Summary
이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.
Abstract
여기에서는 시험 관내 폐 세포 배양 여러 컴포넌트 세포 배양 하이드로 겔을 형성하기위한 방법을 제시한다. 돼지, 쥐, 또는 마우스에서 블록의 폐 조직 엔 건강을 시작으로, 조직은 관류 및 세포 파편을 제거하기 위해 후속 화학 세제에 잠겨있다. 처리 전후의 조직 학적 비교는 이중 가닥 DNA 및 알파 갈 락토시다 제 염색을 95 % 이상 제거하는 것을 확인 세포 파편의 대부분이 제거되어 나왔다. 탈세 포화 후, 조직을 동결 건조 후 분말로 cryomilled이다. 매트릭스 분말 산성 펩신 소화 용액에 48 시간 동안 절단 한 후, 프리 겔 용액을 형성하기 위해 중화된다. 프레 겔 용액의 겔화 37 ° C에서 배양하여 유도 할 수 있고, 곧바로 다음 중화 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 코팅은 C에 대한 비 처리 판의 프리 겔 용액을 사용하여 형성 될 수있다엘 첨부. 세포는 세포 골격을 통해 이전 또는 코팅에 도금 할 수있는 형성된 겔의 표면 상에 도금 된 3 차원 배양을 달성하기 위해 자기 조립 전에 프레 겔에 현탁 될 수있다. 전략에 변화가 겔화 온도, 강도, 또는 단백질 단편의 크기에 영향을 미칠 수 있습니다 발표했다. 하이드로 겔 형성 외에도 하이드로 겔 강성 genipin을 사용하여 증가 될 수있다.
Protocol
| 해결책 | 살균 필터 | 지도 |
| DiH 2 O | 예 | DiH 2 O; 무균 여과 |
| 0.1 % 트리톤 X-100 솔루션 | 예 | 흄 후드에서 DiH 2 O 100 ㎖에 100 μL 트리톤-X 100 솔루션을 추가하고 용해 될 때까지 교반; 살균 필터. |
| 2 % 데 옥시 콜레이트 솔루션 | 예 | 흄 후드에서 2g 나트륨 데 옥시 콜레이트 솔루션을 추가 100 ㎖ DiH 2 O 용해 될 때까지 교반 당; 살균 필터 |
| 1 M의 NaCl | 예 | DiH 2 O 1 L에 58.44 g의 NaCl을 추가; 용해 될 때까지 교반; 살균 필터 |
| DNase의 솔루션 | 예 | 12,000 추가단위 DNase의 1 L DiH 2 O에; 0.156 g 황산 추가 (무수물), 및 0.222 g의 CaCl2를; 용해 될 때까지 교반; 살균 필터 |
| PBS | 예 | , 27.2 g 나 2 HPO 4 · 7H 2 O (이염 수화물)를 결합 80g의 NaCl, 10 L DiH 2 O와 2g의 KCl; 용해 될 때까지 교반; 7.4으로 산도를 조정; 살균 필터 |
표 1 : 조직 탈세 포화에 필요한 솔루션. 탈세 포화 프로세스에 대한 위의 솔루션을합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. 약 2.5 L은 한 돼지의 폐를 위해 필요합니다.
1. 하이드로 겔 형성
- (참조 9,10에서 적응) 돼지 폐 탈세 포화
- 마음과 vasc으로, 도축장에서, 블록 엔 정상 돼지의 폐를 구합니다ulature 그대로.
- 마음에 최대한 가까운 혈관을 절단, 마음을 멀리 해부 조직 가위 또는 메스를 사용, 나머지 혈관이 관류에 대한 이후 단계에서 사용됩니다.
- 조심스럽게 메스 나 가위를 사용하여 기관, 기관지 및 혈관 주위의 결합 조직을 멀리 해부하다.
참고 : 탈세 포화 과정의 효과를 방해 할 수 큰 상처 또는 천공 늑막 통해 무기폐 또는 혈관 폐색 많은 양의없이 폐를 선택하여 절차의 나머지에 사용할 최적의 폐를 결정합니다. - (처분 할 수있다 심장, 결합 조직 및 제거 된 폐의 로브) 가능한 한 기관에 부착만큼 기관지를 떠나 최적 폐를 버려야. 하나의 폐는 기관지와 혈관에 부착 된 남아가 있어야합니다.
참고 : 원하는 경우 조직학에 대한 섹션을 유지. 9 - 페이지에 클램프 또는 봉합와 연결이 끊어진 기관지를 닫습니다하지 못하 초과 역류.
- (표 1) 필요할 때까지 4 ° C에서 탈세 포화 솔루션과 냉장을 준비합니다.
- 폐동맥 맞게 폐동맥 및 기관 모두를 통해 폐 조직을 탈 이온수로 3 회 관류하는 유관 핸드 펌프를 사용. 제마다 혈관을 관류. 혈관에 약 1 L 각 관류에 대한 기관에 1.5 L로 시작하지만, 세포 파편 제거로 더 많은 액체가 시스템을 통해 관류 할 수 있습니다.
- 트리톤 X-100 용액을 모두 혈관과 기관을 관류.
- 4 ℃에서 24 시간 동안 트리톤 X-100 용액에 폐 조직을 잠수함.
- DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다.
- 옥시 콜레이트 솔루션을 모두 혈관과 기관을 관류.
- 4 ℃에서 24 시간 동안 옥시 콜레이트의 조직 섹션 잠수함.
- DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다.
- NaCl 용액으로 모두 혈관과 기관을 관류.
- 4 ℃에서 1 시간 동안 여과 NaCl 용액에 조직을 잠수함.
- DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다.
- DNase의 솔루션을 모두 혈관과 기관을 관류.
- 4 ℃에서 1 시간 동안 여과 DNase의 솔루션에서 조직을 잠수함.
- 혈관 및 기관 PBS로 5 회를 모두 관류.
- 눈에 띄는 연골 조직, 기관 만 호흡 영역 (주로 주변 지역)을두고기도를 수행에서 (주로 폐문과 폐의 중간 부분 주위에 있음) 직경의 모든 세관 2mm 이상을 멀리 해부하다.
- 1 인치 절 이하에 조직을 해부하다. 조직의 방향은이 단계에서 문제가되지 않습니다.
- 50 ML 원뿔 튜브를 초과하는 액체와 장소 조직을 따르십시오. -80 ° C에서 조직을 동결.
참고 : 조직학 세포 및 세포 debri의 제거를 보장하는 섹션을 유지S 원한다면. 우리는 H & E를 사용, α - 갈 락토시다 아제, picogreen, 하이드 록시 프롤린, 닌히 드린, 알 시안 블루, SDS-PAGE 및 질량 분석의 특징입니다. 9
- 폐 처리
- decellularized 폐 조직을 포함하는 냉동 튜브의 뚜껑을 제거합니다.
- 튜브 입구에 필터 종이를 놓고 고무 밴드로 고정합니다.
참고 : 튜브 및 내용은 여전히 고정 될 때까지 그렇지 않으면 -80 ° C에 배치 동결해야합니다. - 모든 초과 액체 제조 업체의 지시에 따라 동결 건조기를 사용하여, 사라 될 때까지 조직을 동결 건조. 밀 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 근로 조건에 절연 및 내부 부품의 온도를 냉장고 밀에 액체 질소를 추가 시작하기 전에.
- 밀 튜브에서 자기 밀 줄을 제거하고 바닥을 충당하기 위해 조직을 추가합니다.
- 밀 줄을 교체하고 느슨하게 포장 조직을 추가합니다. 밀 바는 여전히 자유롭게 이동해야합니다.
- 밀 튜브와 괞 찮아을 닫습니다냉동 공장에서 가전.
- 최대 적재 선에 액체 질소를 입력합니다.
- 냉동기 밀 미분말에 모든 조직 (약 5 분 ~ 600 분의 충돌 속도 -1)와, 스테인레스 스틸 충격기 폴리 카보네이트 실린더뿐만 아니라 제조자 지시에 따라 냉동기 밀을 사용하여 스테인리스 단부 플러그이다. 사용 전까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 마이크로 다공성 겔 형성 (8 ㎎ / ㎖) (참조 각색 9,11)
- 1 % 추가 (W / V)를 decellularized 분말 및 0.1 % (w / v)의 0.01 M 염산을 펩신, 일정한 교반하에 들면, 실온에서, (액체의 최상위에 흐름을 볼 수 있어야한다) 48 시간.
주 : 분말 정적 분말이 튜브 벽면에 과잉 세척 할 기회를 제공 한 후이므로 염산을 추가 충전된다. - 48 시간 동안 소화 한 후, 5 분 동안 얼음에 솔루션 및 시약을 배치합니다.
- 냉장 10 % 사용 (v / v)의 0.1 M NaOH를,D 11.11 % (v / v)의 10 배 PBS는 7.4의 생리적 산도에 소화 단백질 용액을 가지고 (농도를 1 배 전체 솔루션을 가지고).
참고 :이 솔루션은 이제 일주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 원하는 경우 유변학 (9)를 사용하여 겔화 반응 속도를 수행합니다.
- 1 % 추가 (W / V)를 decellularized 분말 및 0.1 % (w / v)의 0.01 M 염산을 펩신, 일정한 교반하에 들면, 실온에서, (액체의 최상위에 흐름을 볼 수 있어야한다) 48 시간.
2. 기계적 강도를 개선하기 위해 하이드로 겔 가교
- 1 %, 0.1 % 및 V genipin 가교 용액 / w 0.01 % 용액을 10 % DMSO에 genipin 분말의 필요량을 용해시켜 제조 하였다.
- 1 시간 동안이 용액을 15 분마다 와동.
- 이전 부분 1.3.4에서 조립 된 ECM 하이드로 겔 (96 웰 플레이트의 각 웰에 100 μL)를 커버하는 genipin 솔루션을 추가합니다.
- 37 ° C에서 24 시간 동안 가교 각 ECM 하이드로 겔을 둡니다.
- 세정액이 더 이상 청색까지 ECM 하이드로 겔을 PBS로 3 회 씻어 없다. 가교 하이드로 겔은 더 특성화 및 CE에 대한 준비가 될 것입니다LL 문화 연구.
미세 다공성 젤 3. 세포 배양
- 이차원 코팅
- 1.3.3에서 용액을 사용하여 96 웰 비 - 처리 된 조직 배양 플레이트의 각 웰에 프리 겔 용액 20 μL를 추가한다.
- 4 ° C에서 냉장 하룻밤 단백질 흡착 플레이트 할 수 있습니다.
- 기음 프레 겔 용액 PBS로 씻어.
- 통로 세포 (9).
- 우물에 10,000 세포 / cm 2를 추가합니다.
- 물론 당 100 μL 미디어를 높이고 37 ° C에서 품어.
- 삼차원 세포 배양 9
- 1.3.3에서 용액을 사용하여, 프리 겔 용액을 100 세포 / ml의 농도로 세포 펠렛을 재현 탁.
- 신속 3D 세포 배양 용 ~ 500 μm의 두께 하이드로 겔을 형성하기 위해, 96 웰 플레이트의 각 웰에 프레 겔 세포 현탁액 16 μL 분주.
- 30, 37 ° C에서 품어젤 분 형성한다.
- 형성된 하이드로 겔의 상단에 미디어 100 μl를 추가하고 37 ° C에서 품어.
- 가변 강성 젤에 세 차원 세포 배양
- 96 웰 플레이트의 각 웰에 피펫 1.3.3에서 프리 겔 용액을 100 μL 용액을 사용.
- 겔을 형성하도록 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
참고 : 여기에 사용할 수있는 2 부에서 단계를 상호 결합. - 통로 세포 (9).
- 우물에 10,000 세포 / cm 2를 추가합니다.
- 물론 당 100 μL 미디어를 높이고 37 ° C에서 품어.
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Representative Results
이 방법을 사용하여, 우리는 정상 돼지, 래트, 마우스 폐 (도 1)로부터의 하이드로 겔을 제조 하였다. 폐 처리는 각각 5 ㎎, 40 ㎎, 및 ECM 분말 10g을 추정 제공한다. 공정의 개요는도 2에 도시되어있다. 과정에서 주요 시각화은 다음과 같습니다 : 데 옥시 콜레이트 세척 후 폐의 흰색 외관; 프레 겔을 형성 한 후에, 용액을 은폐되어야하고 4 ℃에서 저장하는 경우, 용액을 균질 개월 표시한다. 우리는 과정 (표 2)를 통해 오류의 원인을 파악하는 데 도움이되는 기본적인 문제 해결 테이블을 포함하고있다. 겔화 후, 수화겔 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 저장된다. 레올 로지 시험 겔의 90 % 이상은 37 ° C (도 3)에 도달 한 후 제 분에 발생하는 것을 확인한다. 형성된 하이드로 겔은 긴 PBS의 기간 있지만, 세포 부착 및 proliferatio에 대한 안정여기서 n은 (그림 4) 변경 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 돼지의 폐를 위해 작성되는 동안, 공간 제한은 돼지의 폐를 decellularizing 때 하나의 폐를 사용하여 우리를 제한 할 수 있습니다. 우리는 다른 종 모두 폐를 decellularize하기 위해 약간의 수정과 같은 방법을 사용하고 있습니다. 쥐를 들어, 폐는 그대로 유지 될 수 있고 심장 부착되지만 결합 조직 여전히 메스 나 가위 제거되어야한다. 우리는 그대로 쥐와 마우스에 대한 부착 된 마음을 유지하고 우심실 대신 폐동맥을 통해 솔루션을 관류. 기관 관류는 여전히 동일하다; 그러나, 정맥은 작은 종에 대한 접근의 용이성을 위해 기관에서 봉합 될 수있다.
우리는 여러 세포 유형, 인간 중간 엽 줄기 세포, 구 마우스 중간 엽 줄기 세포, 인간 상피 세포주 (A549s) 인간의 기본 미세 혈관 엔도 추가 한상피 세포 (HpuVECs) 및 내부와 폐 ECM 하이드로 겔의 표면 상에 인간 제대 정맥 상피 세포 (HUVEC를). 우리는 형성 젤의 이종 성격에 관한 문제가 발생하지 않았습니다. 우리의 이전 연구는 돼지의 하이드로 겔의 α-갈 락토시다 아제의 상당한 감소를 보여 주었다. 9 프리 겔 용액은 세포 부착을 향상시키기 위해, 4 ℃에서 코팅으로서 사용될 수있다. ECM 폐 코팅 조직 배양 플레이트에 첨가하면 프레 겔 용액 HpuVEC 부착 및 증식을 향상시킨다. 코팅 우물은 크게 비 처리 된 우물 (그림 5)와 비교하여 세포 부착을 향상을 보여줍니다.
genipin 추가 하이드로 겔 가교 결합을 증가시킨다. 전자 재료의 열화를 감소하면서 증가 된 가교 결합은 더 중요한 생리 강성을 제공 할 수있다. 분해의 감소, 시험 관내 비록 마이너 인해 증가 간의 결합이 발생할 수있다단백질과 세포의 ECM 리모델링에 따라서 더 많은 저항. 우리는 가교 하이드로 겔의 기계적 성질을 측정하기위한 유량계의 주파수 스위프를 사용 하였다. 하이드로 겔 강성 직접 중앙값과 가장 관련성이 높은 농도 인 0.01 %로 농도 genipin 상관 관계가 확인되었다 (도 6, 기본 조직 미도시). MTT 분석법은 가교 결합 된 하이드로 겔에 세포 증식 및 생존을 정량화 하였다. 세포 증식은 가교 하이드로 겔 (그림 7)에 더 높다. 이것은 다른 사람이 증가 강성에 증가 된 세포 증식을 지원합니다. 시간이나 온도 가교 (12) 변화시키는 genipin 다른 가교도 발생할 수 있습니다.
그림 1 : 우리는 폐의 이미지 Decellularized하게한다. decellulari 후 (A) 마우스 폐에서 사진zation 심장 제거 트리톤 X-100, 떨어진 후에 세정 (B) 쥐 (C) 돼지, 초기 린스 전에; 이들은 각각 ~ 5 ㎎, 40 ㎎, 폐 ECM의 10g을 얻었다. 캐 뉼러와 탈세 포화 후 (D) 마우스 폐 그대로 마음은 여전히 제자리에 봉합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 방법의 개요. 이 폐에서 하이드로 겔을 생산하는 방법의 개요입니다. 블록 돼지 폐 탈세 포화가 ECM 단백질로 구성되어 불투명 흰색 또는 반투명 조직을 떠나는 발생 욕실로 시작. 이어서 잔여 물을 제거하고, 산 분해를 최적화하는 표면적을 증가 후 조직을 용해한다. 교류의 중화ID와 생리 학적 수준으로 소금을 증가 겔화에 대한 준비가 프레 겔 솔루션을 만듭니다. 이 솔루션은 37 ° C에서 하이드로 겔을 형성하면 특성은 겔 레오 미터 및 주사 전자 현미경으로 이루어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
온도 램핑에서 겔화에 대한 대표 유변학 데이터 : 그림 3. 초기 진폭 스위프 선형 점탄성 범위를 결정하면, 온도 경사가 겔화 반응 속도를 결정하는 데 사용되었다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시됩니다. N = 4.
그림 4 : 장기 안정성. 메신저실온에서 6 개월 이상 PBS에 저장 돼지 폐 ECM 하이드로 겔의 나이.
그림 5 : HpuVECs의 대사 분석. 비 처리 된 조직 배양 플레이트 상에 성장 차 인간 미세 혈관 내피 세포 (HpuVECs)에서 MTT 증식 데이터. 1.3.3에서 프레 겔 용액 플레이트 밤새 냉장 프리 겔 폐 ECM 코팅 된 플레이트를 형성하는 세정에 첨가 하였다. HpuVECs 비 코팅에 비해 ECM 코팅 된 플레이트에 MTT 높은 활성을 보였다. * p <0.05 대조군과 비교 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 그룹 당 n = 3에게 있습니다.
그림 6 : 향상된 가교에 대한 유변학 적 데이터. genipin 가교 용 레오 메타 데이터입니다. GENI의 농도 증가와 강성 증가1 % genipin에서 고원에 핀. 데이터는 genipin와 가교의 배 증가를 보여 정규화된다.
그림 7; Genipin 가교 젤에 세포 증식. genipin 가교 하이드로 겔에 A549s에 대한 표준화 MTT 데이터. 증가 된 세포 증식이 증가 강성 본. P <0.05 제어에 비해. 데이터는 평균 ± 표준 편차입니다. 그룹 당 n = 3.
| 문제 | 발행물 | 해결 |
| 탈세 포화 후 유지 레드 / 핑크 색상 | 비효율적 탈세 포화 | 새로운 폐와 함께 시작 |
| 불완전 탈세 포화의 영역을 제거 </ TD> | ||
| 혈관 폐색 | 새로운 폐와 함께 시작 | |
| 불완전 탈세 포화의 영역을 제거 | ||
| 중요한 세포 파편은 유지 | 비효율적 탈세 포화 | 새로운 폐와 함께 시작 |
| 불완전 탈세 포화의 영역을 제거 | ||
| 혈관 폐색 | 새로운 폐와 함께 시작 | |
| 불완전 탈세 포화의 영역을 제거 | ||
| 무기폐 | 새로운 폐와 함께 시작 | |
| 불완전 탈세 포화의 영역을 제거 | ||
| 조직 학적 샘플에서 발견 된 세포막의 파괴 | 재관류 동안 혈관의 이상 가압 | 관류 압력을 감소세제의 |
| 큰 입자는 분쇄 후 유지 | 튜브에 너무 많은 동결 건조 재료 | 실린더 연삭에서 재료를 감소 |
| 충분히 분쇄되지 않음 | 밀링 시간이 증가 | |
| 겔화되지 프레 겔 솔루션 | 솔루션 pH가 너무 높은 | 확인 pH가 7.4 |
| 신선한 가루와 프레 겔 용액 시작 | ||
| 솔루션 pH가 너무 낮 | 확인 pH가 7.4 | |
| 신선한 가루와 프레 겔 용액 시작 | ||
| 소화를 통해 ECM | 신선한 가루와 프레 겔 용액 시작 | |
| 세포는 생존하지 않습니다 | 염산 소화 한 후 도입 된 미생물 | 신선한 분말을 다시 시작하고 무균 여과 솔루션을 사용 |
| pH가 오FF | 다시 프리 겔 용액을 시작할 | |
| 확인 pH가 7.4 | ||
| 세포는 버스트 | 프레 겔 용액에 소금 콘텐츠를 수정 |
표 2 : 문제 해결 안내서는 잠재적 인 오류의 소스를 식별한다.
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Discussion
생물학 적분 측면 중 하나는 특정한 작업을 수행하는 계층 적 구조로 분자의 자기 조직이다. 연구실에서 (13)는, 자기 조립은 염 농도, 산도, 소화 기간 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 도시 된 바와 같이, 자기 조직화 하이드로 폼 가용화 된 단백질은 생리 학적 온도로 돌아 오면. 형성된 하이드로 겔은 생체 외에서 세포의 부착과 증식을 촉진 할 수있다.
ECM에서 생물 물리학 신호를 세포 반응 고분자를 사용하여 연구 할 수 없습니다. 생물 물리학 신호 조직 특이 적 세포 반응이 다른 조직을 이용하여 조사 할 수 없다. 재생 연구자 및 임상 decellularized 비계를 사용하여 조직 재생 및 상처 치유를 향상 생각합니다. 만성 폐 질환 환자는 장기 가용성을 증가시키고 면역 원성을 감소시키는 치료 개선이 필요합니다. 장기 특정 셀 ECM 상호 작용해야합니다또한 장기 생물학을 연구.
폐 세포에 대한 세포 지지체로 사용 ECM은 일관된 결과를 보여 주었다. 질병 모델에서 폐 조각을 사용하여 14, 15은 질병 갱신을, 말초 폐에 (17, 18)을 발견 (16)의 줄기 또는 전구 세포를 장려하고 기형 종의 형성을 방지하기 위해 특별한 틈새 시장을 필요로한다. 전달 수단으로 조직 특이 ECM을 사용하여 선조 세포의 재생 효과를 향상시킬 수있다. 전자 재료 하이드로 겔은 세포 외 기질에 세포 반응을 평가하기보다 해당 환경을 설정합니다.
그것은 셀룰러 시그널링에 관한 연구로하는 큰 몸체의 강성 찾고 존재한다. genipin 가교의 우리의 방법은 세포 강성 신호뿐만 아니라 세포 ECM 구성 요소 상호 작용 할 수 있습니다. 하이드로 겔 강성 ECM 단백질 량의 비율에 의해 조작 될 수 있지만, genipin의 사용은 ECM 콘텐츠 다소 독립적 겔 강성 변화를 허용한다. 세대를 조정epin 농도가 가장 밀접하게 자연의 폐 조직 (6)를 닮은 기계적 특성의 정확한 튜닝을 허용 할 수있다. genipin 데이터는 본 연구에서 말초 폐에서 하이드로 겔을 사용하여 얻은에서 (5 파 75 파에) 15 배 증가가 관찰되었다. 말초 폐 하이드로 겔을 1 % genipin 및 추가 추정 (전체 폐 하이드로 0.01 %를 첨가하여, 우리는 대략 주변 폐 조직의 강성 (데이터 미도시) 달성 할 수있는 동일한 방법을 사용 decellularized 된 생체 검사 정상 쥐의 폐 조직의 유변학 적 데이터에 기초 ). 폐 실질로 이루어진 주변 폐 ECM을 사용하면 우리의 이전에 게시 된 전체 폐 ECM 하이드로 겔 결과 7에 비해 상당히 부드러운 젤을했다. 따라서 추가로 극적으로 강성에 영향을 미칠 수 decellularize하기 위해 폐 조직의 특정 지역을 선택 genipin합니다.
일반적으로 perfusi에 사용되는 단계를 추가로 포함 할 수있다이 방법을 개선 할 수있는 기회가있다전체 폐 조직의 탈세 포화에. 이 방법은 정상 폐 조직에서 사용되었으며 병에 걸린 폐의 탈세 포화에 대한 수정을 요구할 수있다. 우리는 아직 특정 질병 상태에서이 과정을 조사하지 않았습니다. 우리는 도살장에서 하룻밤 얼음에 제공 우리의 폐를 얻을 수 있습니다. 이 방법에 의한 무기폐 또는 혈관 폐색에 대한 우리의 프로세스의 효과를 제한 할 수 있습니다; 그러나, 우리는 거의 철저하게 decellularized되지 않은 폐의 영역을 제거 할 필요가 없습니다. 신선한 폐 조직을 얻을 때, 우리는 조직 처리의 모든 일시 정지를 방지하기 위해 폐를 얻기 전에 필요한 모든 솔루션을 추천 할 것입니다. 이전 연구는 생산 행렬에 최종 멸균 단계로 초산을 사용하여 19 잠재적으로 decellularized 조직의 proregenerative 효과를 개선, 면역 세포 침투에 회생 M1의 대식 세포 표현형을 일으키는 발견했다. 다른 연구는 프로세스를 완료하기 위해 다른 세제를 사용 들어갔하지만 그 appea했다r은 탈세 포화에 궁극적으로 동일한 영향을 실험실 특정 환경 설정을 할 수 있습니다. 탈세 포화 과정 및 분해 단계는 연구자의 특정 애플리케이션에 따라 최적화 될 수있다. 예를 들어, 겔 소화시 또는 중화 방법을 변경하는 것은, 단백질 조성, 기계적 성질, 또는 겔화 반응 속도를 변경할 수있다.
여기서 설명하는 방법에 대한 대안이 원하는 실험 결과에 따라 복잡성의 수준에 따라 다를 수 있습니다. 목표는 가능한 한 그대로 기저막 유지 인 경우 예를 들어, 제한된 압력 제어 관류 펌프 장벽의 손상을 줄일 수있다. 하나의 큰 종 그대로 모두 폐를 계속 사용할 수있는 실험실 설정이 있다면 또한,의 탈세 포화 프로세스는 효능을 향상시킬 수 있습니다. 반대로, 박격포와 유 봉 기술을 연마 손은 cryomill이없는 실험실의 동결 건조 된 조직에 적용될 수있다. 우리는 손 grindin을 기대분해 시간이 경우 변경 될 필요가있을 수 있으므로 g는 산 분해 가능한 면적을 제한하는 큰 단편을 생성한다.
대안은 탈세 포화 단계 및 하이드로 겔의 형성에 제한되지 않는다. 글루 타르가 모델 시스템에 사용되는 생물학적 하이드로 겔의 기계적 강도를 증가시키는 하나의 가능한 대안을 제공하는 하이드로 겔에 대한 가교 결합제로서 사용되어왔다. 다른 모델 시스템은 모델 3D 체외 발판으로 폐 조각을보고 체외 3D 문화 시스템, 또는 더 일반적으로 그대로 decellularized 폐를 포함한다. 20 우리는 이미 고분자 지지체뿐만 아니라 단일 성분 비계 작업에서 오는 한계를 언급했지만, 사람들은 여기에 제시된 절차에 가능한 대안으로 남아있다. 또한, 다른 (예 : DNA 분리)을 탈세 포화 효능, 겔화 (탁도 분석을 사용하여) 결정하는 방법 및 세포 부착 A는 존재차 증식 (예 : CCK8의 사용과 같은). 우리는 여기에서 설명하는 방법은 모델 차원 인공 지지체로 사용하기 위해 하이드로 겔의 특성을하기에 충분보다 더 많은 것으로 나타났습니다.
우리가 여기서 설명하는 폐 전자 재료 하이드로 겔은 셀 ECM 상호 작용 연구를위한 효과적인 플랫폼을 제공합니다. 프레 겔 용액은 중간 엽 줄기 세포의 전달을 돕는 고분자 약물 담체에 대한 코팅으로서 가능성이 있거나 그 자체로 약물 전달 플랫폼있다. 여기에 제시된 프로토콜은 폐 ECM에서 파생 된 다양한 하이드로 겔을 만들기위한 기본 단계를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 그대로 돼지의 폐 조직 기증에 대한 스미스 필드 팜을 감사드립니다. 우리는 또한 우리 자신의 장비를 사용할 수 있도록 박사 후 양 박사 크리스티나 당나라와 VCU 성형 외과 부서에 감사의 말씀을 전합니다. 히드로 겔 및 조직 샘플은 자금 조달 형태 NIH-NCI 암 센터 지원 그랜트에 의해 부분적으로 NIH - NINDS 센터 코어 그랜트 (5) P30 NS047463에서 자금에 의해 부분적으로 지원되는 해부학 및 신경 생물학 현미경 시설의 VCU 부서에서 SEM을 준비했다 P30의 CA016059. VCU 나노 기술 핵심 특성화 시설 (NCC)에서 샘플의 SEM 영상. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation), CMMI 1351162에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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