Introduction
Tek duvarlı karbon nanotüpler (SWNTs) atomik karbon atomlarının ince tabakalar eşsiz elektronik ve optik özelliklerini sergileyen ince uzun silindir içine yuvarlandı vardır. 1 Bu özellikler yerel çevreye son derece duyarlı exciton rekombinasyon yoluyla yakın kızılötesi (NIR) floresan emisyon üreten bir bant boşluk bulunmaktadır. SWNTs NIR emisyon ışık penetrasyon derinliği biyolojik doku için maksimal olduğu yakın kızılötesi pencere içinde düşer. , SWNT sergi büyük Stokes kayması photobleach yoktur ve yanıp yok: 2,3 Ayrıca, SWNTs organik fluorophores aksine atipik birçok benzersiz özellik sergilerler. 4 Son zamanlarda, bu özelliklere istismar biyoloji uygulamaları ile yeni moleküler sensörlerin bir ürün yelpazesine gelişmesine yol açmıştır. 5,6 değiştirilmemiş, ancak, SWNTs suda çözünmeyen ve tek tek SWNTs süspansiyonları elde edilmesi zor olabilir. 7,8 Bundling ve çözeltide SWNTs toplanması algılama uygulamaları için uygun hale getirilerek onların bant boşluk floresan, 2 allak bullak edebilir.
sulu çözelti içinde tek tek C-nanotüpler Dispersleme hidrofobiklik odaklı toplanmasını engellemek için yüzey modifiye gerektirir. Kovalent modifikasyon SWNTs suda çözünür, 10 oluşturmak yanı sıra spesifik bağlanma kimyası vermek mümkün olmakla birlikte 9 SWNT kafes, kusurlu kısımları azaltmak ya da floresan emisyon ortadan kalkar. Hidrofobik ve pi-pi istifleme etkileşimler yoluyla nanotüp yüzeyine adsorbe 13 - bunun yerine, SWNT işlevselleştirme yüzey aktif maddeler, lipidler, polimerler ve DNA 9,11 kullanılarak gerçekleştirilebilir. yüzey fonksiyonalizasyonuna SWNTs Çevre elde kimyasal ortamı, korona faz olarak adlandırılır. korona fazına tedirginlikler fluor SWNT için modülasyon neden nanotüp yüzeyinde seyahat eksitonlar üzerinde büyük bir etkisi olabiliremisyon Escence. Bu korona faz ve SWNT geniş yüzey alanı üzerine belirli bağlayıcı yöntemleri dahil ederek yeni moleküler sensörler geliştirmek için kullanılabilir SWNT floresan arasındaki bu hassas bir ilişkidir. analit bağlanması üzerine SWNT korona fazına tedirginlikler, yerel dielektrik ortamındaki değişikliklere yol transferi ücret veya sinyal iletim mekanizması olarak hizmet vermeye SWNTs floresan emisyon modüle bütün bunlar kafes kusurları, tanıtabilirsiniz. 14, bu yaklaşım, DNA da dahil olmak üzere moleküller, birçok farklı sınıfların tespiti, 15,16 glükoz 17 ve ATP gibi küçük moleküller için yeni floresent sensörlerin geliştirilmesinde kullanılır 18. Reaktif oksijen türleri 19 ve nitrik oksit. 20,21 Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, hedef analit için bilinen bir bağlama yöntemi varlığına dayandığı sınırlıdır.
Son zamanlarda, daha genel bir uygulamafloresent sensörlerin tasarlamak için Roach kovalent olmayan bir şekilde amfifilik heteropolimerler, fosfolipidler ve polinükleik asitler ile işlevselleştirilmiş SWNTs kullanılarak geliştirilmiştir. Özellikle proteinler 26,27 veya nörotransmiter dopamin içeren küçük molekülleri bağlayan benzersiz korona fazların 25 - Bu moleküller tek tek SWNTs 22 derece kararlı süspansiyonları üretmek için karbon nanotüp yüzeylere adsorbe. 28-30 Mühendislik SWNTs ve spesifik olarak bağlanan bir hedef analitleri dağıtmak için korona fazı olarak korona fazlı moleküler tanıma (CoPhMoRe) olarak adlandırılır. 28 küçük boyutlu, düşük toksisite, yüksek stabilite ve CoPhMoRe SWNT sensörlerinin unbleaching Nir floresan onları uzun zamana bağımlı ölçümler için in vivo algılama için mükemmel bir aday olun. 6 Yeni çalışmalar reaktif nitrojen ve oksijen türlerinin optik tespiti için bitki dokularında uygulamalarını göstermiştir. 31Böyle elektrokimyasal algılama veya immünhistokimya gibi diğer teknikler, uzamsal çözünürlük, zamansal çözünürlük ve özgüllük eksikliğinden muzdarip nerede CoPhMoRe SWNT sensörler için özellikle heyecan verici bir uygulama gibi in vivo, dopamin olarak nörotransmitterlerin etiket ücretsiz tespiti için potansiyel var.
Tasarımı ve keşfetmek CoPhMoRe SWNT sensörleri kadar belirli bir hedef için bir algılayıcı bulma ihtimalini sınırlamak, dağıtıcı kütüphanenin boyutu ve kimyasal çeşitliliği tarafından tutulurken edilmiştir. Bugüne kadar, araştırmacılar sadece konjüge ortak bloğu, biyolojik ve SWNT sensörleri gibi fonksiyonel olarak aktif dağıtıcılar hizmet verebilir biomimetic polimerlerin yüzeyinde çizik var. Burada, her iki SWNTs dağıtıcı ve yüksek miktarda madde taraması için tek SWNT sensör analiz için kendi flüoresans karakterize etmek için farklı yöntemler sunmaktadır. Özellikle, polinükleik asit oligom sahip kaplama SWNTs prosedürün ana hatlarınıErs diyaliz ile yüzey değişimi yoluyla amfifilik polimerler ile SWNT işlevselleştirilmesi nasıl yanı sıra doğrudan sonikasyon kullanılarak. Bu örnek olarak rodamin izotiosiyanat (RITC-PEG-RITC) ile fonksiyonelleştirilmiş (GT) 15-a-DNA ve polietilen glikol kullanımı. Biz dopamin saptanması için bir sensör olarak CoPhMoRe (GT) 15-a-DNA SWNTs kullanımını göstermektedir. Son olarak, biz karakterizasyonu veya tek molekül algılama için kullanılabilir tek bir molekül sensör ölçümlerini gerçekleştirmek için prosedürleri özetlemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (SDS) danışın. Nanomalzemeler onların dökme malzeme meslektaşı ile karşılaştırıldığında ek tehlikeler olabilir. mühendislik kontrolleri (davlumbaz, gürültü muhafaza) ve kişisel koruyucu donanımlar da dahil olmak üzere tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın (koruyucu gözlük, gözlük, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, kapalı-toe ayakkabıları).
Tampon, yüzey aktif madde ve polimer çözeltilerinin hazırlanması 1.
- 100 mM NaCI çözeltisinin hazırlanması
- iyonu giderilmiş su 80 mL NaCI 584 mg çözülür. 100 mL toplam hacmi getirmek için deiyonize su ilave edilir.
- % 3 sodyum dodesil sülfatın hazırlanışı (SDS) çözeltisi
- iyonu giderilmiş su 80 mL SDS hazırlanan, 3 g. 100 mL toplam hacmi getirmek için deiyonize su ilave edilir.
- % 2 sodyum kolat hazırlanması (SC) çözeltisi
- çimen 2 gr çözülüryum iyonu giderilmiş su 80 mL hidrat kolat. 100 mL toplam hacmi getirmek için deiyonize su ilave edilir.
- Görüntüleme tampon hazırlanması (1 x Trıs: 20 mM Tris, 100 mM NaCI)
- Tris baz 22.23 g ve manyetik bir karıştırma çubuğu ve plaka kullanılarak, deiyonize su, 500 mL NaCl 58.44 g çözündürülür.
- 8.1 arasında bir pH elde edilene kadar dikkatlice konsantre HCI ilave edin.
- 1 L'lik bir son hacim elde etmek için deiyonize su ekleyin
- RITC-PEG-RITC polimerin sentezi
- diklorometan ve dimetilformamid (DMF) 1 karışımı bir 1: 1 mL amin difonksiyonlu polietilen glikol (PEG) (5 kDa veya 20 kDa, 0.1 mol / L) ve rodamin izotiosiyanat (RITC, 0.2 mol / L) içinde çözülür.
- 0.2 mol N / L, N-diizopropiletilamin (DIEA) ekleyin.
- 3 saat sonra, vakumla süzülerek ve ardından dietil eter 10x hacimli hızlandırabilir.
- DMF çözülür ve eter yağış FOLLO tekrarvakum filtreleme işlemi ile evli.
Not: benzer bir yöntem kullanarak diğer izotiyosiyanat değiştirilmiş moleküller (örneğin, fluoresein izotiosiyanat, FITC) PEG ya da amin modifiyeli polimerlere eklenebilir.
- Pegile-DNA'nın hazırlanması (PEG-DNA)
- 100 tris (2-karboksietil) 44.9 uL fosfin hidroklorür (TCEP) çözeltisi (0.5 M, pH 7.0) uL 5'-tiol ile modifiye edilmiş DNA (1 mg / 0.1 M NaCI, 10 uL) ve 4.855 mL ekle birleştirin iyonu giderilmiş su.
- 1 saat boyunca karıştırılır.
- fosfat tamponlu tuzlu su içinde 5 mL metoksipolietilen glikol maleimid 500 mg eritin.
- DNA, ve PEG çözeltileri (10 ml toplam) bir araya getirin ve 24 saat boyunca kanştınn.
Tek Cidarlı Karbon Nanotüp (SWNTs) Cezalar 2. Hazırlık
- SWNTs yıkama katalizör ve safsızlıkları uzaklaştırmak için.
- plastik bir santrifüj tüpü içine conta yıkanmamış SWNTs 200-300 mg eklemeiyonu giderilmiş su ining 45 ml.
- Vortex 2 dk ve sonikasyon 5 dakika boyunca banyo sonikatör kullanarak çözüm. Ayarlar Cihaza cihazdan farklı olduğunu sonikatör unutmayın, bu yüzden SWNTs dağınık edilmesini sağlamak için SWNT çözüm artar optik yoğunluk (yani kararır) kontrol edin.
- 16.100 x g'de 20 dakika süre ile çözelti santrifüj ve supernatant atın.
- yeni iyonu giderilmiş su, yaklaşık 45 mL ekleyin.
- Adımları tekrarlayın 2.1.2-2.1.4 8 kata kadar.
- Mümkün pelet SWNTs rahatsız ve kurumaya SWNT pelet izin için dikkatli olmak kadar su çıkarmak.
- SWNTs nükleik asit süspansiyonları
- 100 mg / mL 'lik bir konsantrasyona kadar, 0.1 M NaCl içinde nükleik asitler (NA) içinde çözülür.
- Bir anti-statik tabancası kullanarak tek kullanımlık spatula, mikrosantrifüj tüpleri ve SWNT stokunun statik elektriği çıkarın. Bir duman başlığı içinde, 0 980 uL NA çözeltisi 20 mcL.1 M NaCl, 1 mg SWNTs ilave edilir.
- 3 mm çapında uçlu bir ultrasonikatör kullanılarak, bir buz banyosunda% 40 genlik 10 dakika için çözelti sonikasyon.
- x g 16,100 90 dakika iki kez DNA SWNT çözeltisi santrifüjleyin. PEG-DNA kullanıyorsanız, 100 kDa spin-filtresi kullanılarak fazlalığının ve reaksiyona girmemiş DNA ve PEG dışarı arındırmak. 1.5 dakika boyunca 9.300 xg'de Spin-filtre ve spin doldurmak bu yıkama adımı 3 kez tekrarlayın için yeterli PBS ekleyin.
- Toplayın ve CNT demetleri ve agrega içeren pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatant tutun. Nanomalzemelerin için uygun kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine uygun olarak pelet atın.
- Lambert-Beer yasası ve uygun seyreltme faktörü ile uygun olarak ε = 0.036 l / cm · mg ile süspansiyon haline SWNTs yaklaşık konsantrasyonunu belirlemek için bir UV / Vis spektrofotometre kullanılarak 632 nm'deki absorbansı ölçülür.
- Amfifilik polimer süspansiyonlarıSWNTs arasında
- tek kullanımlık spatula, mikro santrifüj tüplerine ve SWNT stokunun statik elektriği çıkarın. Bir duman başlığı içinde,% 2 SC çözeltisi 5 mL 5 mg SWNTs ekleyin (alternatif olarak, SDS çözeltisi kullanılabilir).
- 6 mm çapında bir ucu olan bir ultrasonikatör kullanılarak, bir buz banyosunda% 40 genlik de 1 saat çözeltisi sonikasyon.
- Bir ultrasantrifüjdeki kullanarak ve dikkatli supernatant toplamak 4 saat 150.000 xg'de örnek Santrifüj.
- (Örneğin, RITC-PEG-RITC) SC-SWNT çözeltisi içinde amfifilik polimerin ağırlıkça% 1 oranında çözülür.
- iyonu giderilmiş su, 1 L karşı 3.5 kDa diyaliz membranı kullanılarak polimer SC-SWNT çözeltisi Dialyze ya da 5 gün süre ile tampon. suyu değiştirin veya bu kadar uzun süre seçim yüzey kaldırılmasını sağlar gibi, saat 2 ve saat 4. büyük diyaliz membran kullanılabilir sonra tampon, ama SWNT ve amfifilik polimer hem tutma.
- belirlemek için bir UV / Vis spektrofotometre kullanılarak 632 nm'de çözüm absorbansı ölçülürLambert-Beer yasası ve uygun seyreltme faktörü uyarınca ε = 0.036 L / cm * mg kullanarak askıya SWNTs yaklaşık konsantrasyonu.
Yüzey İmmobilize SWNT Sensörler 3. hazırlanması
- BSA-biyotin ve NeutrAvidin Stok çözeltilerin hazırlanması
- 4 ° C'de 10 mg / ml stok çözeltisi ve mağaza yapmak için 1 mL deiyonize su içinde 10 mg liyofilize BSA biotin çözülür.
- 5 mg / ml stok çözelti yapmak için deiyonize su, 2 mL içerisinde 10 mg NeutrAvidin protein (NAV avidin protein deglikosile) içinde çözülür. -20 ° C'de saklayın alikotları. Çözülmüş alikotları 4 ° C'de birkaç gün muhafaza edilebilir.
- BSA-Biotin kaplı mikroskop slaytlar hazırlayın
- metanol, aseton ve deiyonize su son bir durulama adımı ve ardından bir mikroskop slaydı ve deiyonize su ile 0.17 mm kapak camı (veya mikroskop amaç için uygun), temiz.
- 1 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar 900 uL 1x Tris tampon BSA-Biotin, stok çözeltisi 100 uL ekleyin.
- bir ucuna çözelti pipetleme ve doku kullanan diğer çözümün uzaklıkta sürtmeyle kanala BSA-biyotin çözeltisi 50 uL akış. 0.1 M NaCI, 50 uL 3-5 akıtma ve ardından 5 dakika süreyle inkübe edin.
- 0.2 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar 960 uL 1x Tris tamponu içinde 5 mg / ml NAV stokunun 40 uL seyreltilir.
- bir ucuna çözelti pipetleme ve doku kullanan diğer çözümün uzaklıkta sürtmeyle kanala NAV solüsyonu 50 uL akış. 2-5 dakika inkübe0.1 M NaCI, 50 uL 3-5 akıtma izledi.
- 1-10 mg / L'lik bir konsantrasyonda Görüntüleme tampon maddesi içinde süspansiyon haline SWNTs bir stok çözelti seyreltilir ve kanala çözeltisi 50 uL akış ve 5 dakika için inkübe edilir.
- Yavaşça görüntüleme tampon 50 uL kullanarak fazla SWNTs uzakta durulayın.
- APTES Silanlanmış mikroskop lamı hazırlanması
Not: APTES slaytlar bir yolu, bir cam alt-tabaka yüzeyine, negatif yüklü DNA sarılmış SWNTs hareketsiz izin silanize.- Etanol (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) içindeki bir% 10 çözelti hazırlayın.
- 3.2.2 açıklanan aşamalara göre yapılır kanalları kullanılarak, 100 uL 1x Tris tamponu içinde akar.
- APTES çözeltisi ile kanal yıkayın ve 5 dakika için inkübe edilir. 1x Tris tamponu ile yıkayın.
- 1-10 mg / Arazi akışının bir konsantrasyonda kanalı ve bir inkubasyondan içine çözeltisinin 50 uL görüntüleme tampon içinde süspansiyon haline getirilmiş DNA SWNTs stok çözümleri seyreltilir5 dakika boyunca yedi.
- Yavaşça görüntüleme tampon 50 uL kullanarak fazla SWNTs uzakta durulayın.
4. Floresans Spektroskopisi ve SWNT Sensör Mikroskopi
- Nir Floresan Mikroskopi
- lazer uyarma ve görüntüleme için bir InGaAs sensör dizisi ile donatılmış bir ters mikroskop kullanılarak yüzey hareketsiz SWNTs görüntülenmesine gerçekleştirin.
- Ayarlanabilir kinematik bağlar aynalar ve liman yüksekliğe ayarlayın sonrası monte süsen bir çift kullanarak ters bir mikroskop arka aydınlatma noktasını girmek için lazer ışını doğrudan. ışın düzeyinde olduğundan emin olun ve sonraki aynalar arasında ve aydınlatma bağlantı noktasını girmeden önce yerleştirildiğinde düz onaylayarak her iki süsen geçer. Gerekirse, bir periskop tertibatı kullanılarak kiriş yüksekliğini ayarlayın. kiriş zayıflatmak olacağını aydınlatma bağlantı noktasında herhangi bir kısa-geçişli ısı filtrelerini çıkarın.
- mikroskop içine uygun bir filtre küp yerleştirinhedefi haline uyarma ışık yansıtır ve emisyon ışığı toplamak için. Bu genellikle dalgaboyu üzerinde bir kesim, (örneğin, 750 LP) ve daha fazla sensör vurarak dağınık uyarma ışık en aza indirmek için bir emisyon uzun geçiş filtresi (örneğin, 850 LP) ile dikroik uzun geçiş filtresi oluşur. Buna ek olarak, emisyon filtresi belli bir kiralite SWNTs emisyonu için seçici olması tercih edilebilir.
- 1 mm'lik deliklerin içeren iki ofset, buzlu diskler ile objektif yerine uygun bir uyum küp takarak ışın hizalama ince ayarlamalar yapın. hem alt ve üst hizalama disklerin merkezine ışını aynı hizaya getirin.
- Sensör boyutuna uyması için gerekirse uygun bir adaptör ve bir 0.5x lens kullanarak mikroskop yan görüntüleme noktasına 2D InGaAs sensör dizisi takın.
- Bir 100X immersiyon yağı hedefi (1.4 NA) kullanarak, floresan ücretsiz daldırma yağı uygulayın ve IMMOBI koyunMikroskop sahneye lized SWNT örnek.
- Yağ temas edene kadar cam kapak alt (# 1.5, 170 mikron kalınlığında) objektif kaldırın. Görüntüleme koşulları, örneğin, sıcaklık, cam kalınlığı, vb objektif yaka ayarlamalar yapmak gerekirse
- Yavaş yavaş uyarım kaynağı ile objektif yükseltmek ve InGaAs kamera floresan sinyalini izler. odak düzlemi yüzeyini yaklaşır ve hareketsiz sensörler odak noktası haline gelmek gibi floresan yoğunluğu kademeli olarak artmalıdır.
- Nir Floresans Spektroskopisi
NOT: Floresans spektroskopisi aynı mikroskop kurulumu kullanarak gerçekleştirilen ancak mikroskop vücudun dışına ve bir spektrometre ve InGaAs doğrusal dizi dedektör içine toplanan ışığı yönlendirerek edilebilir.- Nir için puan kinematik bağlar ve aynalar kullanılarak, spektrometrenin giriş açıklığına doğru ışık yolu yönlendirmek. Bir poi ışık aşağı Odakgirişinde bir odaklama lens kullanarak yarık nt üzerine (örneğin, dışbükey, f = 150 mm). Bu hizalama <1 mW lazer gücünü zayıflatan ve 1 "ayna ile mikroskop objektif değiştirerek ve 50/50 ışın bölücü filtre küp kullanılarak gerçekleştirilir. Uyarma ışık daha sonra çıkış kısmından mikroskop bedeni terk ve can olacak giriş açıklığının üzerine ışını odaklamak için aynalar ve lensi ayarlamak için kullanılır.
- mikroskop objektif ve uzun geçiş filtresi değiştirdikten sonra, sahneye bir plaka koyun ve spektrometre ve InGaAs dizi kullanarak bir in-odak örnek spektrumları kaydedin.
- Dopamin (GT) 15 DNA SWNTs geri dönüşümlü yanıtının ölçülmesi
- Dağı sensör mikroskop sahneye kanalları kaplı ve bir 100X petrol nesnel ve InGaAs kamerayı kullanarak odak noktası haline getirmek. akış kanalı ve kayıt fosfat tamponlu tuzlu su içinde 100 uM dopamin çözeltisi (PBS) içinde 50 ul eklefloresan değişimi.
- fosfat tamponlu tuzlu su kullanarak dopamin çözüm yıkayın ve bireysel SWNT sensörleri floresan değişimi gözlemlemek.
- SWNTs sensörlerin analit yanıtı için iyi plakalı tarama
Not: farklı analite taranması, bir motorlu kaide ile kontrol saydam plaka kullanılarak gerçekleştirilebilir. İdeal çukurlu plaka görülebilir ve IR şeffaf ve oyuklar arasındaki karışma en aza indirmek için, siyah yan duvarlar ihtiva etmektedir.- Süspansiyon haline SWNT sensör (örneğin, 5 mg / L konsantrasyon) her bir yeterli bir 384-oyuklu bir plaka için 96 oyuklu bir plaka için de eşit, genellikle> 100 uL alt ve> 30 uL kapsayacak Pipet eşit hacimleri .
- Pipet analitler (örneğin, 2 uL 100 uM nihai hacim) gözlü plakalara kütüphanenin taranması ile ilgili. potansiyelin iyi-to-kuyu varyasyon, fluctuat hesaba üç kopya halinde her analit hazırlayınuyarım yoğunluğu, veya sıcaklığın iyonları.
- Hedefi yükseltmek (örneğin, 20X achroplan, 0.45 NA) spektrometresi ve InGaAs dizisini kullanarak emisyon spektrumları izlerken. amacın optimal pozisyonu ölçülen yoğunluğu maksimum karşılık gelmelidir kuyudaki numune hacmi, ortasında yaklaşık odak düzlemi koyacağız.
- Her örnek kuyu için, bir spektrum toplamak için 1-10 s pozlama kaydedin.
- Floresan yanıtı ölçmek için, ek bir analit olmadan da SWNTs ihtiva eden bir kontrol ile her bir emisyon spektrumunu karşılaştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SWNTs yüzey aktif maddeler ve doğrudan sonikasyon ile diyaliz değişimiyle amfifilik polimerlerin her ikisini de kullanarak sulu bir çözelti içinde süspansiyon haline getirildi. Şekil 1 SC, RITC-PEF20-RITC kullanarak askıya demir karbonil katalize yöntemi (HiPCO) kullanılarak yetiştirilen ve, SWNTs gösterir (GT) 15-a-DNA. SDS (veya polimer) bir SWNTs optik yoğunluğu Sonikasyon sonrasında önemli ölçüde artırır ve santrifüj ile saflaştırma yoluyla agrega ve kirletici maddelerin çıkarılması (Şekil 1) üzerine düşer. asma SWNT konsantrasyonunu sayısal nm 632 absorbans ölçümleri. 28
SWNT süspansiyonlarının Fotofiziksel özellikleri absorbansı ve floresan spektroskopisi kullanılarak karakterize edilir. Şekil 2, (GT) 15-a-DNA ve RITC-pEG20-RITC kullanılarak süspanse SWNTs absorbans ve floresan emisyonu spektrumlarını göstermektedir. the absorbans spektrumları numunede nanotüp mevcut her farklı kiralite için bireysel absorbans zirveleri bir süperpozisyon vardır. Benzer şekilde, her kiralite eşsiz floresans emisyon tepe sergiler. görece emisyon tepe yoğunluğu açısından farklı 721 nm lazer kullanarak uyarım verimliliği nüfus chiralities dağıtımı hem de farklılıklar farklar bir sonucudur.
(I 0 başlangıç SWNT floresans şiddetidir ve dopamin ilave edilmesinden sonra SWNT yoğunluğu olan) kullanarak bir numunenin floresan izleyerek ölçülür dopamin farklı konsantrasyonlarının varlığında (GT) 15 DNA SWNTs floresan tepkisi spektrofotometre ve InGaAs doğrusal dizi (Şekil 3). (GT) 15-a-DNA-SWNTs artan dopamin konsantrasyonu ile artmıştır (Şekil 3a), toplam ışık vermiştir. floresan ryanıtı kiralite özgü olabileceğini gösteren esponse emisyon tepe bir fonksiyonudur (Şekil 3b). Dopamin konsantrasyonu 2 mcM yaklaştıkça yoğunluk 2 kat artış zirveleri nm 1044 nm floresan ve 1.078. Şekil 3e, dopamin ilave yanıt olarak PEG (GT) 15 DNA SWNT artış bütün emisyon spektrumları yoğunluğunu gösterir.
Alternatif bir DNA sekansı kullanılarak kaplanmıştır Bağımsız SWNTs, Cı 26-a-DNA bir mikroskop lamı yüzeyine gergin, ((GT) 15 aynı yöntemler kullanılarak hazırlanmıştır) bir InGaAs kamera ve 100X yağ daldırma objektif kullanarak bir lazer ışıması altında ölçülür (Şekil 4). Bir yüzeye gergin tek yayıcılar İzleme uzak tampon çözeltisi kullanılarak yıkama hedef moleküller tarafından sensör reaksiyonların incelenmesidir doğrulamak için kullanılabilir. Toplam iç yansıma floresan (TIRF) microskopyası ışıkla ağartma deneyler aracılığıyla her bir tüpe bağlı DNA moleküllerinin sayısını ölçmek için SWNTs adsorbe görüntü boya-konjüge edilmiş DNA kullanılabilir. Şekil 4 Cy3 etiketli DNA 3 ayrı ağartma olayları tek bir yayıcı floresan yoğunluğu izinin kuantize adımlar olayla gösterir. Bu sonuçlar, üç DNA molekülleri SWNT bağlı olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Polimer ve Yüzey SWNTs Asma. Preparat çeşitli noktalarda% 2 SC kullanılarak süspanse RITC-pEG20-RITC SWNTs (a) fotoğrafı. Sol: SWNTs önce sonication SC çözeltiye doğrudan ilave. Merkez: banyo sonication 10 dk santrifüj ardından% 90 genlik 10 dakika prob ucu sonication tarafından takip sonra. çözeltinin optik yoğunluğu SWNTs demetleri olarak artardağılmış (~ 100 mg / L 'SWNT konsantrasyonu). Sağ: RITC-pEG20-RITC polimer ile diyaliz RITC-PEG-RITC nihai konsantrasyonu SWNTs süspansiyon sonra 20 mg / L-fenildir. (B) SWNT süspansiyonu elde SWNT askıya almak için kullanılan polimere bağlı olarak değişebilir. çözeltinin optik yoğunluğu çözelti faz SWNT konsantrasyonunun iyi bir tahmin sağlar. Farklı konsantrasyonlarda resimde olan (GT) 15 farklı konsantrasyonlarda a-DNA askıya tüpler. Soldan sağa: 100 mg / L, 10 mg / L, 1 mg / L, 0 mg / L'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: yüzey ve polimerin emilimi ve floresan emisyon spektrumları SWNTs askıya aldı. (A) Temsilci absorbans sp(GT) 15-a-DNA doğrudan sonikasyon kullanılarak askıya SWNTs bir ECTRA. SWNT konsantrasyonu, 10 mg / L'dir. Ankastre: emme spektrumları UV alanı 260 nm'de karakteristik DNA emme ucu göstermektedir. (B) RITC-pEG20-RITC absorbansı spektrumu SWNTs diyaliz yoluyla SC değişiminden sonra. Ankastre: RITC-PEG-RITC SWNTs bir 10x seyreltilmiş numunenin absorbansı rodamin karakteristik absorbansını göstermektedir. (C) (GT) 15-a-DNA doğrudan sonikasyon ile (785 nm eksitasyon) kullanarak süspanse SWNTs temsili NIR emisyon spektrumu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: kullanarak dopamin Floresan tespiti (GT) 15-a-DNA sarılmış SWNTs. (a güçlü>) Floresan yanıtı (GT) 15-a-DNA dopamin ek sarılır SWNTs. 5 mg / L'lik bir konsantrasyonda sensörlerin örnekleri, 500 mW, 721 nm CW lazeri kullanılarak heyecan. 250 uM ilave dopamin konsantrasyonu 1 uM ile artar mil 900-1,350 sensör emisyon entegre ışık vermiştir. PEG (b) Flüoresan yayımı spektrumları (GT) 15-a-DNA SWNTs önce ve dopamin ilave edildikten sonra sarılır. Sensörün konsantrasyonu 10 mg / ml olan dopamin 100 uM'lik nihai konsantrasyona kadar ilave edildi etmektir. Numuneler 500 mW, 721 nm CW lazer kullanılarak heyecan vardı. İki yüksek yoğunluk dopamin eklenmesinden sonra yoğunluğu yaklaşık iki kat zirveleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
g "/>
Şekil 4: Tek yüzey hareketsiz SWNTs floresan görüntüleme. (A) Floresans bir APTES silanizasyon prosedürü kullanarak bir silis kapak kayma (# 1.5) üzerine immobilize bireysel C 26-a-DNA-SWNT (kırmızı oklar) emisyon ve 2D InGaAs sensör dizisi kullanarak görüntülü, bir 100X immersiyon yağı amacı ile ters mikroskop ( Plan apochromat, 1.4 NA) ve 500 mW, 721 nm CW lazer. Cı 26 -Cy3 DNA SWNTs (b) Flüoresan ağartıcı deney APTES kullanılarak bir yüzeye gergin. DNA ipliklerini ölümcül önce tüp süspansiyon Cy3 ile etiketlenmiş '3 vardır. ayrı sensörlerin artan aşamalı photobleaching (kırmızı donatılmış iz) Takip SWNTs yüzeyi üzerine adsorbe DNA moleküllerinin sayısını belirlemek için kullanılır. Görüntüler, bir 100X yağ daldırma objektif (Plan Apochromat, 1.4 NA) ve 561 nm lazer eksitasyonla TIRF modunda bir ters mikroskop kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu: 10 mikron.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elde edilen SWNT polimer melez koloidal dispersiyon sağladığı optik yoğunluktaki artış ile gösterildiği gibi SWNTs hali hazırda, SDS ve ssDNA doğrudan sonikasyon ile sulu çözelti içinde süspanse edilmektedir. SDS ve ssDNA dağılır ve hidrofobik veya PI-pi etkileşimlerle SWNT yüzeyi üzerine adsorbe ederek SWNTs demetlerini çözünür. Ek olarak, genomik DNA, amfifilik polimerler, birleştirilmiş polimerler ve lipitler gibi diğer polimerleri, SC veya SDS ile süspansiyon örneklerinin diyaliz ile SWNTs yüzeyi üzerine adsorbe edilebilir. PEG gibi hidrofilik polimerler, blok kopolimerin yüzey adsorpsiyonunu mümkün kılmak için RITC ya FITC gibi hidrofob "çapa" ile biter modifiye edilebilir. Veya SWNT düşük bağlanma afinitelerine sahip polimerler için prob ucu sonikasyon yüksek güçlere maruz kalma üzerine kesme ya da bozulma duyarlı polimerler, diyaliz stabil SWNT polimer süspansiyonu üretmek için en iyi yöntemdir. Polimer Encaps ardındanulation, santrifüj, bir homojen olarak dağılmış bir örnek bırakmak için geniş SWNT demetleri, amorf karbon, artık metal katalizörü ve diğer çözünmeyen kirlilikleri ortadan kaldırır. 10-100 mg / L arasında santrifüj aralığından sonra dağılan SWNTs tipik son konsantrasyonları.
Sonikasyon gücü ve süresi ayarlanmış ve dağıtıcı seçimi için optimize edilebilir. Çok az ya da zayıf sonication kötü dağılmasına neden olabilir, çünkü çok fazla veya çok güçlü sonikasyon kötü floresan yol açabilir iken bu kaplama SWNTs prosedürü kritik bir adımdır. Tipik haliyle, düşük güçler DNA gibi kesme duyarlı polimerler kullanıldığında zararı en aza indirmek için gereklidir. Daha uzun sonikasyon süreleri veya daha yüksek yoğunluklar ~ 100 nm exciton rekombinasyon uzunluğu aşağıdaki SWNTs floresan olmayan hale SWNTs, uzunluğunun azalmasına yol açabilir. sonikatör prob ucu boyutu da sıçramasını önlemek için numune hacmi maç ve optimum için köpürme olmalıdırSonuçlar (genellikle üretici tarafından sağlanan). kabın iki prob ucu dokunmaktan kaçının ve solüsyonun ısıtılmasını minimum seviyeye indirmek için bir buz bloğu üzerine çözelti yerleştirin. dağılmış sonra SWNTs çözeltileri süresiz oda sıcaklığında stabildir.
dağılmış oluşturulan SWNTs Çözeltilerin absorbansı ve emisyon spektrumu, farklı chiralities dağılmış SWNTs bir karışımının varlığına işaret eden, birden fazla tepe içerir. SWNT üretim veya saflaştırma yöntemlerinin alternatif yöntemler farklı pik uyarma ve emisyon floresans spektrumları yol kiralite dağılımını değiştirebilir. Ayrıca, farklı sentez yöntemleri farklı bakışımsızlık nüfus dağılımları ile SWNTs örnekleri verebilir. Örneğin: HiPCO (demir karbonil katalizörü ile yüksek basınç) yetiştirilen SWNTs (7,6) kiralite zengin iken CoMoCAT (kobalt, molibden katalizör) yetiştirilen SWNTs emme farklılıklara yol (6,5) kiralite açısından zengin ve photoluminescence spektrumları.
Bazı adsorbe polimerler tüp yüzeyinde yerel ortamı değiştirerek SWNT floresan emisyonunu modüle ederek analitlerin belirli algılanmasını sağlamak. Bu yaklaşım kalıcı floresans emisyon yoğunluğunu azaltabilir SWNT kafesi, bozarak değil tarafından kısımları bağlama kovalent eki üzerinde ayrı bir avantaj sunuyor. 6,32 - 34 Ayrıca, CoPhMoRe yaklaşımı zaten bilinen bir bağlama kısmını orada olmayabilir hedefler için antikor ücretsiz sensörler geliştirme potansiyeline sahiptir. 28. Spesifik olarak, (GT) 15-a-DNA seçici dopamin sensörü olarak kullanımını sağlayan, dopamin mevcudiyetinde SWNTs floresan emisyonu artırmak için gösterilmiştir. Toplu floresan ölçümleri belli SWNT chiralities için pik emisyon 80 kadar% artış göstermektedir. Sabitleştirici (GT) bir bardak slayt 15-a-DNA SWNTs floresan resp sağlarSürekli lazer aydınlatma altında, kayda değer herhangi bir photobleaching olmadan, dopamin varlığında tek SWNT sensörler için 3 kat üzerinde bir artış olduğunu floresan gösteren bireysel (GT) 15-a-DNA işlevselleştirilmiş SWNT ve onse ölçümleri. dopamin ve SWNT sensörü arasındaki etkileşim tamponu ile mikroakışkan odasının dışında dopaminin yıkandıktan sonra orijinal floresan sinyal kurtarma ile belirgin olarak, tersine çevrilebilir. Buna ek olarak, tek bir molekül ölçümleri polimer adsorpsiyonu (Şekil 4) ya da bağlanma etkinlikleri kinetiklerini ölçülmesi için güçlü bir karakterizasyon tekniği olabilir. Ayrıca, rasyometrik algılama kimyasal benzersiz uyarım emisyonu zirve ile tekil bir SWNT kiralite izole edilmesi (GT) 15-a-DNA ile fonksiyonalize ve dopamin duyarsız olduğu ikinci bir SWNT kiralite izole edilmesi suretiyle elde edilebilir. Her iki SWNT chiralities İzleme m mukayese edilebilir istikrarlı kontrol floresan kanalı sağlar (GT) 15-a-DNA SWNTs floresan odulating. Farklı polimerler (ör, polietilen glikol ve (GT) 15-a-DNA) gibi modifiye yayılma veya hücresel alım özellikleri, in vivo deneyler yaparken önemli olan özellikler olarak eklemek için ek işlevler birleştirilmesi.
Şu anda, geliştirme sensör CoPhMoRe yaklaşımının bir sınırlama polimer kütüphane geliştirme içerir. Bağlama parçasının yoğun bir zaman alabilir ve tarama sensörü kütüphanesinin oluşturulması için kimyasal olarak çeşitli polimerlerin çok sayıda gerektirebilir belirli bir hedef için bir algılayıcı geliştirme, a priori olarak bilinmesi değildir çünkü. Buna ek olarak, in vivo ortamlarda stabilite ve sensörlerin uyumluluk sensör sensör arasında değişebilir. Aday sensörü belirlendikten sonra, ancak, başka bir modifikasyonu stratejileri in vivo uygulamalar için gerekli özelliklerini optimize etmek için kullanılabilir.
ve_content "> Burada, dağıtıcı ajanlar, çok çeşitli uygulanabilen sulu çözeltiler içinde SWNTs dağıtmak için bir yöntem gösterilmiştir. Bu yaklaşım, küçük moleküller ve biyolojik belirteçler için yeni yeni NIR sensörleri keşfi için dağılmış SWNTs kütüphanelerini oluşturmak için kullanılabilir . özellikle ilgi çekici gerçek zamanlı, karmaşık biyolojik ortamlarda bu moleküllerin mekansal hassas algılama sağlayabilir nörotransmitterlerin tespiti için sensörler bulunmaktadır.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
- O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al.
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
