Introduction
Monoparoi nanotubes de carbone (SWNTs) sont atomiquement des couches minces d'atomes de carbone laminées dans de longs cylindres minces, qui présentent des propriétés électroniques et optiques uniques. 1 Ces propriétés comprennent une bande interdite production proche infrarouge (NIR) émission de fluorescence par recombinaison exciton qui est très sensible à son environnement local. L'émission NIR SWNT tombe dans la fenêtre infrarouge proche dans lequel la profondeur de pénétration de la lumière est maximal pour les tissus biologiques. 2,3 En outre, SWNT présentent plusieurs caractéristiques uniques atypiques contrairement à des fluorophores organiques: SWNT présentent un grand décalage de Stokes, ne photobleach pas, et ne clignotent pas. 4 Récemment, l' exploitation de ces caractéristiques a conduit à l'élaboration d'un assortiment de capteurs moléculaires avec des applications en biologie. 5,6 Unmodified, cependant, SWNT sont insolubles dans l' eau, et d' obtenir des suspensions de SWNT individuelles peut être un défi. 7,8 Bundling et l' agrégation des SWNT en solution peuvent masquer leur fluorescence de bande interdite, 2 les rendant impropres à des applications de détection.
Dispersion des nanotubes de carbone individuels en solution aqueuse nécessite la modification de leur surface pour empêcher l'agrégation entraînée hydrophobie. 9 Bien que la modification covalente peut rendre SWNT soluble dans l'eau, 10 ainsi que de répandre la chimie de liaison spécifique, les sites de défaut dans le réseau de SWNT réduire ou diminuent leur émission de fluorescence. Au lieu de cela, des SWNT fonctionnalisation peut être réalisée en utilisant des tensioactifs, des lipides, des polymères et de l' ADN 9,11 - 13 adsorbées à la surface des nanotubes au moyen d' interactions hydrophobes et d' empilement pi-pi. L'environnement chimique résultante entourant SWNT fonctionnalisés de surface est appelée la phase de couronne. Perturbations à la phase corona peuvent avoir un impact important sur excitons voyageant sur la surface du nanotube, ce qui provoque des modulations à SWNT Fluorescence émission. Il est cette relation sensible entre la phase corona et SWNT fluorescence qui peut être exploitée pour développer de nouveaux capteurs moléculaires en incorporant des modalités de liaison spécifique sur la grande surface de SWNT. Perturbations à la phase de corona SWNT sur analyte de liaison peuvent conduire à des changements dans l'environnement diélectrique local, transfert de charge, ou d'introduire des défauts de réseau, tous capables de moduler l'émission de fluorescence des SWNT à servir de mécanisme de transduction du signal. 14 Cette approche est utilisée dans le développement de nouveaux capteurs fluorescents pour la détection de différentes classes de molécules , y compris l' ADN, 15,16 glucose 17 et de petites molécules telles que l' ATP, 18 espèces réactives de l' oxygène 19 et d' oxyde nitrique. 20,21 Cependant, ces approches sont limitées en ce qu'elles reposent sur l'existence d'une modalité de liaison connue pour l'analyte cible.
Récemment, une application plus génériquegardon à la conception de capteurs fluorescents a été développé en utilisant SWNT non covalente fonctionnalisés avec des hétéropolymères amphiphiles, des phospholipides et des acides polynucléique. Ces molécules adsorbées à la surface des nanotubes de carbone pour produire des suspensions très stables de SWNT individuels 22 - 25 avec des phases corona uniques qui peuvent se lier spécifiquement à des protéines ou de petites molécules 26,27 , y compris la dopamine. 28 - 30 Ingénierie de la phase corona pour disperser SWNT et en particulier des analytes cibles se lient est appelé à la reconnaissance moléculaire de phase corona (CoPhMoRe). 28 La petite taille, faible toxicité, une grande stabilité et unbleaching fluorescence nIR de capteurs CoPhMoRe SWNT font d'excellents candidats pour la détection in vivo pour des mesures résolues en temps prolongées. 6 Des travaux récents ont montré leurs applications dans les tissus végétaux pour la détection optique des espèces d'azote et d' oxygène réactif. 31Une application particulièrement intéressante pour les capteurs CoPhMoRe SWNT est le potentiel de marqueur libre détection des neurotransmetteurs tels que la dopamine in vivo, où d' autres techniques, telles que la détection électrochimique ou immunohistochimie, souffrent d'un manque de résolution spatiale, la résolution temporelle et la spécificité.
Conception et découverte capteurs CoPhMoRe SWNT a jusqu'à présent été freinée par la taille et la diversité chimique de la bibliothèque de dispersant, ce qui limite la probabilité de trouver un capteur pour une cible particulière. À ce jour, les chercheurs ont seulement gratté la surface de conjugué disponible, co-bloc, biologique et polymères biomimétiques qui pourraient servir de dispersants fonctionnellement actifs pour les capteurs de SWNT. Ici, nous présentons des méthodes différentes pour les deux dispersant SWNT et de caractériser leur fluorescence pour le criblage à haut débit et pour seule analyse du capteur de SWNT. Plus précisément, nous décrivons la procédure de SWNT de revêtement avec oligom d'acide polynucléiqueteurs utilisant sonication directe ainsi que la façon de fonctionnaliser SWNT avec des polymères amphiphiles par l'échange de surfactant par dialyse. Nous utilisons (GT) 15 -ADN et de polyéthylène glycol fonctionnalisé avec de la rhodamine isothiocyanate (RMCT-PEG-RMCT) à titre d' exemples. Nous démontrons l'utilisation de (GT) 15 -ADN SWNT comme un capteur de CoPhMoRe pour la détection de la dopamine. Enfin, nous décrivons des procédures pour effectuer des mesures individuelles de détection de molécules qui peuvent être utilisées pour la caractérisation ou la détection de la molécule unique.
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Protocol
Attention: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (SDS) avant utilisation. Nanomatériaux peuvent avoir des risques supplémentaires par rapport à leurs homologues de la matière en vrac. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées, y compris les contrôles techniques (hotte, enceinte de bruit) et de l'équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, lunettes, blouse, pantalon de longueur, fermé orteils chaussures).
1. Préparation de tampon, un tensioactif et un polymère Solutions
- Préparation d' une solution de NaCl 100 mM ,
- Dissoudre 584 mg de NaCl dans 80 ml d'eau déminéralisée. Ajouter de l'eau déminéralisée pour amener le volume total à 100 ml.
- Préparation de 3% de dodécylsulfate de sodium (SDS) à une solution
- Dissoudre 3 g de SDS dans 80 ml d'eau déminéralisée. Ajouter de l'eau déminéralisée pour amener le volume total à 100 ml.
- Préparation de cholate de sodium à 2% (SC) solution
- Dissoudre 2 g de gazonium cholate hydraté dans 80 ml d'eau déminéralisée. Ajouter de l'eau déminéralisée pour amener le volume total à 100 ml.
- Préparation du tampon d'image (1 x Tris: 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl)
- Dissoudre 22,23 g de base Tris et 58,44 g de NaCl dans 500 ml d'eau déminéralisée en utilisant une barre d'agitation magnétique et la plaque.
- ajouter avec précaution du HCl concentré jusqu'à ce qu'un pH de 8,1 soit atteint.
- Ajouter de l'eau déminéralisée pour atteindre un volume final de 1 L.
- Synthèse du polymère RMCT-PEG-RMCT
- Dissoudre l'aminé difonctionnalisés polyéthylène glycol (PEG) (5 kDa ou 20 kDa, de 0,1 mol / L) et de l'isothiocyanate de rhodamine (RMCT, 0,2 mol / L) dans 1 ml d'un mélange 1: 1 de dichlorométhane et de diméthylformamide (DMF).
- Ajouter 0,2 mol / L de N, N - diisopropyléthylamine (DIEA).
- Au bout de 3 h, un précipité 10x volume d'éther diéthylique suivie d'une filtration sous vide.
- Redissoudre dans du DMF et répéter l'éther précipitation follomené par filtration sous vide.
REMARQUE: Les autres molécules modifiées isothiocyanate (par exemple, isothiocyanate de fluorescéine, FITC) peut être attaché à du PEG ou d' autres polymères d'aminé modifiée à l' aide d' un procédé similaire.
- Préparation de l' ADN-pégylé (PEG-ADN)
- Moissonneuse-batteuse 100 ul de tris (2-carboxyéthyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP) solution (0,5 M, pH 7,0) avec 44,9 ul de 5'-thiol modifié par l'ADN (1 mg / 10 ul dans du NaCl 0,1 M) et ajouter à 4,855 ml de l'eau déminéralisée.
- Agiter pendant 1 h.
- Dissoudre 500 mg de méthoxypolyéthylèneglycol maléimide dans 5 ml de tampon phosphate salin.
- Combiner les solutions d'ADN et de PEG (10 ml au total) et agiter pendant 24 h.
2. Préparation de l'unité Walled Carbon Nanotubes (SWNT) Suspensions
- Wash de SWNT pour éliminer le catalyseur et les impuretés.
- Ajouter 200-300 mg de SWNT non lavés dans un conta de tube de centrifugeuse en plastiqueining 45 ml d'eau déminéralisée.
- Tourbillonnaire la solution pendant 2 min et de traitement par ultrasons au moyen d'un bain de sonication pendant 5 min. Notez que sonicator paramètres varient d' un instrument à, afin de vérifier que la densité optique de la solution SWNT augmente (c. -à- vire au noir) pour veiller à ce que les SWNT sont dispersés.
- Centrifuger la solution pendant 20 minutes à 16.100 xg et jeter le surnageant.
- Ajouter environ 45 ml d'eau désionisée fraîche.
- Répétez les étapes 2.1.2-2.1.4 jusqu'à 8 fois.
- Retirer l'eau autant que possible en faisant attention à ne pas perturber SWNT granulées et laisser SWNT culot sécher à l'air.
- Les suspensions d'acide nucléique de SWNT
- Dissoudre les acides nucléiques (NA) dans 0,1 M de NaCl à une concentration de 100 mg / ml.
- Retirer l'électricité statique de spatule jetable, microtubes et SWNT stock à l'aide d'un canon anti-statique. Dans une hotte aspirante, ajouter 20 ul de la solution d'AN à 980 pi de 00,1 M de NaCl suivi par l'addition de 1 mg SWNT.
- L'utilisation d'un appareil à ultrasons avec embout de 3 mm de diamètre, sonication la solution pendant 10 min à 40% d'amplitude dans un bain de glace.
- Centrifuger la solution ADN-SWNT DEUX FOIS pendant 90 min à 16100 x g. Si vous utilisez PEG-ADN, purifier l'excès et l'ADN qui n'a pas réagi et le PEG en utilisant un 100 kDa spin-filtre. Ajouter suffisamment PBS pour remplir le spin-filtre et essorage à 9300 xg pendant 1,5 min, Répétez cette étape de lavage 3 fois.
- Recueillir et conserver le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber le culot contenant les faisceaux et les agrégats de la CNT. Jeter la pastille conformément aux procédures de déchets dangereux institutionnels appropriés pour les nanomatériaux.
- Mesurer l'absorbance de la solution à 632 nm en utilisant un spectrophotomètre UV / VIS pour déterminer la concentration approximative de SWNT en suspension en utilisant ε = 0,036 L / cm · mg conformément à la loi de Beer-Lambert et le facteur de dilution approprié.
- Les suspensions de polymères amphiphilesde SWNT
- Retirer l'électricité statique de spatule jetable, des tubes de centrifugeuse micro et SWNT stock. Dans une hotte, ajouter 5 mg SWNT à 5 ml de solution de SC 2% (en variante, la solution SDS peut être utilisé).
- L'utilisation d'un appareil à ultrasons avec la pointe de 6 mm de diamètre, sonication la solution pendant 1 h à 40% d'amplitude dans un bain de glace.
- échantillon Centrifugeuse à 150.000 xg pendant 4 h en utilisant une ultracentrifugeuse et recueillir soigneusement surnageant.
- Dissoudre 1% en poids de polymère amphiphile (par exemple, RMCT-PEG-RMCT) en solution SC-SWNT.
- Dialyser la solution polymère-SC-SWNT en utilisant une membrane de dialyse 3,5 kDa contre 1 L d'eau déminéralisée ou tampon pendant 5 jours. Modifier hors de l'eau ou un tampon après 2 heures et 4 heures une membrane de dialyse plus grand peut être utilisé, tant qu'il permet l'élimination de l'agent tensioactif de choix, mais la rétention des deux SWNT et d'un polymère amphiphile.
- Mesurer l'absorbance de la solution à 632 nm en utilisant un spectrophotomètre UV / VIS pour déterminerconcentration approximative de SWNT en suspension en utilisant ε = 0,036 L / cm * mg conformément à la loi de Beer-Lambert et le facteur de dilution approprié.
3. Préparation de surface Immobilisé Capteurs SWNT
- Préparation de BSA-biotine et des solutions mères NEUTRAVIDIN
- Dissoudre 10 mg lyophilisé BSA-biotine dans 1 ml d'eau déminéralisée pour faire un / ml solution mère et stocker 10 mg à 4 ° C.
- Dissoudre 10 mg de protéine NeutrAvidin (NAV, déglycosylée protéine avidine) dans 2 ml d'eau déminéralisée pour faire un / ml de solution mère de 5 mg. aliquotes de conserver à -20 ° C. aliquots décongelés peuvent être conservés pendant plusieurs jours à 4 ° C.
- Préparer BSA-biotine lames de microscope revêtues
- Nettoyer une lame de microscope et 0,17 mm couvercle en verre (ou en fonction de l'objectif du microscope) avec de l'eau déminéralisée, suivi par le méthanol, l'acétone et un rinçage final de l'eau déminéralisée.
- Ajouter 100 pi de BSA-biotine solution mère à 900 pi de tampon de 1x Tris à une concentration finale de 1 mg / mL.
- Un débit de 50 ul de la solution de BSA-biotine dans le canal par pipetage de la solution dans une extrémité et évacuant la solution à l'autre à l'aide d'un tissu. Incuber pendant 5 minutes, puis 3-5 bouffées avec 50 ul de 0,1 M de NaCl.
- Diluer 40 pi de 5 mg / mL VNI stock en 960 pi de tampon 1x Tris à une concentration finale de 0,2 mg / mL.
- Écoulement 50 ul de la solution VL dans le canal par pipetage de la solution dans une extrémité et évacuant la solution à l'autre à l'aide d'un tissu. Incuber pendant 2-5 minutessuivie de 3-5 bouffées avec 50 ul de 0,1 M de NaCl.
- Diluer les solutions mères de SWNT en suspension dans un tampon d'image à une concentration de 1-10 mg / l et un débit de 50 ul de la solution dans le canal et laisser incuber pendant 5 min.
- Rincer délicatement loin SWNT en excès à l'aide de 50 pi de tampon d'imagerie.
- Préparation des lames de microscope de APTES
REMARQUE: Les lames silanisées APTES permettent d'immobiliser un moyen SWNT d'ADN enveloppés chargés négativement à la surface d'un substrat en verre.- Préparer une solution aqueuse à 10% de (3-aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) dans l'éthanol.
- Utilisation des canaux réalisés en utilisant les étapes décrites dans 3.2.2, le débit dans un tampon de 100 pi de Tris 1x.
- Rincer le canal avec une solution APTES et incuber pendant 5 min. Laver avec du tampon Tris 1x.
- Diluer solutions de stockage de l'ADN-SWNT en suspension dans un tampon d'imagerie à une concentration de flux / Terrain 1-10 mg 50 ul de la solution dans le canal et Incubmangé pendant 5 min.
- Rincer délicatement loin SWNT en excès à l'aide de 50 pi de tampon d'imagerie.
4. Fluorescence Spectroscopy et Microscopie de SWNT Capteurs
- nIR Fluorescence Microscopy
- Effectuer une imagerie de surface en utilisant des SWNT immobilisés excitation laser et d'un microscope inversé équipé d'un réseau de capteurs InGaAs pour l'imagerie.
- Diriger le faisceau laser pour entrer dans le port d'éclairage arrière d'un microscope inversé en utilisant des miroirs sur supports cinématiques réglables et une paire d'iris-tige fixés à la hauteur du port. Assurer que le faisceau soit de niveau et droite en confirmant qu'il passe à travers les deux iris lorsqu'il est placé entre les miroirs ultérieurs et avant qu'il ne pénètre dans l'orifice d'illumination. Si nécessaire, ajuster la hauteur du faisceau en utilisant un ensemble de périscope. Retirez tous les filtres de chaleur de courte passe-sur le port d'éclairage qui atténuerait le faisceau.
- Insérez un cube de filtre approprié dans le microscopepour réfléchir la lumière d'excitation dans l'objectif et de collecter la lumière d'émission. Cela se compose généralement d'un filtre à long col dichroïque avec une coupure au-dessus de la longueur d' onde d'excitation, (par exemple, 750 LP) et un filtre à long passage d'émission (par exemple, 850 LP) afin de réduire davantage la lumière d'excitation diffusée à partir de frapper le capteur. En outre, le filtre d'émission peut être choisi pour être sélectif pour l'émission d'un SWNT chiralité particulier.
- Effectuer des réglages fins de l'alignement du faisceau en insérant un cube d'alignement approprié de remplacer l'objectif avec deux offset, disques dépoli contenant 1 mm pinholes. Aligner le faisceau par rapport au centre des deux disques d'alignement inférieure et supérieure.
- Attacher un capteur tableau 2D InGaAs au port d'imagerie latérale du microscope en utilisant un adaptateur approprié et une lentille 0,5X si nécessaire pour s'adapter à la taille du capteur.
- L'utilisation d'une immersion dans l'huile objectif 100X (1,4 NA), appliquer de l'huile d'immersion libre fluorescence et placez le Immobilisée échantillon de SWNT sur la platine du microscope.
- Élever l'objectif jusqu'à ce que les contacts de l'huile au fond du verre de couverture (# 1.5, épaisseur de 170 um). Faire des ajustements au collier objectif si nécessaire pour des conditions d'imagerie, par exemple, la température, l' épaisseur du verre, etc.
- Soulevez lentement l'objectif avec la source d'excitation sur et surveiller le signal de fluorescence de la caméra InGaAs. L'intensité de fluorescence devrait augmenter progressivement le plan focal se rapproche de la surface et les capteurs viennent immobilisés dans le foyer.
- nIR Fluorescence Spectroscopy
REMARQUE: La spectroscopie de fluorescence peut être effectuée en utilisant la même configuration de microscope, mais en dirigeant la lumière collectée hors du corps de microscope et dans un spectromètre et InGaAs détecteur à réseau linéaire.- Utilisation de supports cinématiques et des miroirs notés pour nIR, diriger le chemin de la lumière vers la fente d'entrée du spectromètre. Concentrez la lumière vers le bas pour un point sur la fente d' entrée en utilisant une lentille de focalisation (par exemple plan-convexe, f = 150 mm). Cet alignement est réalisé en atténuant la puissance du laser à <1 mW et le remplacement de l'objectif de microscope avec un "miroir 1 et en utilisant un filtre cube 50/50 diviseur de faisceau. La lumière d'excitation sera alors quitter le corps du microscope à travers l'orifice de sortie et ne pouvez être utilisé pour régler les miroirs et de lentilles pour focaliser le faisceau sur la fente d'entrée.
- Après avoir remplacé l'objectif du microscope et à long filtre passe, placer une plaque bien sur la scène et enregistrer les spectres d'un échantillon de mise au point à l'aide du spectromètre et tableau InGaAs.
- Mesure de la réponse réversible (GT) 15 ADN-SWNT à la dopamine
- Monter le capteur revêtu canaux sur la scène du microscope et mettre au point à l'aide d'un objectif d'huile 100X et la caméra InGaAs. Ajouter 50 ul de solution 100 uM de dopamine dans du tampon phosphate salin (PBS) pour le canal d'écoulement et l'enregistrementle changement d'intensité de fluorescence.
- Laver la solution de la dopamine en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate et d'observer le changement de la fluorescence des capteurs de SWNT individuels.
- Dépistage Bien-plaque pour une réponse en analyte de SWNT capteurs
NOTE: Projection de différents analytes peut être effectuée en utilisant une plaque de puits transparente contrôlée à l'aide d'une platine motorisée. Une plaque de puits idéal est transparent à la lumière visible et IR et a des parois latérales noires pour minimiser la diaphonie entre les puits.- Pipette volumes égaux de capteur de SWNT en suspension (par exemple, 5 mg concentration / L) dans chaque puits, assez pour couvrir le fond du puits de manière uniforme, typiquement> 100 pi pour une plaque de 96 puits et> 30 pl pour une plaque à 384 puits .
- Pipette analytes (par exemple, 2 ul, 100 uM de volume final) de criblage de bibliothèque dans les plaques des puits. Préparer chaque analyte en triple pour tenir compte des puits de potentiel à puits variation, fluctuatdes ions d'intensité d'excitation, ou de la température.
- Soulever l'objectif (par exemple, 20X achroplan, 0,45 NA) tout en surveillant les spectres d'émission à l' aide du spectromètre et réseau InGaAs. la position optimale de l'objectif de mettre le plan focal à peu près au milieu du volume de l'échantillon dans le puits, ce qui devrait correspondre à un maximum d'intensité mesurée.
- Pour chaque échantillon, enregistrer l'exposition d'un 1-10 pour recueillir un spectre.
- Comparer les spectres d'émission pour chaque puits à un témoin ne contenant que des SWNT sans analyte supplémentaire pour quantifier la réponse de fluorescence.
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Representative Results
SWNT ont été suspendues en solution aqueuse en utilisant les tensioactifs et les polymères amphiphiles par sonication directe et par échange de dialyse. La figure 1 montre SWNT, cultivé selon la méthode du carbonyle de fer catalysée (HIPCO), suspendue en utilisant SC, RMCT-PEF20-RMCT, et (GT) 15 -ADN. La densité optique d'un SWNT avec du SDS (ou polymère) augmente de manière spectaculaire après sonication et diminue lors de l' élimination des agrégats et des contaminants à travers la purification par centrifugation (figure 1). Les mesures de l'absorbance à 632 nm quantifiées la concentration de SWNT suspendue. 28
Les propriétés photophysiques des suspensions de SWNT sont caractérisées à l'aide d'absorbance et la spectroscopie de fluorescence. La figure 2 montre l'absorbance et la fluorescence des spectres d' émission de SWNT en suspension à l' aide (GT) 15 -ADN et RMCT-PEG20-RMCT. the spectres d'absorption sont une superposition des pics d'absorbance individuels pour chaque chiralité des nanotubes distincts présents dans l'échantillon. De même, chaque chiralité présente son pic unique, d'émission de fluorescence. Les différences dans l'intensité relative de pic d'émission sont le résultat de différences dans la répartition de la population de chiralité ainsi que des différences dans l'efficacité d'excitation à l'aide du laser 721 nm.
La réponse de fluorescence (GT) 15 d' ADN SWNT (où I 0 est l'intensité initiale de la fluorescence SWNT et I est l'intensité de SWNT après l' addition de la dopamine) , en présence de différentes concentrations de la dopamine est mesurée en surveillant la fluorescence d'un échantillon en utilisant un spectrophotomètre et InGaAs réseau linéaire (figure 3). La fluorescence totale de (GT) 15 -ADN-SWNT augmentait avec la concentration de dopamine (Figure 3a). La fluorescence rEPONSE est une fonction du pic d'émission (figure 3b), ce qui indique que la réponse peut être chiralité spécifique. La fluorescence de la nm et 1044 nm, les pics 1078 augmentation de l'intensité deux fois plus que la concentration de dopamine se rapproche de 2 uM. La figure 3e montre l'intensité de l'ensemble des spectres d'émission de PEG- (GT) 15 augmentation de l' ADN SWNT en réponse à l'addition de la dopamine.
SWNT individuels revêtus à l' aide d' une séquence d'ADN variante, C 26 -ADN (préparé en utilisant les mêmes méthodes à (GT) 15), attachés à la surface d'une lame de microscope sont mesurés sous un éclairage laser à l' aide d' une caméra InGaAs et 100X objectif à immersion dans l' huile (fig 4). Surveiller les émetteurs individuels attachés à une surface peut être utilisée pour vérifier la réversibilité de la réponse du capteur par les molécules cibles de lavage en utilisant une solution tampon de distance. Total fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopie peut également être utilisé pour imager l'ADN de colorant conjugué adsorbé sur les SWNT pour quantifier le nombre de molécules d'ADN attachées à chaque tube par des expériences de photoblanchiment. La figure 4 montre 3 événements distincts de blanchiment de l' ADN marqué au Cy3 déduites des mesures quantifiées de la trace de l' intensité de fluorescence d'un seul émetteur. Ces résultats indiquent que les trois molécules d'ADN sont attachées à la SWNT.
Figure 1: Polymer et Surfactant Suspendu SWNT. (A) Photographie de SWNT RMCT-PEG20-RMCT suspendue en utilisant 2% SC à différents points de la préparation. Gauche: SWNT ajoutés directement à la solution SC avant sonication. Centre: Après 10 min de bain sonication suivie par 10 min pointe de la sonde sonication à 90% d'amplitude suivie d'une centrifugation. La densité optique de la solution augmente à mesure que des faisceaux sont SWNTdispersé (~ 100 mg / L de concentration SWNT). A droite: Après la dialyse avec un polymère RMCT-PEG20-RMCT, la concentration finale de RMCT-PEG-RMCT suspendu SWNT est ~ 20 mg / L. (B) le rendement de SWNT de la suspension peut varier en fonction du polymère utilisé pour suspendre le SWNT. La densité optique de la solution fournit une bonne estimation de la concentration de la solution en phase SWNT. Sur la photo sont différentes concentrations de (GT) 15 -ADN tubes suspendus à différentes concentrations. De gauche à droite: 100 mg / l, 10 mg / L, 1 mg / l 0 mg / l. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: L' absorption et la fluorescence des spectres d'émission de tensioactif et de polymère en suspension SWNT. (A) absorbance Représentant spectra de SWNT en suspension à l' aide (GT) 15 -ADN par sonication directe. La concentration en SWNT est de 10 mg / L. Encart: La région UV du spectre d'absorbance de l'ADN montre le pic d'absorption caractéristique à 260 nm. (B) spectres Absorbance de RMCT-PEG20-RMCT SWNT après échange de SC par dialyse. Encart: Absorbance d'un échantillon dilué 10x de SWNT RMCT-PEG-RMCT montre l'absorbance caractéristique de rhodamine. (C) spectres représentant nIR d'émission de SWNT en suspension à l' aide (GT) 15 -ADN par sonication directe (785 nm excitation). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: détection de fluorescence de la dopamine en utilisant (GT) 15 -ADN de SWNT enveloppées. (a strong>) Réponse de Fluorescence de (GT) 15 -ADN SWNT enveloppées à l'ajout de la dopamine. Des échantillons de capteurs à une concentration de 5 mg / L étaient excités à l'aide de 500 mW, 721 nm laser CW. La fluorescence intégrée d'émission de capteur à partir 900-1,350 nm augmente avec la concentration de dopamine a ajouté 1 uM à 250 uM. (B) des spectres d'émission de fluorescence PEG- (GT) -ADN 15 enroulé SWNT avant et après addition de la dopamine. La concentration de la sonde est de 10 mg / mL à laquelle la dopamine a été ajouté à une concentration finale de 100 uM. Les échantillons ont été excités à l'aide de 500 mW, 721 nm laser CW. Les deux plus haute intensité culmine environ le double de l'intensité après addition de la dopamine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4: l' imagerie de fluorescence de SWNT de surface immobilisée unique. (A) l' émission de fluorescence de C individuelle 26 -ADN-SWNT (flèches rouges) immobilisé sur une lamelle de silice (# 1.5) en utilisant une procédure APTES de silanisation et imagée en utilisant un réseau de capteurs 2D InGaAs, microscope inversé avec un objectif 100X à immersion d'huile ( plan apochromatiques, 1.4 NA), et un 500 mW, 721 nm laser CW. (B) l' expérience Fluorescence de blanchiment de C 26 -Cy3 ADN-SWNT attaché à une surface en utilisant APTES. Les brins d'ADN sont 3 'terminale marquée avec Cy3 avant le tube de suspension. Suivi de l'photoblanchiment par étapes incrémental (rouge trace équipée) de capteurs individuels est utilisé pour déterminer le nombre de molécules d'ADN adsorbées sur la surface des SWNT. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope inversé en mode FRBR avec un objectif 100X à immersion d'huile (plan de apochromat, 1.4 NA), et 561 nm excitation laser. Barre d'échelle: 10 um.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
SWNT sont facilement mises en suspension dans une solution aqueuse par sonication directe avec le SDS ou ADNsb, comme indiqué par une augmentation de la densité optique fournie par la dispersion colloïdale de l'hybride SWNT-polymère résultant. SDS et ADNsb solubilise et disperse des faisceaux de SWNTs par adsorption sur la surface de SWNT par des interactions hydrophobes ou pi-pi. En outre, d'autres polymères, tels que l'ADN génomique, des polymères amphiphiles, des polymères et des lipides conjugués, peuvent être adsorbées sur la surface de SWNT par dialyse en utilisant des échantillons en suspension SC ou SDS. des polymères hydrophiles tels que le PEG, peuvent être à extrémités modifiées avec des "ancres" hydrophobes tels que le FITC ou la récupération des CTI pour permettre l'adsorption de surface du copolymère séquencé. Pour les polymères qui sont sensibles au cisaillement ou à la dégradation lors de l'exposition aux hautes puissances de pointe de sonde sonication, ou pour des polymères ayant des affinités faibles de liaison à SWNT, la dialyse est la meilleure méthode pour produire une suspension SWNT-polymère stable. Après encaps polymèreulation, la centrifugation élimine les grosses grappes de SWNT, le carbone amorphe, le catalyseur métallique résiduel et d'autres impuretés insolubles à partir d'un échantillon uniformément dispersé. concentrations finales typiques de SWNT dispersées après plage de centrifugation entre 10-100 mg / L.
puissance de sonication et la durée peuvent être ajustés et optimisés pour le choix particulier de dispersant. Ceci est une étape critique dans la procédure de SWNT de revêtement parce que trop peu ou faible sonication peut entraîner une mauvaise dispersion, tandis que sonication trop ou trop puissant peut conduire à une mauvaise fluorescence. En règle générale, des puissances plus faibles sont nécessaires pour minimiser les dommages lors de l'utilisation de polymères sensibles au cisaillement, tels que l'ADN. Plus longues durées de sonication ou des intensités plus élevées peuvent conduire à une réduction de la longueur des SWNT, où SWNT ci-dessous l'exciton nm de longueur ~ 100 de recombinaison deviennent non-fluorescent. La taille de la pointe de la sonde de sonicator devrait également correspondre au volume de l'échantillon pour éviter les éclaboussures et le moussage pour optimalles résultats (généralement fourni par le fabricant). Évitez de toucher la pointe de la sonde sur les côtés du récipient et placer la solution sur un bloc de glace pour réduire au minimum le chauffage de la solution. Une fois dispersés, les solutions de SWNT sont stables à température ambiante indéfiniment.
Les spectres d'absorption et d'émission de solutions de SWNT générées dispersées contiennent de multiples pics, ce qui indique la présence d'un mélange de dispersion de SWNT différents chiralité. Des méthodes alternatives de génération ou de purification des méthodes SWNT peuvent changer la distribution de chiralité, conduisant à différents excitation de pic et de spectres d'émission de fluorescence. En outre, les différentes méthodes de synthèse peuvent produire des échantillons de SWNT avec des distributions différentes de la population des chiralité. Par exemple: CoMoCAT (catalyseur cobalt-molybdène) SWNT cultivées sont riches en (6,5) chiralité, tandis que SWNT HIPCO (haute pression avec un catalyseur au carbonyle de fer) cultivés sont riches en (7,6) chiralité, conduisant à des différences dans l'absorption et photspectres oluminescence.
Certains polymères adsorbés permettent la détection spécifique de la substance à analyser par la modulation de l'émission de fluorescence de SWNT en changeant l'environnement local à la surface du tube. Cette approche offre l'avantage sur la fixation covalente de fragments de liaison par ne pas perturber de façon permanente le réseau SWNT, ce qui peut réduire l'intensité d'émission de fluorescence. 6,32 - 34 En outre, l'approche de CoPhMoRe a le potentiel pour le développement de capteurs sans anticorps pour les cibles où il ne peut pas exister déjà un fragment de liaison connue. 28 Plus précisément, (GT) -ADN 15 a été montré pour améliorer de manière sélective l'émission de fluorescence de SWNT , en présence de dopamine, ce qui permet son utilisation en tant que capteur de la dopamine. des mesures de fluorescence en vrac montrent une augmentation de près de 80% des émissions de pointe pour certains chiralité SWNT. Immobilisation (GT) 15 -ADN SWNT sur une lame de verre permet la fluorescence respmesures onse de particuliers (GT) 15 -ADN fonctionnalisés SWNT, montrant que la fluorescence peut augmenter de plus de 3 fois pour les capteurs de SWNT simples en présence de dopamine, sans photoblanchiment appréciable, sous illumination laser continu. L'interaction entre la dopamine et le capteur de SWNT est réversible, comme en témoigne la récupération du signal fluorescent d'origine après le lavage de la dopamine de la chambre microfluidique avec un tampon. En outre, des mesures d'une seule molécule peut être une technique de caractérisation puissante pour quantifier l' adsorption du polymère (figure 4) ou la cinétique des événements de liaison. En outre, la détection ratiométrique peut être obtenu par isolement chimique d' un SWNT chiralité singulier avec un pic unique de l' excitation-émission, la fonctionnalisation avec (GT) -ADN 15, et l' isolement d' un deuxième chiralité SWNT pour être insensible à la dopamine. Surveillance deux chiralité SWNT fournit un canal de fluorescence de contrôle régulier qui peut être comparé à la m odulating fluorescence des (GT) 15 -ADN SWNT. La combinaison de différents polymères (par exemple, le polyéthylène glycol et (GT) 15 -ADN) peut ajouter des fonctionnalités supplémentaires telles que la modification diffusivité ou absorption cellulaire caractéristiques, propriétés qui sont critiques lors de la réalisation des expériences in vivo.
Actuellement, une limitation de l'approche CoPhMoRe au capteur de développement comprennent le développement des bibliothèques polymère. Étant donné que des fractions de liaison ne sont pas connus a priori, l' élaboration d' un capteur pour une cible particulière peut prendre beaucoup de temps et nécessitent un grand nombre de polymères chimiquement variés pour la construction de la bibliothèque de capteur pour le criblage. En outre, la stabilité et la compatibilité des capteurs dans des environnements in vivo peuvent varier d' un capteur à l'autre . Cependant, une fois qu'un capteur de candidat a été identifié, d' autres stratégies de modification peuvent être utilisées pour optimiser les propriétés qu'il est nécessaire pour des applications in vivo.
ve_content "> Ici, nous avons montré une méthode pour la dispersion de SWNT dans des solutions aqueuses applicables à une grande variété d'agents de dispersion. Cette approche peut être utilisée pour créer des bibliothèques de SWNT dispersées pour la découverte de nouveaux nouveaux capteurs NIR pour les petites molécules et les marqueurs biologiques . d'un intérêt particulier sont des capteurs pour la détection des neurotransmetteurs, ce qui pourrait permettre en temps réel, la détection précise dans l'espace de ces molécules dans des milieux biologiques complexes.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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