Abstract
O trato reprodutivo (FRT) da mucosa sistema imunológico feminino serve como a primeira linha de defesa. Melhor conhecimento da mucosa genital é, portanto, essencial para a compreensão da patogenicidade de diferentes patógenos, incluindo o HIV. Gama células delta (GD) T são o protótipo de células T 'não convencionais' e representam um subconjunto relativamente pequeno de células T definidos pela sua expressão de receptores de células T heterodiméricos (TCRs) compostas de cadeias gama e delta. Isso os diferencia das células T clássicos e muito melhor conhecidos CD4 + auxiliares e células CD8 + T citotóxicos que são definidos por TCRs alfa-beta. GD células T muitas vezes mostram a localização específica do tecido e são enriquecidos em epitélio. GD células T orquestrar respostas imunes em inflamação, vigilância de tumores, doenças infecciosas e auto-imunidade.
Aqui, apresentamos um método para isolar reprodutível e analisar linfócitos intra-epiteliais endocervicais humanos GD T. que have amostras cytobrush endocervicais usados mulheres participantes Infecção Estudo Interagency HIV das Mulheres (WIHS). Conhecimento sobre GD células T interações durante as condições em que não é um insulto à mucosa vaginal poderia ser aplicada a qualquer estudo clínico em que a vulnerabilidade das mucosas são os destinatários, incluindo o desenvolvimento de adição microbicides.In vaginal, o conhecimento sobre as respostas das células da mucosa GD T tem potencial para aplicação de terapia imunitária baseada em células T GD no tratamento de doenças infecciosas.
Introduction
Nós desenvolvemos metodologia de utilização de amostras escova endocervical para avaliar células GD T intra-epitelial. O canal endocervical é recoberto por uma camada única de epitélio colunar. Linfócitos intra-epiteliais representam linfócitos linha de frente que residem na camada epitelial que podem iniciar rapidamente as respostas imunes ao encontrar micróbios patogênicos 7, 8. Compreender os eventos imunológicos do compartimento intra-epitelial endocervical é importante para a concepção de estratégias eficazes para prevenir infecções, incluindo o HIV.
O nosso método pode ser aplicado a amostras endocervicais humanos recentemente recolhidos, bem como células endocervicais congelados para explorar ainda mais o papel das células T intra-epiteliais GD em mulheres com infecção por VIH ou em risco de infecção pelo HIV. O principal objectivo deste protocolo é descobrir novos eventos imunológicos no compartimento intra-epitelial endocervical e Avaliado comrespostas de células e GD T como um marcador de vulnerabilidade da mucosa em mulheres com infecção pelo HIV.
As lacunas substanciais no conhecimento em torno imunidade FGT são parcialmente devido à dificuldade na recolha e processamento de amostras de mucosa com sucesso. Além disso, o complexo de heterogeneidade das células imunes das mucosas, e a sua interligação uns com os outros, são os principais desafios para a identificação de medições clinicamente relevantes que reflectem o estado e a capacidade do sistema imunitário. Nós desenvolvemos um método para obter células T GD intra-epitelial altamente purificados que podem ser analisados usando tecnologias altamente multiplexados, de uma única célula que pode ser fundamental para identificar os mecanismos subjacentes da imunidade FRT.
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Protocol
atividades de estudo teve lugar na Universidade de Miami Unidade de Pesquisa de HIV em colaboração com Estudo das Mulheres Miami HIV Interagency (WIHS) e do Centro Miami for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Universidade de Miami Miller School of Medicine) aprovação foi obtida antes ao recrutamento e quaisquer procedimentos de avaliação ou de estudos relacionados.
Coleta de Amostras 1. Endocervical Escova
NOTA: Os participantes foram submetidos a um exame vaginal realizado por MD treinados ou ginecologista e recolha de linfócitos intra-epiteliais foram realizadas em exame especular, inserindo cytobrush.
- As características dos participantes
- Recrutar mulheres participantes que estão com idade de 18 a 45 anos de idade, sexualmente ativa, não está grávida e não em medicamentos contraceptivos ou com um dispositivo intra-uterino.
- Antes do exame vaginal, têm participantes passam por um empate de 10 mL de sangue em verdeVACUTAINERS heparina superior para o isolamento periférico de células mononucleares do sangue (PBMC). para servir como um controle para análise intra-epitelial endocervical 9.
- Coleta das amostras endocervicais
- Inserir um espéculo estéril de tamanho apropriado na vagina sem lubrificação. Usar uma água quente para facilitar a inserção do espéculo e gaze estéril para limpar o muco. A posição do espéculo permite a visualização completa do sistema operacional e ectocérvice.
- Insira escova endocervical no canal endocervical até que apenas as cerdas mais próxima da mão são visíveis. Girar a escova para 360 °. Transferir a escova para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de meio IMDM.
- Imediatamente após a coleta, colocar o tubo contendo cytobrush no gelo. Para obter uma alta viabilidade das células intra-epitelial recolhidos, entregar o cytobrush para o laboratório e processo dentro de 1 h.
- tubo de vórtice contendo cytobrush endocervical aplicando 4 cursos de curta duração (10 seg).
- Centrifuga-se o tubo, contendo cytobrush, durante 10 min a 250 x g.
- Cuidadosamente remover o cytobrush a partir do tubo (não perturbar o sedimento no fundo do tubo) e adicionar 1 mL de meio IMDM e colocar o tubo em gelo.
- Colocar o cytobrush no filtro de células 100 milímetros na parte superior do tubo de 50 ml.
- Lave o cytobrush com 20 ml de IMDM.
- tubo de centrifugação durante 10 min a 250 x g.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 1 ml de IMDM e combinam-se com o sedimento ressuspenso já descrito em 2.3.
- Contar as células utilizando um contador de células automatizado 10 ou contar as células utilizando um hemocitómetro, combinando 10 ul da suspensão celular com 10 ul de corante azul de tripano. Suavemente pipeta cima e para baixo dez vezes para misturar as células e corante. Carga de 10 ulda mistura para dentro da abertura de uma das duas câmaras de hemocitómetro. Contar todas as células nas cinco áreas de grade. Manter uma contagem separada de as células viáveis e não viáveis. Determinar a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:% de células viáveis = células não viáveis x 100 células / total de número de células.
Determinar a concentração de células por ml subsequente (e o número total de células) utilizando os seguintes cálculos. Total de células por ml = x total de células contadas (fator de diluição / número de quadrados contados) x 10.000 células / ml. - Congelar as células endocervicais isolados utilizando meio de congelamento contendo 10% de DMSO e 90% de FBS.
3. Citometria de Fluxo
- Re-suspender a 1-3 x 10 5 células endocervicais em 100 ul de tampão de FACS (PBS contendo 1% de albumina de soro bovino
- Adicionar 1 mL / 10 6 Live / Dead fixável kit celular mancha amarela inoperante e anticorpos para marcadores de superfície nas concentrações descritas na Tabela 1.
- Incubam-se as células durante 30 min a 4 ° C, protegidos da luz.
- Adicionar 1 mL de tampão de FACS e as células e tubos de centrifugação durante 5 min a 350 xg
- Re-suspender a pelete de células em 300 uL de paraformaldeído a 1%.
- Preparar controlos de compensação usando grânulos e anticorpos utilizados para a coloração por adição de 100 uL de tampão de SCAF e uma gota de os grânulos e a mesma concentração dos anticorpos utilizados para a coloração da amostra.
- Adquirir pérolas coradas e as amostras num citómetro de fluxo, equipado com 405 nm, 488 nm e 635 nm lasers.
4. Endocervical Gamma delta T Isolamento celular
- Isolamento esférulas magnéticas
- Re-suspender a pelete de células endocervicais (≤ 10 7 células totais), descrito em 2.6, em 40 mL de tampão incluídos no kit micropérola gama delta TCR referenciado na Tabela de Materiais e Reagentes.
- Siga as instruções do kit para protocolo de coloração de duas etapas: primeiro, sagacidadeh anti TCR-delta gamma de hapteno-anticorpo e, segundo, com anti-hapteno microbeads-FITC
- Após a incubação de 15 min a 4-8 ° C, lavar as células por adição de 1 ml de tampão e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Decantar o sobrenadante por inversão do tubo, e toque em seco com a ajuda de um pedaço de papel.
- Re-suspender o sedimento celular em 500 uL de tampão fornecido e preparar a coluna magnética, colocando-o num separador magnético apropriado de acordo com o protocolo do fornecedor.
- Aplicar a suspensão de células na coluna e recolher células não marcadas que passam através da coluna e lavar 3x com a quantidade apropriada de tampão (500 uL). Executar passos de lavagem através da adição de tampão três vezes, cada vez que uma vez que o reservatório está vazio da coluna. Recolha efluente total. Esta é a fracção de células não marcado, negativo
- Retirar a coluna do separador magnético formar e pipeta de 1 ml de tampão para a coluna e imediatamente expulsar fracção com o rótulo magneticamenteed células, aplicando firmemente o êmbolo fornecidas com a coluna.
NOTA: célula isolada T gama delta já estão fluorescente corada para análise de citometria de fluxo desde marcadas magneticamente microesferas anti-hapteno são conjugados com FITC corante fluorescente.
- separação de células
- Para separação de células, as células endocervicais de etiquetas com die viabilidade e painel de anticorpos, como descrito na seção 3.
- Configurar portões eletrônicos na ao vivo, CD45 + CD3 + e delta gamma células positivas e executar separação de células.
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Representative Results
Recentemente, analisamos células GD T intraepiteliais endocervicais e fomos o primeiro a relatar sobre a perda de células T gama delta endocervical em mulheres infectadas pelo HIV 9, 11. Aqui, descrevemos o protocolo para isolar e analisar o subconjunto de células T gama delta endocervical. Como mostrado na Figura 1, as células T GD pode ser facilmente detectado em amostras de células endocervicais humanos.
Uma população única de células endocervicais gama delta V1 (GD1) T foi descrita utilizando multiparametar imunofenotipagem de fluxo baseado em citometria (Figura 1). Uma estratégia para a amostra representativa gating endocervical não infectado pelo HIV é mostrado na Figura 1. A análise foi realizada sobre as células endocervicais totais, definindo o portão electrónico na dispersão para a frente / lateral (Figura 1A) seguido por tele exclusão de dupletos celulares (Figura 1B). As células viáveis foram definidos pela exclusão de células mortas usando o Live / Dead fixável Amarelo Amine Stain celular Dead (Figura 1C). Análise da expressão de CD45 foi realizada em células vivas fechado (Figura 1D), seguido pela análise de expressão CD3 (Figura 1E). Gama de delta 1 (GD1) ou gama delta de 2 células (GD2) positivos foram definidas como uma subpopulação de células CD3 + que expressam GD TCR (TCR gama delta V1 ou V2 gama delta TCR). Para além disso, confirmou-se que apenas as células T CD3 + expressam TCR gama delta CD3, uma vez fechado - células T não expressam TCR V1 ou V2 gama delta delta. Análise fenotípica de células fechadas CD3 + GD1 + revelado (Figura 1G), que a maioria das células GD1 (~ 74%) são CD4 - CD8 -.
No presente estudo, a viabilidade de utilizar endoceamostras escova rvical para células T intra-epiteliais GD purificado por selecção magnética positivo foi demonstrado (Figura 2).
Figura 1: Gamma delta subpopulação de células (GD) T na mucosa endocervical analisadas por citometria de fluxo. Seguindo a estratégia gating foi usada para populações de células endocervical T identificados: células cytobrush endocervicais (A) foram fechado de acordo com o tamanho e granularidade (FSC, dispersão lateral para a frente vs SSC, dispersão lateral). (B) dobletes celulares foram excluídos, definindo os portões eletrônicos do FSC-A (área) vs SSC-W (largura). (C) células vivas são fechado sobre a população corante negativo viabilidade. (D) portão eletrônico foi criado em células positivas ao vivo, CD45. (E) portão eletrônico para células positivas CD45 foi criado em células CD3 positivas(F) TCRVD1 (GD1) e expressão TCRVD2 (GD2) foi analisada em células CD3 +. (L) CD4 e CD8 foi analisada a expressão em células GD1 +. (H) TCRVD1 e expressão TCRVD2 foi analisada em células negativas CD3 fechado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento de células T gama delta endocervicais (GD) por separação magnética positiva. Frequência de células T GD endocervicais foi confirmada antes e depois da separação magnética positiva. Células endocervicais foram primeiro marcadas com anticorpo delta gamma anti-TCR e depois com fluorescência coradas com anti-hapteno microbeads-FITC. Percentagem de células TCR GD + T foi relatado antes e depois mseparação agnetic. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Avaliação da vulnerabilidade das mucosas do tracto genital inferior feminino é um componente essencial de estudos clínicos que abordam risco de aquisição e transmissão do HIV. Tipicamente FGT vulnerabilidade à infecção do HIV é avaliada através da medição moduladores imunitários solúveis em secreções genitais (citocinas, quimiocinas e péptidos antimicrobianos) 12, 13. No entanto, estes biomarcadores são apenas indicativos da inflamação vaginal, são afetados por eventos fisiológicos e patológicos, e nem sempre representam danos na mucosa direta. A fim de melhorar a nossa compreensão de como os fatores mucosas aumentar o risco de aquisição e transmissão de HIV, marcadores celulares de danos na mucosa precisam ser desenvolvidos. células T intra-epitelial GD estão presentes na FGT, intercalado entre as células epiteliais, e pensa-se que contribuem para a homeostase, bem como a uma primeira linha de defesa contra os desafios ambientais. células T GD têm o poten cial para constituir um biomarcador adicional para avaliar a vulnerabilidade da mucosa no FGT.
Neste protocolo, mostra-se como preparar linfócitos intra-epiteliais da amostra cytobrush endocervical humano e é facilmente dominado. O ponto mais importante deste processo é o de manter a viabilidade celular por processamento rápido da amostra, bem como mantendo as células em gelo durante todo o procedimento. O rendimento das células irá depender técnica de coleta cytobrush, habilidade, bem como o status infecciosa (infecção pelo HIV ou outras infecções virais, bacterianas ou infecções fúngicas) manuseio. O nosso grupo e outros têm publicado vários estudos que descrevem diferentes populações de linfócitos no trato genital humano 9, 14, 15. Em nossas mãos, uma amostra cytobrush endocervical pode fornecer 0,5-5 x 10 6 células com 80-90% de viabilidade. Em comparação com o método de isolamento utilizadaclasse = "refex"> 14, 15, pelo nosso método, o rendimento e a viabilidade de células é aumentada.
Este método proporciona uma ferramenta eficiente para estudar endocervicais linfócitos T gama delta intra-epitelial e pode fornecer informações sobre outras células do sistema imunológico que migram para esse compartimento durante a infecção e / ou inflamação e poderosa. A composição celular in vivo de tecidos da mucosa é muitas vezes difícil de investigar de uma forma abrangente e quantitativa. Técnicas como a imuno-histoquímica e citometria de fluxo são limitados pela disponibilidade de anticorpos monoclonais específicos de antigénios e pelo pequeno número de medições paralelas que podem ser executadas em cada célula individual. ensaios de alto rendimento tradicionais, como arrays de expressão genética, quando realizada em tecidos inteiros, fornecer informações sobre o nível de expressão gênica média, e pode ser apenas indiretamente correlacionados com modificações quantitativas em subpopulações celulares.Estas limitações tornam-se particularmente difícil de superar quando se estuda populações minoritárias, ou a população de células que não têm marcadores exclusivos. Através da combinação de "fluorescência de separação de células activada" (FACS) e "de uma única célula de análise PCR do gene-expressão", é possível realizar uma análise de alto rendimento de transcrição das células T intra-epiteliais GD em endocervical. Este método explora a capacidade de citómetros de fluxo modernas para classificar células individuais individuais com exactidão e de precisão, em conjunto com o uso de tecnologias de microfluidos para pré-formar alta sensibilidade multiplexado por PCR a partir de pequenas quantidades de ARNm, permitindo assim a análise paralela da expressão de até 96 genes para cada célula individual 16.
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Disclosures
Autores não têm associação comercial ou outra, que podem representar um conflito de interesses (por exemplo, a propriedade de ações farmacêutica, consultoria, a adesão Advisory Board, patentes relevantes, ou o financiamento da investigação).
Acknowledgments
Agradecemos aos participantes do estudo Miami WIHS para a sua vontade de participar neste trabalho. Os dados apresentados nesta manuscrito foram recolhidos por Interagency HIV Study das Mulheres Miami (WIHS). O conteúdo desta publicação é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam a posição oficial do National Institutes of Health (NIH). Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e das mulheres Infecção Estudo Interagency HIV (WIHS) [subvenção número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão P30AI073961], Centro Nacional para a Promoção Ciências translacionais e do Instituto Nacional sobre Minority Saúde e Saúde disparidades, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão UL1TR000460 e 1KL2TR000461], e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
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