Introduction
Einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (SWNT) sind atomar dünne Schichten aus Kohlenstoffatomen rollten in lange, dünne Zylinder, die einzigartige elektronische und optische Eigenschaften aufweisen. 1 Derartige Eigenschaften umfassen eine Bandlücken Herstellung nahen Infrarot (NIR) Fluoreszenzemission über Exziton Rekombination , die sehr empfindlich gegenüber ihrer lokalen Umgebung ist. NIR- Emission von SWNTs fällt in den nahen Infrarot-Fenster, in dem die Eindringtiefe des Lichts für biologisches Gewebe maximal ist. 2,3 Zusätzlich zeigen SWNT einige einzigartige Eigenschaften atypisch im Gegensatz zu organischen Fluorophore: SWNT weisen eine große Stokes - Verschiebung, nicht photobleach, und nicht blinken. 4 In jüngster diese Eigenschaften ausnutzt , hat zur Entwicklung einer Zusammenstellung der neuen molekularen Sensoren mit Anwendungen in der Biologie geführt. 5,6 Unveränderte sind jedoch SWNTs in Wasser unlöslich und Suspensionen einzelner SWNT zu erhalten , kann eine Herausforderung sein. 7,8 Bundling und Aggregation von einwandigen Nanoröhren in Lösung können ihre Bandlückenfluoreszenz, 2 macht sie ungeeignet für Sensoranwendungen zu verschleiern.
Dispergier- einzelnen Kohlenstoff-Nanoröhren in wässriger Lösung erfordert ihre oberflächenmodifizierenden Hydrophobizität getriebenen Aggregation zu verhindern. 9 Während Modifikation kovalente kann SWNT wasserlöslich machen, 10 sowie vermitteln spezifische Bindungschemie, Defektstellen im SWNT Gitter reduzieren oder ihre Fluoreszenzemission abklingen. 13 , die durch hydrophobe und pi-pi Stapel - Wechselwirkungen an die Nanoröhrenoberfläche adsorbieren - Stattdessen kann SWNT Funktionalisierung unter Verwendung von Tensiden, Lipiden, Polymeren und DNA 9,11 erreicht werden. Die sich ergebende chemische Umgebung umgebende Oberfläche funktionalisierte SWNTs wird als seine corona Phase. Störeinflüsse auf die Corona-Phase kann einen großen Einfluss auf Exzitonen haben auf der Oberfläche von Nanoröhren reisen, Modulationen verursacht fluor zu SWNTescence Emission. Es ist dieses empfindliche Beziehung zwischen der Koronaphase und SWNT Fluoreszenz, die durch den Einbau von spezifischen Bindungsmodalitäten auf die große Oberfläche von SWNT neuen molekularen Sensoren zu entwickeln, ausgenutzt werden kann. Störeinflüsse auf die SWNT Corona Phase bei Analyt-Bindung kann in der lokalen dielektrischen Umgebung zu Veränderungen führen, Ladungstransfer oder Gitterfehler einführen, die alle die Fluoreszenzemission der SWNTs modulieren kann als Signalübertragungsmechanismus zu dienen. 14 Dieser Ansatz in der Entwicklung neuer Fluoreszenzsensoren für den Nachweis von vielen verschiedenen Klassen von Molekülen , einschließlich DNA, 15,16 Glucose 17 und kleine Moleküle, wie ATP, 18 reaktive Sauerstoffspezies 19 und Stickstoffmonoxid verwendet wird. 20,21 Jedoch sind diese Ansätze beschränkt, daß sie sich auf die Existenz eines bekannten Bindungs Modalität für die Zielanalyten verlassen.
Vor kurzem wurde eine allgemeinere AppRotauge Fluoreszenzsensoren zur Gestaltung wurde SWNTs nicht-kovalent funktionalisiert mit amphiphilen Hetero, Phospholipide und Polynucleinsäuren entwickelt wurden. Diese Moleküle adsorbieren an Kohlenstoff - Nanoröhrchen - Oberflächen zu produzieren hochstabile Suspensionen einzelner SWNT 22-25 mit einzigartigen Corona - Phasen , die spezifisch Proteine 26,27 oder kleine Moleküle einschließlich des Neurotransmitters Dopamin binden kann. 28-30 Engineering the Corona Phase SWNTs und spezifisch binden Zielanalyten zu dispergieren , wird als Corona - Phase molekulare Erkennung (CoPhMoRe) bezeichnet. 28 Die kleine Größe, geringe Toxizität, hohe Stabilität und unbleaching nIR Fluoreszenz von CoPhMoRe SWNT - Sensoren machen sie zu ausgezeichneten Kandidaten für die in vivo Mess für längere zeitaufgelöste Messungen. 6 Neuere Arbeiten zur optischen Detektion von reaktivem Stickstoff und Sauerstoff - Spezies ihre Anwendungen in Pflanzengewebe gezeigt. 31Eine besonders spannende Anwendung für CoPhMoRe SWNT - Sensoren ist das Potenzial für markierungsfreie Detektion von Neurotransmittern wie Dopamin in vivo, wo andere Techniken, wie elektrochemische Mess oder Immunhistochemie, leiden an einem Mangel an räumlicher Auflösung, zeitliche Auflösung und Spezifität.
Die Projektierung und die Entdeckung CoPhMoRe SWNT-Sensoren hat bisher von der Größe und chemische Vielfalt der Dispersions Bibliothek zurückgehalten worden, um die Wahrscheinlichkeit zu begrenzen eines Sensors für ein bestimmtes Ziel zu finden. Bisher haben Forscher verkratzt nur die Oberfläche der verfügbaren konjugierten, co-block, biologische und biomimetische Polymere, die als funktionell aktives Dispergiermittel für SWNT-Sensoren dienen. Hier stellen wir verschiedene Methoden für beide SWNT Dispergieren und ihre Fluoreszenz für Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung für einzelne SWNT-Sensor-Analyse. Insbesondere beschreiben wir das Verfahren zur Beschichtung von SWNT mit Polynukleinsäure oligomers durch direkte Beschallung sowie wie SWNT mit amphiphilen Polymeren durch Tensid Austausch durch Dialyse zu funktionalisieren. Wir verwenden (GT) 15 -DNA und Polyethylenglykol funktionalisiert mit Rhodaminisothiocyanat (RITC-PEG-RITC) als Beispiele. Wir veranschaulichen die Verwendung von (GT) 15 -DNA SWNTs als CoPhMoRe Sensor für den Nachweis von Dopamin. Schließlich beschreiben wir Verfahren zur Einzelmolekül-Sensormessungen durchführt, die für die Charakterisierung oder Einzelmolekülmessung verwendet werden kann.
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Protocol
Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDS) vor dem Gebrauch. Nanomaterialien können zusätzliche Gefahren im Vergleich zu ihren Schüttgut-Pendant. Verwenden Sie alle erforderlichen Sicherheitsmaßnahmen einschließlich technische Kontrollen (Dunstabzug, Lärm-Gehäuse) und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Schutzbrille, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe).
1. Herstellung der Puffer, Tensid und Polymer Solutions
- Herstellung von 100 mM NaCl - Lösung
- Man löst 584 mg NaCl in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen.
- Herstellung von 3% Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung
- Man löst 3 g SDS in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen.
- Herstellung von 2% Natriumcholat (SC) Lösung
- Löse 2 g sodium Cholat-Hydrat in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen.
- Herstellung von Abbildungspuffer (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
- Man löst 22,23 g Tris-Base und 58,44 g NaCl in 500 ml entsalztem Wasser ein Magnetrührstab und Platte verwendet wird.
- Vorsichtig konzentrierte HCl hinzu bis ein pH von 8,1 erreicht ist.
- entsalztem Wasser hinzufügen Endvolumen von 1 l zu erreichen
- Synthese von RITC-PEG-Polymer RITC
- Auflösen Amin difunktionalisierten Polyethylenglykol (PEG) (5 kDa oder 20 kDa, 0,1 mol / L) und Rhodamin-Isothiocyanat (RITC, 0,2 mol / L) in 1 mL einer 1: 1 Mischung von Dichlormethan und Dimethylformamid (DMF).
- Hinzufügen 0,2 mol / l N, N - Diisopropylethylamin (DIEA).
- Nach 3 h mit 10-fach Volumen Diethylether durch Vakuumfiltration gefolgt auszufällen.
- Abgeblasen, in DMF und wiederholen follo Etherfällungwed durch Vakuumfiltration.
Hinweis: andere Isothiocyanat modifizierten Moleküle (zB Fluoresceinisothiocyanat, FITC) an PEG oder einem anderen Amin modifizierten Polymere unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens angebracht werden.
- Herstellung von pegyliertem-DNA (PEG-DNA)
- Kombinieren von 100 & mgr; l Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) -Lösung (0,5 M, pH 7,0) mit 44,9 & mgr; l 5'-Thiol-modifizierte DNA (1 mg / 10 & mgr; l in 0,1 M NaCl) und in den 4,855 ml entionisiertes Wasser.
- Rühre 1 Stunde.
- Man löst 500 mg Methoxypolyethylenglykol Maleimid in 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.
- Kombinieren Sie DNA und PEG-Lösungen (10 ml gesamt) und rühre 24 h.
2. Herstellung von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (SWNT) Suspensions
- Wäsche von SWNTs Katalysator und Verunreinigungen zu entfernen.
- In 200-300 mg ungewaschener SWNTs in eine Plastikzentrifugenröhrchen containing 45 ml entionisiertem Wasser.
- Vortex die Lösung für 2 min und beschallen ein Ultraschallbad für 5 Minuten verwendet wird. Beachten Sie, dass Beschallungsgerät Einstellungen von Instrument zu Instrument variieren, so überprüfen Sie, dass die optische Dichte der SWNT - Lösung erhöht (dh schwarz wird ) , um sicherzustellen , dass die SWNT verteilt werden.
- Zentrifugieren Sie die Lösung für 20 min bei 16.100 xg und Überstand verwerfen.
- In etwa 45 ml frischem entionisiertem Wasser.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.4 bis zu 8-mal.
- Entfernen Sie so viel Wasser wie möglich darauf achten, nicht pelletierten SWNTs zu stören und SWNT-Pellet an der Luft trocknen lassen.
- Nukleinsäure-Suspensionen von SWNT
- Auflösen Nukleinsäuren (NA) in 0,1 M NaCl zu einer Konzentration von 100 mg / mL.
- Sie statische Elektrizität von Einweg-Spatel, Mikrozentrifugenröhrchen und SWNT Lager eine antistatische Pistole. In einem Abzug, fügen Sie 20 ul der NA-Lösung auf 980 & mgr; l von 00,1 M NaCl durch Zugabe von 1 mg SWNTs gefolgt.
- Verwendung eines Ultraschallgerät mit 3 mm Durchmesser Spitze beschallen die Lösung für 10 min bei 40% Amplitude in einem Eisbad.
- Zentrifugieren Sie die DNA-SWNT Lösung ZWEIMAL 90 min bei 16.100 x g. Bei der Verwendung von PEG-DNA, zu reinigen überschüssiges und nicht umgesetzte DNA und PEG mit einem 100 kDa Spin-Filter. Fügen Sie genug PBS den Spin-Filter und Spin bei 9.300 × g für 1,5 Minuten zu füllen, wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal.
- Sammeln Sie und halten Sie den Überstand, wobei darauf geachtet, nicht das Pellet zu stören enthält CNT Bündel und Aggregate. Entsorgen Sie das Pellet in Einklang mit den institutionellen Sondermüll geeigneten Verfahren für Nanomaterialien.
- mit ε = 0,036 L / cm · mg entsprechend Lambert-Beer-Gesetz und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor Messen Sie die Lösung Absorption bei 632 nm unter Verwendung eines UV / Vis-Spektralphotometer ungefähre Konzentration von suspendierten einwandigen Nanoröhren zu bestimmen.
- Amphiphile PolymersuspensionenSWNT
- Sie statische Elektrizität von Einweg-Spatel, Mikrozentrifugenröhrchen und SWNT Lager. In einem Abzug werden 5 mg SWNT bis 5 ml 2% SC-Lösung (alternativ kann SDS-Lösung verwendet werden).
- Verwendung eines Ultraschallgerät mit 6 mm Durchmesser Spitze beschallen die Lösung für 1 h bei 40% Amplitude in einem Eisbad.
- Centrifuge Probe bei 150.000 g für 4 h eine Ultrazentrifuge und sorgfältig Überstand zu sammeln.
- Man löst 1 wt% des amphiphilen Polymers (zB RITC-PEG-RITC) in SC-SWNT - Lösung.
- Dialysieren das Polymer-SC-SWNT-Lösung mit einer 3,5 kDa Dialysemembran gegen 1 l deionisiertem Wasser oder Puffer für 5 Tage verwenden. Ändern des Wasser oder Puffer für Stunde und 2 Stunde 4. Eine größere Dialysemembran verwendet werden kann, solange es die Entfernung des oberflächenaktiven Mittels der Wahl erlaubt, aber Beibehaltung sowohl der SWNT und amphiphilen Polymer.
- Messen Sie die Lösung Extinktion bei 632 nm unter Verwendung eines UV / Vis-Spektrophotometer zur Bestimmungungefähre Konzentration von suspendierten einwandigen Nanoröhren mit ε = 0,036 L / cm * mg entsprechend Lambert-Beer-Gesetz und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor.
3. Herstellung von Oberflächen Immobilisierte SWNT-Sensoren
- Herstellung von BSA-Biotin und NeutrAvidin Stammlösungen
- Man löst 10 mg gefriergetrocknet BSA-Biotin in 1 ml entsalztem Wasser eine 10 mg / ml Stammlösung und lagern bei 4 ° C zu machen.
- Man löst 10 mg NeutrAvidin Protein (NAV, deglycosyliert Avidinprotein) in 2 ml entionisiertem Wasser eine 5 mg / ml Stammlösung zu machen. Store Aliquots bei -20 ° C. Aufgetaute Aliquots kann für mehrere Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden.
- Bereiten BSA-Biotin beschichtet Mikroskop - Objektträger
- Reinigen Sie einen Objektträger und 0,17 mm Deckglas (oder gegebenenfalls für das Mikroskopobjektiv) mit entsalztem Wasser, gefolgt von Methanol, Aceton und letzte Spülung von entsalztem Wasser.
- Füge 100 & mgr; l BSA-Biotin-Stammlösung zu 900 & mgr; l 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg / mL.
- Fluss 50 ul der BSA-Biotin-Lösung in den Kanal durch Pipettieren der Lösung in ein Ende und Feuchtigkeitsregulierung entfernt Lösung am anderen ein Gewebe verwendet wird. Inkubieren für 5 Minuten, gefolgt von 3-5 Spülungen mit 50 & mgr; l von 0,1 M NaCl.
- Verdünnen 40 & mgr; l von 5 mg / ml NAV Lager in 960 ul 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 mg / ml.
- Durchfluss 50 ul der NAV-Lösung in den Kanal durch Pipettieren der Lösung in ein Ende und Feuchtigkeitsregulierung entfernt Lösung am anderen ein Gewebe verwendet wird. Inkubieren für 2-5 Minutengefolgt von 3-5 Spülungen mit 50 ul 0,1 M NaCl.
- Verdünnte Stammlösungen von suspendierten SWNTs in Abbildungspuffer zu einer Konzentration von 1-10 mg / L und Strömungs 50 & mgr; l der Lösung in den Kanal und Inkubation für 5 min.
- Spülen Sie vorsichtig überschüssiges SWNTs unter Verwendung von 50 & mgr; l von Abbildungspuffer entfernt.
- Herstellung von APTES silanisierte Objektträger
HINWEIS: APTES silanisiert Folien ermöglichen eine Möglichkeit, die Oberfläche eines Glassubstrats negativ geladenen DNA-wrapped SWNTs zu immobilisieren.- Eine 10% ige Lösung von (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) in Ethanol.
- Mit Kanäle unter Verwendung der in 3.2.2 beschriebenen Schritte, fließen in 100 ul 1x Tris-Puffer.
- Spülen Sie den Kanal mit APTES Lösung und Inkubation für 5 min. Waschen mit 1x Tris-Puffer.
- Verdünnte Stammlösungen von suspendierten DNA-SWNTs in Abbildungspuffer zu einer Konzentration von 1-10 mg / Land Strömungs 50 & mgr; l der Lösung in den Kanal und incubaß für 5 min.
- Spülen Sie vorsichtig überschüssiges SWNTs unter Verwendung von 50 & mgr; l von Abbildungspuffer entfernt.
4. Fluoreszenzspektroskopie und Mikroskopie von SWNT-Sensoren
- nIR Fluoreszenzmikroskopie
- Führen Sie Abbildung der Oberflächen immobilisiert SWNT mit Laseranregung und ein inverses Mikroskop mit einer InGaAs-Sensor-Array ausgestattet für die Bildgebung.
- Richten Sie den Laserstrahl mit der Hintergrundbeleuchtung Anschluss eines inversen Mikroskops zur Eingabe mit Hilfe von Spiegeln auf verstellbaren kinematischen Halterungen und ein Paar von Pfosten montiert Iris auf den Hafen Höhe. Sicherstellen, dass die Strahlebene ist und gerade durch die Bestätigung, es geht durch beide Iris, wenn zwischen aufeinanderfolgenden Spiegel gestellt und vor dem Eintritt in die Beleuchtungs Port. Falls erforderlich, stellen Sie die Strahlhöhe ein Periskop Montage verwendet wird. Entfernen Sie alle Kurzpasswärmefilter auf der Beleuchtungs Port, der den Strahl dämpfen würde.
- Legen Sie einen geeigneten Filterwürfel in das Mikroskopdas Anregungslicht in das Objektiv zu reflektieren und Emissionslicht zu sammeln. Dieser besteht typischerweise aus einem dichroitischen Langpassfilter mit einer Grenz oberhalb der Anregungswellenlänge (beispielsweise 750 LP) und einer Emissionslangpassfilter (beispielsweise 850 LP) weiter gestreutes Anregungslicht zu minimieren , den Sensor vom Schlagen. Zusätzlich kann das Emissionsfilter gewählt werden, für die Emission von SWNTs einer bestimmten Chiralität selektiv.
- Führen Sie Feineinstellungen für die Strahlausrichtung durch eine entsprechende Ausrichtung Würfel Einsetzen des Objektivs mit zwei versetzten, Mattscheiben, die 1 mm kleine Löcher zu ersetzen. Richten des Strahls auf die Mitte der beiden unteren und oberen Ausrichtschicht Scheiben.
- Bringen Sie ein 2D InGaAs-Sensoranordnung an der Seite Imaging-Port des Mikroskops einen entsprechenden Adapter und ein 0,5-fach-Objektiv, wenn notwendig, die Sensorgröße anzupassen.
- Unter Verwendung eines 100X -Ölimmersionsobjektiv (1,4 NA), gelten fluoreszenzfrei Sionsöl und legen Sie die immobilized SWNT Probe auf den Mikroskoptisch.
- Heben Sie das Ziel, bis das Öl in Kontakt mit der Unterseite des Deckglases (# 1.5, 170 & mgr; m Dicke). Nehmen Sie die Einstellung mit dem Ziel Kragen notwendig , wenn für Abbildungsbedingungen, zB Temperatur, Glasdicke, usw.
- Langsam heben das Ziel mit der Anregungsquelle auf und das Fluoreszenzsignal der InGaAs-Kamera zu überwachen. Die Fluoreszenzintensität sollte schrittweise zu erhöhen, wie die Fokusebene der Oberfläche nähert, und die immobilisierten Sensoren in den Fokus gerückt.
- nIR Fluoreszenzspektroskopie
HINWEIS: Fluoreszenzspektroskopie kann mit dem gleichen Mikroskopaufbau durchgeführt werden, sondern durch das gesammelte Licht aus dem Mikroskopkörper lenken und in ein Spektrometer und InGaAs Lineararray-Detektor.- Mit kinematischen Halterungen und Spiegel für nIR bewertet, lenken das Licht Weg zu den Eintrittsspalt des Spektrometers. Konzentrieren Sie das Licht auf einen poi untennt auf den Eingang einer Fokussierlinse geschlitzt mit (zB plankonvexe, f = 150 mm). Diese Ausrichtung durch Dämpfen der Laserleistung auf <1 mW und Ersetzen des Mikroskopobjektiv mit einem 1 "Spiegel und unter Verwendung eines 50/50 Strahlteilungsfilterwürfel erreicht wird. Das Anregungslicht wird dann den Mikroskopkörper durch die Austrittsöffnung verlassen können und verwendet werden, die Spiegel und die Linse zu fokussieren den Strahl auf den Eintrittsspalt einzustellen.
- das Mikroskopobjektiv und Langpassfilter, legen Sie eine Well-Platte auf die Bühne und notieren Sie die Spektren von einem Scharf Probe unter Verwendung des Spektrometers und InGaAs-Array nach dem Ersetzen.
- Die Messung der reversiblen Reaktion von (GT) 15 DNA-SWNT zu Dopamin
- Berg Sensorkanäle auf den Mikroskoptisch und bringen in den Fokus mit einem 100X Öl-Objektiv und InGaAs-Kamera beschichtet. Zugabe von 50 ul 100 uM Dopamin-Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit dem Strömungskanal und Aufzeichnungsdie Änderung in der Fluoreszenzintensität.
- Waschen Sie die Dopamin Lösung phosphatgepufferte Salzlösung mit und die Veränderung der Fluoreszenz der einzelnen SWNT-Sensoren beobachten.
- Well-Platten - Screening für Analyten Antwort von SWNT - Sensoren
HINWEIS: Screening von verschiedenen Analyten kann mit einem motorisierten Tisch gesteuert mit Hilfe eines transparenten Well-Platte durchgeführt werden. Eine ideale Well-Platte ist transparent für sichtbares und IR und hat schwarze Seitenwände Übersprechens zwischen den Vertiefungen zu minimieren.- Pipette gleichen Volumina von suspendierten SWNT - Sensor (zB 5 mg / l Konzentration) in jede Vertiefung, genug , um den Boden des Bohrlochs gleichmäßig abzudecken, in der Regel> 100 & mgr; l für eine 96-Well - Platte und> 30 & mgr; l für eine 384-Well - Platte .
- Pipette Analyten ( zum Beispiel 2 & mgr; l, 100 & mgr; M Endvolumen) vom Screening - Bibliothek in die Well - Platten. Bereiten Sie jeden Analyten in dreifacher Ausfertigung für potenzielle Rechnung zu tragen und zu gut Variation, fluctuatIonen der Anregungsintensität oder der Temperatur.
- Heben Sie das Ziel (zB 20X Achroplan, 0,45 NA) , während die Emissionsspektren Überwachung des Spektrometers und InGaAs - Array verwendet wird . Optimale Position des Ziels wird der Brennebene etwa in der Mitte des Probenvolumens in dem Bohrloch gesetzt, die zu einem Maximum der gemessenen Intensität entsprechen.
- Für jede Probe gut, notieren Belichtung eines 1-10 s ein Spektrum zu sammeln.
- Vergleichen Sie die Emissionsspektren für jede Vertiefung zu einem Steuerelement enthält nur SWNT ohne zusätzliche Analyt die Fluoreszenzantwort zu quantifizieren.
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Representative Results
SWNTs wurden in wässriger Lösung mit beiden Tensiden und amphiphile Polymere, die durch direkte Beschallung und durch Dialyse Börse ausgesetzt. Abbildung 1 zeigt SWNTs, gezüchtet , um die Eisencarbonyl katalysierten Verfahren (HiPCO) verwenden, suspendiert SC verwenden, RITC-PEF20-RITC und (GT) 15 -DNA. Die optische Dichte eines SWNTs mit SDS (oder Polymer) erhöht drastisch nach der Beschallung und nimmt bei Entfernung von Aggregaten und Verunreinigungen durch Reinigung durch Zentrifugation (Abbildung 1). Messungen der Extinktion bei 632 nm, die Konzentration von suspendiertem SWNT quantifiziert. 28
Die photophysikalischen Eigenschaften der SWNT-Suspensionen werden Absorption und Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert. Figur 2 zeigt die Absorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren von SWNTs suspendiert Verwendung (GT) 15 -DNA und RITC-PEG20-RITC. the Absorptionsspektren sind eine Überlagerung der einzelnen Absorptionspeaks für jede einzelne Chiralität der Nanoröhren-in der Probe vorliegt. In ähnlicher Weise weist jede Chiralität seine einzigartige Fluoreszenzemissionsspitze. Unterschiede in der relativen Emissionsspitzenintensität sind eine Folge der Unterschiede in der Verteilung der Bevölkerung von Chiralität sowie Unterschiede in Anregungseffizienz der 721-nm-Laser verwendet wird.
Die Fluoreszenzreaktion von (GT) 15 DNA-SWNTs (wobei I 0 die anfängliche SWNT Fluoreszenzintensität und I die SWNT Intensität nach Dopamin - Addition) in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Dopamin durch Überwachen der Fluoreszenz einer Probe gemessen , um eine Verwendung von Spektrophotometer und InGaAs linear array (Abbildung 3). Die Gesamtfluoreszenz (GT) 15 -DNA-SWNTs mit zunehmender Dopamin - Konzentration (Abbildung 3a) erhöht. Die Fluoreszenz response ist eine Funktion des Emissionsspitze (3b), was anzeigt , dass die Antwort Chiralität spezifisch sein können. Die Fluoreszenz des 1.044 nm und 1.078 nm Erhöhung der Intensität 2-Faltenspitzen als Dopamin-Konzentration 2 uM nähert. 3e zeigt die Intensität der gesamten Emissionsspektren von PEG- (GT) 15 DNA-SWNT Anstieg in Reaktion auf die Zugabe von Dopamin.
Einzel SWNTs mit einer alternativen DNA - Sequenz beschichtet, C 26 -DNA (hergestellt , die gleichen Methoden an (GT) 15 verwendet wird ), gebunden an die Oberfläche eines Objektträgers unter Laserbeleuchtung gemessen , um eine InGaAs - Kamera und 100X Ölimmersionsobjektiv (Abbildung 4). Einzelemitter Überwachung an eine Oberfläche gebunden kann die Reversibilität der Sensorantwort durch Waschen Zielmoleküle entfernt unter Verwendung von Pufferlösung, um sicherzustellen, verwendet werden. Totalreflexions-Fluoreszenz (TIRF) microsKopie kann auch an SWNTs adsorbiert Bildfarbstoff konjugierten DNA verwendet werden, um die Anzahl der DNA-Moleküle zu jedem Röhrchen durch Photobleaching Experimente befestigt zu quantifizieren. Figur 4 zeigt drei verschiedene Bleich Ereignisse des Cy3-markierten DNA abgeleitet aus den quantisierten Schritten der Fluoreszenzintensität Spur eines einzigen Emitters. Diese Ergebnisse zeigen, dass drei DNA-Moleküle an das SWNT befestigt sind.
Abbildung 1: Polymer und Tensid suspendiert SWNTs. (A) Foto von RITC-PEG20-RITC SWNT suspendiert unter Verwendung von 2% SC an verschiedenen Punkten der Vorbereitung. Links: SWNT direkt an SC Lösung vor der Beschallung zugegeben. Center: Nach 10 Minuten von Bad Beschallung von 10 min Sondenspitze Beschallung bei 90% Amplitude, gefolgt von Zentrifugation gefolgt. Die optische Dichte der Lösung zunimmt, wenn SWNTs Bündeldispergiert (~ 100 mg / L SWNT-Konzentration). Rechts: Nach Dialyse mit RITC-PEG20-RITC Polymer, die Endkonzentration an RITC-PEG-RITC suspendiert SWNTs von ~ 20 mg / L. (B) SWNT Suspension Ausbeute kann in Abhängigkeit von dem Polymer variieren verwendet , um das SWNT zu suspendieren. Die optische Dichte der Lösung liefert eine gute Schätzung der Lösungsphase SWNT-Konzentration. Abgebildet sind verschiedene Konzentrationen von (GT) 15 -DNA suspendiert Rohre in unterschiedlichen Konzentrationen. Von links nach rechts: 100 mg / L, 10 mg / l, 1 mg / l, 0 mg / L. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Absorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren von Tensid und Polymer suspendiert SWNTs. (A) Repräsentative Absorption spectra SWNT suspendierten (GT) 15 -DNA durch direkte Beschallung. Die Konzentration von SWNT beträgt 10 mg / L. Kleines Bild: Die UV Bereich der Absorptionsspektren zeigt die charakteristische DNA Absorptionsspitze bei 260 nm. (B) Absorptionsspektren von RITC-PEG20-RITC SWNTs nach dem Austausch von SC durch Dialyse. Kleines Bild: Die Absorption von einem 10-fach verdünnten Probe von RITC-PEG-RITC SWNTs zeigt die charakteristische Absorption von Rhodamin. (C) Repräsentative nIR Emissionsspektren von SWNT suspendierten (GT) 15 -DNA durch direkte Beschallung (785 nm Anregung). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Fluoreszenzdetektion von Dopamin mit (GT) 15 -DNA gewickelt SWNTs. (a strong>) Fluoreszenzantwort (GT) 15 -DNA gewickelt SWNTs der Zugabe von Dopamin. Proben von Sensoren in einer Konzentration von 5 mg / l waren begeistert, eine 500 mW, 721 nm CW-Laser verwendet wird. Die integrierte Fluoreszenz des Sensoremission von 900-1,350 nm mit zugesetztem Dopamin-Konzentration 1 & mgr; M bis 250 & mgr; M erhöht. (B) Fluoreszenzemissionsspektren von PEG- (GT) 15 -DNA gewickelt SWNTs vor und nach Zugabe von Dopamin. Die Konzentration der Sensor 10 mg / ml, dem Dopamin zu einer Endkonzentration von 100 uM zugegeben. Die Proben wurden angeregt mit einem 500 mW, 721 nm CW-Laser. Die beiden höchsten Intensitätsspitzen in der Intensität nach Zugabe von Dopamin in etwa verdoppeln. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4: Fluoreszenz - Bildgebung einzelner oberflächen immobilisiert SWNTs. (A) Die Fluoreszenzemission einzelner C 26 -DNA-SWNT (rote Pfeile) immobilisiert auf einer Silica - Deckglas (# 1.5) unter Verwendung eines APTES Silanisierung Verfahren und abgebildet mit einem Sensorarray 2D InGaAs, inverses Mikroskop mit einem -Ölimmersionsobjektiv 100X ( Plan Achromat, 1.4 NA) und eine 500 mW, 721 nm CW-Laser. (B) Fluoreszenzbleich Experiment von C 26 -Cy3 DNA-SWNTs gebunden an eine Oberfläche APTES verwenden. Die DNA-Stränge sind 3 'terminal markiert mit Cy3 vor der Rohraufhängung. die inkrementale schrittweise Photobleaching Tracking (rot Einbau trace) der einzelnen Sensoren verwendet, um die Anzahl der DNA-Moleküle auf der Oberfläche der SWNTs adsorbiert zu bestimmen. Die Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop in TIRF-Modus mit einem 100X -Ölimmersionsobjektiv (Plan Achromat, 1.4 NA) erworben, und 561-nm-Laseranregung. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
SWNTs werden in wässriger Lösung durch direkte Beschallung mit SDS oder ssDNA leicht suspendiert, wie durch eine Zunahme der optischen Dichte durch die kolloidale Dispersion des resultierenden SWNT-Polymer-Hybrid vorgesehen angegeben. SDS und ssDNA streut und solubilisiert Bündel von einwandigen Nanoröhren durch durch hydrophobe oder pi-pi-Wechselwirkungen auf die SWNT Oberfläche zu adsorbieren. Zusätzlich können andere Polymere, wie genomische DNA, amphiphile Polymere, konjugierte Polymere und Lipiden, auf die Oberfläche von SWNTs durch Dialyse der Proben adsorbiert werden SC oder SDS suspendiert werden. Hydrophilen Polymeren, wie PEG, können sein endmodifizierte mit hydrophoben "Anker" wie RITC oder FITC Oberflächenadsorption des Blockcopolymers zu ermöglichen. Für Polymere, die Scher- oder Abbau bei Einwirkung auf die hohen Kräfte der Beschallungssonde-Spitze anfällig sind, oder Polymere mit geringer Bindungsaffinitäten zu SWNT, Dialyse ist die beste Methode, um eine stabile SWNT-Polymer-Suspension herzustellen. Nach Polymer Encapsulation entfernt Zentrifugation große SWNT Bündel, amorphem Kohlenstoff, eine gleichmäßig verteilt Probe zu verlassen Restmetallkatalysator und andere unlösliche Verunreinigungen. Typische Endkonzentrationen von dispergierten SWNTs nach Zentrifugation Bereich zwischen 10-100 mg / L.
Beschallen Leistung und Dauer kann für die besondere Wahl des Dispergiermittels eingestellt und optimiert werden. Dies ist ein entscheidender Schritt in dem Verfahren zur Beschichtung von SWNTs, weil zu wenig oder schwach Beschallung in einem schlechten Zerstreuung führen kann, während zu viel oder zu mächtig Beschallung zu einer schlechten Fluoreszenz führen kann. Typischerweise sind geringere Kräfte erforderlich, um Schäden zu minimieren, wenn Polymere anfällig für Scher wie DNA verwendet wird. Längere Beschallungsdauern oder höhere Intensitäten können in der Länge von SWNT zu einer Reduktion führen, wo SWNTs unter dem ~ 100 nm Exziton Rekombinationslänge werden nicht fluoreszierend. Die Größe der Beschallungsgerät Sondenspitze sollte auch das Probenvolumen entsprechen Spritzen zu vermeiden und Schäumen für eine optimaleErgebnisse (in der Regel durch den Hersteller zur Verfügung gestellt). Vermeiden Sie die Sondenspitze an den Seiten des Behälters zu berühren, und legen Sie die Lösung auf einem Eisblock Erwärmung der Lösung zu minimieren. Einmal dispergiert sind, sind Lösungen von SWNTs bei Raumtemperatur stabil auf unbestimmte Zeit.
Absorptions- und Emissionsspektren der Lösungen dispergiert generierten SWNTs enthalten mehrere Spitzen, was die Anwesenheit einer Mischung von dispergiertem SWNTs unterschiedlicher Chiralität angibt. Alternative Methoden der SWNT Generation oder Reinigungsverfahren können die Chiralität Verteilung ändern, was zu unterschiedlichen Spitzen Anregungs- und Emissionsfluoreszenzspektren. Zusätzlich können verschiedene Synthesemethoden Proben von einwandigen Nanoröhren ergeben mit unterschiedlichen Chiralität Bevölkerungsverteilungen. Zum Beispiel: CoMoCAT (Kobalt-Molybdän-Katalysator) sind gewachsen SWNT reich an (6,5) Chiralität, während HiPCO (Hochdruck mit Eisen-Katalysators) gezüchtet SWNT reich an (7,6) Chiralität sind, um Unterschiede in der Absorption führt und photoluminescence Spektren.
Bestimmte adsorbierten Polymere ermöglichen den spezifischen Nachweis von Analyten durch die Fluoreszenzemission des SWNT Modulation durch die lokale Umgebung an der Rohroberfläche zu verändern. Dieser Ansatz bietet den entscheidenden Vorteil gegenüber kovalente Bindung von Einheiten, die durch nicht dauerhaft stören die SWNT Gitter Bindung, die Fluoreszenzemissionsintensität zu reduzieren. 6,32 - 34 Zusätzlich hat der CoPhMoRe Ansatz das Potential Antikörper freien Sensoren für Targets für die Entwicklung von wo es nicht bereits eine bekannte Bindungseinheit vorhanden sein können. 28 Genauer gesagt, (GT) 15 -DNA wurde seine Verwendung als Dopamin - Sensor gezeigt , um selektiv die Fluoreszenzemission von SWNTs in Gegenwart von Dopamin erhöhen, ermöglicht. Bulk-Fluoreszenzmessungen zeigen einen Anstieg von bis zu 80% in Spitzenemission für bestimmte SWNT Chiralität. Immobilisierende (GT) 15 -DNA SWNTs auf einem Glasträger ermöglicht Fluoreszenz bzw.onse Messungen einzelner (GT) 15 -DNA funktionalisierten SWNT, dass die Fluoreszenz zeigen , können für einzelne SWNT - Sensoren in Gegenwart von Dopamin durch mehr als 3-fache erhöhen, ohne nennenswerte Photobleaching, unter kontinuierlicher Laserbeleuchtung. Die Wechselwirkung zwischen Dopamin und dem SWNT-Sensor ist reversibel, wie offensichtlich durch die Wiederherstellung der ursprünglichen Fluoreszenzsignals nach Dopamin aus der mikrofluidischen Kammer mit Puffer gewaschen wurde. Zusätzlich Einzelmolekülmessungen können zur Quantifizierung der Polymer - Adsorption (Abbildung 4) oder die Kinetik der Bindungsereignisse eine leistungsfähige Charakterisierungstechnik sein. Auch kann ratiometrisch Erfassung durch chemisch Isolieren einer singulären SWNT Chiralität mit einer einzigartigen Anregungs--Emissionsspitze erreicht werden, ist es mit (GT) 15 -DNA funktionalisieren und eine zweite SWNT Chiralität sein unempfindlich gegen Dopamin isolieren. beide SWNT Chiralität Überwachung sorgt für eine stetige Kontrolle Fluoreszenzkanal, der dem m verglichen werden können odulating Fluoreszenz der (GT) 15 -DNA SWNTs. Kombination verschiedener Polymere (beispielsweise Polyethylenglycol und (GT) 15 -DNA) kann zusätzliche Funktionalität hinzuzufügen , wie beispielsweise Modifizieren Diffusionsvermögen oder die zelluläre Aufnahme Eigenschaften, Eigenschaften , die kritisch sind , wenn sie in vivo Experimente durchgeführt wird .
Derzeit ist eine Begrenzung der CoPhMoRe Ansatz für die Entwicklung Sensor umfassen Polymer-Bibliothek Entwicklung. Weil Bindungseinheiten sind nicht a priori bekannt, einen Sensor für ein bestimmtes Ziel zu entwickeln kann für den Aufbau der Sensor Bibliothek zum Screenen zeitintensiv und erfordert eine große Anzahl von chemisch verschiedensten Polymere sein. Zusätzlich Stabilität und Kompatibilität von Sensoren in in vivo - Umgebungen können von dem Sensor zu Sensor variieren. Sobald jedoch ein Kandidat Sensor identifiziert worden ist , können weitere Modifikation Strategien Eigenschaften wie nötig zur Optimierung verwendet werden für in vivo - Anwendungen.
ve_content "> Hierbei wir eine Methode zur Dispergierung von SWNTs in wässrigen Lösungen anwendbar auf eine große Vielzahl von Dispergiermitteln gezeigt haben. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Bibliotheken von dispergierten SWNTs für die Entdeckung neuartiger neuen nIR Sensoren für kleine Moleküle und biologische Marker zu erzeugen . von besonderem Interesse sind Sensoren zur Erfassung von Neurotransmittern, die Echtzeit, räumlich präzise Detektion dieser Moleküle in komplexen biologischen Umgebungen ermöglichen könnte.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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