Summary
Dit is een methode om een 3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.
Abstract
Hier presenteren we een methode voor het vaststellen van meervoudige component celkweek hydrogels voor in vitro long celkweek. Beginnend met gezonde en bloc longweefsel van varkens, rat of muis, wordt het weefsel perfusie en ondergedompeld in daaropvolgende chemische reinigingsmiddelen om de celresten te verwijderen. Histologische vergelijking van het weefsel voor en na verwerking bevestigt verwijdering van meer dan 95% van dubbelstrengs DNA en alfa- galactosidase kleuring zien dat de meerderheid van cellulaire afval wordt verwijderd. Na decellularisatie, het weefsel gevriesdroogde en vervolgens cryomilled tot een poeder. De matrix poeder wordt gedigereerd gedurende 48 uur in een zure pepsine oplossing en daarna geneutraliseerd tot de pre-gel te vormen. Gelering van het pre-gel oplossing kan worden geïnduceerd door incubatie bij 37 ° C en kan worden gebruikt direct na neutralisatie of maximaal twee weken opgeslagen bij 4 ° C. Coatings kunnen worden gevormd met de pre-gel oplossing op niet-behandelde dienblad cell attachment. Cellen kunnen worden gesuspendeerd in de pre-gel voorafgaand aan zelfassemblage een 3D cultuur bereiken, uitgeplaat op het oppervlak van een gel gevormd waarvan de cellen kunnen migreren door het schavot, of bedekt op de bekledingen. Wijzigingen in de strategie gepresenteerd van invloed kan zijn geleringstemperatuur, kracht, of eiwit fragment maten. Beyond hydrogel formatie, kan de hydrogel stijfheid verhoogd door toepassing genipin.
Protocol
| Oplossing | steriele Filter | Routebeschrijving |
| DIH 2 O | Ja | DIH 2 O; steriel gefiltreerd |
| 0,1% Triton X-100 oplossing | Ja | Onder zuurkast voeg 100 ul Triton-X 100 Oplossing voor 100 ml Dih 2 O en schud totdat het is opgelost; steriel filter. |
| 2% deoxycholaat oplossing | Ja | Onder zuurkast voeg 2 g natriumdeoxycholaat oplossing per 100 ml Dih 2 O en schud totdat het is opgelost; steriel filter |
| 1 M NaCl | Ja | Voeg 58,44 g NaCl tot 1 L van Dih 2 O; schud totdat het is opgelost; steriel filter |
| DNase oplossing | Ja | Voeg 12.000eenheden DNase 1 L Dih 2 O; Voeg 0,156 g MgSO4 (Watervrij), en 0,222 g CaCl2; schud totdat het is opgelost; steriel filter |
| PBS | Ja | Combineer 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (heptahydraat), 80 g NaCl en 2 g KCl met 10 L Dih 2 O; schud totdat het is opgelost; pH instellen op 7,4; steriel filter |
Tabel 1: oplossingen die nodig zijn voor Tissue Decellularisatie. Maak de bovenstaande oplossingen voor de cellen ontdoen proces. Bewaren bij 4 ° C. Ongeveer 2,5 L is nodig voor een varken long.
1. Hydrogel Formation
- Porcine Lung Decellularisatie (overgenomen van referenties 9,10)
- Te verkrijgen, een en bloc normale varkens long, uit een slachthuis, met hart en Vasculature intact.
- Tissue schaar of scalpel weg ontleden het hart, bloedvaten snijden zo dicht mogelijk bij het hart, zal nog vaatstelsel worden gebruikt in latere stappen voor perfusie.
- ontleden zorgvuldig weg het bindweefsel rond de luchtpijp, bronchiën en vaatstelsel met behulp van een scalpel of schaar.
OPMERKING: Bepaal de beste long gebruiken voor de rest van de procedure uitgesproken door een long zonder grote sneden of gaten door de pleura en grote hoeveelheden atelectase of vasculaire occlusie dat de effectiviteit van de decellularisatie proces kan belemmeren. - Knip de suboptimale long verlaten zoveel bronchus gehecht aan de luchtpijp mogelijk (hart, bindweefsel en de lobben van de verwijderde longen kunnen worden afgestoten). Er moet één long bevestigd blijft aan de luchtpijp en vaatstelsel.
NB: Behoud secties voor histologie indien gewenst. 9 - Sluit verbroken bronchiën met klemmen of hechting aan pRevent overtollige terugstroom.
- Bereid de cellen ontdoen oplossingen de koelkast bij 4 ° C totdat het nodig is (Tabel 1).
- Met behulp van een handpomp canule aan de longslagader passen, perfuseren het longweefsel 3 maal met DI water door middel van zowel de longslagader en de luchtpijp. Perfuseren het vaatstelsel eerst elke keer. Begin met ongeveer 1 L in het vaatstelsel en 1,5 L in trachea per perfusie, maar celresten verwijderd vloeibaarder kan worden geperfuseerd via het systeem.
- Perfuseren zowel vasculatuur en de luchtpijp met Triton X-100 oplossing.
- Onderdompelen longweefsel in Triton X-100 oplossing 24 uur bij 4 ° C.
- Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen.
- Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met deoxycholaat oplossing.
- Dompel de weefselcoupes in deoxycholaat gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen.
- Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met NaCl-oplossing.
- Onderdompelen weefsel in gefilterd NaCl oplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen.
- Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met DNase oplossing.
- Onderdompelen weefsel in gefilterd DNase oplossing 1 uur bij 4 ° C.
- Perfuseren zowel vasculatuur en trachea 5 maal met PBS.
- Ontleden weg merkbare kraakbeenweefsel, trachea en alle buisjes 2 mm of groter in diameter (vooral in de omgeving van de hilus en mediale gedeelten van de longen) vanaf geleidende luchtwegen, waardoor alleen respiratoire zones (voornamelijk randgebieden).
- Ontleden weefsel in 1 inch secties of kleiner. Oriëntatie van het weefsel niet van belang voor deze stap.
- Giet overtollige vloeistof af en plaats weefsel in 50 ml conische buizen. Bevries het weefsel bij -80 ° C.
LET OP: Behoud secties voor histologie om de verwijdering van cellen en cellulaire debri verzekerens, indien gewenst. We gebruiken H & E, α-galactosidase, picogreen, hydroxyproline, ninhydrine, alcian blauw, SDS-PAGE en massaspectrometrie te karakteriseren. 9
- Lung Processing
- Verwijder deksels uit ingevroren buisjes die cellen ontdane longweefsel.
- Plaats de papieren filter over de buis opening en veilig met rubber band.
OPMERKING: Buis en de inhoud moet nog steeds worden bevroren op enigerlei andere wijze in -80 ° C tot bevroren. - Lyofiliseren het weefsel totdat alle overtollige vloeistof is verdwenen, met behulp van een vriesdroger volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bewaar bij -80 ° C tot klaar te frezen.
- Voordat u begint toe te voegen vloeibare stikstof vriezer molen isolatie en interne onderdelen tot de arbeidsomstandigheden.
- Verwijder magnetische molen bar van molen buis en voeg weefsel naar beneden te dekken.
- Vervang de molen bar en voeg los verpakt weefsel. De molen bar moet nog steeds vrij te bewegen.
- Sluit de molen buis en place in de vriezer molen.
- Vul vloeibare stikstof tot max vullijn.
- Vriezer molen alle weefsels tot fijn poeder (ongeveer 5 min, impactie snelheid van ~ 600 min -1), in een polycarbonaat cilinder met een roestvrij stalen impactor evenals roestvrij staal einde stekkers met behulp van de vriezer molen volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bewaren bij -80 ° C tot aan gebruik.
- Microporeuze gelvorming (8 mg / ml) (naar referenties 9,11)
- Voeg 1% (w / v) van het gedecellulariseerde poeder en 0,1% (w / v) pepsine tot 0,01 M HCl, onder constant roeren (moet kunnen stromen weergegeven boven vloeistofniveau), bij kamertemperatuur, 48 uur.
Opmerking: Het poeder wordt statisch geladen, zodat het toevoegen van de HCl nadat het poeder in de gelegenheid om de overtollige wassen de buiswanden verschaft. - Na digereren gedurende 48 uur, plaats de oplossing en reagentia op ijs gedurende 5 minuten.
- Middels gekoelde 10% (v / v) 0,1 M NaOH, eend 11,11% (v / v) 10x PBS (op de gehele oplossing brengen concentratie 1x), brengen de verteerde eiwitoplossing tot fysiologische pH van 7,4.
NB: De oplossing kan nu maximaal een week bewaard bij 4 ° C. Voer geleren kinetiek met behulp van reometrie 9 indien gewenst.
- Voeg 1% (w / v) van het gedecellulariseerde poeder en 0,1% (w / v) pepsine tot 0,01 M HCl, onder constant roeren (moet kunnen stromen weergegeven boven vloeistofniveau), bij kamertemperatuur, 48 uur.
2. Cross-linking Hydrogels om mechanische sterkte te verbeteren
- Oplossingen van 1%, 0,1% en 0,01% w / v genipin verknopingsoplossing werden bereid door oplossen van de noodzakelijke hoeveelheid genipin poeder in 10% DMSO.
- Vortex de oplossing elke 15 min gedurende 1 uur.
- Voeg genipin oplossing ECM hydrogels (100 ul per putje van een 96-well plaat) die eerder zijn geassembleerd gedeeltelijk 1.3.4 dekken.
- Leg elke ECM hydrogel verknopen gedurende 24 uur bij 37 ° C.
- Spoel de ECM hydrogel 3 maal met PBS totdat de wasvloeistof niet langer blauw. De verknoopte hydrogels zal dan klaar voor verdere karakterisering en cell cultuur studies.
3. Cultuur van de Cel met Microporeuze Gel
- Tweedimensionale coating
- Met oplossing van 1.3.3, voeg 20 ul van pre-gel oplossing in elk putje van een 96-well niet-behandelde weefselkweekplaat.
- Nacht in de koelkast bij 4 ° C te laten eiwit adsorptie tot op het bord.
- Zuig Pregel oplossing en spoel af met PBS.
- 9 passage cellen.
- Voeg 10.000 cellen / cm2 putjes.
- Verhoging media 100 pl per putje en incubeer bij 37 ° C.
- Driedimensionale celcultuur 9
- Gebruikt oplossing van 1.3.3, resuspendeer pellet celconcentratie van 1.000.000 cellen / ml Pregel oplossing.
- Snel afzien 16 pi pre-gel-celsuspensie in elk putje van een 96-wells plaat, een ~ 500 um dikke hydrogel 3D celkweek vormen.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30min voor gel te vormen.
- Voeg 100 ul van medium naar de top van hydrogelen en incubeer bij 37 ° C.
- Driedimensionale celcultuur op variabele stijfheid gels
- Gebruik van oplossing 1.3.3 Pipetteer 100 ul van pre-gel oplossing in elk putje van een 96-wells plaat.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten gel te vormen.
Opmerking: Cross-linking stappen van deel 2 kan hier worden gebruikt. - 9 passage cellen.
- Voeg 10.000 cellen / cm2 putjes.
- Verhoging media 100 pl per putje en incubeer bij 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze methode, hebben we hydrogelen van normaal varken, rat, en muis longen (figuur 1) verkregen. Verwerkte longen geven respectievelijk een geschatte 5 mg, 40 mg en 10 g ECM poeder. Een overzicht van de werkwijze is weergegeven in figuur 2. Key visualisaties tijdens het proces zijn onder meer: wit uiterlijk van de longen na het spoelen deoxycholaat; na de vorming Pregel dient de oplossing ondoorzichtig en de oplossing moet homogeen weergegeven voor maanden bij 4 ° C. We hebben opgenomen een basis tabel voor probleemoplossing om te helpen identificeren oorzaken van fouten tijdens het hele proces (tabel 2). Na geleren kan hydrogels onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen voor toekomstig gebruik. Reologische test bevestigt dat meer dan 90% van de gelering optreedt in de eerste minuten na het bereiken van 37 ° C (Figuur 3). Hydrogelen stabiel zijn gedurende lange perioden in PBS, maar celhechting en proliferation kan (figuur 4) te veranderen.
Hoewel dit protocol is geschreven voor varkens longen, ruimtelijke beperkingen beperken ons tot slechts één long gebruiken wanneer decellularizing varken longen. We hebben dezelfde procedure toegepast met kleine wijziging in beide longen voor andere soorten decellularize. Voor ratten en muizen, kan de longen intact worden gelaten en het hart bevestigd, maar het bindweefsel moet nog steeds worden verwijderd met een scalpel of schaar. Wij houden het hart intact en aangesloten voor ratten en muizen en perfuseren de oplossingen via de rechter ventrikel in plaats van de longslagader. Perfusie van de trachea is nog steeds hetzelfde; echter, kan de canule worden gehecht in de trachea voor gemakkelijke toegang voor kleinere soorten.
We hebben meerdere celtypes, menselijke mesenchymale stamcellen, 9 muizen mesenchymale stamcellen, menselijke epitheliale cellijnen (A549s), primaire menselijke microvasculaire endo toegevoegdthelial cellen (HpuVECs) en menselijke navelstrengader epitheelcellen (HUVEC's) binnen en op het oppervlak van de long ECM hydrogels. We hebben niet ondervonden problemen met betrekking tot de xenogene aard van de gevormde gels. Onze vorige onderzoek toonde een significante vermindering van α-galactosidase in varkens hydrogels. 9 De pre-gel oplossing kan ook worden gebruikt als een bekleding bij 4 ° C om celhechting te verbeteren. De pre-gel oplossing verbetert HpuVEC gehechtheid en proliferatie wanneer toegevoegd aan de longen ECM beklede weefselkweekplaten. Beklede putjes aantonen aanzienlijk verbeterde hechting van cellen in vergelijking met niet-behandelde putjes (figuur 5).
Toevoegen genipin verhoogt hydrogel verknoping. Deze verhoogde verknoping kan een fysiologisch relevante stijfheid met minder afbraak van de ECM. De afname in afbraak, hoewel minor in vitro kan optreden als gevolg van verhoogde hechting tusseneiwitten en daardoor weerstand tegen ECM remodeling door cellen. We gebruikten frequentiezwaaien op een reometer de mechanische eigenschappen van de verknoopte hydrogel meten. Hydrogel stijfheid bleek direct worden gecorreleerd aan de concentratie genipin de mediaan en meest relevante concentratie die 0,01% (Figuur 6, natief weefsel niet getoond). Een MTT-assay werd gebruikt om celproliferatie en overleving kwantificeren op verknoopte hydrogel. Celproliferatie is hoger op de verknoopte hydrogel (figuur 7). Dit ondersteunt verhoogde celproliferatie op verhoogde stijfheid van anderen. 12 Variërende genipin verknoping tijd of temperatuur kan leiden tot verschillende graden verknoping.
Figuur 1: Beelden van Longen We Hebben gedecellulariseerde. Foto's uit (A) Mouse long na decellularisatie en hart verwijderd, (B) Rat na Triton X-100 weggespoeld, (C) Pig, vóór het eerste spoeling; zij geven ~ 5 mg, 40 mg en 10 g Lung ECM respectievelijk. (D) Mouse long en intacte hart, na decellularisatie, met canule nog steeds plaats gehecht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van de methoden. Dit is een overzicht van de methode om de hydrogels van de longen te produceren. Te beginnen met en bloc varken long decellularisatie optreedt waardoor alleen ondoorzichtig wit of doorschijnend weefsel dat bestaat uit ECM eiwitten. Dan na verwijdering van het resterende water en voor vergroting van het zuur spijsvertering optimaliseren het weefsel wordt opgelost. Neutralisatie van de acid en het verhogen van het zout naar fysiologische niveaus schept de pre-gel oplossing klaar voor geleren. Zodra de oplossing een hydrogel bij 37 ° C vormt, karakterisering vindt plaats met een gel reometer en scanning elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve Reologische gegevens voor Gelatinevorming onder Temperatuur Ramping. Na een eerste amplitude sweep lineair visco-elastisch samen te stellen, werd een temperatuur ramp gebruikt om te geleren kinetiek te bepalen. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde +/- standaardafwijking. n = 4.
Figuur 4: stabiliteit op lange termijn. een imleeftijd van een varken long ECM hydrogel opgeslagen in PBS gedurende meer dan 6 maanden bij kamertemperatuur.
Figuur 5: Metabole Assay van HpuVECs. MTT proliferatie gegevens van Human primaire microvasculaire endotheelcellen (HpuVECs) zijn gekweekt op niet-behandelde weefselkweek platen. Pregel oplossing van 1.3.3 werd platen, 's nachts gekoeld en gespoeld om pre-gel long ECM beklede platen vormen toegevoegd. HpuVECs werden hogere MTT activiteit ECM beklede platen in vergelijking met niet-gecoate. * P <0,05 vergeleken met controle. Gegevens zijn gemiddelde ± standaardafwijking n = 3 per groep.
Figuur 6: rheologische gegevens voor versterkte verknoping. Rheometrie gegevens genipin verknoping. De stijfheid neemt toe met verhoogde concentraties Genivastmaken aan een plateau op 1% genipin. Gegevens zijn genormaliseerd op een voudige toename in verknopen met genipin tonen.
Figuur 7; Cell Proliferation op Genipin Vernet Gels. Genormaliseerd MTT gegevens voor A549s op genipin verknoopte hydrogels. Verhoogde celproliferatie gezien met verhoogde stijfheid. p <0,05 vergeleken met controle. Gegevens zijn gemiddelde ± standaardafwijking. n = 3 per groep.
| Probleem | Kwestie | Resolutie |
| Rood / roze kleur na decellularisatie behouden | ineffectief decellularisatie | Begin opnieuw met nieuwe longen |
| Verwijder delen van een onvolledige decellularisatie </ Td> | ||
| vasculaire occlusie | Begin opnieuw met nieuwe longen | |
| Verwijder delen van een onvolledige decellularisatie | ||
| Significante celresten behouden | ineffectief decellularisatie | Begin opnieuw met nieuwe longen |
| Verwijder delen van een onvolledige decellularisatie | ||
| vasculaire occlusie | Begin opnieuw met nieuwe longen | |
| Verwijder delen van een onvolledige decellularisatie | ||
| atelectase | Begin opnieuw met nieuwe longen | |
| Verwijder delen van een onvolledige decellularisatie | ||
| Vernietiging van membranen gevonden in histologische samples | Overdruk van de schepen tijdens de perfusie | Verlaag perfusiedrukdetergentia |
| Grote deeltjes overblijft na het frezen | Teveel gevriesdroogd materiaal in buis | Verminder materiaal slijpen cilinder |
| Niet gemalen lang genoeg | toenemen frezen tijd | |
| Pregel oplossing niet geleren | Oplossing pH te hoog | Maak pH 7,4 |
| Begin Pregel oplossing met verse poeder | ||
| PH van de oplossing te laag | Maak pH 7,4 | |
| Begin Pregel oplossing met verse poeder | ||
| ECM dan verteerd | Begin Pregel oplossing met verse poeder | |
| Cellen niet overleven | Microben die na HCl spijsvertering | Begin opnieuw met verse poeder en gebruik steriel gefiltreerd oplossingen |
| pH off | Begin Pregel oplossing weer | |
| Maak pH 7,4 | ||
| cellen barsten | Fix zoutgehalte in Pregel oplossing |
Tabel 2: Problemen oplossen om mogelijke bronnen van fout te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de integrale aspecten van de biologie is de zelforganisatie van moleculen in hiërarchische structuren die een specifieke taak uit te voeren. 13 In het laboratorium zelfassemblage afhankelijk van talrijke factoren zoals zoutconcentratie, pH en duur spijsvertering. Zoals getoond zelforganiserend hydrogel vormen wanneer opgeloste eiwitten weer een fysiologische temperatuur. De gevormde hydrogel kan bevorderen cellulaire hechting en proliferatie in vitro.
Cellulaire respons op biofysische signalen van ECM kunnen niet worden onderzocht met behulp polymeren. Weefselspecifieke cellulaire respons op biofysische signalen kunnen niet worden onderzocht door andere weefsels. Regeneratie onderzoekers en clinici geloven met behulp van cellen ontdane steigers verbetert weefselregeneratie en wondgenezing. Chronische longziekte patiënten moeten therapeutische verbeteringen aan de beschikbaarheid van organen te vergroten en immunogeniciteit te verlagen. Orgaan specifieke, cel-ECM interacties moet zijnonderzocht verder orgaan biologie.
Met ECM als cel matrix voor longcellen blijkt consistente resultaten. 14,15 Met behulp van long segmenten van zieke modellen moedigt ziekte vernieuwing 16 stamcellen of stamcellen, gevonden in distale longen, 17,18 en vereist speciale niches om de vorming van teratomas voorkomen. Gebruik weefselspecifieke ECM als transportmiddel kan regeneratieve effecten van progenitorcellen worden verbeterd. De ECM hydrogel wordt een toepasselijker omgeving om cellulaire reacties op extracellulaire matrix beoordelen.
Een grote hoeveelheid onderzoek bestaat kijken stijfheid als het gaat om cellulaire signalering. Onze methode van genipin verknoping zorgen voor cell-stijfheid signalering evenals cel-ECM component interacties. Terwijl hydrogel stijfheid kan worden gemanipuleerd door ECM hoeveelheid en verhouding van eiwitten, het gebruik van genipin maakt hydrogel stijfheid veranderingen enigszins onafhankelijk van ECM inhoud. Aanpassen genEPIN concentratie kan zorgen voor een nauwkeurige afstemming van de mechanische eigenschappen van de meeste lijken op de natuurlijke longweefsel 6. Genipin van gegevens verkregen met hydrogelen uit perifere long in deze studie werd een 15-voudige toename (van 5 Pa tot 75 Pa) genoteerd. Gebaseerd op reologische gegevens van biopsie normale rat longweefsel dat was ontceld volgens dezelfde methoden, kunnen we bij benadering perifeer longweefsel stijfheid (gegevens niet getoond) te bereiken door het toevoegen van 1% genipin perifere long hydrogels of het toevoegen van 0,01% tot hele long hydrogels (geschat ). Met de perifere long ECM bestaande uit longparenchym die aanzienlijk zachter gel vergeleken met onze eerder gepubliceerde hele long ECM hydrogel resultaten 7. Daarom naast genipin selecteren specifieke gebieden van longweefsel decellularize kan dramatisch beïnvloeden de stijfheid.
Er zijn mogelijkheden om deze methode, die extra stappen gewoonlijk in perfusi kunnen verbeterenop cellen ontdoen van hele longweefsel. Deze werkwijze is gebruikt voor normaal longweefsel en kan een aanpassing van cellen ontdoen van zieke longen vereisen. We zijn nog niet onderzocht dit proces in specifieke ziektebeelden. We krijgen onze longen op ijs 's nachts verzonden uit een slachthuis. Deze methode kan de effectiviteit van onze werkwijze door atelectase of vasculaire occlusie beperken; Maar, we hebben zelden naar gebieden van de long die niet grondig zijn ontceld verwijderen. Bij het verkrijgen van verse longweefsel, raden we aan het maken van alle van de oplossingen die nodig zijn voor het verkrijgen van de longen om eventuele pauzes in het weefsel verwerking te voorkomen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat het gebruik van perazijnzuur als een laatste sterilisatie stap om de productie matrix veroorzaakt een regeneratief M1 macrofaag fenotype in infiltrerende immuuncellen, 19 potentieel verbeteren proregenerative effecten van cellen ontdane weefsel. Ander onderzoek is gegaan in het gebruik van andere reinigingsmiddelen om het proces te voltooien, maar die appear om lab specifieke voorkeuren met uiteindelijk hetzelfde effect op decellularisatie. De decellularisatie procedure en de spijsvertering stappen kunnen worden geoptimaliseerd afhankelijk van de specifieke toepassing van de onderzoeker. Bijvoorbeeld, het veranderen van de gel spijsvertering tijd of neutralisatie methoden kan de eiwitsamenstelling, mechanische eigenschappen, of geleren kinetiek veranderen.
Alternatieven voor de werkwijze besproken kunnen variëren in complexiteit afhankelijk van de gewenste experimentele resultaten. Bijvoorbeeld, als het doel was om het basaal membraan intact zoveel mogelijk te houden, een perfusiepomp met een druk beperkte controle barrière kan schade verminderen. Bovendien, als men een laboratoriumopstelling waarover beide longen intact grotere soorten behouden had, het van cellen ontdoen proces kan de werkzaamheid te verbeteren. Omgekeerd kan een hand slijptechniek met een mortier en stamper worden toegepast op de gevriesdroogde weefsel voor laboratoria die geen CryoMill hebben. We verwachten de hand Grinding om grotere fragmenten, beperken het beschikbare oppervlak voor het zuur vertering zodat de digestietijden moet worden veranderd in dit geval.
Alternatieven zijn niet beperkt tot de decellularisatie stappen en de vorming van hydrogels. Glutaaraldehyde is gebruikt als verknopingsmiddel voor hydrogels, verschaffen een mogelijk alternatief voor toenemende mechanische sterkte van biologische hydrogels voor modelsystemen. Andere modelsystemen omvatten intacte cellen ontdane longen als in vitro kweeksysteem 3D, of meer algemeen kijken long plakjes model 3D in vitro scaffold. 20 Wij hebben reeds vermeld de beperkingen die bij het werken met polymere dragers en afzonderlijk onderdeel steigers, maar die nog mogelijk alternatief voor de hier gepresenteerde. Daarnaast zijn er alternatieve methoden voor het bepalen decellularisatie werkzaamheid (zoals DNA isolatie) gelering (kan vertroebeling assays) en celhechting eennd proliferatie (zoals het gebruik van CCK8). We vonden dat de hier beschreven werkwijzen zijn meer dan voldoende om hydrogelen te karakteriseren om als model 3D draagstructuren.
De long ECM hydrogels beschrijven we hier zorgen voor een effectief platform voor het bestuderen van cel-ECM interacties. Het pre-gel oplossing potentieel als een bekleding voor de polymere medicijndragers, hulp bij de levering van mesenchymale stamcellen of medicijnafgifteplatform zelf. Het protocol hier gepresenteerde biedt de basisstappen voor het maken van een veelzijdig hydrogel afgeleid van de longen ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag Smithfield boerderijen bedanken voor het doneren van het intacte varkens longweefsel. We willen ook graag bedanken Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang en de afdeling Heelkunde VCU Plastic voor het mogelijk maken om hun apparatuur te gebruiken. Hydrogel en weefselmonsters werden voorbereid voor SEM bij de VCU Afdeling Anatomie en Neurobiologie Microscopy Facility ondersteund, voor een deel, door de financiering van NIH-NINDS Center Core Grant 5 P30 NS047463 en, gedeeltelijk, door de financiering vorm NIH-NCI Cancer Center Ondersteuning Grant P30 CA016059. SEM beeldvorming van monsters bij de VCU Nanotechnologie Core karakterisering Facility (NCC). Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
