Abstract
Женского репродуктивного тракта (FRT) иммунная система слизистых оболочек служит в качестве первой линии обороны. Более глубокое понимание слизистой оболочки половых органов, поэтому необходимо для понимания патогенность различных патогенов, включая ВИЧ. Гамма-дельта (GD) Т-клетки являются прототипом «нетрадиционным» Т-клеток и представляют собой относительно небольшое подмножество Т-клеток, определяемых их экспрессии гетеродимерных рецепторов Т-клеток (TCR), состоящих из гамма и дельта цепей. Это отличает их от классических и гораздо более известных CD4 + Т - хелперов и CD8 + цитотоксических Т - клеток, которые определяются альфа-бета - ТКО. GD Т-клетки часто показывают локализацию тканеспецифичную и обогащены эпителия. GD Т-клетки оркестровать иммунные реакции воспаления, наблюдения опухоли, инфекционные болезни и аутоиммунитета.
Здесь мы представляем метод воспроизводимым выделять и анализировать человеческие эндоцервикальные интраэпителиальной GD Т-лимфоциты. Мы гаве использовали эндоцервикальные образцы цитощеточка от женщин, участвующих в женском инфекции исследовании Межведомственная ВИЧ (WIHS). Знание о GD взаимодействий Т-клеток во время условий, в которых есть оскорбление влагалища через слизистую оболочку может быть применен к любому клинического исследования, в которых адресуется через слизистую оболочку уязвимости, включая развитие вагинального microbicides.In Кроме того, знание о ответах через слизистую оболочку GD имеет Т-клеток потенциал для применения клеточной иммунотерапии GD T при лечении инфекционных заболеваний.
Introduction
Мы разработали методику использования эндоцервикальные образцов кисти для оценки интраэпителиальной GD Т-клеток. Эндоцервикальный канал выстланы однослойным цилиндрическим эпителием. Внутриэпителиальные лимфоциты представляют фронтовые лимфоциты , проживающих в пределах эпителиального слоя , который может быстро инициировать иммунный ответ при встрече с патогенными микробами 7, 8. Понимание иммунологических событий эндоцервикальной интраэпителиальной купе имеет важное значение для разработки эффективных стратегий для предотвращения инфекций, включая ВИЧ-инфекцию.
Наш метод может быть применен для свежесобранных эндоцервикса образцов человека, а также замороженных эндоцервикса клеток для дальнейшего изучения роли интраэпителиальных GD Т-клеток у женщин с ВИЧ-инфекцией или с высоким риском ВИЧ-инфекции. Основной целью данного протокола является выявление новых иммунологических событий в эндоцервикальной интраэпителиальной отсеке и evaluatклеточные ответы е GD T в качестве маркера уязвимости слизистых оболочек у женщин с ВИЧ-инфекцией.
Существенные пробелы в знаниях вокруг FGT иммунитета частично из-за трудностей в успешном сборе и обработке проб слизистых оболочек. Кроме того, комплекс гетерогенность слизистыми иммунных клеток, а также их взаимосвязанность друг с другом, являются основными проблемами для выявления клинически значимых измерений, которые отражают состояние и способность иммунной системы. Мы разработали метод получения высокоочищенных интраэпителиальной GD Т-клетки, которые могут быть дополнительно проанализированы с использованием высоко уплотненные, одноклеточные технологии, которые могут иметь решающее значение для определения механизмов, лежащих в основе FRT иммунитета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Учебные мероприятия проводились в Университете отдела исследований ВИЧ Майами в сотрудничестве с Майами женского ВИЧ Межведомственной исследования (WIHS) и Майами Центра исследований СПИДа (CFAR) Совет Обзор .Institutional (Университет Майами Миллер Школа медицины) одобрение было получено до приема на работу и какие-либо оценки или исследования, связанные с процедурами.
1. Endocervical Кисть для сбора проб
Примечание: Участники прошли влагалищное исследование выполняется обученным MD или гинеколога и сбор интраэпителиальной лимфоцитов проводили в зеркалах обследования путем введения цитощеточка.
- Участник характеристики
- Набирать участников женщин, которые в возрасте от 18 до 45 лет, ведущих активную половую жизнь, не беременна, а не на противозачаточные лекарства или с внутриматочные устройства.
- Перед влагалищного исследования, имеют участники подвергаются ничьи 10 мл крови в зеленыйтоп vacutainers гепарин для мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) изоляции. чтобы служить в качестве контроля для эндоцервикальной интраэпителиальной анализа 9.
- Сбор образцов эндоцервикса
- Вставьте стерильный расширитель соответствующего размера во влагалище без смазки. Используйте теплую воду, чтобы облегчить введение рефлектора и стерильную марлю, чтобы очистить слизь. Положение рефлектора обеспечивает полную визуализацию зева и эктоцервикса.
- Вставьте щетку в канала шейки эндоцервикальный канал, пока только щетина ближе всего к руке не видно. Поверните кисть по часовой стрелке на 360 °. Перенести щетку в трубку 15 мл, содержащую 5 мл среды IMDM.
- Сразу после сбора поместите пробирку, содержащую цитощеточка на льду. Для того, чтобы получить высокую жизнеспособность собранных интраэпителиальной клеток, доставить цитощеточка в лабораторию и процесса в течение 1 ч.
- Вихревая труба, содержащая цитощеточка претендуете канала шейки 4 коротких (10 сек) инсультов.
- Центрифуга трубки, содержащая цитощеточка, в течение 10 мин при 250 х г.
- Осторожно удалите цитощеточка из трубки (не беспокоить осадок на дне пробирки) и добавляют 1 мл IMDM среде и поместите трубку на льду.
- Поместите цитощеточка на ситечко ячейки 100 мм в верхней части 50 мл трубки.
- Вымойте цитощеточка с 20 мл IMDM.
- Центрифуга трубки в течение 10 мин при 250 х г.
- Декантируют супернатант, и осажденные клетки ресуспендируют в 1 мл IMDM и в сочетании с уже ресуспендировали гранулы, описанной в разделе 2.3.
- Граф клеток с использованием автоматического счетчика клеток 10 или количества клеток с использованием гемоцитометра путем объединения 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего красителя. Аккуратно пипеткой вверх и вниз в десять раз, чтобы смешать клетки и краситель. Нагрузка 10 мклсмеси в отверстие любой из двух камер гемоцитометра. Граф все ячейки в пяти областях сетки. Держите отдельный подсчет жизнеспособных и нежизнеспособных клеток. Определение жизнеспособности клеток с использованием следующей формулы:% жизнеспособных клеток = нежизнеспособных клеток х 100 / общее количество клеток клетки.
Определить последующую концентрацию клеток на мл (и общее число клеток) с использованием следующих вычислений. Общее количество клеток на мл = общее количество подсчитанных клеток х (коэффициент разбавления / количество подсчитанных площади) х 10000 клеток / мл. - Замораживание изолированных эндоценвикальных клеток с использованием замораживания среды, содержащей 10% ДМСО и 90% FBS.
3. Проточная цитометрия
- Ресуспендируйте 1-3 × 10 5 клеток эндоценвикальных в 100 мкл FACS буфера (PBS , содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина
- Добавить 1 мкл / 10 6 DEAD поправимо ЖИВОЙ Желтый Мертвый набор и антитела для поверхностных маркеров в концентрациях , описанных в таблице 1 / Cell Stain.
- Инкубируйте клетки в течение 30 мин при +4 ° С, в защищенном от света месте.
- Добавляют 1 мл FACS буфера, и клетки и центрифужные пробирки в течение 5 мин при 350 х г
- Повторное приостановить осадок клеток в 300 мкл 1% параформальдегидом.
- Готовят управления компенсацию с использованием бусин и антитела, используемые для окрашивания путем добавления 100 мкл буфера FACS и одну каплю бусинок и ту же концентрацию антител, используемых для окрашивания образца.
- Приобретать запятнанные бусы и образцов на проточном цитометре, оборудованном с 405 нм, 488 нм и 635 нм лазеров.
4. Endocervical гамма-дельта Т-клеток изоляции
- Магнитная изоляция борта
- Повторное приостановить осадок клеток канала шейки (≤10 7 общего числа клеток), описанный в 2.6, в 40 мкл буфера , включенного в гамма - дельта микрогранулами набора TCR ссылка в Таблице материалов и реактивов.
- Следуйте инструкциям по установке для протокола окрашивания два этапа: во-первых, остроумиеч анти-TCR-гамма-дельта гаптен-антитело и во-вторых, с анти-гаптен микрогранулы-FITC
- После инкубации 15 мин при 4-8 ° С, промыть клетки путем добавления 1 мл буфера и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин. Декантируют супернатант переворачивая пробирку, и нажмите сухой с помощью листа бумаги.
- Повторное приостановить осадок клеток в 500 мкл буфера и при условии подготовки магнитную колонку, поместив его в соответствующий магнитный сепаратор в соответствии с протоколом производителя.
- Нанести клеточной суспензии на колонку и собирают немаркированные клетки, которые проходят через колонку и мыть 3x с соответствующим количеством буфера (500 мкл). Выполнение стадии промывки путем добавления в буфер в три раза, каждый раз, как только колонна резервуар пуст. Собрать общий сточные воды. Это непомеченная, отрицательная фракция клеток
- Удалить столбец образуют магнитный сепаратор и пипеткой 1 мл буфера на колонку и сразу вымывать фракцию с магнитномодулировэнная этикеткойэд клетки, крепко применяя поршень, поставляемый вместе с колонной.
Примечание: Изолированные гамма-дельта Т-клеток уже флуоресцентно окрашивали для проточной цитометрии анализа, так как магнитно-меченными анти-гаптен микросферы сопрягаются с FITC флуоресцентного красителя.
- сортировки клеток
- Для сортировки клеток, меток эндоцервикса клеток с жизнеспособностью и фильеры панели антител, как описано в разделе 3.
- Установить электронные ворота на живом, CD45 + CD3 + и гамма - дельта - положительных клеток и выполняют сортировку клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Недавно мы проанализировали эндоцервикальные интраэпителиальной GD Т - клетки , и мы были первым , чтобы сообщить о потере эндоцервикальную гамма - дельта Т - клеток у ВИЧ - инфицированных женщин , 9, 11. Здесь мы опишем протокол для выделения и анализа подмножества эндоцервикальную гамма-дельта Т-клеток. Как показано на рисунке 1, Г.Д. Т - клетки могут быть легко обнаружены в образцах из канала шейки матки клеток человека.
Уникальная популяция эндоцервикальную гамма - дельта - V1 (GD1) Т - клеток описана с использованием multiparametar проточной цитометрии на основе иммунофенотипирование (рисунок 1). Представитель стратегии стробирования для ВИЧ - неинфицированных эндоцервикальной образца показана на рисунке 1. Анализ проводили на общее число клеток эндоцервикса, установив шлагбаумом с дистанционным управлением на вперед / бокового рассеяния (рис 1А) , а затем тон исключение клеточных дублетов (рис 1В). Жизнеспособные клетки были определены путем исключения мертвых клеток с использованием LIVE / DEAD поправимо Yellow Амин мертвые клетки Stain (рис 1C). Анализ экспрессии CD45 проводили на живых коттеджных клеток (рис 1D), с последующим анализом экспрессии CD3 (рис 1E). Гамма - дельта 1 (GD1) или гамма - дельта - 2 (GD2) позитивные клетки были определены как субпопуляции CD3 + клеток , которые экспрессируют GD TCR (TCR Гамма - Дельта V1 или TCR гамма - дельта V2). Кроме того, было подтверждено , что только CD3 + Т - клетки экспрессируют TCR гамма - дельта поскольку закрытого типа CD3 - Т - клетки не экспрессируют TCR гамма - дельта - V1 или V2 - дельта. Фенотипическая анализ закрытого типа CD3 + клеток GD1 + выявленных (рис 1G), что большинство клеток GD1 (~ 74%) являются CD4 - CD8 -.
В настоящем исследовании, целесообразность с использованием endocervical пробы кисти к очищенным интраэпителиальной GD Т - клеток положительной магнитной селекции было показано (рисунок 2).
Рисунок 1: Гамма - дельта (GD) Т - клеток субпопуляции в эндоцервикальной слизистой анализировали с помощью проточной цитометрии. Следуя стратегии стробирования была использована для определенных групп населения эндоцервикальную Т - клеток: (A) эндоцервикса цитощеточка клетки закрытого типа в соответствии с размером и зернистость (FSC, бокового рассеяния вперед против SSC, боковой разброс). (Б) Клеточные дублеты были исключены путем установки электронных ворот в FSC-A (область) против SSC-W (ширина). (C) Живые клетки закрытого типа на популяции жизнеспособность красителя отрицательный. (D) Электронный затвор был установлен на живых, CD45 положительных клеток. (Е) Электронные ворота для CD45 позитивных клеток была установлена на CD3 положительных клеток(F) TCRVD1 (GD1) и выражение TCRVD2 (GD2) анализировали на CD3 + клеток. (G) , CD4 и CD8 экспрессии анализируют на GD1 + клеток. (Н) TCRVD1 и выражение TCRVD2 анализируют на закрытых CD3 отрицательных клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Выделение эндоцервикса гамма - дельта Т - клеток (GD) положительными магнитной сепарации. Частота эндоцервикса GD Т-клеток было подтверждено до и после положительного магнитной сепарации. Эндоценвикальных клетки сначала метят анти-TCR гамма - дельта - антителом , а затем с флуоресцентно окрашенных анти-гаптен микрогранулы-FITC. Процент TCR GD + Т-клеток было сообщено до и после того, как мagnetic разделение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оценка женских нижних половых путей уязвимости слизистой оболочки является важным компонентом клинических исследований, касающихся риска заражения и передачи ВИЧ-инфекции. Обычно FGT уязвимость по отношению к ВИЧ - инфекции оценивали путем измерения растворимых иммуномодуляторы в генитальных выделениях (цитокинов, хемокинов и антимикробных пептидов) 12, 13. Тем не менее, эти биомаркеры являются лишь ориентировочными вагинального воспаления, страдают от физиологических и патологических событий, и не всегда представляют прямой ущерб слизистой оболочке. Для того, чтобы улучшить наше понимание того, как слизистых оболочек факторы, которые повышают риск заражения и передачи ВИЧ, клеточные маркеры повреждения слизистых оболочек должны быть разработаны. GD внутриэпителиальное Т-клетки присутствуют в FGT, Интеркалят между эпителиальных клеток, и, как полагают, способствуют гомеостаза, а также к первой линии защиты от экологических проблем. GD Т-клетки имеют POTEN TiAL составлять дополнительный биомаркеров для оценки уязвимости слизистых оболочек в FGT.
В этом протоколе, показано, как подготовить интраэпителиальной лимфоциты человека из эндоцервикальной образца цитощеточка и легко освоен. Наиболее критическая точка этого процесса состоит в поддержании жизнеспособности клеток путем быстрой обработки образца, а также путем поддержания клеток на льду в течение всей процедуры. Выход клеток будет зависеть от методики сбора цитощеточка, обработки навыков, а также инфекционный статус (ВИЧ-инфекции или других вирусных инфекций, бактериальных или грибковых инфекций). Наша группа и другие опубликовали различные исследования , описывающие различные популяции лимфоцитов в человеческом генитального тракта 9, 14, 15. В наших руках, один эндоцервикальную образец цитощеточка может обеспечить 0,5-5 × 10 6 клеток с 80-90% жизнеспособность. По сравнению с традиционно используемым способом изоляциикласс = "Xref"> 14, 15, по нашему методу жизнеспособность клеток и выход увеличивается.
Этот метод обеспечивает мощный и эффективный инструмент для изучения эндоцервикальные внутриэпителиальное гамма-дельта Т-лимфоциты и может дать представление о других иммунных клеток, которые мигрируют в этот отсек во время инфекции и / или воспаления. В естественных условиях клеточного состава тканей слизистых оболочек часто бывает трудно исследовать комплексно и количественно. Такие методы, как иммуногистохимии и проточной цитометрии ограничены наличием антиген-специфических моноклональных антител и с помощью небольшого числа параллельных измерений, которые могут быть выполнены на каждой отдельной клетки. Традиционные с высокой пропускной способностью анализы, такие как экспрессии генов массивов, когда выполняются на целых тканях, предоставляют информацию о среднем уровне экспрессии генов, и может быть лишь косвенно коррелируют с количественными изменениями в клеточных субпопуляций.Эти ограничения становятся особенно трудно преодолеть при изучении групп меньшинств, или популяции клеток, что недостаток эксклюзивных маркеров. Комбинируя "флуоресценции активированного сортировки клеток" (FACS) и "одноклеточной ПЦР-анализа экспрессии генов" можно выполнить с высокой пропускной транскрипционный анализ интраэпителиальной Г.Д. Т-клеток в эндоцервикса. Этот метод использует потенциал современных цитометров сортировать отдельные единичные клетки с точностью и точностью, а также с использованием микроканалов технологий преформ с высокой чувствительностью мультиплексированный ПЦР из незначительных количеств мРНК, тем самым позволяя параллельный анализ экспрессии вплоть до 96 генов для каждой отдельной ячейки 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют коммерческую или иную ассоциацию , которая может привести к конфликту интересов (например, фармацевтической акционерной собственности, консультации, консультативный членство платы, соответствующие патенты, или финансирование исследований).
Acknowledgments
Мы благодарим участников исследования Майами WIHS за их готовность участвовать в этой работе. Данные в этой рукописи были собраны Межведомственной исследование ВИЧ Майами женщин (WIHS). Содержание данной публикации является исключительной ответственностью авторов и не отражают официальную точку зрения Национального института здоровья (NIH). Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний и женского инфекционного исследования Межведомственная ВИЧ (WIHS) [грант номер U01 AI103397], Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения [номер гранта P30AI073961], Национальный центр Выросшие трансляционные наук и Национальный институт по проблемам здоровья меньшинств и здравоохранения диспаритета, Национальный институт здравоохранения [номер гранта UL1TR000460 и 1KL2TR000461] и Национальный институт здоровья ребенка и развития человека, Национальный институт здравоохранения [номер гранта K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
