Abstract
여성의 생식 기관 (FRT) 점막 면역 시스템은 첫 번째 방어선 역할을합니다. 성기 점막의 더 나은 지식은 HIV를 포함하여 다른 병원균의 병원성을 이해하는 것이 필수적이다. 감마 델타 (GD) T 세포는 '비 전통적인'T 세포의 원형이며, 감마 및 델타 사슬로 구성된 이종이 T 세포 수용체 (TCR도)들의 식으로 정의 T 세포의 상대적으로 작은 부분 집합을 나타낸다. 이 알파 - 베타 TCR도에 의해 정의 된 고전 훨씬 더 잘 알려 CD4 + 헬퍼 T 세포와 CD8 + 세포 독성 T 세포에서 차별화. GD T 세포는 종종 조직 별 현지화를 보여 상피 세포에 농축되어있다. GD T 세포는 염증, 종양 감시, 감염성 질환, 및자가 면역 반응에 대한 면역 반응을 조율.
여기서는 재현성 분리 및 인간 자궁 경부 상피내 GD T 림프구를 분석하는 방법을 제시한다. 우리는 하여자의 부처 간 HIV 감염 연구 (WIHS)에 참여하는 여성에서 사용 경부 cytobrush 샘플을했습니다. 질 점막 모독가 인 조건에서 GD T 세포의 상호 작용에 대한 지식은 질 microbicides.In 추가의 개발을 포함한 점막 취약점을 해결하는 임상 연구에 적용 할 수 점막 GD T 세포 반응에 대한 지식을 가지고 감염성 질환의 치료에서 GD T 세포 기반 면역 요법의 적용 가능성.
Introduction
우리는 GD 상피내 T 세포를 평가하기 위해 브러시 경부 샘플을 사용하는 방법을 개발 하였다. 자궁 경관은 원주 상피의 단일 층으로 늘어서있다. 상피내 림프구는 병원성 미생물 7, 8 발생에 면역 반응을 빠르게을 시작할 수 있습니다 상피 층 내부에있는 전선 림프구를 나타냅니다. 자궁 경부 상피내 구획의 면역 학적 사건을 이해하는 것은 HIV를 포함하여 감염을 방지하는 효과적인 전략의 설계에 중요합니다.
우리의 방법은 HIV 감염 또는 HIV 감염 위험이있는 여성 GD 상피내 T 세포의 역할을 조사하기 위해 신선하게 수집 된 인간 경부 샘플뿐만 아니라 냉동 경부 세포에 적용 할 수있다. 이 프로토콜의 주요 목표는 자궁 경부 상피내 구획에 새로운 면역 학적 이벤트를 발견하고 evaluat하는 것입니다HIV 감염 여성의 점막 취약점 마커로 전자 GD T 세포 반응.
FGT 내성 주변 지식에 상당한 격차가 성공적으로 수집하고 점막 샘플의 처리에 어려움에 부분적으로 기인한다. 또한, 복잡한 점막 면역 세포 이질성, 서로와의 상호 연결성은 면역 시스템의 상태 및 성능을 반영 임상 적 측정을 식별하는 주요 과제이다. 우리는 추가 될 FRT 면역 기전을 확인하기위한 없어서는 안될 매우 다중화 된 단일 셀 기술을 사용하여 분석 할 수 고순도 GD 상피내 T 세포를 수득하는 방법을 개발 하였다.
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Protocol
연구 활동은 마이애미 여성의 HIV 부처 연구 (WIHS) 및 AIDS 연구를위한 마이애미 센터 (CFAR) .Institutional 검토위원회 (의과 대학 마이애미 밀러 학교) 승인 전에 얻었다와 공동으로 마이애미 HIV 연구 단위의 대학에서 일어났다 채용 및 평가 또는 연구 관련 절차.
1. 자궁 경부 브러쉬 샘플 컬렉션
참고 : 참가자는 훈련 MD 또는 산부인과 의사와 cytobrush를 삽입하여 검경 시험에서 수행되었다 상피내 림프구의 컬렉션에 의해 수행되는 질 검사를 시행 하였다.
- 참가자 특성
- 성적, 활성 임신하지 아니라 피임 약물이나 자궁 내 장치와 나이, 18 ~ 45 년 세되는 여성 참가자를 모집.
- 질 검사하기 전에,이 참가자는 녹색에서 10 mL의 혈액 무승부를 받다말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 분리 용 상부 헤파린 vacutainers. 자궁 경부 상피내 분석 (9)에 대한 제어 역할을합니다.
- 자궁 경부 샘플 컬렉션
- 윤활없이 질에 적절한 크기의 살균 검경를 삽입합니다. 검기와 점액을 청소하는 멸균 거즈의 삽입을 용이하게하기 위해 따뜻한 물을 사용합니다. 검기의 위치는 운영 체제 및 ectocervix의 완벽한 시각화 할 수 있습니다.
- 손에 가장 가까운 단지 강모가 표시 될 때까지 자궁 경관에 자궁 경부 브러쉬를 삽입합니다. 360 °의 브러시를 시계 방향으로 돌립니다. IMDM 배지 5 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 브러쉬를 옮긴다.
- 즉시 수집 한 후, 얼음에 cytobrush를 포함하는 튜브를 배치합니다. 수집 된 상피내 세포의 높은 생존 능력을 얻으려면 1 시간 내에 실험실 및 프로세스에 cytobrush을 제공합니다.
- 4 단 (10 초) 스트로크를 적용 경부 cytobrush을 포함 소용돌이 관.
- X 250 g에서 10 분 동안, cytobrush을 포함하는 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 튜브에서 cytobrush을 제거 (튜브 하단의 펠렛을 방해하지 않음) 및 IMDM 미디어의 1 mL를 넣고 얼음에 튜브를 배치합니다.
- 50 ML 튜브의 상단에 100mm의 셀 스트레이너에 cytobrush를 놓습니다.
- 20 ㎖의 IMDM으로 cytobrush을 씻으십시오.
- 250 × g에서 10 분 동안 원심 분리기 튜브.
- 뜨는을 가만히 따르다 및 펠렛 세포를 1 mL의 IMDM에 재현 탁 2.3에 설명 된 이미 다시 중단 펠렛과 결합.
- 자동 세포 계수기 (10)를 사용하여 세포를 트립 판 블루 수나 염료 10 μL로 세포 현탁액 10 μL를 조합하여 혈구를 이용하여 세포 수를 계산. 부드럽게 피펫 및 열 배 아래로 세포를 혼합 염색. 로드 10 μL두 혈구 챔버들 중 하나의 개구 내로의 혼합물. 다섯 개의 격자 영역의 모든 세포를 카운트. 생존과 비 생존 세포의 별도의 수를 유지합니다. 다음 식을 사용하여 세포 생존도를 결정 생존 세포 % = 비 생존 세포 × 100 / 총 세포 수의 세포를 포함한다.
다음 계산을 사용 mL의 후속 세포 농도 (세포의 총 수)를 결정한다. ml의 당 전체 세포는 = 총 세포 계수 × (희석 배수 / 계산 사각형의 수) 10,000 세포 / ml를 X. - 10 % DMSO 90 % FBS를 포함하는 동결 매체를 사용하여 격리 된 자궁 경부 세포를 고정.
3. 유동 세포 계측법
- PBS를 1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 100 μL FACS 완충액에 1-3 × 105 자궁 경부 세포 (다시 일시
- 1 μL / 10 추가 6 LIVE / DEAD 고칠 옐로우 사균 얼룩 키트 및 표 1에 기재된 농도로 표면 마커에 대한 항체.
- 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 세포를 품어.
- 350 XG에서 5 분 동안 1 ㎖의 FACS 완충액 및 세포를 원심 분리 관에 추가
- 300 μL 1 % 파라 포름 알데히드의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- FACS 완충액 100 μL 비드 한 방울 샘플 염색에 사용 된 항체의 동일한 농도를 첨가하여 염색에 사용되는 비드 및 항체를 사용하여 보정 제어를 준비한다.
- 사이토, 405 nm의, 488 nm의 및 635 nm의 레이저가 장착 된 흐름에 스테인드 구슬과 샘플을 획득.
4. 자궁 경부 감마 델타 T 세포 분리
- 자기 비드 분리
- 다시 중단 재료 및 시약의 표 참조 TCR 감마 델타 마이크로 비드 키트에 포함 된 버퍼의 40 μL에서 2.6에 설명 된 자궁 경부 세포 펠렛 (≤10 7 총 셀).
- 두 단계 염색 프로토콜에 대한 키트의 지시 사항을 따르십시오 : 첫째, 재치항 합텐 마이크로 비드-FITC와 시간 반 TCR 감마 델타 합텐 - 항체 및 초,
- 4-8 ℃에서 15 분간 배양 한 후, 10 분 동안 300 XG에 버퍼 원심 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 튜브를 반전시켜 상등액을 경사 분리하고, 종이의 도움으로 건조 탭.
- 제공된 버퍼 500 μL의 세포 펠렛을 다시 중단하고 공급 업체의 프로토콜에 따라 적절한 자기 분리기에 배치하여 자기 열을 준비합니다.
- 칼럼에 세포 현탁액을 적용하고 통과 레이블이없는 세포를 수집하고 버퍼의 적절한 금액 (500 μL)과 열 배 씻는다. 버퍼 세 번, 열 저수지가 비어 번 할 때마다 추가하여 세척 단계를 수행합니다. 총 폐수를 수집합니다. 이 레이블이없는, 음의 세포 분획이다
- 열이 컬럼에 버퍼 1 ㎖를 자기 분리기 및 피펫을 형성하고 즉시 자기 라벨 부분을 세척 제거단단히 열와 함께 제공된 플런저를 적용하여 세포를 에드.
주의 : 자성 표지 항 합텐 마이크로 비드는 형광 염료 FITC가 결합되어 있기 때문에 절연 감마 델타 T 세포는 이미 형광 유세포 분석을 위해 염색 하였다.
- 셀 정렬
- 생존 다이 항체 패널 셀 정렬, 라벨 자궁 경부 세포의 경우 3 절에 설명 된대로.
- 라이브, CD45 + CD3 + 감마 델타 양성 세포에 전자 게이트를 설정하고 셀 정렬을 수행합니다.
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Representative Results
최근에는 경부 상피내 GD T 세포를 분석하고, 우리는 HIV 감염 여성 9, 11의 경부 감마 델타 T 세포의 감소에 관하여보고 처음이었다. 여기서는 분리하고 경부 감마 델타 T 세포의 서브 세트를 분석하는 프로토콜을 기술한다. 도 1에 도시 된 바와 같이, T 세포 GD 용이 인간 자궁 경부 세포 샘플에서 검출 될 수있다.
자궁 경부 감마 델타 V1 (GD1) T 세포의 고유 한 인구는 multiparametar이 세포 계측법 기반 면역 표현형 (그림 1) 흐름을 사용하여 설명 하였다. HIV 감염되지 않은 자궁 경부 샘플의 대표적인 게이팅 전략은도 1에 도시되어있다. 분석 t 다음에 정 / 측면 분산 (그림 1A)에 전자 게이트를 설정하여 총 자궁 경부 세포에서 수행되었다세포 이중선 (그림 1B)의 고 제외. 실행 가능한 세포 LIVE / DEAD 고칠 노란색 아민 죽은 세포 얼룩 (그림 1C)를 사용하여 죽은 세포의 배제에 의해 정의되었다. CD45 발현 분석 CD3 발현의 분석 (도 1E)이어서 게이트 살아있는 세포 (도 1d)에서 수행 하였다. 감마 델타 1 (GD1) 감마 델타 2 (GD2) 양성 세포는 GD TCR (TCR 감마 델타 V1 또는 TCR 감마 델타 V2)를 표현 CD3 + 세포의 하위 집단으로 정의 하였다. 또한, 단지 CD3 + T 세포의 TCR 게이트 CD3 사람 감마 델타 발현이 확인되었다 - T 세포 TCR 감마 델타 V1 또는 V2 델타를 표현하지 않는다. CD8 - 공개 게이트 + CD3 + 세포 GD1 (도 1G)의 표현형 분석은 GD1 세포의 대다수 (~ 74 %)는 CD4이다 -.
이용 endoce의 본 연구에서 타당성양성 자성 선택 그래피 GD 상피내 T 세포 rvical 브러시 샘플 (도 2)을 입증 하였다.
도 1 : 유세포 분석 경부 점막 감마 델타 (GD) T 세포 아 집단. 다음 게이팅 전략이 식별 경부 T 세포 집단을 사용 하였다 : (A) cytobrush 경부 세포의 크기 및 입도 (SSC VS FSC 전방 측면 산란, 측면 산란)를 따라 게이트 하였다. (B)이 세포를 대 이중선 FSC-A에서, 전자 게이트 (영역)를 설정하여 제외 된 SSC-W (폭). (C) 생균 생존 염료 제외 모집단 게이팅된다. (D) 전자 게이트는 라이브, CD45 양성 세포에 설정되었다. CD45 양성 세포에 대한 (E) 전자 게이트는 CD3 양성 세포에 설정된(F) TCRVD1 (GD1) 및 TCRVD2 (GD2) 표현은 CD3 + 세포 분석 하였다. (G) CD4 및 CD8의 발현은 GD1 + 세포 분석 하였다. (H) TCRVD1 및 TCRVD2 발현 게이트 CD3 음성 세포에 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 긍정적 인 자기 분리에 의해 자궁 경부 감마 델타 T 세포 (GD)의 분리. 경부 GD T 세포의 빈도는 이전과 양성 자성 분리 후에 확인되었다. 자궁 경부 세포는 최초의 안티 TCR 감마 델타 항체로 표지 한 다음에 형광 방지 합텐 마이크로 비드-FITC로 염색 하였다. TCR GD + T 세포의 퍼센트는 전과 후에보고 된 magnetic 분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여성 하부 생식기의 점막 취약점 평가는 HIV 수집 및 전송의 위험을 다루는 임상 연구의 필수적인 구성 요소입니다. 일반적으로 HIV 감염에 FGT 취약점은 생식기 분비물 (사이토 카인, 케모카인 및 항균 펩타이드) 12, 13에 용해 면역 조절제를 측정하여 평가한다. 그러나 이러한 바이오 마커는, 질 염증의 지표이다 생리 학적 및 병리학 적 사건에 의해 영향을받는, 항상 직접 점막 손상을 대변하지 않습니다. 점막 요인 취득 및 HIV를 전송할 위험성을 증가시키는 방법에 대한 이해를 향상시키기 위하여, 점막 세포 손상의 지표가 개발되어야한다. GD 상피내 T 세포 넣다 상피 세포 사이 FGT에 존재하고, 환경 문제에 대한 방어의 제 라인뿐만 아니라 항상성에 기여하는 것으로 생각된다. GD T 세포는 poten을 FGT 점막 취약점 평가 추가적인 바이오 마커를 구성 자유형.
이 프로토콜에서, 인간 경부 cytobrush 샘플에서 상피내 림프구를 제조 용이 마스터되는지 나타낸다. 이 방법의 가장 중요한 점은 시료의 빠른 처리에 의해뿐만 아니라 전체 과정 동안 얼음에 세포를 유지하여 세포 생존을 유지하는 것이다. 셀 수율 기술뿐만 아니라 감염 상태 (HIV 감염 또는 기타 바이러스 감염, 박테리아 또는 진균 감염)을 취급 cytobrush 수집 기술에 의존 할 것이다. 우리 그룹과 다른 사람의 생식기 9, 14, 15에서 다른 림프구 인구를 설명하는 다양한 연구를 발표했다. 우리의 손에, 하나 경부 cytobrush 샘플 80-90 %의 생존과 0.5 × 10 6 세포를 제공 할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 분리 방법에 비해클래스 생존과 세포 수율이 증가 우리의 방법에 의해 = "외부 참조"> 14, 15,.
이 방법은 강력하고 자궁 경부 상피내 감마 델타 T 림프구를 연구하고 감염 및 / 또는 염증 동안이 구획으로 마이그레이션 다른 면역 세포에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 효율적인 도구를 제공합니다. 점막 조직의 생체 내 세포 조성물은 포괄적이고 정량적 인 방법으로 조사하는 것이 어렵다. 예와 같이 면역 조직 화학 기술은 계측법 항원 특이 단일 클론 항체의 이용에 의해 각각의 셀에 대해 수행 할 수있는 병렬 측정 작은 숫자로 제한되어 흐른다. 전체 조직을 수행 할 때 이러한 유전자 발현 어레이 전통적인 높은 처리량 분석은, 평균 유전자 발현 량에 대한 정보를 제공하고, 간접적으로 세포 개체군 정량적 변형에 상관 될 수있다.이러한 제한은 소수 집단, 또는 전용 마커를 부족한 세포 집단을 연구 할 때 극복하는 것이 특히 어려워진다. "형광 활성화 세포 정렬"(FACS) 및 "단일 셀 PCR 유전자 발현 분석"을 조합하여 하나의 자궁 경부 상피내 GD T 세포의 높은 처리량 전사 분석을 수행 할 수있다. 이 방법은 이에 96 유전자의 발현의 병렬 분석을 허용 mRNA의 미량의 고감도 다중 PCR 프리폼하는 마이크로 유체 기술의 사용과 함께, 정확성과 정밀성 개별 단셀 정렬 현대식 유동 세포 계측기의 용량을 활용 각 개별 셀 16.
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Disclosures
저자는 이해의 충돌을 야기 할 수 상업적 또는 다른 관련이없는 (예를 들어, 제약 사주, 컨설팅, 자문위원회 회원, 관련 특허 또는 연구 자금).
Acknowledgments
우리는이 작업에 참여할 의지의 마이애미 WIHS 연구 참가자 감사합니다. 이 논문의 데이터는 마이애미 여성 부처 HIV 연구 (WIHS)에 의해 수집 하였다. 이 책의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원 (NIH)의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 이 작품은 전진에 대한 알레르기 및 전염병 국립 연구소와 여자의 부처 간 HIV 감염 연구 (WIHS) 허가 번호 U01의 AI103397, 알레르기 국립 연구소 감염증, 건강 [허가 번호 P30AI073961]의 국립 연구소, 국립 센터 지원 건강의 병진 과학 및 소수 민족 보건 및 건강 불균형에 국립 연구소, 건강 [허가 번호 UL1TR000460 및 1KL2TR000461] 국립 연구소 및 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소 국립 연구소 [허가 번호 K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
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