Introduction
Enkelwandige koolstof nanobuizen (SWNT) zijn atomair dunne lagen koolstofatomen gerold in lange, dunne cilinders die unieke elektronische en optische eigenschappen. 1 Dergelijke eigenschappen zijn een band-gap productie van nabij-infrarood (NIR) fluorescentie-emissie via exciton recombinatie dat zeer gevoelig is voor de lokale omgeving. Het nabij infrarood emissie van SWNT valt in het nabije infrarood venster waarin de indringdiepte van licht maximaal is voor biologisch weefsel. 2,3 Daarnaast SWNTs vertonen een aantal unieke kenmerken atypische in tegenstelling tot organische fluoroforen: SWNT vertonen een grote Stokes verschuiving, niet photobleach en niet knipperen. 4 Onlangs exploitatie van deze kenmerken heeft geleid tot de ontwikkeling van een assortiment van nieuwe moleculaire sensoren met toepassingen in de biologie. 5,6 Ongewijzigde echter SWNTs zijn niet oplosbaar in water, en het verkrijgen van suspensies van de individuele SWNTs kan een uitdaging zijn. 7,8 Bundling en aggregatie van SWNTs in oplossing kunnen hun band-gap fluorescentie, 2 verdoezelen waardoor ze ongeschikt zijn voor sensing-toepassingen.
Dispergeermiddelen individuele koolstof nanobuisjes in een waterige oplossing vereist het wijzigen van hun oppervlak te hydrofobiciteit gedreven aggregatie te voorkomen. 9 Terwijl covalente modificatie SWNT kunnen wateroplosbaar, 10 en geven specifieke binding chemie, defectlocaties in de SWNT rooster verminderen of verminderen hun fluorescentie-emissie. In plaats daarvan kunnen SWNT functionalisering worden bereikt door gebruik surfactanten, lipiden, polymeren en DNA 9,11 - 13 die adsorberen aan de nanobuis oppervlak met hydrofobe en pi-pi interacties stapelen. De resulterende chemische omgeving rond het oppervlak gefunctionaliseerde SWNT's wordt aangeduid als de corona fase. Verstoringen van de corona fase kan een grote impact hebben op excitonen reizen op de nanobuis oppervlak, waardoor modulaties tot SWNT fluorescence emissie. Hierdoor gevoelige relatie tussen de corona fase en SWNT fluorescentie die kan worden benut om nieuwe moleculaire detecterende sensoren door specifieke binding modaliteiten op het grote oppervlak van SWNT. Verstoringen de SWNT corona fase na binding analyt kan leiden tot veranderingen in de lokale omgeving diëlektrische, ladingsoverdracht of invoeren roosterfouten, die allemaal kunnen de fluorescentie-emissie van de SWNT moduleren om te dienen als een signaaltransductie mechanisme. 14 Deze werkwijze wordt gebruikt bij de ontwikkeling van nieuwe fluorescerende sensoren voor de detectie van vele verschillende klassen van moleculen zoals DNA, 15,16 glucose 17 en kleine moleculen zoals ATP, 18 reactieve zuurstofdeeltjes 19 en stikstofoxide. 20,21 Echter, deze methoden beperkt doordat ze vertrouwen op het bestaan van een bekend bindend modaliteit voor het doelanalyt.
Onlangs, een meer algemene appvoorn het ontwerpen fluorescerende sensoren is ontwikkeld met SWNT niet- covalent gefunctionaliseerd met amfifiele heteropolymeren, fosfolipiden en polynucleïnezuren. Deze moleculen adsorberen aan koolstof nanobuis oppervlakken zeer stabiele suspensies van de individuele SWNTs 22 produceren - 25 met unieke corona fasen die specifiek proteïnen 26,27 of kleine moleculen, met inbegrip van de neurotransmitter dopamine kan binden. 28-30 Techniek de corona fase SWNTs en specifiek binden doelanalyten dispergeren wordt genoemd corona fase moleculaire herkenning (CoPhMoRe). 28 Het kleine formaat, lage toxiciteit, hoge stabiliteit en unbleaching nabij infrarood fluorescentie van CoPhMoRe SWNT sensoren maken ze uitstekende kandidaten voor in vivo sensing voor langere tijdsopgeloste metingen. 6 Recent werk heeft hun toepassingen in plantenweefsels getoond voor optische detectie van reactieve stikstof en zuurstof soorten. 31Een bijzonder interessante toepassing voor CoPhMoRe SWNT sensoren bestaat op label vrij detecteren van neurotransmitters zoals dopamine in vivo, waar andere technieken, zoals elektrochemische detectie of immunohistochemie, lijdt aan een gebrek aan ruimtelijke resolutie, temporele resolutie en specificiteit.
Het ontwerpen en het ontdekken CoPhMoRe SWNT sensoren tot dusver beperkt door de grootte en chemische diversiteit van de bibliotheek dispergeermiddel, beperkt de kans op het vinden van een sensor voor een bepaald doel. Tot op heden hebben onderzoekers alleen oppervlakkig beschikbare geconjugeerd, co-block, biologische en biomimetische polymeren die als functioneel actieve dispergeermiddelen voor SWNT sensoren kan dienen. Hier presenteren we verschillende methoden voor zowel het verspreiden SWNTs en karakteriseren van hun fluorescentie voor high throughput screening en voor alleenstaande SWNT sensor analyse. In het bijzonder, we een overzicht van de procedure voor het coaten van SWNTs met polynucleïnezuur oligomers met behulp van directe sonicatie alsmede hoe SWNT met amfifiele polymeren te functionaliseren door middel van oppervlakte-actieve uitwisseling door middel van dialyse. Wij gebruiken (GT) 15 -DNA en polyethyleenglycol gefunctionaliseerd met rhodamine-isothiocyanaat (RITC-PEG-RITC) als voorbeeld. We demonstreren het gebruik van (GT) 15 -DNA SWNT als CoPhMoRe sensor voor de detectie van dopamine. Tenslotte beschrijven we procedures voor het uitvoeren van individuele moleculen sensormetingen, die kan worden gebruikt voor de karakterisering of single molecule detectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Nanomaterialen kunnen extra risico's hebben in vergelijking met hun stortgoed tegenhanger. Gebruik maken van alle passende veiligheidsmaatregelen praktijken, waaronder de technische controles (zuurkast, lawaai behuizing) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, brillen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen).
1. Voorbereiding van de Buffer, Surfactant en Polymer Solutions
- Bereiding van 100 mM NaCl-oplossing
- Oplossen 584 mg NaCl in 80 ml gedeïoniseerd water. Voeg gedeïoniseerd water om de totale volume op 100 ml te brengen.
- Bereiding van 3% natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing
- Los 3 g SDS in 80 ml gedeïoniseerd water. Voeg gedeïoniseerd water om de totale volume op 100 ml te brengen.
- Bereiding van 2% natriumcholaat (SC) -oplossing
- Los 2 g zodeium cholaat hydraat in 80 ml gedeïoniseerd water. Voeg gedeïoniseerd water om de totale volume op 100 ml te brengen.
- Bereiding van beeldvormende buffer (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
- Oplossen 22,23 g Tris base en 58,44 g NaCl in 500 ml gedeïoniseerd water met een magnetische roerstaaf en plaat.
- voeg geconcentreerd HCl voorzichtig totdat een pH van 8,1 is bereikt.
- Voeg gedeïoniseerd water tot een uiteindelijk volume van 1 L. bereiken
- Synthese van RITC-PEG-polymeer RITC
- Ontbinden amine difunctionalized polyethyleenglycol (PEG) (5 kDa of 20 kDa, 0,1 mol / l) en rhodamine-isothiocyanaat (RITC, 0,2 mol / l) in 1 ml van een 1: 1 mengsel van dichloormethaan en dimethylformamide (DMF).
- Voeg 0,2 mol / l N, N-diisopropylethylamine (DIEA).
- Na 3 uur, precipiteren met 10x volume diethylether gevolgd door vacuüm filtratie.
- Opnieuw op te lossen in DMF en herhaal ether neerslag followed door vacuümfiltratie.
OPMERKING: Andere isothiocyanaat gewijzigde verbindingen (bijvoorbeeld fluoresceïne isothiocyanaat, FITC) kan worden bevestigd aan PEG of andere amine gemodificeerde polymeren met een soortgelijke methode.
- Bereiding van gepegyleerd DNA (PEG-DNA)
- Combineer 100 pl Tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) oplossing (0,5 M, pH 7,0) met 44,9 pl 5'-thiol-gemodificeerde DNA (1 mg / 10 pl in 0,1 M NaCl) en voeg aan 4,855 mL gedemineraliseerd water.
- Roer gedurende 1 uur.
- Los 500 mg methoxypolyethyleenglycol maleïmide in 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing.
- Combineer DNA en PEG-oplossing (10 ml totaal) en roer gedurende 24 uur.
2. Voorbereiding van enkelwandige koolstof nanobuis (SWNTs) Schorsingen
- Wash van SWNTs te katalysator en onzuiverheden te verwijderen.
- Voeg 200-300 mg van ongewassen SWNTs in een plastic centrifugebuis Containing 45 ml gedemineraliseerd water.
- Vortex de oplossing gedurende 2 minuten en ultrasone trillingen met een badsonificeerinrichting gedurende 5 min. Merk op dat ultrasoonapparaat instellingen variëren van instrument naar instrument, dus controleer of de optische dichtheid van de SWNT oplossing toeneemt (dat wil zeggen, wordt zwart) om ervoor te zorgen dat de SWNTs worden verspreid.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 20 min bij 16.100 xg en verwijder het supernatant.
- Voeg ongeveer 45 ml vers gedeïoniseerd water.
- Herhaal stappen 2.1.2-2.1.4 tot 8 keer.
- Verwijder zoveel mogelijk water voorzichtig gepelletiseerd SWNTs niet te verstoren en laat SWNT pellet aan de lucht drogen.
- Nucleïnezuur suspensies van SWNTs
- Ontbinden nucleïnezuren (NA) in 0,1 M NaCl tot een concentratie van 100 mg / ml.
- Verwijder statische elektriciteit van wegwerp spatel, microcentrifugebuizen en SWNT stock gebruik van een anti-statische gun. In een zuurkast, voeg 20 ul van de oplossing NA 980 ul van 00,1 M NaCl, gevolgd door toevoeging van 1 mg SWNT.
- Met een ultrasonicator met 3 mm tip diameter, ultrasone trillingen de oplossing gedurende 10 minuten bij 40% amplitude in een ijsbad.
- Centrifugeer de DNA-SWNT oplossing tweemaal gedurende 90 min bij 16.100 x g. Bij gebruik van PEG-DNA, zuiveren het overtollige en niet-omgezette DNA en PEG met behulp van een 100 kDa spin-filter. Voeg genoeg PBS om de spin-filter en draaien op 9300 xg te vullen voor 1,5 min, Herhaal deze wasstap 3 keer.
- Verzamelen en te bewaren supernatant, zorg dat u de pellet met CNT bundels en aggregaten niet te verstoren. Gooi de pellet in overeenstemming met de institutionele gevaarlijk afval procedures geschikt zijn voor nanomaterialen.
- Meet de oplossing absorptie bij 632 nm met een UV / Vis spectrofotometer globale concentratie van gesuspendeerde SWNT gebruik ε = 0,036 L / cm · mg overeenkomstig de wet van Lambert-Beer en de juiste verdunningsfactor bepalen.
- Amfifiele polymeer suspensiesvan SWNTs
- Verwijder statische elektriciteit van wegwerp spatel, micro centrifuge buizen, en SWNT voorraad. In een zuurkast, voeg 5 mg SWNTs tot 5 ml 2% SC-oplossing (als alternatief, SDS-oplossing kan worden gebruikt).
- Met een ultrasonicator met 6 mm tip diameter, ultrasone trillingen de oplossing gedurende 1 uur bij 40% amplitude in een ijsbad.
- Centrifugeer steekproef bij 150.000 xg gedurende 4 uur met behulp van een ultracentrifuge en zorgvuldig te verzamelen supernatant.
- Los 1 gew% van amfifiele polymeer (bijvoorbeeld PEG-RITC-RITC) in SC-SWNT oplossing.
- Dialyseer de polymeer-SC-SWNT oplossing wordt met een 3,5 kDa dialysemembraan tegen 1 L gedeïoniseerd water of buffer gedurende 5 dagen. Verander het water of buffer na 2 uur en 4 uur Een grotere dialysemembraan kan worden gebruikt, zolang het mogelijk verwijderen van de oppervlakte van keuze, maar het vasthouden van zowel de SWNT en amfifiele polymeer.
- Meet de oplossing absorptie bij 632 nm met een UV / Vis spectrofotometer te bepalenglobale concentratie van zwevende SWNTs gebruik van ε = 0,036 L / cm * mg in overeenstemming met de wet van Lambert-Beer en de juiste verdunningsfactor.
3. Voorbereiding van Surface geïmmobiliseerd SWNT Sensoren
- Voorbereiding van de BSA-biotine en neutravidine stamoplossingen
- Los 10 mg gevriesdroogd BSA-biotine in 1 mL gedeïoniseerd water om een 10 mg / ml voorraadoplossing en bewaar bij 4 ° C te maken.
- Los 10 mg neutravidine eiwit (NAV, gedeglycosyleerd avidine eiwit) in 2 ml gedeïoniseerd water om een 5 mg / ml voorraadoplossing te maken. WINKEL aliquots bij -20 ° C. Aliquots ontdooid kan meerdere dagen worden bewaard bij 4 ° C.
- Bereid BSA-biotine beklede microscoopglaasjes
- Reinig een microscoop glijbaan en 0,17 mm dekking van glas (of zoals geschikt is voor de microscoop objectief) met gedemineraliseerd water, gevolgd door methanol, aceton en een laatste spoeling van gedeïoniseerd water.
- Voeg 100 ul van BSA-Biotine voorraadoplossing aan 900 pl 1x Tris-buffer tot een eindconcentratie van 1 mg / ml.
- Flow 50 pi van de BSA-biotine oplossing in het kanaal pipetteren de oplossing in een einde en transporteren van oplossing aan het andere met een tissue. Incubeer gedurende 5 minuten gevolgd door 3-5 spoelingen met 50 ul van 0,1 M NaCl.
- Verdun 40 ui 5 mg / ml voorraad NAV in 960 pl 1x Tris-buffer tot een eindconcentratie van 0,2 mg / ml.
- Flow 50 pi van het NAV oplossing in het kanaal pipetteren de oplossing in een einde en transporteren van oplossing aan het andere met een tissue. Incubeer gedurende 2-5 minutengevolgd door 3-5 spoelingen met 50 ul van 0,1 M NaCl.
- Verdunde voorraadoplossingen van SWNT gesuspendeerd in beeldvorming buffer tot een concentratie van 1-10 mg / L en stroom 50 pi van de oplossing in het kanaal en incubeer gedurende 5 min.
- Voorzichtig weg te spoelen overtollige SWNTs met behulp van 50 ul van imaging buffer.
- Voorbereiding van de APTES gesilaniseerde microscoopglaasjes
OPMERKING: APTES gesilaniseerde objectglaasjes mogelijk een manier om negatief geladen DNA verpakt SWNT immobiliseren aan het oppervlak van een glassubstraat.- Bereid een 10% oplossing van (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) in ethanol.
- Met behulp van kanalen gemaakt met behulp van de stappen in 3.2.2, flow in 100 ul 1x Tris buffer.
- Spoel het kanaal met APTES-oplossing en incubeer gedurende 5 min. Wassen met 1x Tris buffer.
- Verdunde voorraadoplossingen van gesuspendeerde DNA-SWNT imaging buffer tot een concentratie van 1-10 mg / Grond stroom 50 pi van de oplossing in het kanaal en incubaten 5 min.
- Voorzichtig weg te spoelen overtollige SWNTs met behulp van 50 ul van imaging buffer.
4. fluorescentiespectroscopie en Microscopie van SWNT Sensors
- nabij infrarood fluorescentiemicroscopie
- Uitvoeren van beeldvorming oppervlak geïmmobiliseerd SWNT middels laserexcitatie en een omgekeerde microscoop uitgerust met een InGaAs sensorarray voor beeldvorming.
- Richt de laserbundel naar de achterkant belichting haven van een omgekeerde microscoop met spiegels op verstelbare kinematische bergen en een paar na Gedragen irissen ingesteld op de hoogte haven binnengaan. Zorg ervoor dat de straal waterpas en recht door de bevestiging van het door beide irissen wanneer geplaatst tussen opeenvolgende spiegels en voordat het in de verlichting poort. Pas indien nodig de bundel hoogte met behulp van een periscoop montage. Verwijder eventuele warmte filters korte pas de verlichting poort die de bundel zou verzwakken.
- Plaats een geschikte filter kubus in de microscoopde excitatie licht in de doelstelling weerspiegelen en het verzamelen van de emissie licht. Deze bestaat meestal uit een dichroïsche lange pass filter met een cutoff boven de excitatiegolflengte, (bijvoorbeeld 750 LP) en een emissie lange pass filter (bijvoorbeeld 850 LP) om verstrooid excitatielicht verder te minimaliseren van het raken van de sensor. Bovendien kan de emissie filter selectief worden gekozen voor de uitstoot van SWNT van een bepaalde chiraliteit te zijn.
- Voer fijne aanpassingen aan de koplampen door het invoegen van een geschikte uitlijning kubus het vervangen van de doelstelling met twee offset, mat schijven met 1 mm gaatjes. Richt de bundel naar het midden van zowel de onderste en bovenste uitlijning schijven.
- Bevestig een 2D InGaAs sensorarray aan de zijkant beeldvorming poort van de microscoop met een geschikte adapter en een 0,5x lens indien nodig de sensor geschikt formaat.
- Met behulp van een 100x olie-immersie objectief (1.4 NA), toe te passen fluorescentie-free immersie olie en leg de Immobiseerd SWNT monster op de microscoop podium.
- Hef het doel tot de olie contact maakt met de bodem van het dekglas (# 1,5, 170 urn dikte). Maak aanpassingen aan de doelstelling kraag indien nodig voor de beeldvorming omstandigheden, bijvoorbeeld temperatuur, glasdikte, etc.
- Langzaam verhogen van de doelstelling van de excitatie bron op en monitoren van de fluorescentie-signaal van de InGaAs camera. Fluorescentie-intensiteit moet geleidelijk toenemen als de focal plane benadert het oppervlak en de geïmmobiliseerde sensoren in beeld komen.
- nabij infrarood fluorescentiespectroscopie
OPMERKING: Fluorescentie spectroscopie kan worden uitgevoerd met dezelfde microscoop setup maar de verzamelde lichtrichtende van de microscoop lichaam en in een spectrometer en InGaAs lineaire array detector.- Met behulp van kinematische mounts en spiegels beoordeeld voor nabij infrarood, richt het lichtpad naar de ingang gleuf van de spectrometer. Richt het licht naar beneden naar een point op de ingangsspleet via een focusserende lens (bijvoorbeeld plano-convex, f = 150 mm). Deze afstemming wordt bereikt door het verzwakken van het laservermogen tot <1 mW en de microscoop objectief te vervangen door een 1 "spiegel en het gebruik van een 50/50 bundeldelende filter kubus. Het excitatielicht zal dan vertrekken de microscoop lichaam via de exit-poort en kan worden gebruikt om de spiegels en de lens aan te passen aan het focusseren op de ingangsspleet.
- Na het vervangen van de microscoop doelstelling en lange pass filter, zet een plaat op het podium en de spectra van een in-focus monster met behulp van de spectrometer en InGaAs serie op te nemen.
- Meten van de reversibele reactie van (GT) 15 DNA-SWNT's in dopamine
- Mount sensor gecoat kanalen op de microscoop podium en brengt in beeld met behulp van een 100X olie objectief en InGaAs camera. Voeg 50 ul van 100 uM dopamine oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan het stromingskanaal en opnemende verandering in fluorescentie-intensiteit.
- Spoel de dopamine-oplossing met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing en observeer de verandering in fluorescentie van de individuele SWNT sensoren.
- Well-plate screening voor analyt reactie van SWNTs sensoren
LET OP: Screening van verschillende analyten kunnen worden uitgevoerd met behulp van een doorzichtige plaat goed gecontroleerd met behulp van een gemotoriseerde podium. Een ideale well plaat is transparant voor zichtbaar en IR en heeft zwarte zijwanden om overspraak tussen de putten te minimaliseren.- Pipetteer gelijke volumes gesuspendeerd SWNT sensor (bijvoorbeeld 5 mg / l concentratie) in elk putje, genoeg om de bodem van de put uniform, kenmerkend> 100 ul van een 96-wells plaat en> 30 ul van een 384-plaatafdekking .
- Pipet analyten (bijvoorbeeld 2 pl, 100 uM uiteindelijk volume) van het screenen van de bibliotheek in de put platen. Bereid elke analyt in drievoud om rekening te houden voor potentiële well-to-well variatie, Fluctuationen van excitatie-intensiteit, of temperatuur.
- Til de doelstelling (bijvoorbeeld 20X Achroplan, 0,45 NA), terwijl het toezicht op de emissie spectra met behulp van de spectrometer en InGaAs array. Optimale positie van het doel zal het brandpuntsvlak ongeveer in het midden van het monstervolume in de put, die overeenkomen met een maximum in gemeten intensiteit zetten.
- Voor elk monster goed, neem een 1-10 s blootstelling aan een spectrum te verzamelen.
- Vergelijk de emissiespectra voor elk putje met een controlegroep die alleen SWNT zonder bijkomende analyt de fluorescentie respons kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SWNTs werden gesuspendeerd in een waterige oplossing met behulp van zowel oppervlakteactieve stoffen en amfifiele polymeren door directe sonificatie en door dialyse te wisselen. Figuur 1 toont SWNTs, geteeld met behulp van de ijzeren carbonyl gekatalyseerde methode (HiPCO), opgehangen met behulp van SC, RITC-PEF20-RITC, en (GT) 15 -DNA. De optische dichtheid van een SWNT's met SDS (of polymeren) sterk verhoogd na sonicatie en vermindert bij verwijdering van aggregaten en verontreinigingen door middel van zuivering door centrifugeren (figuur 1). Metingen van de absorptie bij 632 nm gekwantificeerd de concentratie aan gesuspendeerde SWNT. 28
De fotofysische eigenschappen van de SWNT schorsingen worden gekenmerkt met behulp van absorptie en fluorescentie spectroscopie. Figuur 2 toont de absorptie en fluorescentie emissiespectra van SWNT gesuspendeerd gebruik (GT) 15 -DNA en RITC-PEG20-RITC. the absorptiespectra een superpositie van de individuele absorptiepieken voor elke afzonderlijke chiraliteit nanobuis in het monster. Evenzo, elke chiraliteit vertoont unieke fluorescentie-emissiepiek. Verschillen in relatieve emissie piekintensiteit zijn het gevolg van verschillen in de verdeling van de populatie chiralities en verschillen in excitatie efficiënt gebruik van de 721 nm laser.
De fluorescentie respons van (GT) 15 DNA-SWNT (waarbij I 0 de initiële SWNT fluorescentie-intensiteit en I de SWNT intensiteit na dopamine toevoeging) in de aanwezigheid van verschillende concentraties van dopamine wordt gemeten door het volgen van de fluorescentie van een monster met een spectrofotometer en InGaAs lineaire array (figuur 3). De totale fluorescentie van (GT) 15 -DNA-SWNTs toe met toenemende dopamine concentratie (Figuur 3a). De fluorescentie response is een functie van de emissiepiek (figuur 3b), wat aangeeft dat de respons chiraliteit specifiek zijn. De fluorescentie van de 1044 nm en 1078 nm pieken intensiteitstoename 2-voudig dopamine concentratie nadert 2 uM. Figuur 3e toont de intensiteit van de gehele emissiespectra van PEG- (GT) 15 DNA-SWNT toename in respons op de toevoeging van dopamine.
Individuele SWNTs bekleed met een alternatieve DNA-sequentie, C 26 -DNA (bereid volgens dezelfde methoden bij (GT) 15), vastgemaakt aan het oppervlak van een microscoopglaasje worden gemeten onder toepassing van een laserbelichting InGaAs camera en 100x olie-immersie objectief (Fig 4). Monitoring enkele emitters gebonden aan een oppervlak kan worden gebruikt om de omkeerbaarheid van de sensor respons door wassen doelmoleculen afstand via bufferoplossing verifiëren. Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) micro'skopie kan ook worden gebruikt om beeldkleurstof-geconjugeerde DNA geadsorbeerd op de SWNT het aantal DNA-moleculen door fotobleken experimenten bevestigd aan elke buis kwantificeren. Figuur 4 toont 3 verschillende verbleking van Cy3-gemerkte DNA afgeleid uit de gekwantiseerde stappen van de fluorescentie-intensiteit spoor van een emitter. Deze resultaten geven aan dat drie DNA moleculen aan de SWNT.
Figuur 1: Polymer en oppervlakteactieve Geschorst SWNTs. (A) Foto van RITC-PEG20-RITC SWNTs opgehangen met behulp van 2% SC op verschillende punten van de voorbereiding. Links: SWNTs direct toegevoegd aan SC oplossing voorafgaand aan sonicatie. Center: Na 10 minuten van bad sonicatie gevolgd door 10 min sonde sonicatie bij 90% amplitude gevolgd door centrifugeren. De optische dichtheid van de oplossing toe naarmate SWNT bundels zijnverspreid (~ 100 mg / l SWNT concentratie). Rechts: Na dialyse met RITC-PEG20-RITC polymeer, de eindconcentratie van RITC-PEG-RITC gesuspendeerd SWNT is ~ 20 mg / l. (B) SWNT suspensie opbrengst kan variëren afhankelijk van het gebruikte polymeer voor de SWNT schorten. De extinctie van de oplossing geeft een goede schatting van oplossingsfase SWNT concentratie. Afgebeeld zijn verschillende concentraties (GT) 15 -DNA opgehangen buizen bij verschillende concentraties. Van links naar rechts: 100 mg / l, 10 mg / l, 1 mg / l, 0 mg / L. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Absorptie en fluorescentie-emissie spectra van oppervlakte-actieve stof en polymeer geschorst SWNTs. (A) Vertegenwoordiger absorptie spECTRA van SWNTs opgehangen met behulp van (GT) 15 -DNA door directe sonicatie. De concentratie van SWNT is 10 mg / l. Inzet: De UV-gebied van de absorptiespectra toont de karakteristieke DNA absorptiepiek bij 260 nm. (B) De absorptie spectra van RITC-PEG20-RITC SWNTs na uitwisseling van SC door dialyse. Inzet: De absorptie van een 10x verdunde monster van RITC-PEG-RITC SWNTs toont de karakteristieke absorptie van rhodamine. (C) Vertegenwoordiger nabij infrarood emissiespectra van SWNTs opgehangen met behulp van (GT) 15 -DNA door directe sonicatie (785 nm excitatie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fluorescentie detectie van dopamine gebruik (GT) 15 -DNA verpakt SWNT. (a strong>) Fluorescentie reactie van (GT) 15 -DNA verpakt SWNT de toevoeging van dopamine. Monsters sensors met een concentratie van 5 mg / l werden geëxciteerd met een 500 mW, 721 nm CW-laser. De geïntegreerde fluorescentie sensor emissie van 900-1,350 nm toeneemt met toegevoegde dopamine concentratie 1 uM tot 250 uM. (B) Fluorescentie-emissiespectra van PEG- (GT) 15 -DNA verpakt SWNTs vóór en na toevoeging van dopamine. De concentratie sensor 10 mg / ml waaraan dopamine werd toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 uM. De monsters werden aangeslagen met een 500 mW, 721 nm CW-laser. De twee hoogste intensiteit bereikt ongeveer twee op intensiteit na toevoeging van dopamine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
g "/>
Figuur 4: Fluorescentie beeldvorming van single-oppervlak geïmmobiliseerd SWNTs. (A) de fluorescentie-emissie van de afzonderlijke C 26-DNA-SWNT (rode pijlen) geïmmobiliseerd op een silica dekglaasje (# 1.5) met behulp van een APTES silaneren procedure en afgebeeld met behulp van een 2D InGaAs sensor array, omgekeerde microscoop met een 100x olie-immersie objectief ( plannen apochromaat, 1,4 NA) en een 500 mW, 721 nm CW-laser. (B) Fluorescentie bleken experiment C 26 -Cy3 DNA-SWNT vastgebonden aan een oppervlak met APTES. De DNA strengen 3 'terminaal gemerkt met Cy3 vóór tube suspensie. Het volgen van de incrementele stapsgewijze fotobleken (rood getailleerd sporen) van individuele sensoren wordt gebruikt om het aantal DNA-moleculen geadsorbeerd op het oppervlak van de SWNT bepalen. Beelden werden verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop in TIRF mode met een 100x olie-immersie objectief (plan Apochromat, 1,4 NA), en 561 nm laser excitatie. Schaal bar: 10 pm.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SWNT's worden gemakkelijk gesuspendeerd in waterige oplossing via directe sonicatie met SDS of ssDNA, zoals aangegeven door een toename van de optische dichtheid door de colloïdale dispersie van de resulterende SWNT-hybride polymeer. SDS en ssDNA verspreidt en oplosbaar bundels van SWNTs door adsorberen op de SWNT oppervlak door middel van hydrofobe of pi-pi interacties. Bovendien, andere polymeren, zoals genomisch DNA, amfifiele polymeren geconjugeerde polymeren en lipiden, worden op het oppervlak van SWNT geadsorbeerd door dialyse monsters worden opgehangen met behulp SC of SDS. Hydrofiele polymeren, zoals PEG, kunnen eindgebruikers gemodificeerd met hydrofobe "ankers" zoals RITC FITC of aan oppervlakteadsorptie van het blokcopolymeer schakelen. Voor polymeren die gevoelig zijn voor afschuiving of afbraak bij blootstelling aan de hoge vermogens van probe-tip sonicatie of voor polymeren met een lage bindingsaffiniteit voor SWNT zijn, dialyse is de beste methode om een stabiele SWNT-polymeersuspensie produceren. Na polymeer encapsning, centrifugeren verwijdert grote SWNT bundels, amorfe koolstof, achtergebleven metaal katalysator, en andere onoplosbare verontreinigingen aan een gelijkmatig verspreid monster vertrekken. Typische eindconcentraties van gedispergeerde SWNT's na centrifugeren bereik tussen 10-100 mg / l.
Sonicatie vermogen en duur kan worden aangepast en geoptimaliseerd voor de bepaalde keuze van dispergeermiddel. Dit is een kritieke stap in de procedure voor het bekleden van SWNT omdat te weinig of zwak sonicatie kan leiden tot een slechte dispersie, terwijl te veel of te krachtig sonicatie kan leiden tot slechte fluorescentie. Typisch lagere krachten nodig om schade te beperken bij het gebruik polymeren gevoelig voor afschuiving zoals DNA. Langere sonicatie duur of hogere intensiteiten kan leiden tot een vermindering van de lengte van de SWNTs, waarbij SWNTs onder de ~ 100 nm exciton recombinatie lengte worden niet-fluorescerende. De afmeting van de tip ultrasoonapparaat sonde voldoen ook aan de monstervolume om spatten te voorkomen, schuimend optimaalresultaten (meestal geleverd door de fabrikant). Raak de sondepunt naar de zijkanten van de houder en zet de oplossing op een ijsblok de verwarming van de oplossing te minimaliseren. Eenmaal gedispergeerd oplossingen van SWNT zijn stabiel bij kamertemperatuur onbeperkt.
Absorptie en emissie spectra van oplossingen van verspreide gegenereerd SWNTs bevatten meerdere pieken, met vermelding van de aanwezigheid van een mengsel van verspreide SWNTs van verschillende chiralities. Alternatieve methoden van SWNT generatie of zuiveringsmethoden kan de chiraliteit distributie te veranderen, wat leidt tot verschillende piek excitatie en emissie fluorescentie spectra. Bovendien kunnen verschillende synthesemethoden monsters van SWNT's met verschillende chiraliteit populatieverdelingen verkregen. Bijvoorbeeld: CoMoCAT (kobalt-molybdeen katalysator) gekweekt SWNT zijn rijk aan (6,5) chiraliteit, terwijl HiPCO (hoge druk met ijzer carbonyl katalysator) gekweekt SWNT zijn rijk aan (7,6) chiraliteit, leidt tot verschillen in de absorptie en photoluminescence spectra.
Bepaalde geadsorbeerde polymeren maken de specifieke detectie van analyten door het moduleren van de fluorescentie emissie van de SWNT door het veranderen van de plaatselijke omgeving aan het buisoppervlak. Deze benadering biedt het voordeel ten opzichte van covalente binding van bindende groepen van niet permanent verstoren van de SWNT rooster, die fluorescentie-emissie-intensiteit kan verminderen. 6,32 - 34 Bovendien heeft de CoPhMoRe benadering kan voor het ontwikkelen van antilichamen vrij sensoren targets waar mogelijk niet reeds bekend bindingsdeel bestaan. 28 Specifiek (GT) -DNA 15 is aangetoond dat het selectief verbeteren van de fluorescentie-emissie van SWNT's in de aanwezigheid van dopamine, waardoor het gebruik als dopamine sensor. Bulk fluorescentiemetingen een toename van wel 80% in piekemissie bepaalde SWNT chiralities. Immobiliseren (GT) 15 -DNA SWNTs op een glasplaatje in staat stelt fluorescentie response metingen van afzonderlijke (GT) 15 -DNA gefunctionaliseerde SWNT, waaruit blijkt dat de fluorescentie te verhogen met meer dan 3-voudig voor één SWNT sensoren in de aanwezigheid van dopamine, zonder noemenswaardige fotobleken, onder continue laserbelichting. De interactie tussen dopamine en de SWNT sensor is omkeerbaar, zoals duidelijk door het herstel van de oorspronkelijke fluorescerend signaal na het wassen van dopamine uit de microfluïdische kamer met buffer. Bovendien kunnen enkel-molecuul metingen een krachtige techniek voor het kwantificeren karakterisering polymeeradsorptie (figuur 4) of de kinetiek van binding gebeurtenissen. Ook kan ratiometrische sensing worden bereikt door chemisch isoleren van een enkelvoud SWNT chiraliteit met een unieke excitatie-emissie piek, functionaliseren met (GT) 15-DNA, en het isoleren van een tweede SWNT chiraliteit ongevoelig voor dopamine te zijn. Monitoring beide SWNT chiralities verschaft een constante regeling fluorescentiekanaal die kan worden vergeleken met de m odulating fluorescentie van de (GT) 15 -DNA SWNTs. Combineren van verschillende polymeren (bijvoorbeeld polyethyleenglycol en (GT) -DNA 15) kunnen additionele functionaliteit zoals het wijzigen van diffusie of cellulaire opname kenmerken, eigenschappen die essentieel zijn bij het uitvoeren van in vivo experimenten.
Momenteel is een beperking van de CoPhMoRe ontwikkelingsaanpak sensor omvatten polymeerbibliotheek ontwikkeling. Omdat bindende groepen niet a priori bekend, de ontwikkeling van een sensor voor een bepaald doel kan tijd intensief en vereist een groot aantal chemisch verschillende polymeren voor het construeren van de sensor library screening. Bovendien kan de stabiliteit en de compatibiliteit van sensoren in vivo omgevingen variëren van sensor tot sensor. Zodra een kandidaat sensor is geïdentificeerd, verdere modificatie strategieën kunnen worden toegepast om eigenschappen die nodig zijn voor in vivo toepassingen te optimaliseren.
ve_content "> Hierin hebben we een methode voor het dispergeren SWNT in waterige oplossingen toepasbaar op een grote verscheidenheid van dispergeermiddelen aangetoond. Deze benadering kan worden gebruikt om bibliotheken van gedispergeerde SWNT creëren voor de ontdekking van nieuwe nieuwe nabij infrarood sensoren voor kleine moleculen en biologische markers . van bijzonder belang zijn sensoren voor de detectie van neurotransmitters, real time, ruimtelijk precieze detectie van deze moleculen in complexe biologische omgevingen kan stellen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
- O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes--the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
