Summary
Dette er en metode til at skabe en 3-dimensionel cellekultur stillads fra pulmonal ekstracellulære matrix. Intakt lunge forarbejdes til hydrogeler, der kan understøtte væksten af celler i tre dimensioner.
Abstract
Her præsenteres en fremgangsmåde til etablering af flere komponenter cellekultur hydrogeler til in vitro lunge-cellekultur. Begyndende med sund en bloc lungevæv fra svin, rotte eller mus, er vævet perfunderes og nedsænket i efterfølgende kemiske rengøringsmidler til fjernelse af cellerester. Histologisk sammenligning af vævet før og efter forarbejdning bekræfter fjernelse af over 95% af dobbeltstrenget DNA og alfa galactosidase-farvning antyder størstedelen af cellerester fjernes. Efter decellularization, vævet er lyofiliseret og derefter cryomilled til pulver. Matricen pulver fordøjes i 48 timer i et surt pepsinfordøjelse opløsning og derefter neutraliseret til dannelse prægelen opløsning. Gelering af prægelen opløsning kan induceres ved inkubation ved 37 ° C og kan anvendes umiddelbart efter neutralisering eller opbevaret ved 4 ° C i op til to uger. Belægninger kan dannes under anvendelse af prægelen løsning på et ikke-behandlede plade til cell vedhæftet fil. Celler kan suspenderes i før selv-samling for at opnå en 3D kultur prægelen, udpladet på overfladen af en dannet gel fra hvilken cellerne kan migrere gennem stilladset, eller udpladet på belægningerne. Ændringer den strategi, kan påvirke geleringstemperaturen, styrke, eller proteinfragment størrelser. Beyond hydrogel-dannelse, kan hydrogelen stivhed forøges ved anvendelse genipin.
Protocol
| Løsning | sterilfilter | Kørselsvejledning |
| DIH 2 O | Ja | DIH 2 O; sterilfiltreret |
| 0,1% Triton X-100 opløsning | Ja | Under stinkskab tilsættes 100 pi Triton-X 100 Løsning på 100 ml DIH 2 O og agitere indtil opløst; sterilt filter. |
| 2% deoxycholat Solution | Ja | Under stinkskab tilsættes 2 g natriumdeoxycholat opløsning pr 100 ml DIH 2 O og omrør indtil opløsning; sterilt filter |
| 1 M NaCl | Ja | Tilføj 58,44 g NaCl til 1 I DIH 2 O; agitere indtil opløsning; sterilfilter |
| DNase løsning | Ja | Tilføj 12.000enheder DNase til 1 l DIH 2 O; Tilføj 0,156 g MgSO4 (Vandfrit), og 0,222 g CaCl2; agitere indtil opløsning; sterilfilter |
| PBS | Ja | Kombiner 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibasisk heptahydrat), 80 g NaCl og 2 g KCl med 10 L DIH 2 O; agitere indtil opløsning; justering af pH til 7,4; sterilfilter |
Tabel 1: Løsninger Kræves for Tissue Decellularization. Foretag løsningerne ovenfor for decellularization processen. Opbevares ved 4 ° C. Ca. vil være behov 2.5 L for en porcin lunge.
1. Hydrogel Formation
- Svin Lung Decellularization (tilpasset fra referencer 9,10)
- Få en samlet normal svin lunge, fra et slagteri, med hjerte og Vaseulature intakt.
- Brug væv saks eller en skalpel til at dissekere væk hjertet, opskæring vaskulatur så tæt som muligt på hjertet, vil resterende vaskulatur anvendes i senere trin for perfusion.
- dissekere forsigtigt væk bindevævet omkring luftrøret, bronkierne, og vaskulaturen under anvendelse af en skalpel eller saks.
BEMÆRK: Bestem den bedste lunge til brug for resten af proceduren ved at vælge en lunge uden store nedskæringer eller punkteringer gennem lungehinden og store mængder af atelektase eller vaskulær okklusion, der kan hindre effektiviteten af decellularization processen. - Skåret væk det suboptimale lunge forlader så meget Bronkie knyttet til luftrøret som muligt (hjerte, bindevæv og kamre af fjernede lungen kan bortskaffes). Der bør være en lunge forbliver fastgjort til luftrøret og vaskulaturen.
BEMÆRK: Behold sektioner til histologi, hvis det ønskes. 9 - Luk afbrudt bronkier med klemmer eller sutur til pRevent overskydende tilbageløb.
- Forbered decellularization løsninger og opbevares i køleskab ved 4 ° C indtil brug (tabel 1).
- Ved hjælp af en håndpumpe kanyleret til at passe lungepulsåren, perfundere lungevævet 3 gange med DI vand gennem både lungepulsåren og luftrøret. Perfundere vaskulatur først hver gang. Begynd med omkring 1 l ind vaskulatur og 1,5 L i trachea for hver perfusion, men som cellerester fjernes mere væske kan perfunderes gennem systemet.
- Perfundere både vaskulaturen og luftrør med Triton X-100 opløsning.
- Sænk lungevæv i Triton X-100 opløsning i 24 timer ved 4 ° C.
- Perfundere vaskulatur og luftrøret 3 gange med DI vand til skylning.
- Perfundere både vaskulaturen og luftrør med deoxycholat opløsning.
- Nedsænkes vævssnit i deoxycholat i 24 timer ved 4 ° C.
- Perfundere vaskulatur og luftrøret 3 gange med DI vand til skylning.
- Perfundere både vaskulaturen og luftrør med NaCl-opløsning.
- Sænk væv i filtreret NaCl-opløsning i 1 time ved 4 ° C.
- Perfundere vaskulatur og luftrøret 3 gange med DI vand til skylning.
- Perfundere både vaskulaturen og luftrør med DNase-opløsning.
- Sænk væv i filtreret DNase opløsningen i 1 time ved 4 ° C.
- Perfundere både kar og luftrør 5 gange med PBS.
- Dissekere væk mærkbar bruskvæv, luftrør og alle tubuli 2 mm eller større i diameter (primært fundet omkring hilum og mediale dele af lungerne) fra at foretage luftveje, så kun respiratoriske zoner (primært de perifere områder).
- Dissekere væv i 1 tommer sektioner eller mindre. Orientering af vævet er ligegyldigt for dette skridt.
- Hæld overskydende væske og sted væv i 50 ml koniske rør. Frys vævet ved -80 ° C.
BEMÆRK: Opbevar sektioner til histologi at sikre fjernelse af celler og cellulært debris, hvis det ønskes. Vi anvender H & E, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyprolin, ninhydrin, Alcian Blue, SDS-PAGE, og massespektrometri til karakterisering. 9
- Lung Processing
- Fjern låg fra frosne rør indeholdende decellulariseret lungevæv.
- Placer filtrerpapir over røret åbning og sikkert med elastik.
BEMÆRK: Tube og indhold skal stadig fryses på anden måde sætte i -80 ° C indtil frosset. - Lyofilisere vævet, indtil alt overskydende væske er væk, ved anvendelse af en frysetørrer ifølge producentens anvisninger. Opbevar ved -80 ° C indtil den er klar til mølle.
- Inden du begynder tilføje flydende nitrogen til fryser mølle til at køle isolering og interne komponenter arbejdsvilkår.
- Fjern magnetisk mølle bar fra møllen rør og tilføj væv til dækning bund.
- Udskift mølle og tilføje løst pakket væv. Møllen bar skal stadig bevæge sig frit.
- Luk møllen rør og place i fryser mill.
- Fyld flydende nitrogen til maks opfyldningslinje.
- Fryser mølle alle væv til fint pulver (ca. 5 min, impaction på ~ 600 min -1), i en polycarbonat cylinder med en rustfri stål slaglegemet samt rustfrit stål endepropper vha fryseren mølle ifølge producentens anvisninger. Opbevar ved -80 ° C indtil den er klar til brug.
- Mikroporøs geldannelse (8 mg / ml) (tilpasset fra referencer 9,11)
- Tilsæt 1% (vægt / volumen) af den decellulariserede pulver og 0,1% (vægt / volumen) af pepsin til 0,01 M HCI, under konstant omrøring (bør kunne se strømning ved det øverste niveau af væske), ved stuetemperatur, til 48 timer.
BEMÆRK: Pulveret statisk ladet, så tilsætte HCI efter pulveret giver mulighed for at vaske overskydende off rørvæggene. - Efter fordøjelse i 48 timer, placere opløsningen og reagenser på is i 5 min.
- Brug af nedkølet 10% (v / v) 0,1 M NaOH, end 11.11% (v / v) 10x PBS (at bringe hele opløsningen til 1x koncentration), bringe det fordøjede protein løsning på fysiologisk pH på 7,4.
BEMÆRK: Opløsningen kan nu opbevares ved 4 ° C i op til en uge. Udfør geleringsegenskaber kinetik ved hjælp rheometri 9, hvis det ønskes.
- Tilsæt 1% (vægt / volumen) af den decellulariserede pulver og 0,1% (vægt / volumen) af pepsin til 0,01 M HCI, under konstant omrøring (bør kunne se strømning ved det øverste niveau af væske), ved stuetemperatur, til 48 timer.
2. Cross-linking Hydrogeler at forbedre mekanisk styrke
- Opløsninger af 1%, 0,1% og 0,01% vægt / volumen genipin tværbindingsopløsning blev fremstillet ved at opløse den nødvendige mængde genipin pulver i 10% DMSO.
- Vortexes opløsningen hver 15 min i 1 time.
- Tilføj genipin løsning til dækning ECM hydrogeler (100 pi for hver brønd på en plade med 96 brønde), der tidligere har været samlet i del 1.3.4.
- Efterlad hver ECM hydrogel til tværbinding i 24 timer ved 37 ° C.
- Skyl ECM hydrogel 3 gange med PBS, indtil vaskevandet ikke længere blå. De tværbundne hydrogeler er derefter klar til yderligere karakterisering og cell kulturundersøgelser.
3. Cell Culture med Mikroporøse Gel
- To-dimensionelle belægning
- Med løsningen fra 1.3.3, tilsættes 20 pi prægel opløsning til hver brønd af en 96-brønds ikke-behandlede vævskultur plade.
- Opbevares i køleskab natten over ved 4 ° C for at tillade proteinadsorption til plade.
- Aspirer prægel opløsning og skylles med PBS.
- Passage celler 9.
- Tilføj 10.000 celler / cm2 til brønde.
- Øge medier til 100 pi per brønd og inkuberes ved 37 ° C.
- Tredimensionel cellekultur 9
- Brug af opløsning fra 1.3.3, resuspender pelleterede celler til en koncentration på 1.000.000 celler / ml prægel opløsning.
- Hurtigt dispensere 16 pi prægel-cellesuspension i hver brønd i en 96-brønds plade, for at danne en ~ 500 um tyk hydrogel for 3D cellekultur.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 30min for gel til dannelse.
- Tilsæt 100 pi medier til toppen af dannede hydrogeler og inkuberes ved 37 ° C.
- Tre dimensionel cellekultur på variable stivhed geler
- Brug af opløsning fra 1.3.3, pipette 100 pi prægel opløsning i hver brønd i en plade med 96 brønde.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter for gel til dannelse.
Bemærk: Tværbinding skridt fra del 2 kan anvendes her. - Passage celler 9.
- Tilføj 10.000 celler / cm2 til brønde.
- Øge medier til 100 pi per brønd og inkuberes ved 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi produceret hydrogeler fra normal gris, rotte, og muselunger (figur 1). Forarbejdede lunger giver en anslået 5 mg, 40 mg og 10 g ECM pulver hhv. En oversigt over processen er vist i figur 2. Vigtige visualiseringer i løbet af processen omfatter: hvidt udseende af lungerne efter skylning deoxycholat; efter prægelen dannelse, skal opløsningen være uigennemsigtige og løsningen skal vises homogen for måneder, hvis de opbevares ved 4 ° C. Vi har inkluderet en grundlæggende fejlfinding tabel til at hjælpe med at identificere fejlkilder i hele processen (tabel 2). Efter gelering kan hydrogeler anvendes straks eller opbevares til senere brug. Rheologisk test bekræfter, at over 90% af det geldannende forekommer i de første minutter efter at have nået 37 ° C (figur 3). Dannet hydrogeler er stabile i lange perioder i PBS, men cellebinding og proliferation kan ændre (figur 4).
Mens denne protokol er skrevet for svin lunge, pladsbegrænsninger begrænse os til kun at bruge én lunge, når decellularizing svin lunger. Vi har brugt den samme procedure med mindre modifikation til decellularize begge lunger for andre arter. For rotter og mus, kan lungerne efterlades intakt og hjertet fastgjort, men bindevævet bør stadig fjernes med en skalpel eller saks. Vi holde hjertet intakt og vedlægges til rotter og mus og perfundere opløsningerne gennem den højre ventrikel i stedet for lungepulsåren. Perfusion af luftrøret er stadig den samme; dog kan kanylen sutureres i luftrøret for at lette adgangen til mindre arter.
Vi har tilføjet flere celletyper, humane mesenchymstamceller, 9 mus mesenchymstamceller, humane epiteliale cellelinier (A549s), human primær mikrovaskulære endothelial celler (HpuVECs) og human navlevene epithelceller (HUVEC'er) i og på overfladen af lungen ECM hydrogeler. Vi har ikke stødt på spørgsmål vedrørende xenogen karakter af de dannede geler. Vores tidligere arbejde har vist en signifikant reduktion i α-galactosidase i de porcine hydrogeler. 9 prægelen opløsning kan også anvendes som et overtræk ved 4 ° C for at forbedre cellevedhæftning. Prægelen opløsning forbedrer HpuVEC fastgørelse og proliferation ved tilsætning til lunge ECM coated vævskulturplader. Coatede brønde udviser signifikant forbedret cellulær vedhæftning sammenlignet med ikke-behandlede brønde (figur 5).
Tilføjelse genipin øger hydrogel tværbinding. Denne forøgede tværbinding kan tilvejebringe et mere fysiologisk relevant stivhed, men med færre nedbrydning af ECM. Faldet i nedbrydning, selv om mindre in vitro, kan forekomme på grund af øget binding mellemproteiner og derfor mere modstand mod ECM remodellering af celler. Vi anvendte frekvens fejer på et rheometer til måling af mekaniske egenskaber af den tværbundne hydrogel. Hydrogel stivhed fandtes at være direkte korreleret til genipin koncentrationen med median og mest relevante koncentration er 0,01% (figur 6, nativt væv ikke vist). En MTT assay blev anvendt til at kvantificere celle proliferation og overlevelse på den tværbundne hydrogel. Celleproliferation er højere på den tværbundne hydrogel (figur 7). Dette understøtter øget celledeling på øget stivhed fra andre. 12 Varierende genipin krydsbinding tid eller temperatur kan resultere i forskellige tværbindende grader.
Figur 1: Billeder af lunger vi har decellulariserede. Billeder fra (A) Mouse lunge efter decellularining og hjerte fjernet, (B) Rotte efter Triton X-100 skyllet væk, (C) Pig, før initial skylning; de giver ~ 5 mg, 40 mg og 10 g Lung ECM hhv. (D) Mouse lunge og intakt hjerte, efter decellularization, med kanyle stadig sutureret på plads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over metoder. Dette er en oversigt over den metode til at producere hydrogeler fra lungerne. Begyndende med en bloc gris lunge decellularization sker så kun uigennemsigtig hvid eller gennemsigtig væv, der består af ECM-proteiner. Derefter efter ophæve resterende vand, og forøgelse af overfladearealet at optimere syreoplukning vævet er solubiliseret. Neutralisering af acid og øge salt til fysiologiske niveauer skaber prægelen opløsningen klar til gelering. Når opløsningen danner en hydrogel ved 37 ° C, karakterisering sker med en gel rheometer og scanning elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentant rheologisk Data til Geldannelse under Temperatur Ramping. Efter en indledende amplitude sweep at bestemme lineært viskoelastisk interval blev en temperaturstigning anvendes til at bestemme geleringsegenskaber kinetik. Data er præsenteret som gennemsnit +/- standardafvigelse. n = 4.
Figur 4: Long Term Stabilitet. en imalder af en gris lunge ECM hydrogel opbevaret i PBS i over 6 måneder ved stuetemperatur.
Figur 5: Metabolic Assay of HpuVECs. MTT spredning data fra humane primære mikrovaskulære endotelceller (HpuVECs) dyrket på ikke-behandlede vævsdyrkningsplader. Pregel opløsning fra 1.3.3 blev tilsat til plader, afkølet natten over og skylles til dannelse prægelen lunge ECM-coatede plader. HpuVECs udviste højere MTT aktivitet på ECM-coatede plader sammenlignet med ikke-overtrukket. * P <0,05 sammenlignet med kontrol. Dataene er middelværdier ± standardafvigelse n = 3 per gruppe.
Figur 6: rheologisk Data til Enhanced Tværbinding. Rheometry data for genipin tværbinding. Stivheden øges med øgede koncentrationer af Genipin til et plateau på 1% genipin. Data er normaliseret til at vise en fold forøgelse i tværbinding med genipin.
Figur 7; Cell Proliferation på genipin Crosslinked Gels. Normaliserede MTT data for A549s om genipin tværbundne hydrogeler. Øget celleproliferation ses med øget stivhed. p <0,05 sammenlignet med kontrol. Dataene er middelværdier ± standardafvigelse. n = 3 pr gruppe.
| Problem | Spørgsmål | Løsning |
| Rød / pink farve bevaret efter decellularization | ineffektiv decellularization | Start forfra med nye lunger |
| Fjern områder af ufuldstændig decellularization </ Td> | ||
| vaskulær okklusion | Start forfra med nye lunger | |
| Fjern områder af ufuldstændig decellularization | ||
| Signifikant cellerester tilbageholdes | ineffektiv decellularization | Start forfra med nye lunger |
| Fjern områder af ufuldstændig decellularization | ||
| vaskulær okklusion | Start forfra med nye lunger | |
| Fjern områder af ufuldstændig decellularization | ||
| atelektase | Start forfra med nye lunger | |
| Fjern områder af ufuldstændig decellularization | ||
| Ødelæggelse af membraner fundet i histologiske prøver | Over-tryksætning af skibe under perfusion | Reducer perfusionstrykaf rengøringsmidler |
| Stort partikelformet tilbage efter formaling | For meget frysetørrede materiale i røret | Reducer materiale i slibning cylinder |
| Ikke formalet i lang nok | øge malevarighed | |
| Pregel løsning ikke geldannende | PH for høj | Lav pH 7,4 |
| Begynd prægel løsning med frisk pulver | ||
| PH for lav | Lav pH 7,4 | |
| Begynd prægel løsning med frisk pulver | ||
| ECM løbet fordøjet | Begynd prægel løsning med frisk pulver | |
| Celler overlever ikke | Mikrober indført efter HCI fordøjelse | Begynd igen med frisk pulver og bruge sterile filtrerede løsninger |
| pH off | Begynd prægel løsning igen | |
| Lav pH 7,4 | ||
| Celler brast | Fix saltindhold i prægel løsning |
Tabel 2: Vejledning til fejlfinding for at identificere kilder til potentiel fejl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et af de integrerede aspekter af biologi er selvorganisering af molekyler i hierarkiske strukturer, der udfører en bestemt opgave. 13 I laboratoriet, saml-selv afhænger af mange faktorer såsom saltkoncentration, pH, og fordøjelse varighed. Som vist, et selvorganiserende hydrogel former når solubiliserede proteiner vender tilbage til en fysiologisk temperatur. Hydrogelen dannes, er i stand til at fremme cellulær vedhæftning og proliferation in vitro.
Cellulære respons på biofysiske signaler fra ECM kan ikke forsket hjælp polymerer. Vævsspecifik cellulære respons på biofysiske signaler kan ikke udforsket ved hjælp af andre væv. Regeneration forskere og klinikere mener bruger decellulariseret stilladser forbedrer væv regenerering og sårheling. Kronisk lungesygdom syge har brug for terapeutiske forbedringer for at øge adgangen til organer og mindske immunogenicitet. Organspecifik, celle-ECM interaktioner skal væreforsket yderligere orgel biologi.
Ved hjælp af ECM som en celle stillads til lungeceller har vist ensartede resultater. 14,15 Anvendelse lung skiver fra syge modeller tilskynder sygdom fornyelse 16 stam- eller progenitorceller, der findes i distale lunger, 17,18 og kræver særlige nicher at forhindre dannelse af teratomer. Brug vævsspecifik ECM som et køretøj levering, kan regenerative effekter af stamceller styrkes. ECM hydrogel etablerer en mere anvendelig miljø til at vurdere cellulære reaktioner på ekstracellulær matrix.
En stor mængde forskning eksisterer ser på stivhed som den vedrører cellulær signalering. Vores fremgangsmåde til genipin tværbinding tillader celle-stivhed signalering samt celle-ECM komponent interaktioner. Mens hydrogel stivhed kan manipuleres af ECM mængden og forholdet af proteiner, anvendelse af genipin tillader hydrogel stivhed ændringer noget uafhængigt af ECM-indhold. Justering genEPIN koncentration kan give mulighed for præcist indstillet mekaniske egenskaber til de fleste ligner naturlige lungevæv 6. Fra opnået genipin data ved hjælp af hydrogeler fra perifert lunge i den foreliggende undersøgelse blev en 15-fold forøgelse (fra 5 Pa til 75 Pa) noteret. Baseret på rheologiske data for biopsi normal rottelunge væv, der blev decellulariserede anvendelse af de samme metoder, kan vi opnå omtrentlig perifert lungevæv stivhed (data ikke vist) ved tilsætning af 1% genipin til perifere lunge hydrogeler eller tilføje 0,01% til hele lunge hydrogeler (anslået ). Brug af den perifere lunge ECM består af lungeparenkym lavet en betydeligt blødere gel sammenlignet med vores tidligere offentliggjorte hel lunge ECM hydrogel resultater 7. Derfor foruden genipin, udvælge specifikke regioner af lungevæv at decellularize kan dramatisk påvirke stivheden.
Der er muligheder for at forbedre denne fremgangsmåde, som kan omfatte yderligere trin, der almindeligvis anvendes i perfusipå decellularization af hele lungevæv. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt på normalt lungevæv og kan kræve modifikation for decellularization af syge lunger. Vi har endnu ikke undersøgt denne proces i specifikke sygdomstilstande. Vi får vores lunger sendes på is natten fra et slagteri. Denne metode kan begrænse effektiviteten af vores proces grundet atelektase eller vaskulær okklusion; vi imidlertid sjældent nødt til at fjerne områder af lungen, som ikke er grundigt decellulariserede. Når opnåelse frisk lungevæv, vil vi anbefale, at gøre alle de løsninger, der kræves, før det bliver lungerne til at forhindre eventuelle pauser i vævsbehandling. Tidligere forskning har vist sig, at anvendelse af pereddikesyre som et sidste steriliseringstrin til matrix produktionen forårsager en regenerativ M1 makrofag fænotype i infiltrerende immunceller, 19 potentielt forbedres proregenerative virkninger af decellulariseret væv. Anden forskning har gået ind i at bruge andre rengøringsmidler til at fuldføre processen, men dem appear for at være lab specifikke præferencer med i sidste ende den samme indvirkning på decellularization. Proceduren og fordøjelse skridt decellularization kan optimeres afhængig af forskerens specifikke anvendelse. For eksempel kan ændring af gel fordøjelsesperiode eller neutralisering metoder ændre proteinsammensætningen, mekaniske egenskaber, eller geleringsegenskaber kinetik.
Alternativer til metoden diskuteret her kan variere i kompleksitet, afhængigt af de ønskede eksperimentelle resultater. For eksempel, hvis målet var at holde basalmembranen intakt så meget som muligt, kan en perfusion pumpe med et tryk begrænset kontrol mindske skader barriere. Desuden, hvis en havde en laboratorieopstilling rådighed til at holde begge lunger intakt i større arter, kan decellularization processen forbedre virkningen. Omvendt kan et hånd slibning teknik med en morter og pistil påføres den frysetørrede væv til laboratorier, der ikke har en cryomill. Vi forventer hånd Grinding producerer større fragmenter, begrænse det areal til rådighed for syreoplukning så kan være nødvendigt at blive ændret i dette tilfælde fordøjelsesperiode.
Alternativer er ikke begrænset til de decellularization trin og dannelse af hydrogeler. Glutaraldehyd er blevet anvendt som en tværbinder for hydrogeler, giver et muligt alternativ til at øge mekanisk styrke af biologiske hydrogeler anvendes til modelsystemer. Andre modelsystemer omfatter intakte decellulariserede lunger som et in vitro 3D kultur-system, eller mere almindeligt ser på lunge skiver som en model 3D in vitro stillads. 20 Vi har allerede nævnt de begrænsninger, der kommer fra at arbejde med polymerstativer samt enkelt komponent stilladser, men de forbliver som mulige alternativer til den procedure, der præsenteres her. Derudover er der alternative metoder til at bestemme decellularization effekt (såsom DNA isolation), gelering (kan bruge turbiditet assays), og cellebinding ennd spredning (såsom brug af CCK8). Vi fandt, at de her beskrevne metoder er mere end tilstrækkelige til at karakterisere hydrogeler til anvendelse som model 3D scaffolds.
De lunge ECM hydrogeler vi beskriver her en effektiv platform til at studere celle-ECM interaktioner. Prægelen løsning har potentiale som et overtræk til polymer lægemiddelbærere, medvirken i levering af mesenkymale stamceller, eller som et lægemiddelafgivelsessystem platform af sig selv. Protokollen præsenteret heri indeholder de grundlæggende trin til at skabe en alsidig hydrogel afledt lunge ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Smithfield gårde for at donere den intakte porcint lungevæv. Vi vil også gerne takke Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang og VCU plastikkirurgi Institut for at tillade os at bruge deres udstyr. Hydrogel og vævsprøver blev forberedt SEM ved VCU Anatomisk Institut og Neurobiologi Microscopy Facility understøttes til dels af finansiering fra NIH-NINDS center Core Grant 5 P30 NS047463 og dels ved finansiering formular NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30 CA016059. SEM billeddannelse af prøver på VCU Nanoteknologi Core Karakterisering Facility (NCC). Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
