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Immunology and Infection

मानव endocervical गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के अलगाव और प्रवाह cytometric विश्लेषण

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55038
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

Abstract

महिला प्रजनन पथ (FRT) श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रणाली रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करता है। जननांग म्यूकोसा का बेहतर ज्ञान इसलिए एचआईवी सहित विभिन्न रोगाणुओं की pathogenicity को समझने के लिए आवश्यक है। गामा डेल्टा (जीडी) टी कोशिकाओं 'अपरंपरागत' टी कोशिकाओं के प्रोटोटाइप कर रहे हैं और टी कोशिकाओं heterodimeric टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) गामा और डेल्टा जंजीरों की रचना की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित की एक अपेक्षाकृत छोटे सबसेट प्रतिनिधित्व करते हैं। इससे उन्हें शास्त्रीय और ज्यादा बेहतर जाना जाता सीडी 4+ टी कोशिकाओं सहायक और सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं है कि अल्फा बीटा TCRs द्वारा परिभाषित कर रहे हैं से अलग करता है। जीडी टी कोशिकाओं अक्सर ऊतक विशेष स्थानीयकरण दिखाने के लिए और उपकला में समृद्ध कर रहे हैं। जीडी टी कोशिकाओं में सूजन, ट्यूमर निगरानी, ​​संक्रामक रोग, और autoimmunity में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आर्केस्ट्रा।

यहाँ, हम एक विधि reproducibly अलग और मानव endocervical अंतःउपकला जीडी टी lymphocytes विश्लेषण करने के लिए उपस्थित थे। हम हामहिलाओं की Interagency एचआईवी संक्रमण अध्ययन (WIHS) में भाग लेने के लिए महिलाओं से endocervical cytobrush नमूनों का इस्तेमाल किया है। शर्तों के दौरान जीडी टी कोशिकाओं बातचीत के बारे में ज्ञान जिसमें वहाँ योनि श्लैष्मिक का अपमान है योनि microbicides.In अलावा के विकास सहित, किसी भी नैदानिक ​​अध्ययन में श्लैष्मिक असुरक्षा संबोधित किया है करने के लिए लागू किया जा सकता है, श्लैष्मिक जीडी टी सेल प्रतिक्रिया के बारे में ज्ञान है संक्रामक रोगों के उपचार में जीडी टी सेल आधारित चिकित्सा प्रतिरक्षा के आवेदन के लिए संभावित।

Introduction

हम अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के endocervical ब्रश नमूने का उपयोग करने की पद्धति विकसित की। endocervical नहर स्तंभ उपकला की एक परत से तैयार है। अंतःउपकला लिम्फोसाइट उपकला परत के भीतर रहने वाले सीमावर्ती लिम्फोसाइट है कि तेजी से रोगजनक रोगाणुओं का सामना 7, 8 पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आरंभ कर सकते हैं प्रतिनिधित्व करते हैं। endocervical अंतःउपकला डिब्बे की रोग प्रतिरोधक घटनाओं को समझने प्रभावी रणनीति के डिजाइन एचआईवी सहित संक्रमण, को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।

हमारे विधि आगे एचआईवी संक्रमण के साथ या एचआईवी संक्रमण के जोखिम में महिलाओं में अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं की भूमिका का पता लगाने के लिए हौसले से एकत्र मानव endocervical नमूने के रूप में अच्छी तरह से जमे हुए endocervical कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य endocervical अंतःउपकला डिब्बे में उपन्यास प्रतिरक्षात्मक घटनाओं को खोजने के लिए और evaluat करने के लिए हैएचआईवी संक्रमण के साथ महिलाओं में असुरक्षा की श्लैष्मिक एक मार्कर के रूप में ई जीडी टी सेल प्रतिक्रिया।

FGT प्रतिरक्षा के आसपास ज्ञान में काफी अंतराल आंशिक रूप से सफलतापूर्वक इकट्ठा करने और श्लैष्मिक नमूने प्रसंस्करण में कठिनाई के कारण हैं। इसके अलावा, श्लैष्मिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जटिल विविधता, और एक दूसरे के साथ उनके interconnectedness, चिकित्सकीय प्रासंगिक माप है कि राज्य और प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता को प्रतिबिंबित करने के लिए की पहचान के प्रमुख चुनौतियां हैं। हम उच्च शुद्ध अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं है कि आगे हो सकता है अत्यधिक मल्टिप्लेक्स, एकल कोशिका प्रौद्योगिकियों कि FRT उन्मुक्ति के अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है का उपयोग विश्लेषण प्राप्त करने के लिए एक विधि विकसित की है।

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Protocol

अध्ययन गतिविधियों मियामी महिलाओं की एचआईवी Interagency अध्ययन (WIHS) और एड्स अनुसंधान के लिए मियामी केंद्र (CFAR) .Institutional समीक्षा बोर्ड (मियामी विश्वविद्यालय मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन) की मंजूरी से पहले प्राप्त किया गया था के सहयोग से मियामी एचआईवी रिसर्च यूनिट के विश्वविद्यालय में जगह ले ली भर्ती और किसी भी निर्धारण या अध्ययन से संबंधित प्रक्रियाओं के लिए।

1. endocervical ब्रश नमूना संग्रह

नोट: प्रतिभागियों को प्रशिक्षित एमडी या स्त्री रोग विशेषज्ञ और अंतःउपकला लिम्फोसाइट cytobrush डालने से वीक्षक परीक्षा के तहत प्रदर्शन किया गया के संग्रह के द्वारा प्रदर्शन एक योनि परीक्षा कराना पड़ा।

  1. प्रतिभागी विशेषताओं
    1. महिलाओं के प्रतिभागियों जो उम्र, यौन, सक्रिय गर्भवती नहीं और गर्भनिरोधक दवाओं पर या एक अंतर्गर्भाशयी डिवाइस के साथ नहीं की करने के लिए 18 से 45 वर्ष आयु वर्ग के हैं रंगरूट।
    2. योनि परीक्षा से पहले है, प्रतिभागियों को हरे रंग में एक 10 एमएल रक्त ड्रा से गुजरनापरिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMC) अलगाव के लिए शीर्ष हेपरिन वैक्यूटेनर। endocervical अंतःउपकला विश्लेषण 9 के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।
  2. Endocervical नमूनों का संग्रह
    1. स्नेहन के बिना योनि में उचित आकार का एक बाँझ वीक्षक डालें। वीक्षक और बाँझ धुंध बलगम साफ करने की प्रविष्टि की सुविधा के लिए एक गर्म पानी का प्रयोग करें। वीक्षक की स्थिति ओएस और बहिर्जरायुग्रीवा का पूरा दृश्य के लिए अनुमति देता है।
    2. endocervical नहर में endocervical ब्रश डालें तक केवल जगमग हाथ करने के लिए करीब दिखाई दे रहे हैं। 360 डिग्री के लिए ब्रश दक्षिणावर्त घुमाएँ। IMDM माध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ब्रश स्थानांतरण।
    3. तुरंत संग्रह के बाद, बर्फ पर cytobrush युक्त ट्यूब जगह है। एकत्र अंतःउपकला कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए, 1 घंटे के भीतर प्रयोगशाला और प्रक्रिया के लिए cytobrush देने के लिए।

  1. भंवर endocervical cytobrush 4 कम (10 सेकंड) स्ट्रोक लागू करने से युक्त ट्यूब।
  2. ट्यूब अपकेंद्रित्र, cytobrush युक्त, 250 x जी पर 10 मिनट के लिए।
  3. ध्यान से ट्यूब से हटाने cytobrush (ट्यूब के तल पर गोली परेशान नहीं है) और IMDM मीडिया के 1 एमएल जोड़ने और बर्फ पर ट्यूब जगह।
  4. 50 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर 100 मिमी सेल झरनी पर cytobrush रखें।
  5. 20 मिलीलीटर IMDM साथ cytobrush धो लें।
  6. 250 x जी 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब।
  7. सतह पर तैरनेवाला छानना और pelleted कोशिकाओं 1 एमएल IMDM में resuspend और 2.3 में वर्णित पहले से ही फिर से निलंबित गोली के साथ गठबंधन।
  8. एक स्वचालित सेल काउंटर 10 का उपयोग कोशिकाओं की गणना या trypan नीले रंग की डाई के 10 μL के साथ सेल निलंबन के 10 μL के संयोजन से hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती। धीरे pipet और दस बार नीचे कोशिकाओं मिश्रण और डाई करने के लिए। लोड 10 μLदो hemocytometer कक्षों के दोनों के उद्घाटन में मिश्रण की। पांच ग्रिड क्षेत्रों में सभी कोशिकाओं की गणना। व्यवहार्य और अलाभकारी कोशिकाओं का एक अलग गिनती रखें। निम्न सूत्र का उपयोग सेल व्यवहार्यता का निर्धारण:% व्यवहार्य कोशिकाओं = अलाभकारी कोशिकाओं x 100 / कुल सेल नंबर कोशिकाओं।
    मिलीलीटर प्रति बाद में सेल एकाग्रता (और कोशिकाओं की कुल संख्या) निम्नलिखित गणना का उपयोग निर्धारित करते हैं। मिलीलीटर प्रति कुल कोशिकाओं = कुल कोशिकाओं की गिनती एक्स (कमजोर पड़ने कारक / गिना वर्ग की संख्या) x 10,000 कोशिकाओं / एमएल।
  9. ठंड मध्यम 10% DMSO और 90% FBS युक्त का उपयोग कर अलग endocervical कोशिकाओं रुक।

3. से फ्लो

  1. 100 μL FACS बफर में 1-3 x 10 5 endocervical कोशिकाओं (पीबीएस युक्त 1% गोजातीय सीरम albumin पुनः निलंबित
  2. 1 μL / 10 जोड़े 6 लाइव / मृत fixable पीला मृत सेल दाग किट और तालिका 1 में वर्णित सांद्रता में सतह मार्करों के लिए एंटीबॉडी।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट, प्रकाश से सुरक्षित करने के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. 350 XG पर 5 मिनट के लिए 1 एमएल FACS बफर और कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र ट्यूब जोड़े
  5. 300 μL 1% paraformaldehyde में सेल गोली फिर से निलंबित।
  6. मोती और एंटीबॉडी नमूना धुंधला के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी का एक ही एकाग्रता 100 FACS बफर के μL और मोतियों की एक बूंद और जोड़कर धुंधला के लिए इस्तेमाल का उपयोग कर मुआवजा नियंत्रण तैयार करें।
  7. एक प्रवाह कोशिकामापी, 405 एनएम, 488 एनएम और 635 एनएम लेज़रों के साथ सुसज्जित पर दाग माला और नमूने मोल।

4. endocervical गामा डेल्टा टी सेल अलगाव

  1. चुंबकीय मनका अलगाव
    1. पुनः निलंबित endocervical सेल गोली (≤10 7 कुल कोशिकाओं), 2.6 में वर्णित है, TCR गामा डेल्टा microbead किट सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका में संदर्भित में शामिल बफर के 40 μL में।
    2. दो कदम धुंधला प्रोटोकॉल के लिए किट निर्देशों का पालन करें: पहला, बुद्धिज विरोधी TCR गामा डेल्टा Hapten एंटीबॉडी और दूसरा, विरोधी hapten microbeads-FITC के साथ
    3. 4-8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के ऊष्मायन के बाद, 10 मिनट के लिए 300 XG पर बफर और सेंट्रीफ्यूज के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। inverting ट्यूब द्वारा सतह पर तैरनेवाला छानना, और कागज के एक टुकड़े की मदद से सूखे नल।
    4. उपलब्ध कराए गए बफर के 500 μL में सेल गोली पुनः निलंबित और विक्रेता के प्रोटोकॉल के अनुसार उचित चुंबकीय विभाजक में रखकर चुंबकीय स्तंभ तैयार करते हैं।
    5. स्तंभ पर सेल निलंबन लागू करें और लेबल हटाया गया है जो कोशिकाओं के माध्यम से पारित इकट्ठा करने और बफर की उचित मात्रा में (500 μL) के साथ स्तंभ 3x धो लें। बफर तीन बार, हर बार एक बार स्तंभ जलाशय खाली है जोड़कर धोने चरणों का प्रदर्शन। कुल प्रवाह लीजिए। इस लेबल हटाया गया, नकारात्मक सेल अंश है
    6. हटाये स्तंभ स्तंभ पर चुंबकीय विभाजक और पिपेट फार्म बफर के 1 मिलीलीटर और तुरंत चुंबकीय लेबल के साथ अंश बाहर निकलवानेमजबूती सवार स्तंभ के साथ आपूर्ति लगाने से एड कोशिकाओं।
      नोट: पृथक गामा डेल्टा टी सेल पहले से ही fluorescently प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए दाग रहे हैं के बाद से चुंबकीय लेबल विरोधी Hapten microbeads फ्लोरोसेंट रंजक FITC के साथ संयुग्मित हैं।
  2. सेल छंटनी
    1. सेल छँटाई, व्यवहार्यता मरने और एंटीबॉडी के पैनल के साथ लेबल endocervical कोशिकाओं के लिए धारा 3 में वर्णित है।
    2. लाइव, CD45 + CD3 + और गामा डेल्टा सकारात्मक कोशिकाओं पर इलेक्ट्रॉनिक फाटक सेट अप और सेल छँटाई प्रदर्शन करते हैं।

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Representative Results

हाल ही में, हम endocervical अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं का विश्लेषण किया और हम एचआईवी संक्रमित महिलाओं 9, 11 में endocervical गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के नुकसान के बारे में रिपोर्ट करने के लिए पहले से एक थे। यहाँ, हम प्रोटोकॉल अलग और endocervical गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के सबसेट का विश्लेषण करने का वर्णन है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, जी.डी. टी कोशिकाओं को आसानी से मानव endocervical सेल के नमूने में पाया जा सकता है।

Endocervical गामा डेल्टा V1 (GD1) टी कोशिकाओं की एक अनूठी आबादी multiparametar प्रवाह cytometry आधारित immunophenotyping (चित्रा 1) का उपयोग करते हुए बताया गया था। एचआईवी असंक्रमित endocervical नमूने के लिए एक प्रतिनिधि gating रणनीति चित्र 1 में दिखाया गया है। विश्लेषण आगे / ओर तितर बितर (चित्रा 1 ए) पर इलेक्ट्रॉनिक गेट की स्थापना द्वारा कुल endocervical कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया था टी द्वारा पीछा कियावह सेल दोहरी (चित्रा 1 बी) के बहिष्कार। व्यवहार्य कोशिकाओं लाइव / मृत fixable पीला अमाइन मृत सेल दाग (चित्रा 1 सी) का उपयोग करते हुए मृत कोशिकाओं के बहिष्कार से परिभाषित किया गया। CD45 अभिव्यक्ति का विश्लेषण लाइव gated कोशिकाओं (चित्रा -1), CD3 अभिव्यक्ति का विश्लेषण (चित्रा 1E) द्वारा पीछा किया पर प्रदर्शन किया गया था। गामा डेल्टा 1 (GD1) या गामा डेल्टा 2 (GD2) सकारात्मक कोशिकाओं CD3 + कोशिकाओं है कि जीडी TCR (TCR गामा डेल्टा V1 या TCR गामा डेल्टा V2) एक्सप्रेस के एक उप-जनसंख्या के रूप में परिभाषित किया गया। इसके अलावा, यह पुष्टि की गई है कि केवल CD3 + टी कोशिकाओं gated CD3 के बाद से TCR गामा डेल्टा व्यक्त - टी कोशिकाओं व्यक्त नहीं करते TCR गामा डेल्टा V1 या डेल्टा V2। सीडी 8 - गेटेड CD3 + GD1 + पता चला कोशिकाओं (चित्रा 1G) की प्ररूपी विश्लेषण, GD1 कोशिकाओं की है कि बहुमत (~ 74%) CD4 कर रहे हैं -।

वर्तमान अध्ययन में, उपयोग endoce की व्यवहार्यतासकारात्मक चुंबकीय सेलेक्शन अंतःउपकला शुद्ध जीडी टी कोशिकाओं को rvical ब्रश के नमूने (चित्रा 2) का प्रदर्शन किया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: गामा डेल्टा से फ्लो द्वारा विश्लेषण endocervical म्यूकोसा में (जीडी) टी सेल उप-जनसंख्या। बाद gating रणनीति पहचान endocervical टी सेल आबादी के लिए इस्तेमाल किया गया था: (ए) endocervical cytobrush कोशिकाओं के आकार और विघटन (एफएससी, आगे की ओर तितर बितर एसएससी बनाम ओर तितर बितर) के अनुसार gated थे। एसएससी-W (चौड़ाई) (बी) सेल दोहरी एफएससी-ए में इलेक्ट्रॉनिक फाटकों (क्षेत्र) बनाम स्थापना करके बाहर रखा गया। (सी) लाइव कोशिकाओं व्यवहार्यता डाई नकारात्मक जनसंख्या पर gated हैं। (डी) इलेक्ट्रॉनिक गेट रहते हैं, CD45 सकारात्मक कोशिकाओं पर स्थापित किया गया था। (ई) CD45 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए इलेक्ट्रॉनिक गेट CD3 सकारात्मक कोशिकाओं पर स्थापित किया गया था(एफ) TCRVD1 (GD1) और TCRVD2 (GD2) अभिव्यक्ति CD3 + कोशिकाओं पर विश्लेषण किया गया था। (G) सीडी 4 और सीडी 8 अभिव्यक्ति GD1 + कोशिकाओं पर विश्लेषण किया गया था। (एच) TCRVD1 और TCRVD2 अभिव्यक्ति गेटेड CD3 नकारात्मक कोशिकाओं पर विश्लेषण किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: endocervical गामा डेल्टा टी कोशिकाओं (जीडी) सकारात्मक चुंबकीय जुदाई से अलगाव की। endocervical जीडी टी कोशिकाओं की आवृत्ति से पहले और सकारात्मक चुंबकीय जुदाई के बाद इस बात की पुष्टि की गई थी। Endocervical कोशिकाओं पहले विरोधी TCR गामा डेल्टा एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे और फिर साथ fluorescently विरोधी Hapten microbeads-FITC के साथ दाग। TCR जीडी + टी कोशिकाओं का प्रतिशत पहले और मीटर के बाद बताया गयाagnetic जुदाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मादा जननांग पथ कम श्लैष्मिक असुरक्षा का आकलन एचआईवी अधिग्रहण और संचरण के जोखिम को संबोधित नैदानिक ​​अध्ययन का एक आवश्यक घटक है। आमतौर पर एचआईवी संक्रमण के जोखिम को FGT जननांग स्राव (साइटोकिन्स, chemokines और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स) 12, 13 में घुलनशील प्रतिरक्षा modulators को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है। हालांकि, इन बायोमार्कर, योनि सूजन का केवल संकेत कर रहे हैं शारीरिक और रोग की घटनाओं से प्रभावित कर रहे हैं, और हमेशा सीधा श्लैष्मिक क्षति का प्रतिनिधित्व नहीं करते। कैसे श्लैष्मिक कारकों प्राप्त करने और एचआईवी के प्रसारण का खतरा बढ़ के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए, श्लैष्मिक क्षति के सेलुलर मार्कर विकसित किए जाने की जरूरत है। जीडी अंतःउपकला टी कोशिकाओं intercalate उपकला कोशिकाओं के बीच, FGT में मौजूद हैं, और पर्यावरण की चुनौतियों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में रूप में अच्छी तरह homeostasis में योगदान करने के लिए लगा रहे हैं। जीडी टी कोशिकाओं पोतेन है FGT में श्लैष्मिक जोखिम का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त बायोमार्कर का गठन करने के Tial।

इस प्रोटोकॉल में, यह दिखाया गया है कि कैसे मानव endocervical cytobrush नमूना से अंतःउपकला लिम्फोसाइट तैयार करने के लिए और आसानी से महारत हासिल है। इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण बिंदु नमूना के तेजी से प्रसंस्करण के साथ ही पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर कोशिकाओं रखकर सेल व्यवहार्यता बनाए रखना है। सेल उपज पर cytobrush संग्रह तकनीक निर्भर करेगा, (बैक्टीरियल एचआईवी संक्रमण या अन्य वायरल संक्रमण, या फंगल संक्रमण) कौशल के साथ ही संक्रामक स्थिति से निपटने। हमारे समूह और दूसरों मानव जननांग पथ 9, 14, 15 में विभिन्न लिम्फोसाइट आबादी का वर्णन विभिन्न अध्ययनों से प्रकाशित किया है। हमारे हाथ में, एक endocervical cytobrush नमूना 80-90% व्यवहार्यता के साथ 0.5-5 x 10 6 कोशिकाओं प्रदान कर सकते हैं। आमतौर पर इस्तेमाल किया अलगाव विधि के साथ इसकी तुलना मेंवर्ग = "xref"> 14, 15, हमारे विधि द्वारा व्यवहार्यता और सेल उपज में वृद्धि हुई है।

इस पद्धति का एक शक्तिशाली और endocervical अंतःउपकला गामा डेल्टा टी lymphocytes अध्ययन करने के लिए और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि संक्रमण और / या सूजन के दौरान इस डिब्बे की ओर पलायन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है एक कुशल उपकरण प्रदान करता है। इन विवो श्लैष्मिक ऊतकों के सेलुलर संरचना अक्सर एक व्यापक और मात्रात्मक तरह से जांच करने के लिए मुश्किल है। ऐसे immunohistochemistry और के रूप में तकनीक से फ्लो विशिष्ट प्रतिजन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की उपलब्धता से और समानांतर माप की छोटी संख्या है कि प्रत्येक व्यक्ति सेल पर किया जा सकता द्वारा सीमित हैं। इस तरह के जीन अभिव्यक्ति सरणियों के रूप में पारंपरिक उच्च throughput assays, जब पूरे ऊतकों पर प्रदर्शन औसत जीन अभिव्यक्ति के स्तर के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं और केवल परोक्ष रूप से सेलुलर उप-जनसंख्या में मात्रात्मक संशोधन करने के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है।इन सीमाओं जब अल्पसंख्यक आबादी, या सेल की आबादी है कि विशेष मार्कर की कमी का अध्ययन दूर करने के लिए विशेष रूप से कठिन हो गया है। संयोजन "प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई" (FACS) और "एकल कोशिका पीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण" द्वारा एक अंतर्गर्भाशयग्रीवा में अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं के एक उच्च throughput ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते हैं। इस विधि, एक साथ microfluidic प्रौद्योगिकी के उपयोग के साथ mRNA की मात्रा मिनट से पहिले उच्च संवेदनशीलता मल्टिप्लेक्स पीसीआर, जिससे अप करने के लिए 96 जीनों की अभिव्यक्ति के समानांतर विश्लेषण की अनुमति सटीकता और परिशुद्धता के साथ व्यक्तिगत एकल कक्षों सुलझाने के लिए आधुनिक प्रवाह cytometers की क्षमता कारनामे प्रत्येक व्यक्ति के सेल 16 के लिए।

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Disclosures

लेखक वाणिज्यिक या अन्य संघ है कि ब्याज की एक संघर्ष बन सकता है की जरूरत नहीं है (उदाहरण के लिए, दवा स्टॉक स्वामित्व, परामर्श, सलाहकार बोर्ड की सदस्यता, प्रासंगिक पेटेंट, या अनुसंधान के वित्तपोषण)।

Acknowledgments

हम इस काम में भाग लेने के लिए अपनी इच्छा के लिए मियामी WIHS अध्ययन प्रतिभागियों को धन्यवाद। इस पांडुलिपि में डेटा मियामी महिलाओं की एचआईवी Interagency अध्ययन (WIHS) द्वारा एकत्र किए गए थे। इस प्रकाशन की सामग्री को केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करते। इस काम में आगे बढ़ने के लिए एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान और महिला Interagency एचआईवी संक्रमण अध्ययन (WIHS) [अनुदान संख्या U01 AI103397], नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों, स्वास्थ्य [अनुदान संख्या P30AI073961] के राष्ट्रीय संस्थानों, राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा समर्थित किया गया ट्रांसलेशनल विज्ञान और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं पर, स्वास्थ्य [अनुदान संख्या UL1TR000460 और 1KL2TR000461] के राष्ट्रीय संस्थान, एवं बाल स्वास्थ्य और मानव विकास, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान [अनुदान संख्या K23HD074489]।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytobrush Plus GT  (CareFusion, San Diego, CA, USA
IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium  ThermoFisher Scientific 12440061
Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer Beckman Coulter 496178
DMSO, Dimethyl sulfoxide  Sigma Aldrich  D2650
FBS, Fetal Bovine Serum Invitrogen, Gibco 26140-079
PBS Invitrogen, Gibco 10010023
BSA Sigma Aldrich A-9647
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies, L349S9
1% paraformaldehyde Sigma Aldrich  D6148
Fortessa flow cytometer  Becton Dickinson
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) Life Technologies A10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit  Milteny Miltenyi Biotec Inc. 130-050-701
MS column 103-042-201
MACS separator 4124

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References

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Strbo, N., Romero, L., Alcaide, M., Fischl, M. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells. J. Vis. Exp. (120), e55038, doi:10.3791/55038 (2017).

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