Abstract
kadın üreme yolları (FRT) mukozal bağışıklık sistemi ilk savunma hattı olarak hizmet vermektedir. Genital mukozanın daha iyi bilgi HIV dahil olmak üzere farklı patojenlerin patojenitesini anlamak için elzemdir. Gama ö (GD) T hücreleri 'alışılmamış' T hücrelerinin prototipi ve gamma ve delta zincirlerinden oluşan heterodimerik T hücre reseptörleri (TCR'ler) kendi ekspresyonu ile tanımlanan T hücrelerinin görece küçük alt grubunu temsil eder. Bu alfa-beta TCR ile tanımlanır klasik ve daha iyi bilinen CD4 + yardımcı T hücreleri ve CD8 + sitotoksik T hücreleri ayıran. GD T hücreleri genellikle dokuya özel dağılımını gösteren ve epitelde zenginleştirilmiştir. GD T hücreleri iltihap, tümör gözetimi, enfeksiyon hastalıkları ve otoimmünite immün yanıtları düzenlemişlerdir.
Burada, tekrarlanabilir izole ve insan endoservikal intraepitelyal GD T lenfositleri analiz etmek için bir yöntem mevcut. Biz haKadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) katılan kadınlardan kullanılan endoservikal cytobrush örnekleri ettik. vajinal mukoza hakaret var olduğu koşulları sırasında GD T hücreleri etkileşimleri hakkında bilgi vajinal microbicides.In ek geliştirilmesi dahil olmak üzere, mukozal açığı ele aldığı herhangi bir klinik çalışmada uygulanan olabilir, mukozal GD T hücre yanıtları hakkında bilgi vardır enfeksiyonlu hastalıkların tedavi edilmesi GD T hücre tabanlı immün terapinin uygulanması için potansiyeli.
Introduction
Biz intraepitelyal GD T hücrelerini değerlendirmek için endoservikal fırça örneklerini kullanarak metodolojisini geliştirdi. endoservikal kanal kolumnar epitel tek bir tabaka ile kaplı olduğu. İntraepitelyal lenfositler patojen mikropların 7, 8 karşılaşmak üzerine immün yanıtları hızla başlatabilir epitel tabakası içinde ikamet cephe lenfositler temsil etmektedir. endoservikal intraepitelyal bölmenin immünolojik olayların anlaşılması HIV de dahil olmak üzere hastalıklardan korunmak için etkili stratejiler tasarımı için önemlidir.
Önerilen yöntem, bundan başka, HIV enfeksiyonu ya da HIV enfeksiyonu riski taşıyan kadınlarda intraepitelyal GD T hücrelerinin rolünün anlaşılması için çalışmalar yeni toplanmış insan endoservikal örneklerinde hem de dondurulmuş endoservikal hücreler için uygulanabilir. Bu protokolün ana amacı endoservikal intraepitelyal bölmede yeni immünolojik olayları keşfetmek ve değerlendirme, içinHIV enfeksiyonu olan kadınlarda mukozal açığına bir göstergesi olarak e GD T hücresi tepkileri.
FGT bağışıklık etrafında bilgide önemli boşluklar başarıyla toplanması ve mukozal örnekleri işleme zorluk kısmen kaynaklanmaktadır. Ayrıca, karmaşık mukozal bağışıklık hücrelerinin heterojen ve birbirleri ile birbirine bağlılığı, bağışıklık sisteminin durumunu ve yeteneği yansıtan klinik olarak önemli ölçümler belirlenmesi için önemli zorluklar vardır. Biz daha olacak FRT dokunulmazlık yatan mekanizmaları belirlemek için kritik olabilir son derece mültipleksli, tek hücreli teknolojileri kullanılarak analiz edebilir yüksek derecede saflaştırılmış intraepitelyal GD T hücrelerini elde etmek için bir yöntem geliştirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma faaliyetleri Miami Kadın HIV Kurumlararası Çalışması (WIHS) ve AIDS Araştırma Miami Merkezi (SYAO) .Institutional İnceleme Kurulu (Üniversitesi Tıp Miami Miller Okulu) onayı öncesinde elde edilmiştir işbirliği ile Miami HIV Araştırma Birimi Üniversitesi'nde gerçekleşti işe alma ve herhangi bir değerlendirme veya çalışma ile ilgili prosedürlere.
1. Endoservikal Fırça Örnek Toplama
NOT: Katılımcılar eğitim MD ya da jinekolog ve cytobrush takarak spekulum muayenesinde altında yapıldı intraepitelyal lenfositler toplanması tarafından gerçekleştirilen bir vajinal muayene yapıldı.
- katılımcı özellikleri
- cinsel olarak aktif hamile değil ve kontraseptif ilaçlar veya rahim içi cihaz ile yaş, 18 ila 45 yaş arası kadınlar katılımcıları askere.
- Vajinal muayenede önce, sahip katılımcıların yeşil bir 10 ml kan beraberlik geçmesiperiferik kan mononükleer hücre (hücre) izolasyonu için üst heparin vacutainers. endoservikal intraepitelyal analiz 9 için bir kontrol olarak hizmet vermektedir.
- Endoservikal örneklerinin toplanması
- yağlama olmadan vajina içine uygun büyüklükte bir steril spekulum yerleştirin. spekulum ve mukus temizlemek için steril gazlı bez sokulmasını kolaylaştırmak için ılık su kullanın. spekulum pozisyonu os ve ektoservikste tam görünüm için izin verir.
- Ancak yakın sadece kıllar görünür olana kadar endoservikal kanala endoservikal fırça yerleştirin. 360 ° fırça saat yönünde çevirin. IMDM ortamı 5 ml ihtiva eden 15 mL'lik bir tüp içerisine fırça aktarın.
- Toplandıktan hemen sonra, buz üzerinde cytobrush içeren tüp yerleştirin. Toplanan intraepitelyal hücrelerinin yüksek canlılığını elde edilmesi için, 1 saat içinde ve laboratuar işleme cytobrush sağlar.
- 4 kısa (10 saniye) vuruş uygulayarak endoservikal cytobrush içeren vorteks tüp.
- X 250 g 10 dakika süre ile, cytobrush içeren tüp santrifüjleyin.
- Dikkatle tüpten cytobrush çıkarın (tüpün altındaki pelet rahatsız etmeyin) ve IMDM medya 1 ml ekleyin ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
- 50 ml tüp üstünde 100 mm hücre süzgecinden üzerinde cytobrush yerleştirin.
- 20 ml IMDM ile cytobrush yıkayın.
- 250 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj tüpü.
- Süpernatantı Durusu ve pelet hücreler 1 ml IMDM tekrar süspansiyon ve 2.3 tarif zaten yeniden askıya pelet ile birleştirir.
- Otomatik bir hücre sayacı 10 ile hücre sayımı veya tripan mavi boya, 10 uL hücre süspansiyonu 10 uL birleştirerek hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Yavaşça pipetlemeyin yukarı ve on kat aşağı hücreleri karıştırmak ve boya. Yük 10 uLİki hemositometre odaları birinin açıklığı içine karışımı. Beş ızgara alanlarında tüm hücreleri saymak. canlı ve cansız hücreler ayrı sayımı tutun. aşağıdaki formül kullanılarak hücre canlılığı belirlemek:% Canlı hücreler = cansız hücreler x 100 / toplam hücre sayısı hücreleri.
Aşağıdaki hesaplamalar kullanarak ml başına müteakip hücre konsantrasyonu (ve hücrelerin toplam sayısı) belirler. ml başına toplam Hücreler = toplam hücre sayılan x (seyreltme faktörü / sayılan kare sayısı) 10.000 hücre / ml x. - % 10 DMSO ve% 90 FBS ihtiva eden dondurma ortamı kullanılarak izole endoservikal hücreleri dondurun.
3. Akım Sitometri
- PBS% 1 sığır serum albümini içeren 100 ul FACS tampon maddesi içinde 1-3 X 10 5 endoservikal hücreler (yeniden askıya
- 1 uL / 10 Ekle 6 CANLI / DEAD fixable Sarı Ölü Hücre Leke kiti ve Tablo 1'de açıklanan konsantrasyonlarda yüzey belirteçleri için antikorlar.
- ışıktan korunan + 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- 350 xg 5 dakika için 1 ml FACS tampon ve hücreleri santrifüj tüpleri ekleme
- 300 uL% 1 paraformaldehid hücre pelet yeniden askıya.
- FACS tampon 100 ul boncuk bir damla ve örnek boyama için kullanılan antikorlara aynı konsantrasyonda eklenmesi ile boyanması için kullanılan boncuk ve antikorlar kullanılarak dengeleme kontrol hazırlayın.
- sitometre 405 nm, 488 nm ve 635 nm lazer ile donatılmış bir akış lekeli boncuk ve örnekleri edinin.
4. endoservikal Gamma Delta T Hücre İzolasyonu
- Manyetik boncuk ayırma
- Yeniden askıya Malzemeler ve Reaktifler Tablo başvurulan TCR gama delta microbead kitine dahil tampon 40 uL, 2.6 anlatılan endoservikal hücre pelet (≤10 7 toplam hücreleri).
- iki adımlı boyama protokolü için kit talimatları uygulayın: Birincisi, zekâanti-hapten mikroboncuklar-FITC H, anti-TCR y ö hapten antikoru ve ikinci
- 4-8 ° C'de 15 dakika inkübe edildikten sonra, 10 dakika boyunca 300 x g'de tampon ve santrifüj 1 mL eklenerek hücrelerin yıkayın. Tersine tüp süpernatant süzün ve bir kağıt parçası yardımı ile kuru dokunun.
- Resim tampon 500 uL hücre pelet yeniden askıya ve satıcının protokolüne göre, uygun manyetik ayırıcı yerleştirerek manyetik kolon hazırlanmıştır.
- kolona hücre süspansiyonu uygulayın ve geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak ve tampon uygun miktarda (500 uL) ile kolon 3x yıkayın. bir tampon üç kez, kolon rezervuar boş bir kez her zaman ekleyerek yıkama adımları uygulayın. toplam atık toplamak. Bu durum işaretlenmemiş, negatif hücre fraksiyonudur
- Sütun sütun üzerine tampon 1 ml manyetik ayırıcı ve pipet oluşturmak ve hemen manyetik etiket ile fraksiyonu floş kaldırsıkıca kolonu ile birlikte piston uygulayarak hücreleri ed.
NOT: manyetik olarak etiketlenmiş anti-hapten mikroboncuklar floresan boya FITC ile konjuge beri İzole gama delta T hücresi zaten floresan akış sitometri analizi için boyandı.
- hücre sıralama
- canlılığı kalıbı ve antikor paneli ile hücre sıralama, etiket endoservikal hücreler için bölüm 3'de tarif edildiği gibi.
- Canlı, CD45 +, CD3 + ve gama delta pozitif hücreler üzerinde elektronik kapıları kurmak ve hücre sıralama gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Son zamanlarda, endoservikal intraepitelyal GD T hücrelerini analiz ve HIV bulaşmış kadınların 9, 11 yılında endoservikal gama delta T hücrelerinin kaybı bildiren ilk sendin. Burada, biz izole etmek ve endoservikal gama delta T hücrelerinin alt kümesini analiz protokol açıklar. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, GD T hücreleri hali hazırda insan endoservikal hücre örneklerinde tespit edilebilir.
Endoservikal y ö V1 (GD1) T hücrelerinin benzersiz bir popülasyon multiparametar sitometri tabanlı immünofenotiplemeyi (Şekil 1) akış kullanılarak tarif edildi. HIV bulaşmamış endoservikal numune için temsili bir geçit stratejisi, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Analiz t ardından İleri / Yan dağılım (Şekil 1A) elektronik kapı ayarlayarak toplam endoservikal hücreler üzerinde yapıldıHücre çiftler (Şekil 1B) o dışlama. Canlı hücreler CANLI / DEAD tamir edilebilir Sarı Amin Ölü Hücre Leke (Şekil 1C) kullanarak ölü hücrelerden dışlama yoluyla belirlendi. CD45 ekspresyonunun analizi CD3 ekspresyonunun analizi (Şekil 1 E) ve ardından canlı kapı hücreleri (Şekil 1D) üzerinde gerçekleştirilmiştir. Gama delta 1 (GD1) veya gamma delta 2 (GD2) pozitif hücreler GD TCR (TCR gama delta V1 veya TCR gama delta V2) ifade eden CD3 + hücrelerin bir alt olarak tanımlandı. Ayrıca, sadece CD3 + T hücreleri kapılı CD3 beri TCR gama delta ifade teyit edilmiştir - T hücreleri TCR gama delta V1 veya delta V2 ifade etmezler. CD8 - ortaya kapılı CD3 + GD1 + hücreler (Şekil 1G) fenotipik analizi, GD1 hücrelerinin çoğunluğu (~% 74) CD4 vardır -.
kullanan endoce bugünkü çalışmada, fizibilitePozitif bir manyetik seçim ile saflaştırılmış intraepitelyal GD T hücrelerine rvical fırçası örnekleri (Şekil 2) gösterilmiştir.
Şekil 1: akış sitometrisi ile analiz endoservikal mukozada Gama ö (GD) T hücresi alt popülasyonu. Aşağıdaki yolluk strateji tespit endoservikal T hücre popülasyonları için kullanılmıştır: (A) endoservikal cytobrush hücreleri boyutu ve ayrıntı (SSC vs FSC, ileri yan dağılım, yan dağılım) göre kapılı bulundu. (B) Hücre çiftlerin vs FSC-A elektronik kapıları (bölge) ayarlayarak dışı bırakıldı SSC-W (genişlik). (C) Canlı hücreler canlılık boya-negatif nüfus Geçitli. (D) Elektronik kapı canlı CD45 pozitif hücreler üzerinde kurulmuştur. CD45 pozitif hücreler (E) elektronik kapı CD3 pozitif hücreleri üzerinde ayarlandı(F) TCRVD1 (GD1) ve TCRVD2 (GD2) ifadesi, CD3 + hücreleri üzerinde analiz edilmiştir. (G) CD4 ve CD8 sentezleme GD1 + hücreleri üzerinde analiz edilmiştir. (H) TCRVD1 ve TCRVD2 sentezleme kapı CD3 negatif hücrelerin üzerinde analiz edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Pozitif manyetik ayırma ile endoservikal y delta T hücreleri (GD) izolasyonu. endoservikal GD T hücrelerinin sıklığı öncesi ve pozitif manyetik ayırma sonra doğrulandı. Endoservikal hücreler önce bir anti-TCR y ö antikor ile etiketlenir ve daha sonra floresan anti-hapten mikroboncuklar-FITC ile boyandı. TCR GD + T hücrelerinin yüzdesi önce ve m sonra bildirilmiştiragnetic ayırma. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kadın alt genital sistem mukoza açığına değerlendirilmesi, HIV edinimi ve bulaşma riskini ele klinik çalışmaların önemli bir bileşenidir. Tipik haliyle, HIV enfeksiyonuna FGT güvenlik genital salgıları (sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptitler) 12, 13 içinde çözünür immün modülatörler ölçerek değerlendirilir. Ancak, bu biyobelirteçler, vajinal iltihap sadece göstergesidir fizyolojik ve patolojik olaylardan etkilenir ve her zaman doğrudan mukozal hasarı temsil etmemektedir. mukozal faktörler edinme ve HIV bulaştırma riskini artırır nasıl anlayışımızı geliştirmek amacıyla, mukozal hasar hücresel belirteçleri geliştirilmesi gerekmektedir. GD intraepitelyal T hücreleri interkalat epitel hücreleri arasındaki, FGT mevcut, ve çevresel zorluklara karşı ilk savunma hattı yanı sıra homeostazı katkıda düşünülmektedir. GD T hücreleri potansiyeli taşıdığı FGT mukozal açığı değerlendirmek için ek bir biyobelirteci teşkil TIAL.
Bu protokol, insan endoservikal cytobrush örnekten intraepitelyal lenfositler hazırlamak ve kolayca hakim nasıl gösterilir. Bu işlemin en önemli noktası, numunenin hızlı işleme ile hem de tüm prosedür sırasında buz üzerinde hücreleri tutarak hücre canlılığını muhafaza etmektir. hücre verimi becerisi hem de enfeksiyon durumu (HIV enfeksiyonunun ya da diğer viral enfeksiyonlar, bakteriyel veya mantar enfeksiyonları) taşıma, cytobrush toplama tekniğine bağlı olacaktır. Grubumuz ve diğerleri insan genital sistem 9, 14, 15 farklı lenfosit toplulukları tanımlayan çeşitli çalışmalar yayınlanmıştır. Bizim ellerde, bir endoservikal cytobrush numune% 80-90 canlılığı ile 0.5-5 x 10 6 hücre sağlayabilir. Yaygın olarak kullanılan yalıtım yöntemi ile karşılaştırıldığındasınıf canlılığı ve hücre verimi artar bizim yöntemiyle = "xref"> 14, 15,.
Bu yöntem, bir güçlü ve endoservikal intraepitelyal y delta T lenfositlerini çalışma ve enfeksiyon ve / veya iltihap sırasında bu bölmeye göç diğer bağışıklık hücreleri fikir verebilir etkin bir araç içerir. Mukozal dokulara in vivo hücre bileşimin kapsamlı ve niceliksel bir şekilde araştırmak için çoğu zaman zordur. Bu ve immünohistokimya gibi teknikler sitometri antijen spesifik monoklonal antikorların mevcudiyeti ile ve her bir hücrede gerçekleştirilebilir paralel ölçümler az sayıda sınırlı akış. Bütün dokular üzerinde yapılan bu tür gen ifadesi dizileri gibi geleneksel yüksek verimlilik analizleri, ortalama gen ekspresyon seviyesi hakkında bilgi vermek ve sadece dolaylı olarak hücresel subpopulations nicel değişikliklere ilişkilendirilebilir.Bu sınırlamalar, azınlık nüfusu, ya da özel belirteçler eksikliği hücre popülasyonunu okuyan zaman üstesinden gelmek için özellikle zor hale gelir. "Floresan hücre sıralama aktive" (FACS) ve "tek hücreli PCR gen ifade analizi" birleştirerek tek endoserviksteki intraepitelyal GD T hücrelerinin yüksek verimli transkripsiyon analiz gerçekleştirebilirsiniz. Bu yöntem, böylece 96 adete kadar genlerin ifadesi paralel analizini sağlayan mRNA dakika miktarlarından yüksek hassasiyet çoğaltılmış çok katlı PCR ürününün için mikroakışkan teknolojilerin kullanımı ile birlikte, doğruluk ve hassasiyet ile bireysel tek hücreleri sıralamak için, modern akış sitometrelerinde kapasitesini patlatır her bir hücre 16 için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bir çıkar çatışması doğurabilecek ticari veya başka ilişki yoktur (örneğin, ilaç hisse senedi sahipliği, danışmanlık, danışma kurulu üyeliği, ilgili patentler ya da araştırma fonu).
Acknowledgments
Biz bu çalışmalarına katılmak için istekli olduklarını Miami WIHS çalışma katılımcılara teşekkür ederiz. Bu yazıda veriler Miami Kadın Kurumlararası HIV Çalışması (WIHS) ile toplanmıştır. Bu yayının içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu çalışma İlerletme Allerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve Kadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) [hibe sayısı U01 AI103397], Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı P30AI073961] National Institutes, Ulusal Merkezi tarafından desteklenen Sağlık translasyonel Bilimleri ve Azınlık Sağlığı ve Sağlık Farklılıkların Ulusal Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı UL1TR000460 ve 1KL2TR000461] Ulusal Enstitüsü, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi, Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü [hibe sayısı K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
