amorce inverse sans codon stop à l' extrémité 3 ') ou de quitter l' extrémité N-terminale His-tag clivé, comme dans certains cas, une étiquette peut aider pendant la cristallisation. Pour rPPEP-1, le rendement et la stabilité d'une construction C-terminale marquée par His était inférieure. En outre, un test initial pour obtenir les meilleurs sl' expression des protéines oluble doit être incluse dans les souches de E. coli suivantes: BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS ou Lemo21 (DE3), BL21 (DE3) codon plus de RIPL ou Rosetta 2 (DE3), BL21 (DE3) Star et C41 (DE3) à trois températures différentes / temps d'incubation (3-4 heures à 37 ° C, 5 heures à 30 ° C et une nuit à 20 ° C). Avant le clonage, vérifier l'existence d'un site de clivage de la thrombine interne en utilisant l'outil ExPASy PeptideCutter 31 pour empêcher le clivage de la protéine d'intérêt. Sinon, il existe des vecteurs disponibles fournissant un site de clivage pour HRV3C (c. -à -PETM 14 32 de EMBL) ou TEV la protéase (PETM-11 -à- dire EMBL).
La purification des protéines
Pour rPPEP-1 construit la lyse cellulaire est effectuée par sonication sur de la glace / eau. Pour les protéines les plus sensibles qui tendent à agréger ou précipiter une méthode plus "douce" de lyse cellulaire impliquant un disrupteur cellulaire pourrait être utiliséré. Vérifier les grandes quantités de protéines insolubles après la première étape de centrifugation, qui ne sont pas détectées lors de l'utilisation méthode de la lyse telle que la lyse cellulaire chimique. Pour la purification de rPPEP-1 généralement de 2 ml de la résine NiNTA ont été utilisées. Lisez les instructions du fabricant sur la façon importante la capacité de liaison de la protéine de la résine choisie est et ajuster en conséquence. Dans les premières purifications de rPPEP-1, où seulement 1 ml de résine a été utilisée, beaucoup de protéines n'a pas été liée à la colonne et a été trouvé dans le passage (figure 1D). D'autre part, l'utilisation de trop résine pourrait abaisser la pureté de la protéine purifiée. Ajuster la concentration d'imidazole à l'affinité de liaison de la construction marquée par His à la matrice utilisée NiNTA. Une procédure de lavage par étapes est préférée ici ( par exemple 10 mM, 30 mM, 50 mM, 70 mM d' imidazole), dans lequel l'A280 est surveillée et est autorisé à atteindre la valeur de référence au cours de chaque étape. De cette façon, aucune protéine est perdue, même si elle éluer au cours d'uneétape haute imidazole de lavage (par exemple à 50 ou 70 mM). Dans le cas de NHis-rPPEP-1 des protéines élué déjà mM imidazole 30, mais on ne sait pas quel genre d'espèces de protéines qu'il représente. Certaines protéines précipitent / agrégat lorsque l'imidazole est dialysée ou dilué dans la solution de protéine. Dans de tels cas , réduire la concentration d'imidazole dans le tampon d'élution à 150 mM et le temps d'exposition à des concentrations élevées d'imidazole, par exemple diminuer la concentration d'imidazole par élution dans un bêcher contenant un volume de 5 à 10 fois de tampon sans imidazole par rapport à le volume d'élution prévu. Pour NHis-1 rPPEP-incubation avec 2 unités de thrombine par mg de protéine pendant une nuit à 4 ° C sont suffisantes pour cliver le marqueur His à presque 100%. Ajuster la quantité de thrombine pour la protéine d'intérêt à l'aide de 1-10 unités par mg de protéines à 4 ° C à 20 ° C. Lorsque la concentration de la protéine à l'aide d'une unité d'ultrafiltration pause centrifuge dans des intervalles de 5-10 minutes et mélanger le protein pour homogénéiser le gradient de concentration dans la construction du concentrateur. Sinon protéine hautement concentrée pourrait agréger / précipité.
Cristallisation
rPPEP-1 produit en permanence des cristaux fortement entremêlées (monocristaux de plus en plus au-dessus de l'autre, présentant ainsi de multiples réseaux cristallins) qui ne sont pas appropriés pour une analyse par diffraction des rayons X. L'explication pourrait être que trop d'événements de nucléation se produisent dans la zone de nucléation du diagramme de phase (figure 7).
Figure 7: Diagramme de phase d'une expérience de cristallisation de protéines. Les cristaux ne peuvent se former, lorsque la protéine est sursaturée. La nucléation a lieu dans la zone de nucléation et de croissance cristalline dans la zone métastable. Quand une protéine est undersaturated, la baisse restera claire.
La procédure peut être utilisée pour co-cristalliser les peptides et les peptides de substrat rPPEP-1. Les cristaux dans le groupe spatial P2 1 diffractantes jusqu'à 1,25 Å ont été obtenus à partir de graines de stock dilué à 1: 250 dans la procédure d'optimisation. Les cristaux croissent dans les deux groupes d'espace P2 1 2 1 2 1 (protéine non liée) et P2 1 (structures complexes), tout en provenance des conditions très similaires au sein de l'écran de phosphate d'ammonium de la procédure d'optimisation. En raison de l'empilement cristallin trouvée dans les deux formes de r-1 PPEP-cristal, principalement les petites molécules et de peptides portant sur le côté désamorçage du site actif seul peut être soakeD dans les cristaux. Ce côté-ci de la molécule est accessible à partir du solvant présent dans le cristal. Cependant molécules traitant les deux sous-sites ou le côté apprêté ne doivent être co-cristallisé avec rPPEP-1, que l'ouverture S-boucle serait nécessaire pour les accueillir dans le site actif. En outre, rPPEP-1 est en contact avec les molécules voisines à la sortie du site de liaison au substrat près de la S3'site (promotion des contacts cristallins dans ce domaine) - ce qui limite aussi la longueur des peptides substrats à 3 résidus au côté apprêté dans ces deux formes cristallines.
Le cristal de montage et de protection cryo-
Montage de cristaux de protéines est une méthode qui exige une certaine habileté dans la manipulation sous la loupe binoculaire et a besoin d'une pratique ainsi. Choisir la longueur optimale de la boucle en nylon (ou une autre boucle de choix, par exemple litholoop) pour éviter l'excès de solvant autour du cristal qui contribue à Background dispersion et donc un signal plus faible par rapport au bruit des données de diffraction. La taille optimale de la boucle / longueur permet également la pêche des cristaux plus facile que le cristal ne glisse pas dans la boucle. RPPEP-1 pour les cristaux, qui sont environ 100 à 200 pm dans la dimension la plus longue, les boucles de nylon de 0,1 à 0,2 mm de taille ont été choisies. Le cryo-protecteur peut également contribuer à l'aggravation de la qualité des données, comme le cristal peut rencontrer un choc osmotique lors de son transfert à la cryo-condition. Cela peut entraver ou même détruire l'ordre intérieur du cristal. Choisissez avec soin le type et la concentration du cryo-protecteur. rPPEP-1 cristaux étaient cryo-protégé avec soit 20% de glycérol ou de 30% de saccharose. Si la cristallisation d' un complexe ou d' un complexe de peptide substrat de rPPEP-1 avec un autre ligand, le saccharose doit être choisi en tant que cryo-protecteur comme le glycérol se lie au site apprêtée du site de liaison au substrat de 14 rPPEP-1.
Détermination de la structure
La solution Autosol a obtenu un BAYES-CC de 49,2 ± 18,4, un FOM (figure de mérite) de 0,41, un biais de 0,17 et une corrélation de 0,85 RMS. Le modèle de carte de corrélation est de 0,86 et les facteurs libres R / R sont 0,21 / 0,24. Tous ces paramètres indiquent une solution de construction réussie.
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Acknowledgments
Nous remercions le personnel du X06DA de ligne de lumière à la Source de Lumière Suisse, Paul-Scherrer Institut, Villigen, en Suisse pour le soutien lors de la collecte de données de synchrotron. Nous sommes reconnaissants à Monika Gompert pour un excellent support technique. Le projet a été soutenu par l'Université de Cologne et accorder INST 216 / 682-1 FUGG du Conseil de recherche allemand. Une bourse de doctorat de la Graduate School internationale en santé et développement des maladies à CP est reconnu. Les recherches menant à ces résultats ont reçu un financement du septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) en vertu de la convention de subvention n ° 283570 (BioSTRUCT-X).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genes / Vectors / cell strains | |||
| pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
| E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
| Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Yeast extract | any | ||
| Tryptone | any | ||
| Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
| Agar | any | ||
| Kanamycin | any | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
| NaCl | any | Buffer grade | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glycerol 100% | any | purest grade | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (general) | |||
| Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C - 37 °C | |
| Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L) | |
| Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
| Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150,000 x g | |
| NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
| Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
| Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
| Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO | any | ||
| UV-Vis spectrophotometer | any | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment (crystallography) | |||
| Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
| Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Crystallization robot | any | ||
| 96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
| 24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
| Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
| Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
| Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Cryogenic Foam Dewar 2 L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Color Coder - White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Scalpel | any | ||
| Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
| Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
| Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |
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